С помощью РНК-последовательности для обнаружения Novel сращивание Варианты, относящиеся к лекарственной устойчивости * These authors contributed equally

JoVE Journal
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Здесь мы опишем протокол, направленный на изучение влияния отклоняющегося сплайсинга на лекарственной устойчивости в солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Для этой цели, мы проанализировали транскриптомных профили родительских и устойчивых в лабораторных моделях через Секвенирование РНК и создал метод , основанный QRT-PCR для проверки генов - кандидатов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Устойчивость к лекарственным средствам остается главной проблемой в лечении рака для обоих гематологических злокачественных заболеваний и твердых опухолей. Характеристическая или приобретенное сопротивление может быть вызвано целым рядом механизмов, в том числе повышенной ликвидации наркотиков, снижение поглощения наркотиков, инактивацию наркотиков и изменения лекарственных мишеней. Последние данные показали, что помимо хорошо известной генетической (мутации, амплификации) и эпигенетических (гиперметилированием ДНК, гистонов посттрансляционной модификации) модификаций, механизмы устойчивости к лекарственным средствам также может регулироваться сплайсинга аберраций. Это быстро растущая область исследований, которая заслуживает внимания в будущем, чтобы планировать более эффективные терапевтические подходы. Протокол, описанный в этой статье, направлена ​​на изучение влияния отклоняющегося сплайсинга на лекарственной устойчивости в солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Для этой цели, мы проанализировали транскриптомных профили нескольких моделей в пробирке через РНК-сл и установитьМетод, основанный Эду QRT-PCR для проверки генов-кандидатов. В частности, мы оценивали дифференциальный сплайсинг ddx5 и ПКМ транскриптов. Аберрантная сплайсинга обнаружен вычислительный инструмент MATS была подтверждена в лейкозных клетках, показывая, что различные варианты ddx5 сплайс выражены в резистентных клетках родительская против. В этих клетках, мы также наблюдали / соотношение PKM1 выше PKM2, который не был обнаружен в гемцитабин-резистентный аналог Рапс-1 по сравнению с родительскими клетками Рапс-1, что указывает на иной механизм лекарственной устойчивости, вызванной воздействием гемцитабина.

Introduction

Несмотря на значительные успехи в лечении рака, резистентности злокачественных клеток к химиотерапии, либо собственной или приобретенной при длительном воздействии наркотиков, является основной причиной неэффективности лечения в широком диапазоне лейкемии и солидных опухолей 1.

Для того , чтобы очертить механизмы , лежащие в основе устойчивости к лекарственным средствам, экстракорпоральное модели клеточной линии разработаны ступенчатого подбора раковых клеток , резистентных к химиотерапевтическим агентам. Эта процедура имитирует режимы, используемые в клинических условиях и, следовательно, позволяет в глубине исследования соответствующих механизмов сопротивления. Резистентные клетки , которые выживают лечение затем отличаются от родительских чувствительных клеток с использованием жизнеспособность клеток / цитотоксичности 2. В пробирке профилей лекарственной устойчивости первичных клеток было показано, что в значительной степени связано с клинической реакции на химиотерапию 3.

Высокая пропускная способность cytotoxicity анализы представляют собой удобный метод для определения лекарственной чувствительности в пробирке. При этом жизнеспособность клеток оценивают с помощью, например , 3- [4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенил тетразолия бромид - МТТ 4, который основан на метаболическом превращении некоторых субстратов (то есть, тетразолия соли) в окрашенных продуктов, тем самым отражая митохондриальную активность клеток. В качестве альтернативы, клеточное содержание белка может быть определена количественно с помощью анализа 5 сульфородамина В (SRB). Здесь, количество жизнеспособных клеток пропорциональна оптической плотности (OD), измеренной при соответствующей длине волны на спектрофотометре, без необходимости обширный и отнимает много времени процедуры подсчета клеток. Ингибирование роста, индуцированный определенным химиотерапевтического препарата может быть рассчитана на основе OD лунок, в которых клетки были обработаны с тестируемым агентом и по сравнению с наружным диаметром необработанными контрольными клетками. Кривая доза-ответ obtaIned путем построения графика концентрации лекарственного средства в сравнении с процентным содержанием жизнеспособных клеток по сравнению с контрольными клетками. И, наконец, чувствительности к лекарственным препаратам может быть сообщено как концентрация , которая приводит к 50% ингибированию роста клеток по сравнению с необработанными клетками (IC 50).

Механизмы, лежащие в основе лекарственной устойчивости включают много различных патологий, таких как изменения, влияющих на экспрессию генов, определяющих активности лекарственного средства и клеточного метаболизма. Эти молекулярные повреждения, в том числе мутаций, аберраций в транскрипции и пост-транскрипционном уровне, а также нарушенного эпигенетической регуляции часто влияют на гены , участвующие в обмене веществ либо наркотиков или апоптоза 6.

Альтернативное пре-мРНК , сплайсинг и его запутанный регулирование недавно получили значительное внимание в качестве нового объекта , который может продиктовать устойчивости к лекарственным средствам раковых клеток 7. До 95% человеческих генов подвергаются альтернативному сплайсингу в нормальных клетках с помощью этогожестко регулируется процесс, который производит много различных изоформы белка из того же гена. Альтернативный сплайсинг часто дерегулированы при раке и несколько опухолей характеризуются измененном сплайсинга растущего числа генов , участвующих в метаболизме лекарственных средств (т.е. дезоксицитидинкиназой, folylpolyglutamate синтетазы или белков множественной лекарственной устойчивости) 6,8. Тем не менее, всесторонний анализ сплайсинга профилей резистентных клеток наркотиков мучительно не хватает. Поэтому крайне важно развивать высокие методы пропускной способности для альтернативного анализа сплайсинга. Это могло бы помочь разработать более эффективные терапевтические подходы.

В течение последнего десятилетия, быстрое развитие следующего поколения секвенирования (NGS) технологий обогатила биомедицинские исследования с новому взглянуть на молекулярные механизмы , регулирующие регуляции экспрессии генома и их роль в различных биологических процессах 9. РНК-секвенирование (РНК-сл) является мощным субприложениеиз НГС в области транскриптомику. Это позволяет геному профилирование (качественно и количественно) из паттернов экспрессии тысяч генов одновременно и хорошо подходит для характеристики новых мРНК, кодирующих, а также длинные РНК некодирующие, микроРНК, миРНК и другие малые РНК классы (например, мяРНК и Пирна) 10,11.

Секвенирование РНК имеет много преимуществ по сравнению с предыдущими технологиями для транскриптома характеристик (например, Sanger секвенирования и экспрессии микрочипов). Она не основана на существующих генома аннотацию, он имеет уровень однонуклеотидных резолюции, и она имеет более широкий динамический диапазон для оценки уровня экспрессии. Вкратце, основной экспериментальный рабочий процесс РНК-последовательность SEQ экспериментов состоит из Полиаденилированная транскриптов (мРНК) селекции и фрагментации, с последующим превращением в кДНК, строительство библиотеки и , наконец, с массовым параллелизмом глубокого секвенирования 12,13. Из-за быстрого падения sequencinг затраты в течение последних нескольких лет, Секвенирование РНК постепенно заменяют другие технологии и значительные усилия предпринимаются для улучшения протоколов подготовки библиотеки. Например, теперь можно сохранить информацию о прядей транскриптов мРНК путем маркировки второй цепи кДНК с дезоксиуридина трифосфата (дУТФ) и, перед ПЦР-амплификации, переваривая отмеченное прядь с урацил-ДНК-glycosilase (UDG). Этот процесс повышает точность гена аннотацию и оценки уровней экспрессии 14,15.

Анализ и интерпретация РНК-сл данных требует сложных и мощных вычислительных пакетов программного обеспечения и обработки в пределах биоинформатики трубопроводов 16,17. Во-первых, сырые читает прошли контроль качества посредством устранения технических и биологических артефактов и отбрасывания (обрезки) последовательности, которые не достигают строгим требованиям к качеству. Впоследствии считывает для каждого образца сопоставляются с референсный геном и индексированыв генного уровня, экзон-уровня или транскрипта уровня, для того, чтобы определить содержание каждой категории. В зависимости от применения, Уточненные данные затем вычисляются с помощью статистических моделей для идентификации аллель-специфической экспрессии, альтернативного сплайсинга, ген слитых и одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) 12. И, наконец, дифференциальный анализ на выбранном уровне (т.е. экспрессии гена или альтернативного сплайсинга) могут быть использованы для сравнения образцов , полученных при различных условиях.

Дифференциальный анализ сплайсинг описывает различия в использовании сайтов сплайсинга между двумя образцами. Все большее число программных пакетов , посвященных этой цели доступны на основе различных статистических моделей, представления и пользовательского интерфейса 18. Среди них, ЦИНОВКИ (Многофакторный анализ транскрипция сплайсинга) выступает как свободно доступной и точной вычислительный инструмент на основе байесовской статистической системы и предназначен для обнаружения сиситемахrential сплайсинга события из одиночные или спаренных концевых РНК-сл данных. Начиная с совмещенными файлов (.bam), Матс может обнаружить все основные виды альтернативного сплайсинга событий (пропуск экзонов, альтернативного сплайсинга "сайта, альтернативного 5 '3 сайта сплайсинга, взаимоисключающих экзонов и интронов удержания - также смотрите Рисунок 1).

Во-первых, программное обеспечение идентифицирует читает, которые поддерживают определенное событие сплайсинга, например пропуск экзонов, и классифицирует их на два типа. "Включение чтения" (для канонического события сплайсинга) карту в исследуемом экзона и охватывают соединений между этой конкретной экзона и двух вверх и вниз по фланкирующих экзоны. "Пропускаем читает" (для альтернативного сплайсинга события) перекрывают соединение между двумя фланкирующих экзоны. Впоследствии ЦИНОВКИ возвращает нормализованное уровень включения как для канонического и альтернативных событий и сравнивает значения между образцами или условиями. В конечном счете, он вычисляет P-значение ай уровень ложных обнаружения (ФДР) в предположении , что разница в соотношении вариант гена между двумя условиями превышает заданный пользователем порог для каждого события сплайсинга 19,34.

После дифференциального анализа сплайсинга в сочетании с Секвенирование РНК, обширная экспериментальная проверка является оправданным с целью выявления истинного положительных кандидатов 18 генов. Количественные обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (QRT-ПЦР) является наиболее широко используемым и оптимальный метод в проверке кандидатов , полученных из РНК-Seq анализа 20. Целью данной работы является создание надежной методологии для исследования наркотиков сопротивления связанных профилей сплайсинга солидных опухолей и гематологических злокачественных новообразований. Наш подход использует РНК-ПОСЛ на основе транскриптом профилирование отдельных моделей клеточной линии рака лекарственной устойчивостью в сочетании с установленным методом QRT-PCR для проверки генов-кандидатов, замешанных в лекарственной устойчивости.

21,22 и метотрексата (МТХ) резистентные подлиния CEM / R30dm 23. Хотя современные методы лечения, основанные на ШС и МТХ установить клиническое преимущество примерно в 90% случаев, появление GC-сопротивления по-прежнему представляет собой нерешенная проблема с нечетким молекулярного механизма. Для того, чтобы изолировать GC-резистентный суб-клонов, СЕМ-WT-клетки культивировали в 1 мкМ дексаметазона (DEX) в течение 2-х до 3-х недель. МТХ-устойчивые подлиния CEM / R30dm была разработана на основе повторных краткосрочных (24 ч) воздействия на клетки CEM-WT до 30 мкм МТХ как подражанием клинических протоколов. Интересно, что эта клеточная линия также отображается перекрестная резистентность к Dex (неопубликованные результаты), для которых механизм до конца не изучен.

Твердое тумили модели исследованы в настоящем исследовании, является панкреатический протоковой аденокарциномы, известный своей необычайной рефрактерности к химиотерапии. С этой целью мы выбрали линию Рапс-1 клетки и ее гемцитабин устойчивостью суб-клон Рапс-1Р , полученный путем непрерывной инкубации с 1 мкМ препарата 24. Здесь мы опишем подход , чтобы обнаружить новые механизмы , лежащие в основе экстракорпоральное лекарственной устойчивости путем объединения трех протоколов: колориметрические цитотоксичности для оценки лекарственной чувствительности в лейкозных клетках и раковых клеток из солидных опухолей, РНК-сл на основе трубопровода , чтобы идентифицировать новые варианты сплайсинга , связанные с лекарственную чувствительность / сопротивление и ОТ-ПЦР и анализ QRT-PCR для проверки потенциальных кандидатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Характеристика профилей резистентности к лекарственным средствам через цитотоксичность

  1. Лейкозных клеток линии культуры
    1. Поддерживать родительских Т-клеток ALL клеточной линии КВОР-CEM (CEM-WT), а также его лекарственно устойчивые сублиниях, включая СЕМ / R30dm, CEM-R5 и СЕМ-С3, в 25 см 2 в 10 мл среды RPMI-1640 , содержащей 2,3 мкМ фолиевая кислота с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка и 100 единиц / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина.
    2. Культуры клеток в увлажненной атмосфере при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
    3. Разрешить рост клеток в концентрации между 2 - 3 × 10 6 клеток / мл.
    4. Разделить клетки два раза в неделю при начальной концентрации 0,3 × 10 6 клеток / мл (например, если концентрация клеток составляет 3 × 10 6 клеток / мл, перенос клеточной суспензии 1 мл в новую колбу , содержащую 9 мл свежей среды). Откажитесь культуру после 20 последовательных пассажей.
    Рак поджелудочной железы клеточной линии культуры
    Примечание: Поддержание человеческой линии карциномы поджелудочной железы клеток Рапс-1 в 75 см 2 колбы для культивирования в 10 мл среды DMEM с высоким содержанием глюкозы и L-глутамина , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина , Вариант лекарственной устойчивостью, Рапс-1Р, культивируют в той же самой культуральной среде, содержащей 1 мкМ гемцитабина растворены в стерильной воде. Более подробная информация представлена в 24.
    1. Культуры клеток при 37 ° С в 5% CO 2 инкубаторе.
    2. Разделение клеток каждые 2 - 3 суток при соотношении 1: 5, когда клетки достигают слияния примерно 90%.
    3. Для того, чтобы разделить клетки, моют два раза фосфатно - солевым буфером (PBS), добавляют 1 мл трипсина / EDTA на 75 см 2 колбе для культивирования и инкубировали при 37 ° С в течение 3 мин.
    4. Добавить 9 мл среды и собрать обособленные клетки в 15 мл пробирку. Семенной 2 мл суспензии клеток в новой колбе Конта8 оцен- ками мл среды. Откажитесь культуру после 20 последовательных пассажей.
  2. МТТ для лейкозных клеток
    1. Приготовьте заранее раствор МТТ: растворить 500 мг MTT формазана в 10 мл PBS и размешать (защищенный от света месте) с помощью магнитной мешалки в течение примерно 1 ч. Стерилизацию раствора с использованием фильтра 0,22 мкм. Примечание: Раствор можно хранить в 10 мл аликвотах при -20 ° С. Защита от прямого света после оттаивания.
    2. Приготовьте заранее подкисленной изопропиловый спирт: добавить 50 мл 2 М HCl до 2,5 л изопропанола. Примечание: Хранить раствор в течение по крайней мере одного месяца при комнатной температуре перед использованием. Если изопропиловый спирт не подкисляют правильно, он может образовывать осадки со средой и поставить под угрозу спектрофотометрического считывания.
    3. Подготовьте отдельную 96-луночных плоскодонных "День 0" (контроль) пластины для обеспечения более точной оценки ингибирования роста: выделить 3 до 6 лунок на одну клеточную линию, добавить 30 мкл ростасредний и 120 мкл клеточной суспензии (8000 клеток) в каждую лунку и 150 мкл среды для выращивания в лунки соответствующих заготовок (без клеток). Продолжить от шага к шагу 1.3.9 1.3.13 настоящего раздела для измерения оптической плотности (OD). Примечание: Более подробная информация представлена в 4.
    4. Приготовьте 96-луночных плоскодонных экспериментальную пластинку: выделить 30 лунок в концентрации препарата (10 концентраций, каждая в трех экземплярах), 10 лунок с контрольными клетками и 10 лунок для управления средой без клеток (заготовок) и готовят ряд разведений препарат дексаметазона ( Декс) с использованием диметилсульфоксида в качестве растворителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для клеток СЕМ-WT диапазон разбавления Dex составляет от 2 мкм и 0,97 нМ. Для CEM / R30dm, CEM-R5 и СЕМ-С3 клеток диапазон разбавления Dex составляет от 640 мкМ до 0,33 нМ.
    5. Добавьте 30 мкл из каждого разведения Dex в соответствующую лунку 96-луночного планшета. Убедитесь в том, чтобы включить каждую концентрацию в трех экземплярах.
    6. Добавьте 30 мкл среды для роста хорошоs, соответствующих контрольных клеток и 150 мкл среды для выращивания в лунки соответствующих заготовок.
    7. Урожай экспоненциально растущих клеток и ресуспендируют при их оптимальной концентрации высева.
      Примечание: Для того чтобы определить оптимальные концентрации Отправной клеток, рекомендуется, чтобы оценить характеристики роста каждой линии клеток клеточной линии в 96-луночный планшет посевом клеток при нескольких концентрациях и измерения его ежедневно в течение по крайней мере 4-х дней. Выберите концентрацию высева, которая предотвращает разрастание клеток после 72 часов, так как это будет влиять на эксперимент, насыщая значения ОП. Для СЕМ-WT, CEM-С5 и CEM-R5 оптимальная концентрация затравки составляет 8000 клеток / лунку, а для CEM / R30dm она составляет 5000 клеток / лунку.
    8. Добавьте 120 мкл суспензии клеток в каждую лунку, содержащую либо лекарственного раствора или ростовую среду (соответствующие лунки с контрольными клетками). Заполните пустые внешние лунки планшета с 150 мкл PBS, чтобы обеспечить хорошую влажность в пластине и инкубировать тысе планшеты в течение 72 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2 в культуре клеток инкубаторе.
    9. Добавьте 15 мкл раствора МТТ в каждую лунку и встряхните планшет в течение 5 мин с пластиной-шейкере до максимума 900 встрясок / мин.
    10. Место пластин обратно при 37 ° С с 5% CO 2 в культуре клеток инкубатор и инкубируют в течение еще 4 - 6 ч.
    11. Добавьте 150 мкл подкисленного изопропанола в каждую лунку и хорошо перемешать с помощью многоканальной пипетки, чтобы тщательно ресуспендируют все кристаллы формазана. Начните с пустых лунок и убедитесь в том, чтобы ополоснуть кончики задолго до того, как перейти к другой строке пластины.
    12. Инкубируйте планшет при комнатной температуре (КТ) в течение 10 мин.
    13. С помощью микропланшет-ридера, определяют оптическую плотность при 540 и 720 нм, чтобы обеспечить точное измерение путем коррекции фона OD. Затем сохраните данные в файл электронной таблицы и анализировать его 4.
  3. SRB Анализ на рак поджелудочной железы клеток
    1. Растворите SRB реагента в 1% -ной уксусной кислоты, при конечной концентрации 0,4% (вес / объем).
    2. Растворите трихлоруксусной кислоты (ТСА) в сверхчистой воде в конечной концентрации 50% (вес / объем).
    3. Растворите трис (гидроксиметил) -аминометана в сверхчистой воде в конечной концентрации 10 мМ.
    4. Подготовьте отдельный 96-луночных плоскодонных управления "День 0" пластины, чтобы обеспечить более точную оценку ингибирования роста: Семя 6 скважин с клетками, растущими в экспоненциальной фазе в 100 мкл среды при соответствующей концентрации высева и добавляют 100 мкл среды только лунки, соответствующие заготовки. Инкубируют в течение ночи при температуре 37 ° С с 5% CO 2 , чтобы обеспечить надлежащую адгезию клеток к пластине. Затем добавляют 100 мкл среды во все лунки и перейдите к шагам 1.4.8 - 1.4.16 настоящего раздела.
    5. Готовят 96-луночных плоскодонных экспериментальной пластины: семенные клетки растут в экспоненциальной фазе в трех повторах в 96-луночных плоским дном пластины при соответствующей плотности в 100 мкл меняDIUM с помощью многоканальной пипеткой.
      Примечание: Для того чтобы определить оптимальные концентрации Отправной клеток, рекомендуется, чтобы оценить характеристики роста каждой линии клеток клеточной линии в 96-луночный планшет посевом клеток при нескольких концентрациях и измерения его ежедневно в течение по крайней мере 4-х дней. Выберите концентрацию высева, которая предотвращает разрастание клеток после 72 часов, так как это будет влиять на эксперимент, насыщая значения ОП. Для Рапс-1 и Рапс-1Р клеток, оптимальная концентрация затравки составляет 8000 клеток / лунку.
    6. Добавьте 100 мкл среднего до только лунки и инкубировать в течение ночи при 37 ° С с 5% CO 2 для обеспечения надлежащей адгезии клеток к пластине.
    7. Подготовить диапазон разбавления наркотиков гемцитабина между 1 мкМ и 10 нМ для Panc-1 и 1 мМ и 100 нМ для клеток Рапс-1R. Добавьте 100 мкл из каждого разведения в соответствующую лунку 96-луночного планшета с помощью многоканальной пипетки. Убедитесь в том, чтобы иметь каждую концентрацию в трех экземплярах. К тому же,добавляют 100 мкл среды к средней только лунки и контрольными клетками. Инкубируют при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 72 ч.
    8. Добавьте 25 мкл раствора холодного ТСА в лунки с помощью многоканальной пипетки и инкубировать пластин в течение по меньшей мере 60 мин при температуре 4 ° С для того, чтобы осадить и исправить белки в нижней части лунки.
    9. Пустые пластины путем удаления среды и сухой кратко на ткани.
    10. Промыть 5 раз водопроводной водой, затем очистить тарелку и дать высохнуть при комнатной температуре.
    11. Добавьте 50 мкл раствора SRB на лунку с использованием повтор пипетку и пятна в течение 15 мин при комнатной температуре.
    12. Пустые пластины путем удаления SRB пятно.
    13. Промойте 4 раза с 1% -ной уксусной кислотой, затем очистить тарелку и дайте ему высохнуть при комнатной температуре.
    14. Добавьте 150 мкл раствора Трис на лунку с использованием многоканальной пипеткой и перемешивают в течение 3 мин на пластины-шейкере до максимума 900 встрясок / мин.
    15. Считать оптическую плотность при длине волны 540 нм (или, если 492 нм тон значения ОП слишком высоки).
    16. Анализ данных.
  4. Анализ данных для МТТ и SRB Assays
    1. Вычислить значения ОП ячеек в «день 0» , используя следующую формулу: OD день 0 клетки = контроль OD - средняя ОП пустых скважин
    2. Рассчитывают процент выживающих клеток для каждой концентрации лекарственного средства в соответствии со следующей формулой:% Обработанные клетки = Среднее [OD обработанных клеток - средняя ОП пустых лунок - День О.Д. 0] / [контрольные клетки OD - средняя ОП пустых лунок - OD Day0] * 100
    3. Участок кривой доза-реакция (концентрация лекарственного средства против ингибирования роста в%).
    4. Рассчитывают концентрацию лекарственного средства , которое ингибирует рост клеток на 50% (IC 50) с использованием кривой доза-ответ.

2. Выделение РНК и библиотека Подготовка к РНК-секвенирования

  1. образец Collпрогиб и РНК Изоляция
    1. Для клеток СЕМ: урожай 10 6 клеток непосредственно из культуральной среды.
    2. Для Panc-1 и Panc-1R: удалить среды, промыть клетки дважды ПБС, а затем отделяться путем добавления трипсин-ЭДТА и инкубацией при 37 ° С в течение 3 мин. Добавить культуральной среды и урожай 10 6 клеток.
    3. Спин вниз образцы при 300 х г в течение 3 мин, удаления надосадочной жидкости и извлечь полную мРНК с использованием коммерчески доступных спиновые колонки кремнезема мембраны, следуя протоколу изготовления.
    4. Определить концентрацию и чистоту тотальной РНК с использованием UV-VIS спектрофотометр.
      Примечание: РНК считается высокой чистоты, если отношение оптической плотности 260 нм / 280 нм выше 1,8. Образцы можно хранить при температуре - 80 ° С.
    5. Оценка общей целостности РНК с помощью электрофореза 200 нг пробы на 1% -ном агарозном геле, окрашенном бромидом этидия.
      Примечание: Обнаружение двух неповрежденных полос, соответствующих млекопитающих 28S и 18S рРНК примерно2 кб и 1 кб по размеру является показателем хорошей общей целостности РНК.
  2. Секвенирование Библиотека Подготовка
    1. Используйте 2 мкг тотальной мРНК в каждом образце. Следуйте протокол подготовки библиотеки мРНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
    2. Определить качество и концентрацию каждой библиотеки с помощью системы Bioanalyzer. Объединяют библиотеки в одном образце до конечной концентрации 10 нмоль / л и измеряют его с Bioanalyzer.
    3. Используйте систему секвенирования высокой пропускной способностью с режимом 100 п.н. однократного считывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтение длина> 80 пар оснований необходимо для идентификации транскрипционные изоформы.

3. Обнаружение дифференциальной сращивания из Секвенирование Читает

  1. Выравнивание Читает референсного генома и проверки качества
    1. Компиляция ген аннотацию (.gtf файл) из таблицы NCBI refGene с помощью таблицы УСК браузера (25,963 генов).
    2. выполнятьаннотацию-известно выравнивание секвенирования с зазором читает на референсный геном (GRCh37) с использованием STAR.
    3. Сортировка и индекс итоговые файлы выравнивания с Пикард инструментов.
    4. Осуществлять контроль качества после сопоставления с помощью RSeQC и samtools.
  2. Дифференциальный Сращивание Обнаружение между образцом групп
    1. Установить Python и соответствующие версии NumPy и SciPy. Загрузите и установите samtools. Загрузите и установите бабочку и TopHat,
    2. Добавьте Python, бабочку, TopHat и samtools каталоги к переменной $ PATH среды. Скачать преднастроенным Bowtie индексы (hg19). Скачать rMATS версию 3.0.9.
      Примечание: Более подробная информация о rMATS представлены в 19 и 34.
    3. Обнаружение альтернативные события сплайсинга путем сравнения каждого Dex-устойчивую линию клеток к CEM-WT и Panc-1 Panc-1R в отдельном ЦИНОВОК бежит согласно фиг.5А.
    4. Для обнаружения дифференциального сплайсинга события из Previously выровнен секвенирования читает (файлы .bam), запустите MATS с помощью команд из фиг.5В для СЕМ-WT против CEM- C3, CEM-WT против СЕМ-R5, CEM-WT против CEM / R30dm и Panc1 к Panc- 1Р сравнения.
      Примечание: Маты создаст папку вывода с двумя .txt файлов с результатами по каждому типу события сплайсинга анализируемой (SE - пропуск экзонов, A5SS - альтернатива 'сайта сплайсинга, A3SS - альтернатива 3' 5 сайтов сплайсинга, MEX - взаимоисключающие экзоны и RI - удержание интронов): один файл результаты, содержащие на основе подсчетов плоскостных только и второй файл с результатами, основанными на подсчете плоскостных и читает на цели. Кроме того, дополнительный файл .txt с обзором результатов генерируется в той же папке.
    5. Для SE, A5SS, A3SS и RI импорта в электронные таблицы файлы .txt, основанные на подсчете плоскостных и читает на цели. Для MEX импортировать файлы с расширением .txt, основанные на подсчитывал только узел.
      Примечание: Выходной файл матов сортируются по возрастанию P-значения и содержит несколько параметров: ген ID, символ гена, Хромосомные и положение нити, геномные координаты альтернативного сплайсинга фрагментов, считается также длины включения и пропуск формы для обоих анализируемых образцов, длина включения и пропуск формы, используемый для нормализации, р-значение, уровень ложных обнаружения (FDR ), уровень включения для каждого образца на основе нормированных импульсов и счет дифференциального включения (среднее (IncLevel1) - среднее (IncLevel2)).
    6. Выбор статистически значимых генов - кандидатов с FDR <10% для дальнейшей проверки (например, ddx5 и PKM2).
    7. Визуализируйте альтернативные события сплайсинга с интегративной геномики Viewer (ВНА, https://www.broadinstitute.org/igv/), как сообщается на рисунке 5.

4. Проверка результатов с помощью ОТ-ПЦР и QRT-ПЦР

  1. Праймер Дизайн
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы обеспечить надежную проверку результатов, полученных с использованием биоинформационного трубопровода, мРНК трансcripts в результате альтернативных событий сплайсинга усиливаются с помощью RT-PCR и визуализировали с помощью электрофореза в агарозном геле ПЦР-продуктов. зеленый краситель цианиновыми, такие как SYBR зеленый QRT-PCR анализ используют для количественного определения конкретного сращивания вариантов относительно гена домашнего хозяйства. На рисунке 7 показана стратегия применяется для визуализации экзон 12 , пропустив событие гена ddx5 и количественно взаимоисключающие экзон 9 и 10 экзона гена ПКМ.
    1. Для RT-ПЦР, пары дизайн праймер, отжигать учредительным экзонов (Эксон 10 и экзона 13) , расположенных на входе и выходе альтернативных сайтов сплайсинга (Рисунок 7а).
      Примечание: Размер ампликона должен охватывать между 100 и 800 пар оснований для того, чтобы обеспечить четкое разделение предсказанных продуктов ПЦР в агарозном геле. Температура отжига праймеров должна быть между 55 и 65 ° С, и содержание GC не должна превышать 60%.
    2. Цианиновыми зеленый анализ (7Б). Проверьте последовательность гомологии двух взаимно исключающих экзонов и дизайн двух пар праймеров, каждый из которых специально и исключительно обнаруживает только один из двух вариантов сплайсинга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения ПКМ, обратный праймер отжигов до экзона 11, общий для обоих вариантов, в то время как праймеры являются вариант- специфичны и отжигать с экзоном 9 (PKM1) или экзон 10 (PKM2).
    3. Для того чтобы обнаружить ddx5 ген полной длины, отжигать обратного праймера внутри пропущенного экзона (экзон 12).
      Примечание: Для конкретного обнаружения варианта ddx5 ΔEx12, обратный праймер охватывает границу exon11 / exon13. Используйте ту же прямого праймера, который гибридизуется с конститутивной экзона 10 для обеих реакций.
      Примечание: Размер ампликона должна составлять от 80 до 200 пар оснований.
  • Первую цепь кДНК Синтез
    1. Установка обратной транскрипции 1 мкг выделенной РНК в кДНК с помощью 200 ед / мкл мышиного лейкоза Молони вируса (M-MLV) REVERС. Е. транскриптазы в реакционном буфере, разводили 1: 5 стерильной водой. Добавить DTT 1 мкМ, 0,05 мкг случайных гексамеров, дезоксинуклеотид смеси (дНТФ) 1 мМ и 40 ед / мкл ингибитора рибонуклеазы.
    2. Вихревой кратко и инкубировать в реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 2 часов.
    3. Инкубируйте реакционной смеси при 70 ° С в течение 5 мин, чтобы инактивировать обратную транскриптазу, передавать смесь на льду и спином вниз с помощью микроцентрифуге. Образцы можно использовать сразу или хранить при температуре - 20 ° C.
  • ОТ-ПЦР - реакцию , и в агарозном геле
    1. Настройка реакции ПЦР в ПЦР-пробирку на каждом образце путем смешивания 12,5 мкл 2x концентрированный ПЦР Mastermix, 1,25 мкл 10 мкМ прямого праймера и ту же величину для обратного праймера до конечного объема 25 мкл стерильной водой.
    2. Добавляют 1 мкл кДНК в смесь и поместить пробирки в амплификатор. Запустите программу следующим образом: начальная денатурация: 95 ° С в течение 2 мин.Подтверждают следующие шаги в течение 35 циклов: денатурация при 95 ° С в течение 25 сек; отжиг при 52 ° С в течение 35 сек; удлинение при 72 ° С в течение 1 мин. Установить окончательное удлинение при 72 ° С в течение 5 мин.
    3. Готовят 1% -ном агарозном геле путем растворения 1 г агарозы в 100 мл 1х буфера TBE. Добавить 2,5 мкл этидий-бромида к раствору. ВНИМАНИЕ: этидийбромид является канцерогенным, обращаться с осторожностью с помощью химического вытяжку.
    4. Загрузите образцы и запустить гель в 1x КЭ буфера при 100 V в течение примерно 30 мин в системе для электрофореза.
    5. Выявить гель с цифровой УФ-камеры и сохранить изображение.
  • QRT-ПЦР и анализ данных
    1. Настройка цианиновыми зеленой реакции ПЦР на каждый образец путем смешивания 12,5 мкл 2x зеленого PCR Mastermix 2 мкл 5 мкМ прямого праймера и такое же количество для обратного праймера до конечного объема 15 мкл стерильной воды в пробирку для ПЦР , Приготовьте смесь для каждого конкретного сращиванияВариант для обнаружения (PKM1, PKM2, ddx5 полная длина, ddx5 ΔEx12) и для гена домашнего хозяйства (GUS).
    2. Загрузка Mastermix на белом 96-луночный планшет и подготовить дублей на каждом образце.
    3. Развести кДНК 10x в воде, добавляют 5 мкл к каждой смеси и поместите пластину в амплификатор. Запуск программы следующим образом: начальная денатурация: 95 ° С в течение 5 мин. Подтверждают следующие шаги в течение 45 циклов: денатурация при 95 ° С в течение 10 сек; отжиг при 58 ° С (для ddx5 и ddx5 ΔEx12 смеси) или 60 ° C (для PKM1 и PKM2 смеси) в течение 20 сек. Установить окончательное удлинение при 72 ° С в течение 20 сек. Установка кривой плавления с применением градиента от 65 до 97 ° C.
    4. Для того, чтобы оценить специфичность наборов праймеров к цели, проверить кривые плавления и проверки того, что один пик формируется на каждый набор праймеров.
    5. Вычислить второй производной значения кривых усиления и экспортировать пороговые значения цикла (Ct).
    6. Calculatе относительные уровни экспрессии (REL) мРНК сращивания вариантов по сравнению с GUS домашнем хозяйстве (ссылка) генов в каждом образце с помощью "(& Delta; CТ) дельта Ct" метод. Формула: REL = 2 - & Delta ; CТ, где & Delta ; CТ = Ct целевой сплайсинга вариант - Ct опорный ген
    7. Для того , чтобы количественно оценить относительное обилие вариантов сплайсинга, рассчитать соотношение REL, используя формулу: Коэффициент REL отношение = REL сплайсинга вариант 1 / REL сплайсинга вариант 2.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Цитотоксичность , описанные в протоколе обеспечивают надежный и надежный метод для оценки устойчивости раковых клеток к химиотерапевтическим агентам в пробирке. С помощью МТТ-анализе, чувствительность к Dex была определена в четырех Т-ОЛЛ клеточных линий, в том числе Декс-чувствительных родительских клеток СЕМ-WT, а также три Декс-резистентных сублиниях: CEM / R30dm, CEM-R5 и СЕМ-С3. Два различных диапазоны концентрации должны были быть использованы из-за большой разницы в чувствительности между СЕМ-WT (2 мкМ - 0,97 нм) и устойчивых клеточных линий Dex (640 мкМ - 0,33 нМ). Анализ МТТ ясно показал Dex сопротивление в CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 мкМ), CEM-R5 (IC 50> 640 мкМ) и СЕМ-С3 (IC 50 = 386 ± 98 мкМ) по сравнению с CEM- клетки WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 мкм). Точно так же анализ SRB продемонстрировали высокую устойчивость к гемцитабин в клеточной линии Рапс-1Р (IC 50 = 3.16 ± 0,01 мкМ) по сравнению с родительскими клетками Рапс-1 (IC 50 = 0,077 ± 0,03 мкМ) , как показано на рисунке 2.

    После подтверждения лекарственной устойчивости во всех рассматриваемых клеточных линий, мы затем приступили к изоляции мРНК, подготовка библиотеки и РНК-последовательности. Извлечение общей мРНК с использованием кремнезема мембраны Spin Columns является предпочтительным выбором по сравнению с другими способами, так как он позволяет избежать фенола и белкового загрязнения и обеспечивает высокую степень чистоты образца с 260 нм / 280 нм отношением оптической плотности значительно выше 1,8. Это важное требование для сложных последующих применений, таких как глубокая секвенирования. Метод , используемый для проверки целостности образцов РНК с помощью агарозы 1% особенно хорошо подходит для свежеизолированных клеток (рисунок 3). Поскольку цель этого протокола заключается в выявлении альтернативных вариантов сплайсинга аберрантно, выраженные в клеточных линиях лекарственной устойчивостью, мы выбираем положительный selectioп полиаденилированой мРНК для подготовки библиотеки последовательности, с использованием набора для многожильного мРНК. Электрофореграммы одиночных и объединенных библиотек изображены на фигуре 4, показывающий средний размер фрагмента около 300 пар оснований , в соответствии с требованиями к системе секвенирования. Подготовленные библиотеки были затем секвенировали с использованием чип с режимом 100 п.н. однократного считывания. Выбор последовательности считывает из 100 п.н. необходимо обнаружить альтернативный сплайсинг через вниз по течению биоинформационных трубопроводов.

    После начальных стадий обработки и контроля качества, чистый чтений выравнивается генома человека (hg19) были подвергнуты дифференциальный анализ сплайсинга с использованием матов. В этом анализе мы проводили сравнения лекарственной чувствительной исходной клеточной линии и каждый из его устойчивых к лекарствам сублиний отдельно (то есть, СЕМ WT против клеток СЕМ / R30dm, CEM WT против СЕМ-С3 и т.д.). ЦИНОВКИ опирается на гибкой и точной статистической моделииспользуется для обнаружения дифференциального сплайсинга между образцами. При использовании опции анализа по умолчанию и значение FDR <10% , как отсечкой (изображено на рисунке 5б), мы были в состоянии идентифицировать 38 ± 12 значимых дифференциально сплайсинга кандидатов генов в сравнении упорядоченных по типу альтернативного события сплайсинга, при этом большинство хитов классифицируется как пропуск экзонов. На рисунке 6 показан типичный выход анализа для сравнения Panc-1 против Panc-1R.

    Кроме того, мы сосредоточили наше исследование на двух наиболее распространенных типов альтернативных событий сплайсинга: пропуск экзонов и взаимоисключающие экзонов событий с одного представителя кандидата на одну категорию, описанной ниже. Ddx5 (DEAD-бокс хеликаза 5) был обнаружен с помощью анализа матрасов, а статистически значимым в сравнении СЕМ-WT против СЕМ-С3 и СЕМ-R5, но не имеет существенного значения в сравнении СЕМ-WT против СЕМ / R30dm. Учитывая предполагаемую роль в лейкозе 25,26, мывыбрать этот кандидат для дальнейшей проверки. Настоятельно рекомендуется, чтобы визуализировать РНК-сл данные в браузере, как инструмент генома. ВНА обеспечивает универсальный и удобный интерфейс для этой цели, как показано на рисунке 7 для кандидата гена ddx5. ПКМ (пируваткиназа мышечной изофермент) является статистически значимым взаимоисключающими событие экзон в сравнении СЕМ-WT против всех Декс устойчивые к сублиний, но не в сравнении Рапс-1 против Panc-1R. С учетом важности этого фермента в твердом метаболизма опухоли 27,28 и появляющийся роль клеточного метаболизма в глюкокортикоидной сопротивления в T-ALL 29, мы выбираем этого кандидата для дальнейшей проверки с помощью RT-PCR.

    Грунтовка конструкция должна проводиться с особой осторожностью, чтобы усилить правильную ампликона, особенно когда праймеры отжигают с экзоном-экзон границы (в случае обратного праймера вариант обнаружения ddx5 ΔEx12), или когда тэй отжигать к взаимоисключающие экзоны с высокой гомологии последовательностей (экзон 9 и 10 экзона из ПКМ). На рисунке 8 показана стратегия проектирования праймера, а на рисунке 9 показаны результаты в ОТ -ПЦР для кандидата гена ddx5. Ddx5 ΔEx12 обнаружен в образце CEM-WT и CEM / R30dm, но не в СЕМ-С3 и CEM-R5, подтвердив тем самым данные матов в качественном моде. Цианиновыми зеленый QRT-ПЦР точно квантифицирует уровни экспрессии мРНК ddx5 и ПКМ сплайсинга вариантов, как показано на рисунке 10 и рисунке 11, соответственно.

    Рисунок 1
    Рисунок 1: Схематическое представление альтернативного сплайсинга событий. Схематическое представление возможных форм альтернативного сплайсинга гена. Коробки дискретные экзонов, которые могут быть независимо включены или исключены из мРН.А. транскрипт. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    фигура 2
    Рисунок 2: Результаты цитотоксичности. (А) Анализ МТТ для лейкозных клеточных линий показывает высокий уровень устойчивости дексаметазона в СЕМ-С3 (IC 50 = 386 ± 98), СЕМ-R5 (IC 50> 640 мкМ) и СЕМ / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 мкМ ) по сравнению с родительским CEM-WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 мкМ). (B) SRB анализы для линий клеток рака поджелудочной железы показывают высокие уровни сопротивления гемцитабина в Panc-1R (IC 50 = 3,16 ± 0,01 мкМ) по сравнению с родительским Panc-1 (IC 50 = 77,22 ± 2,76 нм). Графики сообщают среднего роста клеток% ± SEM трех Independent эксперименты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 3
    Рисунок 3: Оценка РНК качества в агарозном геле. Двести нг общей мРНК электрофорезу на 1% агарозном геле, окрашенном бромидом этидия. Присутствие неповрежденных полос, соответствующих рибосомальной РНК (рРНК) видов 18S и 28S и отсутствие мазков при более низких молекулярных масс являются показателем хорошего качества РНК. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4: <сильные> Bioanalyzer Следы секвенирование библиотек. (A) электрофореграммы библиотек секвенирования показывают пики при примерно 300 б.п., что является показателем хорошего качества. Образец 1 до 6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Рапс-1 и Рапс-1Р. (B) Electropherogram из объединенных пробах (FU, флуоресценция Единицы измерения).

    Рисунок 5
    Рисунок 5: Обнаружение дифференциальной сращивания с матами. (A) Группа сравнения (В) сценарии , используемые для запуска матов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 6
    Рисунок 6: ЦИНОВКИ Выходной список. На рисунке изображен типичный выход анализа MATS в программном обеспечении с электронными таблицами: здесь представлены дифференциально сплайсинга кандидатов в сравнении Panc-1 против Panc-1R для пропуска экзонов событий (FDR <10%). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 7
    Рисунок 7: Визуализация дифференциальной сплайсинга ddx5 кандидатом на роль гена через ВНА Genome Browser. Файлы с выровненным читает (.bam), соответствующие лейкозных клеток были загружены на ВНА генома браузера и визуализировали с помощью сашими участков (минимальное ответвительные отсчитывает значение = 10, чтобы визуализировать значимые события сплайсинга). отсчеты сплайсинговых соединений представлены соединительными линиями ичисло, соответствующее Секвенирование РНК чтений охватывает экзонов. CEM-WT и CEM / R30dm показать пропуск экзона отсчетов, охватывающих 11 до экзона 13 по сравнению с СЕМ-С3 и CEM-R5, которые не показывают экзон 12 пропуску. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 8
    Рисунок 8: Праймер Дизайн для ОТ-ПЦР и цианиновыми Green QRT-PCR. (А) ОТ-ПЦР: пары праймеров обнаруживая дифференциальный сплайсинг ddx5 отжигу к конститутивных экзонов (Эксон 10 и экзона 13) , расположенных выше по течению и ниже по течению от альтернативного сплайсинга экзонов. (B) QRT-ПЦР - анализ: для относительного количественного определения транскриптов в результате пропуска экзонов событий по сравнению с каноническим транскриптов, обратный праймер отжигов либо в пропускаются экзона (альтернативный вариант) илик границе exon11 / exon13 (канонический вариант) гена ddx5. Для количественной оценки взаимоисключающих экзонов, обратный праймер отжигов до экзона 11, общий для обеих изоформ, в то время как отжигать прямого праймера либо экзона 9 (PKM1) или экзон 10 (PKM2). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 9
    Рисунок 9: RT-PCR Валидация ddx5 дифференциального сплайсинга. 1% агарозном геле показывает дифференциальный сплайсинга гена ddx5 в лейкозных клетках. Фрагмент, соответствующий ddx5 полной длины ампликона (650 пар оснований) усиливается во всех образцах, в то время как ddx5 ΔEx12 (430 пар оснований) вариант усиливается в СЕМ-WT и CEM / R30dm образцов и размер соответствует экзон 12 пропуску. Это не обнаруживается в СЕМ-С3 и СЕМ-R5 клеток, а отпугиватьдобыты путем анализа матов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 10
    Рисунок 10: экспрессия мРНК Уровни ddx5 сращивания вариантов в клетках СЕМ. (А) QRT-ПЦР - анализ. Средние относительные уровни экспрессии и стандартная ошибка среднего (REL ± SEM) двух независимых экспериментов. (Б) Отношение REL (± SEM) , из вариантов сплайсинга. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 11
    Рисунок 11: Уровень экспрессии мРНКs из ПКМ для сращивания Варианты в CEM и Рапс-1 клеток. (А) QRT-ПЦР - анализ. Средние относительные уровни экспрессии и стандартная ошибка среднего (REL ± SEM) двух независимых экспериментов, и соотношение отн сплайс для клеток СЕМ. (В) QRT-ПЦР - анализ. Среднее сообщение REL ± SEM из двух независимых экспериментов, и соотношение REL (± SEM) из вариантов сплайсинга для клеток Рапс-1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Здесь мы опишем новый подход, который сочетает в себе хорошо зарекомендовавшие себя методы скрининга цитотоксичности и мощный NGS на основе транскриптомики анализа для выявления дифференциальных сплайсинга событий по отношению к лекарственной устойчивости. Спектрофотометрические анализы удобные и надежные методы с высокой пропускной способностью для оценки лекарственной чувствительности в моделях рака в пробирке и представляют собой первый выбор для многих лабораторий , выполняющих цитотоксичности скрининги. Поиск и устранение неисправностей, а также возможные варианты для этого метода были подробно описаны в другом месте 4,5.

    Высокая пропускная способность геномного анализа в настоящее время используется для изучения механизмов лекарственной устойчивости в основном полагаться на обнаружение ОНП и дифференциальной оценки экспрессии генов, ассоциированных с определенным лекарственной устойчивостью фенотипа. В данном исследовании мы описываем использование методов РНК-секвенирования, вместе с надежными биоинформатики трубопроводов для точной аннотацией транскриптов мРНК и обнаружения дифференциальный сплайсинга. Особенно важной особенностью описанного протокола является возможность идентифицировать новые варианты сплайсинга между двумя образцами групп с различными профилями чувствительности к лекарственным препаратам. Одним из важнейших шагов для точного и объективного анализа является выделение РНК, которая должна иметь высокую степень чистоты и целостности.

    КОВРИКИ это программное обеспечение мы выбираем среди ряда аналогичных инструментов биоинформатики доступных (например, Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice и Сращивание компас) для обнаружения альтернативного сплайсинга 18. Основные ключевые особенности, которые делают его предпочтительным вариантом являются его превосходит точность и точность, а также возможность идентифицировать новые события. ЦИНОВКИ генерирует два типа вывода, содержащий анализ дифференциального сплайсинга: первый основан только на подсчете плоскостных экзонов, а второй основан на подсчете плоскостных, а также читает на цели. В то время как последний является предпочтительным для обнаружения пропуска экзонов событий, рекомендуетсяиспользовать первый вариант для анализа взаимоисключающих экзонов, как этот подход уменьшает число ложных положительных кандидатов для этого конкретного типа сплайсинга изменения.

    Кроме того, для анализа с акцентом на сохранение интрона, альтернативные события 3 'и 5' сплайс сайт, следует использовать .gtf файл с аннотациями интронов. В конечном счете, с целью снижения биологической и технической вариабельность в рамках выборочных групп и обеспечить высокие истинные положительные темпы, настоятельно рекомендуется последовательность по меньшей мере , три параллельных образца 34. Выбор дифференцированно сращенных кандидатов генов, основанные на выходе MATS сочеталось с этапа проверки с использованием RT-PCR. Это особенно важно для отбора истинных положительных вариантов среди большого списка статистически значимых кандидатов. Ключевым фактором для точной проверки является разработка олигонуклеотиды и оптимизация ПЦР-реакций, в соответствии со стандартами молекулярной биологии. особая тщательностьСледует соблюдать осторожность при проектировании праймеров, охватывающих экзон-экзона перекрестки и дополнительные этапы проверки, такие как секвенирование ампликонов методом Sanger, имеют гарантию того, чтобы подтвердить их специфику.

    Дифференциальный сплайсинг ddx5 и ПКМ транскриптов, обнаруженных ЦИНОВОК представляют два примера аномальным сплайсинга, связанных с лекарственной устойчивостью. Ddx5 ΔEx12 не была выражена в ГЦ-устойчивые клеточные линии (СЕМ-С3 и R5), которые были отобраны после длительного воздействия Dex. Ddx5 ΔEx12 выражалось в исходной клеточной линии, но и в субклона СЕМ / R30dm, который был выбран на устойчивость к воздействию химиотерапевтического средства МТХ, а не Dex. В раковых клетках, был высокий уровень экспрессии PKM2 по сравнению с его сращивание вариант PKM1, но соотношение PKM2 / PKM1 была выше в Dex-резистентных клеток, как это было предложено по результатам NGS. Это не наблюдалось для Рапс-1 образца по сравнению с его гемцитабина устойчивостью аналога и, в самом деле, этот ген-кандидат не был средистатистически значимые события в анализе матов. Это может отражать различные типы клеток и механизм лекарственной устойчивости, вызванной воздействием гемцитабина.

    В заключение, этот протокол является подходящим подход для обнаружения вариантов сплайсинга , которые могут лежать в основе устойчивости к лекарственным средствам и может быть применено к или лейкозных клеток 30 или твердых опухолевых клеток 31. Четкое ограничение состоит в том, что линии опухолевых клеток захватить лишь малую часть гетерогенности рака. Кроме того, большинство клеточных линий были сохранены на протяжении многих лет в монослоев в ростовых средах. Эти условия влияют на клеточные характеристики, что приводит к выбору субпопуляций, которые значительно отличаются от клеток первичной опухоли, из которых они. Тем не менее, многие из генов, которые участвуют в лекарственной устойчивости также участвуют в других ключевых клеточных функций, таких как рост клеток и апоптоз, которые могут пострадать от долгосрочной culturin г в пластик. Поэтому для того, чтобы улучшить исследование лекарственной устойчивости, больше усилий должно быть направлено на разработку новых доклинических моделей, таких как первичные культуры и ксенотрансплантатов, что более точно имитировать в естественных условиях микросреды рака с тем, чтобы избежать соответствующих изменений в клеточных характеристик вызванное длительных периодов культуры клеток и условий культивирования. 32 Примечательно, что наш протокол может быть применен также к первичным клеткам, с использованием цитотоксичности для того , чтобы определить , исключая виво значения IC 50. Другим ограничением является то, что, поскольку многие механизмы устойчивости существуют для каждого противоракового лекарственного средства, сходные или различные механизмы устойчивости могут развиваться в клетках, подвергнутых идентичных, но независимых обработок. Таким образом, сравнительная стратегия отбора должна включать в себя параллельные выборы и анализы, в том числе генетических анализов на варианты сплайсинга, одних и тех же родительских клеток, обработанных с тем же химиотерапевтического агента.

    jove_content "> Дополнительные подходы для функциональной проверки должны быть направлены на гиперэкспрессией вариант сплайсинга интереса в клеточных линиях или специфически подавляют их экспрессию с помощью РНК - интерференции или сплайс-коммутационные олигонуклеотиды 33.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
    2. McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
    3. Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
    4. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
    5. Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1, (3), 1112-1116 (2006).
    6. Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
    7. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, (5), 547-566 (2013).
    8. Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138, (7), 1645-1656 (2016).
    9. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
    10. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
    11. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
    12. Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9, (Suppl 1), 29-46 (2015).
    13. Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
    14. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
    15. Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16, (Suppl 9), (2015).
    16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
    17. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
    18. Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
    19. Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
    20. Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
    21. Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68, (5), 663-668 (1996).
    22. Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20, (14), 2600-2602 (2006).
    23. McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266, (10), 6181-6187 (1991).
    24. Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41, (6), 2093-2102 (2012).
    25. Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32, (40), 4845-4853 (2013).
    26. Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7, (6), 1887-1899 (2014).
    27. Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. (2016).
    28. Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15, (1), (2016).
    29. Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165, (1), 57-66 (2014).
    30. Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110, (4), 791-800 (2000).
    31. Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88, (7), 773-784 (2008).
    32. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (46), 18708-18713 (2011).
    33. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11, (2), 125-140 (2012).
    34. Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (51), E5593-E5601 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

      Usage Statistics