Användning av RNA-sekvensering för att upptäcka Novel Splice varianter besläktade med drogmotstånd i * These authors contributed equally

JoVE Journal
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här beskriver vi ett protokoll som syftar till att undersöka effekten av avvikande splitsning på läkemedelsresistens i solida tumörer och hematologiska maligniteter. Till detta mål, analyserade vi transcriptomic profiler föräldra och resistenta in vitro-modeller genom RNA-punkter och etablerat en QRT-PCR-baserad metod för att validera kandidatgener.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Läkemedelsresistens är fortfarande ett stort problem i behandlingen av cancer för både hematologiska maligniteter och solida tumörer. Inneboende eller förvärvad resistens kan orsakas av en rad mekanismer, inklusive ökad eliminering läkemedel, minskad läkemedelsupptag, droginaktivering och förändringar av läkemedelsmål. De senaste uppgifterna visar att annat sätt än genom välkända genetiska (mutation, förstärkning) och epigenetiska (DNA hypermethylation, histon posttranslationell modifiering) ändringar, läkemedelsresistensmekanismer kan också regleras genom splits avvikelser. Detta är ett snabbt växande område som ska undersökas som förtjänar framtida uppmärksamhet för att planera mer effektiva behandlingsmetoder. Protokollet som beskrivs i detta dokument syftar till att undersöka effekten av avvikande splitsning på läkemedelsresistens i solida tumörer och hematologiska maligniteter. Till detta mål, analyserade vi transcriptomic profiler i flera in vitro-modeller genom RNA-punkter och fastställaed en QRT-PCR-baserad metod för att validera kandidatgener. Framför allt utvärderade vi differentiell splitsning av DDX5 och PKM transkript. Den avvikande splitsning detekteras av beräkningsverktyg MATS validerades i leukemiceller, vilket visar att olika DDX5 splitsvarianter uttrycks i föräldra vs. resistenta celler. I dessa celler, observerade vi också en högre PKM2 / PKM1-förhållande, vilket inte detekterades i Panc-1 gemcitabin-resistent motsvarighet jämfört med parentala Panc-1-celler, vilket tyder på en annan mekanism av läkemedelsresistens inducerad av gemcitabin exponering.

Introduction

Trots betydande framsteg inom cancerbehandling, motstånd av maligna celler för kemoterapi, antingen inneboende eller förvärvad vid långvarig läkemedelsexponering, är den främsta orsaken till behandlingssvikt i ett brett spektrum av leukemi och solida tumörer 1.

I syfte att avgränsa de mekanismer som ligger bakom drogmotstånd, in vitro cell line modeller utvecklas genom stegvis urval av cancerceller som är resistenta mot kemoterapeutiska medel. Detta förfarande efterliknar regimerna som används i kliniska och därför tillåter djupgående undersökning av relevanta resistensmekanismer. Resistenta celler som överlever behandlingen sedan skiljas från föräldra känsliga celler genom att använda cellviabiliteten / cytotoxicitetsanalyser 2. I läkemedelsresistens vitro profiler av primära celler har visat sig vara signifikant relaterade till kliniskt svar på kemoterapi 3.

Hög genomströmning cytotoxicity analyser utgör en lämplig metod för att bestämma läkemedelskänslighet in vitro. Häri, är livskraften hos cellerna utvärderas av exempelvis 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid - MTT-analys 4, vilket är baserat på metabolisk omvandling av vissa substrat (dvs., tetrazoliumsalter) till färgade produkter och därigenom återspegla den mitokondriella aktiviteten hos celler. Alternativt kan det cellulära proteininnehållet kvantifieras med hjälp av sulforodamin B (SRB) -analys 5. Här, är antalet livskraftiga celler som är proportionell mot den optiska densiteten (OD) mätt vid en lämplig våglängd i en spektrofotometer, utan behov av omfattande och tidskrävande cellräkningsförfaranden. Den tillväxtinhibering som orsakas av en viss kemoterapeutiskt läkemedel kan beräknas baserat på den OD av brunnarna i vilka cellerna behandlades med ett testmedel och jämfört med OD för obehandlade kontrollceller. En dos-responskurva är obtasökte genom plottning läkemedelskoncentrationer kontra procentsatser av livsdugliga celler i förhållande till kontrollceller. Slutligen kan läkemedelskänslighet rapporteras som den koncentration som resulterar i 50% av celltillväxthämning jämfört med obehandlade celler (IC50).

Mekanismerna bakom läkemedelsresistens omfattar många olika avvikelser, till exempel förändringar som påverkar genuttrycket av bestämningsfaktorer för läkemedelsaktivitet och cellmetabolism. Dessa molekylära lesioner, inklusive mutationer, avvikelser vid en transkriptions och posttranskriptionsnivå samt störd epigenetisk reglering påverkar ofta gener involverade antingen i läkemedelsmetabolism eller apoptos 6.

Alternativa pre-mRNA-splitsning och dess invecklade lagstiftning har nyligen fått stor uppmärksamhet som en ny enhet som kan diktera läkemedelsresistens hos cancerceller 7. Upp till 95% av humana gener är alternativt splitsad i normala celler med hjälp av dennahårt reglerad process som producerar många olika protein isoformer från samma gen. Alternativ splitsning är ofta avreglerades cancer och flera tumörer kännetecknas av förändrade splitsning av ett växande antal gener som är involverade i läkemedelsmetabolism (dvs deoxycytidinkinas, folylglutamatsyntetas eller multiresistens proteiner) 6,8. Dock är omfattande analys av splits profiler av läkemedelsresistenta celler plågsamt saknas. Därför är det viktigt att utveckla hög genomströmning metoder för alternativ splitsning analys. Detta skulle kunna bidra till att utveckla mer effektiva behandlingsmetoder.

Under det senaste decenniet har den snabba utvecklingen av nästa generations sekvensering (NGS) teknik berikat biomedicinsk forskning med nya insikter i de molekylära mekanismer som styr regleringen av genomet uttryck och deras roll i olika biologiska processer 9. RNA-sekvensering (RNA-punkter) är ett kraftfullt under ansökanav NGS inom transkriptomik. Det gör att en genomet hela profilering (både kvalitativt och kvantitativt) av uttrycksmönster tusentals gener samtidigt och är väl lämpad för karakterisering av nya kodnings mRNA liksom långa icke-kodande RNA, miRNA, siRNA och andra små RNA klasser (t.ex. snRNA och Pirna) 10,11.

RNA-Seq har många fördelar jämfört med tidigare teknik för transkriptom benämning (t.ex. Sanger-sekvensering och uttryck microarrays). Det är inte baserat på befintlig genom anteckning, har en enda nukleotid nivå på upplösning och har ett bredare dynamiskt omfång för uttrycksnivån uppskattning. I korthet, den grundläggande experimentella arbetsflödet av RNA-punkter experiment består av polyadenylerat transkript (mRNA) val och fragmentering, följt av omvandling till cDNA bibliotekskonstruktion och slutligen massivt parallell djup sekvensering 12,13. På grund av snabb droppe sequencing kostnader under de senaste åren, RNA-punkter successivt ersätta andra tekniker och betydande ansträngningar görs för att förbättra förberedelserna bibliotek protokoll. Till exempel, är det nu möjligt att behålla Strand Information om mRNA-transkript genom att markera den andra strängen cDNA med deoxiuridintrifosfat (dUTP) och före PCR-förstärkning, smälta den markerade strängen med uracil-DNA-glycosilase (UDG). Denna process förbättrar noggrannheten hos genen annotering och uppskattning av de expressionsnivåer 14,15.

Analys och tolkning av RNA-punkter data kräver komplexa och kraftfulla beräknings programpaket och bearbetning inom bioinformatiska rörledningar 16,17. Först läser den råa genomgår kvalitetskontroll genom att undanröja tekniska och biologiska artefakter och kasta (trimning) sekvenserna som inte når höga kvalitetskrav. Därefter läser för varje prov mappas till en referens genomet och indexerasi gen-nivå, exon-nivå, eller transkript-nivå, i syfte att bestämma överflödet av varje kategori. Beroende på användningsområde, är raffinerade uppgifter sedan beräknas genom statistiska modeller för identifiering av allelspecifik uttryck, alternativ splitsning, genfusioner och single nucleotide polymorphisms (SNP) 12. Slutligen kan differentialanalys på vald nivå (det vill säga, genuttryck eller alternativ splitsning) användas för att jämföra prov som erhållits under olika förhållanden.

Differentiell splitsning analysen beskrivs skillnaderna i splitsstället användning mellan två prover. Ett ökande antal av programvarupaket som ägnas åt detta ändamål finns baserade på olika statistiska modeller, uppträdanden och användargränssnitt 18. Bland dessa, MATS (multivariat analys av avskrift Skarvning) framstår som en fritt tillgänglig och exakt beräkningsverktyg baserat på en Bayesiansk statistisk ram och utformat för att upptäcka differential splitsningshändelser från antingen enkla eller parade end RNA-punkter data. Utgående från de inriktade (.bam) filer, kan MATS upptäcka alla större typer av alternativa splitsningar (exon hoppa, alternativ 3 'splitsstället, alternativ 5' splitsstället, ömsesidigt uteslutande exoner och intron behålla - även se Figur 1).

Först läser mjukvaru identifierar som stöder en viss skarv händelse, till exempel exon hoppa, och klassificerar dem i två typer. "Inclusion läser" (för den kanoniska skarv händelse) kartlägga inom den undersökta exon och spänner över korsningar mellan den specifika exon och de två uppströms och nedströms flankerande exon. "Skipping läser" (för den alternativa splitsningshändelse) spänna över föreningspunkten mellan de två flankerande exoner. Därefter MATS returnerar normaliserade inblandning för både kanoniska och alternativa händelser och jämför värden mellan prover eller villkor. I slutändan, beräknar det P-värde and falsk upptäckten hastighet (FDR) under antagande att skillnaden i varianten förhållande av en gen mellan två villkor överskrider ett givet användardefinierad tröskel för varje skarvnings händelse 19,34.

Efter differentiell splitsning analys i samband med RNA-punkter, är en omfattande experimentell validering motiverat för att identifiera sant positiva gen kandidater 18. Kvantitativ omvänd transkription-polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) är den vanligaste och optimal metod validering av kandidater som erhållits från RNA-Seq analys 20. Syftet med detta dokument är att ge en robust metod för att undersöka drogresistenta relaterade skarvning profiler i solida tumörer och hematologiska maligniteter. Vår strategi använder RNA-artiklar baserade transkriptom profilering av utvalda cellinje modeller av läkemedelsresistenta cancerformer i kombination med ett etablerat QRT-PCR-metod för validering av kandidatgener som är inblandade i läkemedelsresistens.

21,22 och metotrexat (MTX) -resistenta sublinje CEM / R30dm 23. Även om nuvarande terapier baserade på GC och MTX etablera klinisk nytta i ca 90% av fallen, representerar uppkomsten av GC-motstånd fortfarande ett olöst problem med en oklar molekylär mekanism. För att isolera GC-resistenta sub-kloner, CEM-WT-celler odlades i 1 | iM dexametason (Dex) under 2 till 3 veckor. MTX-resistenta underlinje CEM / R30dm utvecklades genom upprepad korttids (24 h) exponering av CEM-WT-celler till 30 iM MTX som en imitatör av kliniska protokoll. Intressant, denna cellinje visas också korsresistens mot Dex (opublicerade resultat) för vilken mekanismen inte är helt klarlagd.

Den fasta tumeller modell undersökts i denna studie är pankreas duktal adenokarcinom, ökänd för sin extraordinära refraktäritet för kemoterapi. För detta ändamål valde vi Panc-1-cellinjen och dess gemcitabin resistent subklon Panc-1R som erhållits genom kontinuerlig inkubering med 1 | iM av läkemedlet 24. Här beskriver vi en metod för att upptäcka nya mekanismer som ligger bakom in vitro läkemedelsresistens genom kombination av tre protokoll: kolorimetriska cytotoxicitetsanalyser för att bedöma läkemedelskänslighet i leukemiceller och cancerceller från solida tumörer, RNA-seq baserade rörledningen för att identifiera nya splitsvarianter relaterade till läkemedelskänslighet / resistens och RT-PCR och QRT-PCR-analys för att validera potentiella kandidater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Karaktärisering av läkemedelsresistens profiler genom cytotoxicitetsanalyser

  1. Leukemisk cellinje Culture
    1. Bibehålla den paren T-cell-ALL-cellinjen CCRF-CEM (CEM-WT) samt dess läkemedelsresistenta sublinjer, inklusive CEM / R30dm, CEM-R5 och CEM-C3, i 25 cm 2 i 10 ml RPMI-1640-medium innehållande 2,3 | iM folsyra kompletterat med 10% fetalt kalvserum och 100 enheter / ml penicillin G och 100 | ig / ml streptomycin.
    2. Odla cellerna i en fuktad atmosfär vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
    3. Låt celltillväxt koncentrationer mellan 2-3 x 10 6 celler / ml.
    4. Split cellerna två gånger i veckan vid en initial koncentration av 0,3 x 10 6 celler / ml (t ex om cellkoncentrationen är 3 x 10 6 celler / ml, överföring 1 ml cellsuspension i en ny kolv innehållande 9 ml färskt medium). Kasta kulturen efter 20 passager i följd.
    Pankreatiskt karcinomcellinje Culture
    OBS: Bibehåll humant pankreatiskt karcinom cellinjen Panc-1 i 75 cm 2 odlingskolvar i 10 ml DMEM-medium med hög glukoshalt och L-glutamin utökat med 10% fetalt bovint serum och 100 enheter / ml penicillin G och 100 | ig / ml streptomycin . Den läkemedelsresistenta varianten, Panc-1 R, odlas i samma odlingsmedium innehållande 1 | iM gemcitabin upplösta i sterilt vatten. Mer information finns i 24.
    1. Odla cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator.
    2. Dela upp cellerna var 2 - 3 dygn vid ett förhållande av 1: 5 när cellerna når sammanflytning av ca 90%.
    3. Att dela upp cellerna, tvätta två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS), tillsätt 1 ml trypsin / EDTA per 75 cm 2 kulturen kolv och inkubera vid 37 ° C under 3 min.
    4. Lägga 9 ml medium och skörda lösgjorda celler i ett 15 ml rör. Seed 2 ml cellsuspension i en ny kolv containing 8 ml medium. Kasta kulturen efter 20 passager i följd.
  2. MTT-analys för leukemiceller
    1. Förbered i förväg MTT-lösning: lös 500 mg MTT formazan i 10 ml PBS och rör (skyddad från ljus) med en magnetisk omrörare under ca en timme. Sterilisera lösningen med en 0,22 pm filter. OBS: Lösningen kan lagras i 10 ml alikvoter vid -20 ° C. Skyddas mot direkt ljus efter upptining.
    2. Förbereda i förväg den surgjorda isopropanol: tillsätt 50 ml 2 M HCl till 2,5 L isopropanol. OBS: Förvara lösningen under minst en månad vid rumstemperatur före användning. Om isopropanol inte är korrekt surgörs, kan det bilda fällningar med mediet och äventyra spektrofotometrisk avläsning.
    3. Förbered en separat 96-väl plan botten "Dag 0" (kontroll) platta för att säkerställa mer korrekt uppskattning av tillväxthämning: ägna tre till sex brunnar per cellinje, tillsätt 30 pl tillväxtmedium och 120 pl cellsuspension (8000 celler) per varje brunn och 150 | il tillväxtmedium till brunnar motsvarande ämnen (inga celler). Fortsätt från steg 1.3.9 till steg 1.3.13 i detta avsnitt för att mäta den optiska densiteten (OD). OBS! Mer information finns i fyra.
    4. Bered en 96-brunnars flatbottnad experimentell platta: ägna 30 brunnar till läkemedelskoncentrationer (10 koncentrationer, var och en i triplikat), 10 brunnar med kontrollceller och 10 brunnar för att styra medium utan celler (ämnena) och förbereda en läkemedelsutspädningsområde av dexametason ( Dex) med hjälp av dimetyl-sulfoxid som lösningsmedel.
      OBS: För CEM-WT-celler i Dex utspädningsområde är mellan 2 iM och 0,97 nM. För CEM / R30dm, CEM-R5 och CEM-C3 cellerna Dex utspädningsområde är mellan 640 pM och 0,33 nM.
    5. Tillsätt 30 | il från varje Dex spädning i en lämplig brunn i 96-brunnar. Se till att inkludera varje koncentration vid tredubbel.
    6. Tillsätt 30 pl odlingsmedium till väls motsvarande kontrollceller och 150 pl odlingsmedium till brunnar motsvarande ämnen.
    7. Harvest exponentiellt växande celler och resuspendera vid deras optimala sådd koncentration.
      NOTERA: För att bestämma optimala startcellkoncentrationer, rekommenderas det att bedöma tillväxtprofilen för varje cellinje cellinje i ett 96-brunnsplatta genom ympning celler vid flera koncentrationer och mäta den dagligen under minst 4 dagar. Välj en sådd koncentration som förhindrar överväxt av celler efter 72 timmar, eftersom detta kommer att påverka experimentet genom att mätta de OD-värden. För CEM-WT, CEM-C5 och CEM-R5 den optimala sådd koncentrationen är 8000 celler / brunn, medan CEM / R30dm är 5000 celler / brunn.
    8. Lägg 120 | il cellsuspension till varje brunn innehållande antingen läkemedelslösningen eller tillväxtmediet (brunnar som motsvarar kontrollceller). Fylla de tomma yttre brunnarna i plattan med 150 | j, l PBS för att säkerställa god luftfuktigheten i plattan och inkubera the plattor för 72 timmar vid 37 ° C med 5% CO2 i en cellodlingsinkubator.
    9. Tillsätt 15 pl av MTT-lösning till varje brunn och skaka plattan under 5 min med en plattskakanordning upp till ett maximum av 900 skakningar / min.
    10. Placera plattorna tillbaka vid 37 ° C med 5% CO2 i en cellodlingsinkubator och inkubera under ytterligare 4-6 h.
    11. Tillsätt 150 | il av den surgjorda isopropanol till varje brunn och blanda väl med en flerkanalspipett att grundligt resuspendera alla formazankristaller. Börja med blankbrunnarna och se till att skölja de tips väl innan man går vidare till en annan rad av plattan.
    12. Inkubera plattan vid rumstemperatur (RT) under 10 min.
    13. Med hjälp av en mikroplattläsare, bestämma OD vid 540 och 720 nm för att säkerställa en korrekt mätning genom att korrigera för bakgrunds OD. Spara sedan data i ett kalkylblad och analysera den 4.
  3. SRB-analys för pankreaskarcinom Celler
    1. Upplösa SRB-reagens i 1% ättiksyra vid slutlig koncentration av 0,4% (vikt / volym).
    2. Lös upp triklorättiksyra (TCA) i ultrarent vatten vid slutkoncentration av 50% (vikt / volym).
    3. Lös Tris (hydroximetyl) -aminometan i ultrarent vatten vid slutkoncentration av 10 mM.
    4. Förbered en separat 96-väl plan botten "Dag 0" kontrollplatta för att säkerställa en mer exakt uppskattning av tillväxthämning: utsäde 6 brunnar med celler som växer i exponentiell fas i 100 pl medium vid lämplig sådd koncentration och tillsätt 100 l endast medium till brunnarna som motsvarar ämnen. Inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2 för att säkerställa korrekt vidhäftning av cellerna till plattan. Lägg sedan till 100 l medium till alla brunnarna och vidare till steg 1.4.8 - 1.4.16 i detta avsnitt.
    5. Bered en 96-brunnars flatbottnad experimentell platta: fröceller växer i exponentiell fas i triplikat i 96 brunnar flatbottnade plattor vid lämplig densitet i 100 pl migDIUM genom användning av en flerkanalig pipett.
      NOTERA: För att bestämma optimala startcellkoncentrationer, rekommenderas det att bedöma tillväxtprofilen för varje cellinje cellinje i ett 96-brunnsplatta genom ympning celler vid flera koncentrationer och mäta den dagligen under minst 4 dagar. Välj en sådd koncentration som förhindrar överväxt av celler efter 72 timmar, eftersom detta kommer att påverka experimentet genom att mätta de OD-värden. För Panc-1 och Panc-1 R-celler, är den optimala sådd koncentrationen 8000 celler / brunn.
    6. Tillsätt 100 l medium till medel endast brunnar och inkubera över natten vid 37 ° C med 5% CO2 för att säkerställa korrekt vidhäftning av cellerna till plattan.
    7. Förbered en läkemedelsspäd utbud av gemcitabin mellan 1 um och 10 nM för Panc-1 och 1 mM och 100 nM för Panc-1R celler. Tillsätt 100 | il från varje utspädning i en lämplig brunn i 96-brunnsplatta med hjälp av en flerkanalig pipett. Se till att ha varje koncentration i tre exemplar. Dessutom,tillsätt 100 l medium till de enbart medel brunnar och kontrollcellerna. Inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 under 72 timmar.
    8. Tillsätt 25 ^ il kall TCA-lösning till brunnarna med hjälp av en flerkanalig pipett och inkubera plattorna under minst 60 min vid 4 ° C för att fälla ut och fixera proteinerna i botten av brunnarna.
    9. Töm plattan genom avlägsnande av mediet och torr kortvarigt på en vävnad.
    10. Tvätta 5 gånger med kranvatten, töm sedan plattan och låt torka vid rumstemperatur.
    11. Tillsätt 50 pl SRB-lösning per brunn med användning av en upprepad pipett och fläck under 15 min vid rumstemperatur.
    12. Töm plattan genom att ta bort SRB stain.
    13. Tvätta 4 gånger med 1% ättiksyra, töm sedan plattan och låt den torka vid rumstemperatur.
    14. Lägg 150 | il Tris-lösning per brunn med hjälp av en flerkanalig pipett och blanda i 3 min på en plattskakanordning upp till ett maximum av 900 skakningar / min.
    15. Läs av den optiska densiteten vid 540 nm (eller 492 nm, om than OD-värden är för höga).
    16. Analysera data.
  4. Data Analysis för MTT och SRB analyser
    1. Beräkna OD-värdena av celler vid "Dag 0" med följande formel: OD Dag 0 = OD kontrollceller - Genomsnittliga OD tomma brunnar
    2. Beräkna procentandelen överlevande celler för varje läkemedelskoncentration i enlighet med följande formel:% Behandlade celler = Average [OD behandlade celler - Medel OD tomma brunnar - OD Dag 0] / [OD kontrollceller - Medel OD tomma brunnar - OD Day0] * 100
    3. Plotta dosresponskurvan (läkemedelskoncentration vs. tillväxthämning i%).
    4. Beräkna koncentrationen av läkemedlet som hämmar tillväxten av celler med 50% (IC50) med användning av dos-responskurvan.

2. RNA-isolering och bibliotek Förberedelse för RNA-sekvensering

  1. prov Collektion och RNA-isolering
    1. För CEM-celler: skörda 10 6 celler direkt från odlingsmediet.
    2. För Panc-1 och Panc-1R: ta bort mediet, tvätta cellerna två gånger med PBS och lossa genom tillsats av trypsin-EDTA och inkubering vid 37 ° C under 3 min. Lägg odlingsmedium och skörda 10 6 celler.
    3. Centrifugera ner proverna vid 300 xg under 3 min, avlägsna supernatanten och extrahera totala mRNA med användning av kommersiellt tillgängliga kisel membranspinnkolonner, genom att följa manufacturer`s protokoll.
    4. Bestämma koncentrationen och renheten av totalt RNA genom användning av en UV-Vis spektrofotometer.
      OBS: RNA anses av hög renhet om 260 nm / 280 nm absorbans kvoten är större än 1,8. Proverna kan förvaras vid - 80 ° C.
    5. Bedöma total RNA integritet genom elektrofores av 200 ng av provet på 1% agarosgel färgad med etidiumbromid.
      OBS: detektering av två intakta band som motsvarar däggdjurs-28S och 18S rRNA vid approximativt2 kb och 1 kb i storlek är ett tecken på god total RNA integritet.
  2. Sekvense Library Framställning
    1. Använd 2 pg av total mRNA för varje prov. Följ mRNA bibliotek förberedelse protokollet enligt tillverkarens anvisningar.
    2. Bestämma kvalitet och koncentration av varje bibliotek genom att använda ett Bioanalyzer system. Pool biblioteken i ett enda prov upp till en slutkoncentration av 10 nmol / L och mäta den med Bioanalyzer.
    3. Använd hög genomströmning sekvenseringssystem med Single Läs 100 bp läge.
      OBS: Läs längd> 80 bp är nödvändig för att identifiera transkriptions isoformer.

3. Detektion av differentiell splitsning från sekvensering Läser

  1. Anpassning av Läser att Referens Genome och kvalitetskontroll
    1. Sammanställa en gen anteckning (.gtf fil) från NCBI refGene tabell med UCSC bord webbläsare (25,963 gener).
    2. Utföraanteckning medvetna gapped anpassningen av sekvensering läser referens genomet (GRCh37) med hjälp av STAR.
    3. Sortera och indexera de resulterande inriktnings filer med Picard verktyg.
    4. Utföra post-mapping kvalitetskontroll genom att använda RSeQC och samtools.
  2. Differentiell splitsning Detection mellan urvalsgrupper
    1. Installera Python och motsvarande versioner av numpy och SciPy. Ladda ner och installera samtools. Ladda ner och installera bowtie och tophat,
    2. Tillsätt Python, bowtie, tophat och samtools kataloger till $ PATH-miljövariabel. Ladda ner färdiga bowtie index (hg19). Hämta rMATS version 3.0.9.
      OBS: Ytterligare detaljer om rMATS är anordnade i 19 och 34.
    3. Identifiera alternativa splitsningar genom att jämföra varje Dex-resistent cellinje till CEM-WT och Panc-1 till Panc-1R i separata MATS löper enligt figur 5A.
    4. För att detektera differentialsplitsningshändelser från previously linje sekvense läser (.bam filer), köra MATS med hjälp av kommandon från figur 5B för CEM-WT kontra CEM- C3, CEM-WT kontra CEM-R5, CEM-WT kontra CEM / R30dm och Panc1 att Panc- 1R jämförelser.
      OBS: MATS kommer att skapa en output mapp med två .txt-filer med resultat per typ av skarvning händelse analyseras (SE - exon hoppa, A5SS - alternativ 5 'splitsningsställe, A3SS - alternativ 3' splitsstället, MEX - ömsesidigt uteslutande exoner och RI - intron retention): en fil som innehåller resultat baserade på enbart kopplings räknas och en andra fil med resultat baserade på kopplings räknar och läser på mål. Dessutom är ytterligare en .txt-fil med ett resultat översikt genereras i samma mapp.
    5. För SE, A5SS, A3SS och RI import till kalkylark de .txt filer baserat på kopplings räknas och läser på målet. För MEX importera .txt filer baserat på endast kopplings räknas.
      OBS: MATS utdatafilen sorteras efter stigande P-värden och innehåller flera parametrar: gen ID, gen symbol, Kromosom och strängläge, iska koordinaterna för de alternativt splitsade fragmenten, räknar liksom längden på integration och hoppa former för både analyserade prover, längden på integration och hoppa blankett som används för normalisering, p-värde, falskt upptäckt hastighet (FDR ), inblandning för varje prov baserat på normaliserade räknas och differential integration poäng (genomsnitt (IncLevel1) - genomsnittet (IncLevel2)).
    6. Välj statistiskt signifikanta kandidatgener med en FDR <10% för ytterligare validering (t.ex. DDX5 och PKM2).
    7. Visualisera alternativa splitsningshändelser med integrativ Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), såsom rapporterats i Fig 5.

4. Validering av resultaten av RT-PCR och QRT-PCR-analyser

  1. primer Design
    OBS: För att ge en tillförlitlig validering av resultat som erhållits med hjälp av bioinformatisk rörledningen mRNA transcripts från alternativ splitsningshändelser amplifieras genom användning av RT-PCR och visualiseras genom agarosgelelektrofores av PCR-produkterna. Cyanin grönt färgämne såsom SYBR green QRT-PCR-analys används för att kvantifiera specifika splitsningsvarianter i förhållande till en housekeeping-gen. Figur 7 visar den strategi som tillämpas för att visualisera exon 12 hoppa händelse av DDX5 genen och att kvantifiera den ömsesidigt uteslutande exon 9 och exon 10 av PKM-genen.
    1. För RT-PCR-analys, design primerpar som anlöper till konstitutiva exoner (exon 10 och exon 13) belägna uppströms och nedströms de alternativa splitsningsställen (Figur 7A).
      OBS! Amplicon storlek ska omfatta mellan 100 och 800 bp för att säkerställa en tydlig åtskillnad mellan de förutsagda PCR-produkterna på agarosgel. Glödgningstemperaturen av primrarna bör vara mellan 55 och 65 ° C, och GC-halten bör inte överstiga 60%.
    2. Cyanin grönt analys (Figur 7B). Kontrollera sekvenshomologi av de två ömsesidigt uteslutande exoner och konstruktion två primerpar vilka var specifikt och uteslutande upptäcker bara en av de två splitsvarianter.
      OBS! PKM, parar den omvända primern exon 11 gemensam för båda varianterna, medan de främre primers är variant specifika och glödga exon 9 (PKM1) eller exon 10 (PKM2).
    3. För att detektera DDX5 fullängdsgenen, glödga den omvända primern inom det överhoppade exonet (exon 12).
      OBS: För specifik detektion av DDX5 ΔEx12 variant, spänner den omvända primern exon11 / exon13 gränsen. Använd samma framåt primer som hybridiserar till konstitutiv exon 10 för båda reaktionerna.
      OBS! Amplicon storlek ska vara mellan 80 och 200 bp.
  • Första sträng cDNA-syntes
    1. Inrättat omvänd transkription av 1 | ig av det isolerade RNA: t till cDNA genom att använda 200 U / ^ l av Moloney murint leukemivirus (M-MLV) reverse transkriptas i dess reaktionsbuffert späddes 1: 5 med sterilt vatten. Lägg DTT ett iM, 0,05 mikrogram av slumpmässiga hexamerer, deoxinukleotid mix (dNTP) 1 mM, och 40 U / ul av ribonukleasinhibitor.
    2. Vortex en kort stund och inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C under 2 h.
    3. Inkubera reaktionsblandningen vid 70 ° C under 5 min för att inaktivera det omvända transkriptaset, överföra blandningen på is och centrifugera ner genom användning av en mikrocentrifug. Prover kan användas omedelbart eller lagras vid - 20 ° C.
  • RT-PCR-reaktionen och agarosgel
    1. Sätt upp PCR-reaktion i ett PCR-rör för varje prov genom att blanda 12,5 pl av 2x koncentrerad PCR-mastermix, 1,25 pl av 10 pM framåtprimer och samma belopp för den omvända primern upp till en slutlig volym av 25 | j, l med sterilt vatten.
    2. Tillsätt 1 pl av cDNA till mixen och placera rören i termocykler. Kör programmet enligt följande: initial denaturering: 95 ° C under 2 min.Upprepa följande steg i 35 cykler: denaturering vid 95 ° C under 25 sek; hybridisering vid 52 ° C under 35 sek; förlängning vid 72 ° C under 1 min. Ställa slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 min.
    3. Framställ 1% agarosgel genom att lösa 1 g agaros i 100 ml 1x TBE-buffert. Tillsätt 2,5 | il etidiumbromid till lösningen. VARNING: etidiumbromid är cancerframkallande, hanteras varsamt genom att använda en kemisk dragskåp.
    4. Ladda proverna och kör gelén i 1x TBE-buffert vid 100 V i ungefär 30 min i en elektroforessystem.
    5. Avslöja gelen med en digital UV kamera och spara bilden.
  • QRT-PCR och dataanalys
    1. Ställa in Cyanine grön PCR-reaktionen för varje prov genom att blanda 12,5 pl av 2x grön PCR Mastermix, 2 | il av 5 | iM framåtriktad primer och samma belopp för den omvända primern upp till en slutlig volym av 15 | j, l med sterilt vatten i ett PCR-rör . Förbered en blandning för varje specifik skarvvariant som skall detekteras (PKM1, PKM2, DDX5 full längd, DDX5 ΔEx12) och housekeeping-genen (GUS).
    2. Ladda mastermix på en vit 96-brunnar och förbereda dubbletter per varje prov.
    3. Späd cDNA 10x i vatten, tillsätt 5 il till varje blandning och placera plattan i termo. Kör programmet enligt följande: initial denaturering: 95 ° C under 5 min. Upprepa följande steg i 45 cykler: denaturering vid 95 ° C under 10 sek; hybridisering vid 58 ° C (för DDX5 och DDX5 ΔEx12 blandar) eller 60 ° C (för PKM1 och PKM2 blandar) för 20 sek. Ställa slutlig förlängning vid 72 ° C under 20 sek. Ställa smältkurva genom att applicera en gradient från 65 till 97 ° C.
    4. För att bedöma specificiteten av primeruppsättningar till deras mål, kontrollera smältkurvor och kontrollera att en enda topp bildas för varje primer set.
    5. Beräkna andraderivatan värden på förstärkningskurvor och exportera cykeltröskelvärdena (CT).
    6. Calculate de relativa expressionsnivåerna (REL) av mRNA splitsvarianter jämfört med den GUS-hushållning (referens) genen i varje prov med hjälp av "delta Ct (ΔCt)" -metoden. Formeln är: REL = 2 - ΔCt, där ΔCt = Ct mål splitsningsvariant - Ct referens gen
    7. För att kvantifiera den relativa förekomsten av splitsvarianter, beräkna REL förhållandet med hjälp av formeln: Ratio REL förhållande = REL splitsningsvariant 1 / REL splitsningsvariant 2.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    De cytotoxicitetsanalyser beskrivs i protokollet tillhandahåller en tillförlitlig och robust metod för att bedöma motståndet hos cancerceller för kemoterapeutiska medel in vitro. Med hjälp av MTT-analysen, var känsligheten för Dex bestämdes i fyra T-ALL-cellinjer, inklusive Dex-känsliga paren CEM-WT-celler och tre Dex-resistenta sublinjer: CEM / R30dm, CEM-R5 och CEM-C3. Två olika koncentrationsområden måste användas på grund av den stora skillnaden i känslighet mellan CEM-WT (2 uM - 0,97 nM) och de Dex resistenta cellinjerna (640 ^ M - 0,33 nM). MTT-analysen visade tydligt Dex motstånd i CEM / R30dm (IC50 = 456 ± 49 pM), CEM-R5 (IC50> 640 ^ M) och CEM-C3 (IC50 = 386 ± 98 pM) jämfört med den CEM- WT-celler (IC50 = 0,028 ± 0,003 ^ M). Likaså SRB-analysen visade hög gemcitabin motstånd i Panc-1R cellinje (IC 50 = 3.16 ± 0,01 | iM) jämfört med de parentala Panc-1-celler (IC50 = 0,077 ± 0,03 ^ M) som visade i figur 2.

    Efter bekräftelse av läkemedelsresistens i alla anses cellinjer, nästa fortsatte vi till mRNA-isolering, bibliotek förberedelse och RNA-sekvensering. Extraktion av totalt mRNA genom användning av silika-membranspinnkolonner är det föredragna valet jämfört med andra metoder, eftersom den undviker fenol och proteinkontaminering och ger hög renhet av provet med 260 nm / 280 nm absorbansförhållandet väl över 1,8. Detta är en avgörande förutsättning för komplexa applikationer nedströms såsom djup sekvensering. Den metod som används för att kontrollera integriteten av RNA-prover genom agaros 1% är särskilt lämplig för nyligen isolerade celler (Figur 3). Eftersom syftet med detta protokoll är att upptäcka alternativa splitsvarianter avvikande uttryckta i läkemedelsresistenta cellinjer, väljer vi positiva selection polyadenylerat mRNA för sekvense biblioteket förberedelse genom att använda strandsatta mRNA kit. Elektroferogram av enkel-och poolade biblioteken visas i Figur 4, som visar en genomsnittlig fragmentstorlek av ca 300 bp, överensstämmande med sekvense systemkrav. De beredda biblioteken sekvenserades sedan med hjälp av ett chip med Single Läs 100 bp läge. Valet av sekvensering läser av 100 bp är nödvändig för att upptäcka alternativ splitsning genom nedströms bioinformatiska rörledningar.

    Efter inledande processteg och kvalitetskontroll, läser den rena anpassas till den mänskliga genomet (hg19) underkastades differentiell splitsning analys med användning av MATS. I denna analys har vi gjort jämförelser mellan läkemedlet känsliga modercellinjen och var och en av dess drog resistenta sublinjer separat (dvs., CEM WT vs. CEM / R30dm, CEM WT vs. CEM-C3, etc). MATS bygger på en flexibel och noggrann statistisk modellanvändas för att detektera differentiell splitsning mellan proven. Genom att använda standardanalysmöjligheter och ett FDR värde <10% som en cut-off (visas i figur 5B), kunde vi identifiera 38 ± 12 betydande differentiellt splitsade gener kandidater per jämförelse beställts av typ av alternativ splits händelse, med flest träffar klassificeras som exon skipping. Figur 6 illustrerar en typisk analys utgång för jämförelse Panc-1 vs. Panc-1R.

    Vi fokuserade vidare vår studie på två vanligaste typerna av alternativa splitsningar: exon Hopprep och ömsesidigt uteslutande exon händelser med en representativ kandidat per kategori som beskrivs nedan. DDX5 (DEAD-box helikas 5) har upptäckts av MATS analys som statistiskt signifikant i jämförelse CEM-WT kontra CEM-C3 och CEM-R5, men inte signifikant i jämförelse CEM-WT kontra CEM / R30dm. Med tanke på dess förmodade roll i leukemi 25,26, vivälja denna kandidat för ytterligare validering. Det rekommenderas starkt att visualisera RNA-punkter data i ett genom webbläsarliknande verktyg. IGV tillhandahåller en mångsidig och användarvänligt gränssnitt för detta ändamål, såsom visas i figur 7 för kandidatgenen DDX5. PKM (pyruvatkinas muskel isozymet) är en statistiskt säkerställd ömsesidigt uteslutande exon händelse i jämförelse CEM-WT kontra alla Dex resistenta sublinjer, men inte i jämförelsen Panc-1 vs Panc-1R. Med tanke på betydelsen av detta enzym i fast tumör metabolismen 27,28 och den framväxande roll cellernas ämnesomsättning i glukokortikoid resistens i T-ALL 29, väljer vi denna kandidat för ytterligare validering med hjälp av RT-PCR.

    Primer design måste genomföras med stor försiktighet för att förstärka rätt amplikon, särskilt när primers glödga exon-exon gränser (i fallet med den omvända primern upptäcka DDX5 ΔEx12 variant) eller när thej glödga till ömsesidigt uteslutande exoner med hög sekvenshomologi (exon 9 och exon 10 av PKM). Figur 8 visar den primer designstrategi, medan fig 9 visar resultaten av en RT-PCR för DDX5 kandidatgen. DDX5 ΔEx12 detekteras i provet CEM-WT och CEM / R30dm men inte i CEM-C3 och CEM-R5, vilket bekräftar MATS data i en kvalitativ mode. Cyanin grönt QRT-PCR-analys kvantifierar exakt de mRNA-expressionsnivåer av de DDX5 och PKM splitsningsvarianter, såsom visas i figur 10 och figur 11, respektive.

    Figur 1
    Figur 1: Schematisk representation av alternativa splitsningshändelser. Schematisk representation av de möjliga mönstren för alternativ splitsning av en gen. Lådor är diskreta exoner som kan oberoende inkluderas eller exkluderas från mRNA avskrift. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2: Resultat av cytotoxicitetsanalyser. (A) MTT-analys för leukemicellinjer visar höga nivåer av dexametason motstånd i CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC 50> 640 ^ M) och CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 pM ) jämfört med den parentala CEM-WT (IC50 = 0,028 ± 0,003 ^ M). (B) SRB analyser för pankreatisk karcinoma cellinjer avslöjar höga nivåer av gemcitabin motstånd i Panc-1R (IC 50 = 3,16 ± 0,01 pM) jämfört med den parentala Panc-1 (IC50 = 77,22 ± 2,76 nM). Graferna rapporterar medelcelltillväxt% ± SEM för tre independent experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3: RNA kvalitetsbedömning användning av en agarosgel. Två hundra ng av total-mRNA kördes på 1% agarosgel färgad med etidiumbromid. Närvaron av intakta band motsvarande ribosomalt RNA (rRNA) arter 18S och 28S och frånvaron av utstryk vid lägre molekylvikter är tecken på god kvalitet RNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4: <strong> Bioanalyzer Spår av sekvense bibliotek. (A) elektroferogram av sekvenseringsbibliotek visar toppar vid ungefär 300 bp, vilket är ett tecken på god kvalitet. Prov 1-6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 och Panc-1R. (B) elektroferogram över de sammanslagna proven (FU, Fluorescence Units).

    figur 5
    Figur 5: Detektering av differentiell splitsning med MATS. (A) Grupp jämförelser och (B) skript som används för att köra MATS. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 6
    Figur 6: MATS utgångslista. Figuren visar en typisk produktion av MATS analys i ett program med kalkylblad: här redovisas de differentiellt splitsade kandidater i jämförelse Panc-1 vs Panc-1R för exon hoppa händelser (FDR <10%). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 7
    Figur 7: Visualisering av differentiell splitsning av DDX5 kandidatgen genom IGV Genome Browser. Filer med inriktade läser (.bam) motsvarande leukemiceller har överförts på IGV genomet webbläsare och visualiseras med hjälp av Sashimi tomter (minimum junction räknas value = 10 för att visualisera viktiga splitsningar). Skarvkopplings räknar representeras av anslutande linjer ochen siffra som motsvarar RNA-artiklar läser spänner exonerna. CEM-WT och CEM / R30dm visar hoppa räknas spänner exon 11 exon 13 jämfört med CEM-C3 och CEM-R5 som inte visar någon exon 12 hoppa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 8
    Figur 8: Primer Design för RT-PCR och Cyanine Grön QRT-PCR. (A) RT-PCR: primerpar upptäcka differentiell splitsning av DDX5 glödgning till konstitutiva exoner (exon 10 och exon 13) belägna uppströms och nedströms från alternativt splitsade exoner. (B) QRT-PCR-analys: för den relativa kvantifiering av transkript till följd av exon hoppa händelser jämfört med kanoniska transkript, den omvända primern hybridiserar antingen inom hoppade exon (alternativ variant) ellertill exon11 / exon13 gränsen (canonical variant) av DDX5 genen. För kvantifiering av ömsesidigt exklusiva exoner, hybridiseras den omvända primern exon 11 gemensam för båda isoformer, medan den framåtriktade primern glödgningen antingen exon 9 (PKM1) eller exon 10 (PKM2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 9
    Figur 9: RT-PCR-validering av DDX5 differentiell splitsning. Den 1% agarosgel visar differentiell splitsning av DDX5 genen i leukemiceller. Fragmentet motsvarande DDX5 fullängds amplikon (650 bp) förstärks i alla prover medan DDX5 ΔEx12 (430 bp) variant förstärks i CEM-WT och CEM / R30dm prover och storlek motsvarar Exon 12 hoppa. Detta är inte upptäcks i CEM-C3 och CEM-R5-celler, som avskräckabryts av MATS analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 10
    Figur 10: mRNA-expressionsnivåer av DDX5 splitsvarianter i CEM-celler. (A) QRT-PCR-analys. Genomsnittliga relativa expressionsnivåerna och standardfel av medelvärdet (REL ± SEM) av två oberoende experiment. (B) Förhållande REL (± SEM) av splitsvarianter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 11
    Figur 11: mRNA-expressionsnivås of PKM splitsvarianter i CEM och Panc-1 celler. (A) QRT-PCR-analys. Genomsnittliga relativa expressionsnivåerna och standardfel av medelvärdet (REL ± SEM) av två oberoende experiment och förhållandet av REL av splitsvarianter för CEM-celler. (B) QRT-PCR-analys. Medelvärde REL ± SEM av två oberoende experiment och förhållandet av REL (± SEM) av de splitsningsvarianter för Panc-1-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Här beskriver vi en ny metod som kombinerar väletablerade cytotoxicitet screeningstekniker och kraftfull NGS-baserade transcriptomic analyser för att identifiera differentialsplitsningar i förhållande till läkemedelsresistens. Spektrofotometriska analyser är praktiska och robusta hög genomströmning metoder för att bedöma läkemedelskänslighet i in vitro-modeller cancer och representerar det första valet för många laboratorier som utför cytotoxicitet visningar. Felsökning samt möjliga variationer för denna metod var utförligt beskriven på annat håll 4,5.

    Hög genomströmning genomanalyser som för närvarande används för att undersöka läkemedelsresistensmekanismer i huvudsak beroende av SNP upptäckt och differentiell uttrycks uppskattning av gener associerade med en viss läkemedelsresistent fenotyp. I denna studie beskriver vi användandet av RNA-sekvenseringsmetoder, tillsammans med robusta bioinformatik rörledningar för exakt annotering av mRNA-transkript och detekteringen av differential splitsning. En särskilt viktig egenskap hos den beskrivna protokollet är förmågan att identifiera nya splitsvarianter mellan två provgrupper med distinkta drogkänslighetsprofiler. En av de viktigaste stegen för en noggrann och objektiv analys är isoleringen av RNA, som måste ha hög renhet och integritet.

    MATS är programvaran vi välja mellan en rad liknande bioinformatikverktyg som finns (t.ex. Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice och Skarvning kompass) för detektion av alternativ splitsning 18. De viktigaste viktigaste funktionerna som gör det det bästa alternativet är dess överlägsna precision och noggrannhet samt möjligheten att identifiera nya händelser. MATS genererar två typer av produktion innehåller differentiell splitsning analys: den första är baserad enbart på exon kopplingsvärden och den andra är baserad på kopplings räknas liksom läser på mål. Medan den senare är att föredra för att detektera exon hoppa händelser, är det rekommenderat attAnvänd det första alternativet för analys av ömsesidigt exklusiva exoner som denna metod minskar antalet falska positiva kandidater för denna typ av skarvning förändring.

    Dessutom för analyser med fokus på intron retention, 3 'och 5' splitsstället alternativa händelser, bör en .gtf fil med kommenterade introner. I slutändan, i syfte att minska den biologiska och tekniska variationen inom urvalsgrupper och säkerställa höga sant positiva värden, det rekommenderas starkt att sekvens åtminstone tre replikat 34. Valet av differentiellt splitsade gener kandidater baserade på MATS utsignal kombinerades med en valideringssteg med användning av RT-PCR. Detta är av avgörande betydelse för valet av sant positiva varianter bland en lång lista med statistiskt signifikanta kandidater. Den viktigaste faktorn för en noggrann validering är utformningen av oligonukleotider och optimering av PCR-reaktioner enligt molekylärbiologiska standarder. särskild omsorgbör tas vid utformningen av primers som spänner över exon-exon korsningar och ytterligare valideringssteg, såsom sekvensering av amplikoner av Sånger-metoden, är motiverat för att bekräfta deras specificitet.

    Differential skarvning av DDX5 och PKM transkript detekteras av MATS representerar två exempel på en avvikande splitsning i samband med läkemedelsresistens. DDX5 ΔEx12 var inte uttrycktes i de GC-resistenta cellinjer (CEM-C3 och R5), som har valts ut efter långvarig Dex-exponering. DDX5 ΔEx12 uttrycktes i den parentala cellinjen men också i subklon CEM / R30dm, som valdes ut för resistens mot det kemoterapeutiska medlet MTX snarare än Dex. I cancerceller, var PKM2 högt uttryckt jämfört med dess splitsningsvariant PKM1, men förhållandet PKM2 / PKM1 var högre i Dex-resistenta celler, såsom föreslås av NGS resultat. Detta observerades inte för Panc-1 prov jämfört med dess gemcitabin resistenta motsvarighet och, faktiskt, denna kandidat gen var inte blandde statistiskt signifikanta händelser i MATS analys. Detta kan återspegla de olika celltyp och mekanismen för läkemedelsresistens inducerad av gemcitabin exponering.

    Sammanfattningsvis utgör detta protokoll en lämplig metod för upptäckten av splitsvarianter som kan ligga bakom läkemedelsresistens och kan appliceras på antingen leukemiceller 30 eller fasta tumörceller 31. En tydlig begränsning är att tumörcellinjer fånga endast en liten del av cancer heterogenitet. Dessutom har de flesta cellinjer upprätthållits under många år i monoskikt i tillväxtfrämjande medium. Dessa förhållanden påverkar de cellulära egenskaper, vilket resulterar i valet av subpopulationer som skiljer sig dramatiskt från cellerna i primära tumörer som de härrör. Men många av de gener som är involverade i drogmotstånd är också involverade i andra funktioner centrala cell, såsom celltillväxt och apoptos som kan påverkas av en långsiktig culturin g i plast. Därför, i syfte att förbättra studiet av läkemedelsresistens, mer ansträngning bör riktas mot utvecklingen av nya prekliniska modeller, såsom primära kulturer och xenotransplantat, att närmare efterlikna in vivo cancermikro att undvika relevanta förändringar i cellulära egenskaper orsakad av längre perioder av cellkultur och odlingsbetingelser. 32 Anmärkningsvärt, skulle våra protokoll tillämpas även galvaniska element, med hjälp av cytotoxicitetsanalyser för att bestämma ex vivo IC 50-värden. En annan begränsning är att eftersom många resistensmekanismer finnas för varje läkemedel mot cancer, kan liknande eller olika resistensmekanismer utvecklas i celler som utsätts för identiska men oberoende behandlingar. Därför bör ett jämförande urvalsstrategi innebär parallella val och analyser, inklusive genetiska analyser av splitsvarianter av samma moderceller som behandlats med samma kemoterapeutiska medlet.

    jove_content "> Ytterligare metoder för funktionell validering bör syfta till att överuttrycker splitsningsvarianten av intresse i cellinjer eller specifikt nedreglera deras uttryck med hjälp av RNA-interferens eller skarvkopplande oligonukleotider 33.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
    2. McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
    3. Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
    4. van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
    5. Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1, (3), 1112-1116 (2006).
    6. Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
    7. Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4, (5), 547-566 (2013).
    8. Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138, (7), 1645-1656 (2016).
    9. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
    10. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
    11. Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
    12. Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9, (Suppl 1), 29-46 (2015).
    13. Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
    14. Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
    15. Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16, (Suppl 9), (2015).
    16. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
    17. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
    18. Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
    19. Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
    20. Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
    21. Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68, (5), 663-668 (1996).
    22. Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20, (14), 2600-2602 (2006).
    23. McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266, (10), 6181-6187 (1991).
    24. Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41, (6), 2093-2102 (2012).
    25. Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32, (40), 4845-4853 (2013).
    26. Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7, (6), 1887-1899 (2014).
    27. Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. (2016).
    28. Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15, (1), (2016).
    29. Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165, (1), 57-66 (2014).
    30. Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110, (4), 791-800 (2000).
    31. Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88, (7), 773-784 (2008).
    32. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (46), 18708-18713 (2011).
    33. Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11, (2), 125-140 (2012).
    34. Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (51), E5593-E5601 (2014).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

      Usage Statistics