El uso de ARN de secuenciación para detectar novela de empalme variantes relacionadas con la resistencia de drogas en * These authors contributed equally

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Cancer Research

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Summary

Aquí se describe un protocolo destinado a investigar el impacto de corte y empalme aberrante de resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de modelos parentales y resistentes in vitro a través de RNA-seq y establecimos un método basado QRT-PCR para validar los genes candidatos.

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Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

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Abstract

La resistencia a fármacos sigue siendo un problema importante en el tratamiento del cáncer tanto para neoplasias hematológicas y tumores sólidos. La resistencia intrínseca o adquirida puede ser causada por una variedad de mecanismos, incluyendo el aumento de la eliminación del fármaco, disminución de la captación del fármaco, la inactivación de drogas y alteraciones de objetivos farmacológicos. Los datos recientes muestran que, aparte de por el conocido genética (mutación, amplificación) y epigenética (hipermetilación del ADN, modificación posterior a la traducción de histonas) modificaciones, los mecanismos de resistencia a fármacos también podría ser regulados por las aberraciones de empalme. Este es un campo de rápido crecimiento de la investigación que merece atención en el futuro con el fin de planificar estrategias terapéuticas más eficaces. El protocolo descrito en el presente documento está dirigido a investigar el impacto de corte y empalme aberrante en la resistencia a fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Para este objetivo, se analizaron los perfiles de transcriptómica de varios modelos in vitro a través de RNA-seq y establecered un QRT-PCR basado en el método para validar los genes candidatos. En particular, se evaluó el corte y empalme diferencial de ddx5 y PKM transcripciones. El corte y empalme aberrante detectado por la herramienta computacional MATS fue validado en células leucémicas, lo que demuestra que las diferentes variantes de corte y empalme ddx5 se expresan en las células resistentes frente a los padres. En estas células, también se observó una relación más alta PKM2 / PKM1, que no se detectó en la contraparte gemcitabina resistente Panc-1 en comparación con células parentales Panc-1, lo que sugiere un mecanismo diferente de resistencia a las drogas inducida por la exposición gemcitabina.

Introduction

A pesar de considerables avances en el tratamiento del cáncer, la resistencia de las células malignas a la quimioterapia, ya sea intrínseca o adquirida a la exposición prolongada de drogas, es la razón principal para el fracaso del tratamiento en una amplia gama de leucemia y tumores sólidos 1.

Con el fin de delinear los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos, en los modelos de línea celular in vitro se desarrollan por etapas de selección de las células cancerosas resistentes a los agentes quimioterapéuticos. Este procedimiento imita los regímenes utilizados en los entornos clínicos y por lo tanto permite la investigación en profundidad de los mecanismos de resistencia pertinentes. Las células resistentes que sobreviven al tratamiento son entonces distinguirse de las células sensibles de los padres mediante el uso de ensayos de viabilidad celular / 2 de citotoxicidad. En los perfiles de resistencia a fármacos in vitro de células primarias han demostrado ser significativamente relacionada con la respuesta clínica a la quimioterapia 3.

cytoto de alto rendimientoensayos xicidad constituyen un método conveniente para determinar la sensibilidad a fármacos in vitro. En este documento, la viabilidad de las células se evalúa mediante por ejemplo la 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil bromuro de tetrazolio - ensayo de MTT 4, que se basa en la conversión metabólica de ciertos sustratos (es decir, sales de tetrazolio) en productos de color, lo que refleja así la actividad mitocondrial de las células. Alternativamente, el contenido de proteína celular puede cuantificarse utilizando la sulforodamina B (SRB) de ensayo 5. Aquí, el número de células viables es proporcional a la densidad óptica (DO) medida a una longitud de onda apropiada en un espectrofotómetro, sin necesidad de extensa y consume mucho tiempo procedimientos de recuento de células. La inhibición del crecimiento inducida por un determinado fármaco quimioterapéutico se puede calcular sobre la base de la DO de los pocillos en los que las células fueron tratadas con un agente de ensayo y se compara con el diámetro exterior de las células de control no tratadas. Una curva de dosis-respuesta es obtained por el trazado de las concentraciones de fármaco frente a porcentajes de células viables con respecto a las células control. Finalmente, la sensibilidad al fármaco puede ser reportada como la concentración que da como resultado 50% de inhibición del crecimiento celular en comparación con las células no tratadas (IC 50).

Los mecanismos que subyacen a la resistencia a fármacos incluyen muchas anomalías diferentes, tales como las alteraciones que afectan a la expresión de genes de los determinantes de la actividad del fármaco y el metabolismo celular. Estas lesiones moleculares, incluyendo mutaciones, aberraciones en un transcripcional y post-transcripcional, así como la regulación epigenética perturbado a menudo afectan a los genes implicados en el metabolismo de fármacos, ya sea o apoptosis 6.

Splicing alternativo de pre-mRNA y su intrincada regulación han recibido recientemente una atención considerable como una entidad nueva que pueda dictar la resistencia a fármacos de las células cancerosas 7. Hasta 95% de los genes humanos están empalmados alternativamente en las células normales por medio de estafirmemente proceso regulado que produce muchos diferentes isoformas de la proteína a partir del mismo gen. Splicing alternativo es a menudo desregulado en el cáncer y varios tumores se caracterizan por empalme alterada de un número creciente de genes implicados en el metabolismo de fármacos (es decir, la desoxicitidina quinasa, folilpoliglutamato sintetasa, o las proteínas de resistencia a múltiples fármacos) 6,8. Sin embargo, el análisis exhaustivo de los perfiles de empalme de las células resistentes a los fármacos está dolorosamente ausente. Por lo tanto, es imperativo desarrollar métodos de alto rendimiento para el análisis de corte y empalme alternativo. Esto podría ayudar a desarrollar enfoques terapéuticos más eficaces.

Durante la última década, el rápido desarrollo de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS) ha enriquecido la investigación biomédica con nuevos conocimientos sobre los mecanismos moleculares que regulan la regulación de la expresión del genoma y su papel en diversos procesos biológicos 9. RNA-secuenciación (RNA-seq) es un potente sub-aplicaciónde NGS en el campo de la transcriptómica. Permite un perfilado en todo el genoma (cualitativa y cuantitativamente) de los patrones de expresión de miles de genes simultáneamente y es muy adecuado para la caracterización de nuevos mRNAs de codificación así como de larga ARN no codificante, miRNA, siRNA, y otra RNA pequeña clases (por ejemplo, snRNA y Pirna) 10,11.

RNA-Seq tiene muchas ventajas sobre las tecnologías anteriores para la caracterización transcriptoma (por ejemplo, secuenciación Sanger y microarrays de expresión). No se basa en la anotación del genoma existente, que tiene un nivel de un solo nucleótido de la resolución y tiene un rango dinámico más amplio para la estimación del nivel de expresión. En pocas palabras, el flujo de trabajo experimental básico de experimentos de RNA-seq consiste en la selección transcripción poliadenilado (ARNm) y la fragmentación, seguido de la conversión en cDNA, construcción de la biblioteca y la secuenciación profunda finalmente, masivamente paralelo 12,13. Debido a la rápida caída de sequencincostos ga lo largo de los últimos años, el RNA-seq está reemplazando gradualmente a otras tecnologías y se están haciendo esfuerzos significativos para mejorar los protocolos de preparación de la biblioteca. Por ejemplo, ahora es posible retener la información hebra de transcritos de ARNm mediante el marcado de la segunda cadena de ADNc con trifosfato de desoxiuridina (dUTP) y, antes de la PCR de amplificación, la digestión de la hebra marcada con uracil-DNA-glicosilasa (UDG). Este proceso mejora la exactitud de la anotación de genes y la estimación de los niveles de expresión 14,15.

El análisis e interpretación de datos de RNA-seq requieren paquetes de software de cálculo complejas y de gran alcance y su transformación en tuberías bioinformáticas 16,17. En primer lugar, la prima lee someten a control de calidad mediante la eliminación de artefactos técnicos y biológicos y descartar (recorte) las secuencias que no llegan a estrictos requisitos de calidad. Posteriormente las lecturas para cada muestra se asignan a un genoma de referencia e indexadoen-nivel de genes, a nivel de exón, o a nivel de transcripción, con el fin de determinar la abundancia de cada categoría. Dependiendo de la aplicación, los datos refinados se calculan entonces a través de modelos estadísticos para la identificación de la expresión específica de alelo, splicing alternativo, fusiones de genes y polimorfismos de nucleótido único (SNP) 12. Finalmente, el análisis diferencial en el nivel seleccionado (es decir, la expresión de genes o corte y empalme alternativo) se puede utilizar para comparar las muestras obtenidas en diferentes condiciones.

El análisis diferencial de empalme se describen las diferencias en el uso del sitio de empalme entre dos muestras. Un número creciente de paquetes de software dedicados a este propósito están disponibles basadas en diferentes modelos estadísticos, actuaciones y la interfaz de usuario 18. Entre estos, MATS (análisis multivariante de la transcripción de empalme) emerge como una herramienta computacional de libre disposición y precisa sobre la base de un marco estadístico Bayesiano y diseñados para detectar diferential eventos de empalme de forma de datos de ARN-ss finales individuales o pareadas. A partir de los archivos alineados (.bam), MATS puede detectar todos los tipos de eventos alternativos de empalme (salto de exón, alternativa 'del sitio de empalme alternativo, 5' del sitio de empalme 3, mutuamente excluyentes exones e intrones de retención - véase también la Figura 1).

En primer lugar, se identifica el software lee la cual soporta un determinado evento de empalme, por ejemplo la omisión de exón, y los clasifica en dos tipos. "La inclusión lee" (para el evento de empalme canónica) mapear dentro del exón investigado y abarcan las uniones entre las que el exón específico y los dos exones que flanquean aguas arriba y aguas abajo. "Skipping lee" (para el evento de corte y empalme alternativo) abarcan la unión entre los dos exones que flanquean. Posteriormente, MATS devuelve el nivel de inclusión normalizada, tanto para los eventos canónicas y alternativa y compara los valores entre las muestras o condiciones. En última instancia, se calcula un valor de pnd tasa de falso descubrimiento (FDR), suponiendo que la diferencia en la relación variante de un gen entre dos condiciones excede un umbral definido por el usuario determinado para cada caso de empalme 19,34.

Tras el análisis diferencial de empalme en conjunción con ARN-ss, una extensa validación experimental se justifica con el fin de identificar genes candidatos verdaderos positivos 18. Reacción en cadena de la polimerasa transcrita inversa cuantitativa (QRT-PCR) es el método más comúnmente utilizado y óptima en la validación de los candidatos obtenidos a partir de análisis de ARN-Seq 20. El objetivo de este trabajo es proporcionar una metodología sólida para investigar los perfiles de empalme relacionados con la resistencia a los fármacos en tumores sólidos y neoplasias hematológicas. Nuestro enfoque utiliza ARN-ss-a base de perfiles de transcriptoma de los modelos de líneas celulares seleccionadas de cánceres resistentes a los fármacos en combinación con un método de QRT-PCR establecido para la validación de genes candidatos implicados en la resistencia a los medicamentos.

21,22 y el metotrexato (MTX) sublínea -resistant CEM / R30dm 23. Aunque las terapias actuales basados ​​en GCs y MTX establecen beneficio clínico en aproximadamente 90% de los casos, la aparición de GC-resistencia representa todavía un problema sin resolver con un mecanismo molecular poco clara. Para aislar GC resistente sub-clones, las células CEM-WT se cultivaron en 1 dexametasona mu M (Dex) de 2 a 3 semanas. sublínea resistente a MTX-CEM / R30dm se desarrolló a través de corto plazo repetida (24 horas) la exposición de las células CEM-peso a 30 M MTX como un imitador de protocolos clínicos. Curiosamente, esta línea celular también muestra resistencia cruzada a Dex (resultados no publicados) para el cual el mecanismo no se entiende completamente.

El sólido tumo modelo investigado en el presente estudio es el adenocarcinoma ductal pancreático, conocido por su extraordinaria refractariedad a la quimioterapia. Con este fin, se seleccionaron línea Panc-1 célula y su gemcitabina resistente sub-clon Panc-1R obtenido por incubación continua con 1 M de la droga 24. Aquí se describe un enfoque para descubrir nuevos mecanismos subyacentes in vitro resistencia a los medicamentos mediante la combinación de tres protocolos: los ensayos de citotoxicidad colorimétricos para evaluar la sensibilidad al fármaco en las células leucémicas y células cancerosas de los tumores sólidos, tubería de ARN-basada en la SEC para identificar nuevas variantes de empalme relacionados con sensibilidad a los fármacos / resistencia y RT-PCR y análisis de QRT-PCR para validar los posibles candidatos.

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Protocol

1. Caracterización de los perfiles de resistencia a los medicamentos a través de Ensayos de citotoxicidad

  1. Leucémica Cultura línea celular
    1. Mantener el parental de células T línea celular CCRF-CEM (CEM-WT), así como sus sublíneas resistentes a los fármacos, incluyendo CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3, en 25 cm 2 en medio de 10 ml de RPMI-1640 que contiene 2,3 M de ácido fólico suplementado con 10% de suero fetal de ternera y 100 unidades / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina.
    2. Cultivar las células en una atmósfera húmeda a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
    3. Permitir el crecimiento celular a concentraciones de entre 2 - 3 x 10 6 células / ml.
    4. Dividir las células dos veces a la semana a una concentración inicial de 0,3 x 10 6 células / ml (por ejemplo, si la concentración de células es de 3 x 10 6 células / ml, la transferencia de suspensión de células 1 ml en un nuevo matraz que contenía 9 ml de medio fresco). Desechar el cultivo después de 20 pases consecutivos.
    Carcinoma de células de páncreas Cultura Line
    NOTA: Mantener la línea celular de carcinoma pancreático humano Panc-1 en 75 cm 2 frascos de cultivo en 10 ml de medio DMEM con alta glucosa y L-glutamina suplementado con 10% de suero fetal bovino y 100 unidades / ml de penicilina G y 100 mg / ml de estreptomicina . La variante resistente a los medicamentos, Panc-1R, se cultiva en el mismo medio de cultivo que contiene 1 M gemcitabina disueltos en agua estéril. Se proporcionan más detalles en el 24.
    1. Cultivar las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
    2. Dividir las células cada 2 - 3 días en una proporción de 1: 5 cuando las células alcanzan la confluencia de aproximadamente 90%.
    3. Para dividir las células, se lava dos veces con la solución salina tamponada con fosfato (PBS), añadir 1 ml de Tripsina / EDTA por 75 cm 2 frasco de cultivo y se incuba a 37 ° C durante 3 min.
    4. Añadir 9 ml de medio y cosechar las células separadas en un tubo de 15 ml. Semilla suspensión celular de 2 ml en un matraz de nuevo contacaniza 8 ml de medio. Desechar el cultivo después de 20 pases consecutivos.
  2. MTT ensayo de células leucémicas
    1. Prepararse de antemano la solución de MTT: se disuelven 500 mg de MTT formazano en 10 ml de PBS y agitación (protegido de la luz) con un agitador magnético durante aproximadamente 1 hora. Esterilizar la solución con un filtro de 0,22 micras. NOTA: La solución se puede almacenar en alícuotas de 10 ml a -20 ° C. Proteger de la luz directa después de la descongelación.
    2. Preparar con antelación el isopropanol acidificado: añadir 50 ml de HCl 2 a 2,5 l de isopropanol. NOTA: Guarde la solución durante al menos un mes a temperatura ambiente antes de su uso. Si el isopropanol no se acidifica correctamente, puede formar precipitados con el medio y poner en peligro la lectura espectrofotométrica.
    3. Preparar un fondo plano de 96 pocillos separada "día 0" (control) placa para asegurar la estimación más precisa de la inhibición del crecimiento: dedicar 3 a 6 pocillos por cada línea celular, añadir 30 l de crecimientomedio y 120 l de suspensión de células (8.000 células) por cada l pocillos y 150 del medio de cultivo a los pocillos correspondientes a los espacios en blanco (sin células). Proceder de la etapa 1.3.9 al paso 1.3.13 de esta sección para medir la densidad óptica (OD). NOTA: Se proporcionan más detalles en 4.
    4. Preparar una placa experimental de 96 pocillos de fondo plano: dedicar 30 pozos a concentraciones de fármaco (10 concentraciones, cada una por triplicado), 10 pozos para el control de las células y los 10 pozos de control de medio sin células (espacios en blanco) y preparar una serie de diluciones de fármaco de dexametasona ( Dex) utilizando dimetil sulfóxido como disolvente.
      NOTA: Para las células CEM-WT el intervalo de dilución Dex está entre 2 micras y 0,97 nM. Para las células CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3 el intervalo de dilución Dex está entre 640 mM y 0,33 nM.
    5. Añadir 30 l de cada dilución de Dex en un pocillo apropiado de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de incluir cada concentración en un triplicado.
    6. Añadir 30 l de medio de crecimiento a biens que corresponde a las células de control y 150 l de medio de crecimiento a pocillos correspondientes a los espacios en blanco.
    7. Cosecha de las células y resuspender en crecimiento exponencial en su concentración óptima de la siembra.
      NOTA: Para determinar las concentraciones óptimas de células de partida, se recomienda para evaluar el perfil de crecimiento de cada línea celular de la línea celular en una placa de 96 pocillos mediante la siembra de células a varias concentraciones y midiendo diariamente durante al menos 4 días. Elija una concentración de siembra que impide el crecimiento excesivo de las células después de 72 horas, ya que influirá en el experimento mediante la saturación de los valores de DO. Para CEM-WT, CEM-C5 y CEM-R5 la concentración óptima de siembra es de 8.000 células / pocillo, mientras que para el CEM / R30dm es 5.000 células / pocillo.
    8. Añadir 120 l de suspensión celular a cada ya sea la solución de fármaco que contiene bien o el medio de crecimiento (pozos correspondiente a las células de control). Llenar los pocillos externos vacíos de la placa con 150 l de PBS para asegurar una buena humedad en la placa e incubar THplacas electrónicas para 72 horas a 37 ° C con 5% de CO2 en un incubador de cultivo celular.
    9. Añadir 15 l de la solución MTT a cada pocillo y agitar la placa durante 5 min con una placa-agitador hasta un máximo de 900 batidos / min.
    10. Colocar las placas de nuevo a 37 ° C con 5% de CO2 en un incubador de cultivo celular y se incuba durante otra 4-6 hr.
    11. Añadir 150 ml de isopropanol acidificado la a cada pocillo y mezclar bien con una pipeta multicanal para volver a suspender a fondo todos los cristales de formazán. Comience con los pocillos de blanco y asegúrese de enjuagar bien las puntas antes de pasar a otra fila de la placa.
    12. Se incuba la placa a temperatura ambiente (RT) durante 10 min.
    13. El uso de un lector de microplacas, determinar la DO a 540 y 720 nm para asegurar una medición precisa mediante la corrección para el fondo OD. A continuación, guarde los datos en un archivo de hoja de cálculo y analizarlo 4.
  3. SRB Ensayo para células pancreáticas Carcinoma
    1. Disolver reactivo SRB en ácido acético al 1% a una concentración final de 0,4% (w / v).
    2. Disolver ácido tricloroacético (TCA) en agua ultrapura a una concentración final de 50% (w / v).
    3. Disolver Tris aminometano (hidroximetil) en agua ultrapura a una concentración final de 10 mM.
    4. Preparar una placa de fondo de control "día 0" plana separada de 96 pocillos para asegurar una estimación más precisa de la inhibición del crecimiento: la semilla 6 pocillos con células en crecimiento en fase exponencial de 100 l de medio a una concentración de siembra apropiada y añadir 100 l de medio sólo para pozos correspondientes a espacios en blanco. Incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2 para asegurar la adhesión adecuada de las células a la placa. A continuación, añadir 100 l de medio a todos los pocillos y proceder a los pasos 1.4.8 - 1.4.16 de esta sección.
    5. Preparar una placa experimental de 96 pocillos de fondo plano: células de semillas en crecimiento en fase exponencial por triplicado en 96 pozos de placas de fondo plano a una densidad apropiada en 100 l de míDium utilizando una pipeta multicanal.
      NOTA: Para determinar las concentraciones óptimas de células de partida, se recomienda para evaluar el perfil de crecimiento de cada línea celular de la línea celular en una placa de 96 pocillos mediante la siembra de células a varias concentraciones y midiendo diariamente durante al menos 4 días. Elija una concentración de siembra que impide el crecimiento excesivo de las células después de 72 horas, ya que influirá en el experimento mediante la saturación de los valores de DO. Para las células Panc-1 y Panc-1R, la concentración óptima de siembra es de 8000 células / pocillo.
    6. Añadir 100 l de medio a medio-sólo pocillos e incubar durante la noche a 37 ° C con 5% de CO 2 para asegurar la adhesión adecuada de las células a la placa.
    7. Preparar una serie de diluciones de fármaco de gemcitabina entre 1 M y 10 nM para Panc-1 y 1 mM y 100 nM para las células Panc-1R. Añadir 100 ml de cada dilución en un pocillo apropiado de la placa de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Asegúrese de tener cada concentración por triplicado. En adición,añadir 100 l de medio a las medianas sólo los pozos y las células de control. Incubar a 37 ° C con 5% de CO2 durante 72 hr.
    8. Añadir 25 l solución de TCA frío a los pocillos utilizando una pipeta multicanal y se incuban las placas durante al menos 60 min a 4 ° C con el fin de precipitar y fijar las proteínas en el fondo de los pocillos.
    9. Vaciar la placa eliminando el medio y seca brevemente en un pañuelo de papel.
    10. Lavar 5 veces con agua del grifo, a continuación, vaciar la placa y dejar secar a temperatura ambiente.
    11. Añadir 50 l solución de SRB por pocillo mediante el uso de una repetición-pipeta y las manchas durante 15 minutos a temperatura ambiente.
    12. Vaciar la placa mediante la eliminación de la mancha SRB.
    13. Lavar 4 veces con ácido acético al 1%, a continuación, vaciar la placa y dejar secar a temperatura ambiente.
    14. Añadir 150 l solución de Tris por pocillo usando una pipeta multicanal y se mezcla durante 3 min en una placa-agitador hasta un máximo de 900 batidos / min.
    15. Leer la densidad óptica a 540 nm (o 492 nm si tél OD valores son demasiado altos).
    16. Analizar los datos.
  4. Análisis de los datos de MTT y SRB Ensayos
    1. Calcular los valores de DO de las células en el "día 0" mediante la siguiente fórmula: Día OD = 0 células de control OD - pocillos de blanco DO promedio
    2. Calcular el porcentaje de células supervivientes para cada concentración de fármaco de acuerdo con la siguiente fórmula:% de células tratadas = [células tratadas OD - pocillos de blanco DO promedio - Day OD 0] Media / [células de control OD - pocillos de blanco DO promedio - OD Day0] * 100
    3. Trazar la curva de dosis-respuesta (concentración de fármaco frente a la inhibición del crecimiento en%).
    4. Calcular la concentración del fármaco que inhibe el crecimiento de células en un 50% (IC 50), utilizando la curva de dosis-respuesta.

2. Aislamiento de ARN y preparación de la biblioteca de ARN de secuenciación

  1. Muestra Collreflexión y aislamiento de ARN
    1. Para células CEM: cosechar 10 6 células directamente del medio de cultivo.
    2. Para Panc-1 y Panc-1R: eliminar medio, se lavan las células dos veces con PBS y separar mediante la adición de tripsina-EDTA y la incubación a 37 ° C durante 3 min. Añadir medio de cultivo y la cosecha de 10 6 células.
    3. Centrifugar las muestras a 300 xg durante 3 min, eliminar el sobrenadante y extraer mRNA total usando columnas de centrifugación de la membrana de sílice disponibles comercialmente, siguiendo el protocolo del fabricante de.
    4. Determinar la concentración y pureza del ARN total mediante el uso de un espectrofotómetro de UV-Vis.
      NOTA: el ARN se considera de alta pureza si la relación de absorbancia 260 nm / 280 nm está por encima de 1,8. Las muestras pueden ser almacenadas a - 80 ° C.
    5. Evaluar la integridad de ARN total por electroforesis de 200 ng de la muestra en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
      NOTA: La detección de dos bandas intactas correspondiente a mamíferos 28S y 18S rRNAs aproximadamente a las2 kb y 1 kb de tamaño es indicativo de una buena integridad de ARN total.
  2. Preparación secuenciación Biblioteca
    1. Utilizar 2 g de ARNm total por cada muestra. Siga mRNA protocolo de preparación de la biblioteca de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Determinar la calidad y la concentración de cada biblioteca mediante el uso de un sistema Bioanalyzer. Se combinan las bibliotecas en una sola muestra hasta una concentración final de 10 nmol / L y medirlo con el Bioanalyzer.
    3. Utilizar el sistema de secuenciación de alto rendimiento con el único modo de lectura de 100 pb.
      NOTA: Lee longitud de> 80 pb es necesaria para la identificación de las isoformas de la transcripción.

3. Detección de empalme diferencial de lecturas de secuenciación

  1. Alineación de Lee a la referencia del genoma y la comprobación de la calidad
    1. Compilar una anotación de genes (archivo .gtf) de la tabla NCBI refGene utilizando UCSC navegador mesa (25.963 genes).
    2. Realizaralineamiento con huecos anotación consciente de secuenciación lee en el genoma de referencia (GRCh37) utilizando STAR.
    3. Ordenar e indexar los archivos de alineación resultantes con herramientas Picard.
    4. Realizar el control de calidad posterior a la asignación de notificaciones mediante RSeQC y samtools.
  2. La detección diferencial de empalme entre los grupos de la muestra
    1. Instalar Python y las correspondientes versiones de NumPy y SciPy. Descargar e instalar samtools. Descargar e instalar pajarita y sombrero de copa,
    2. Añadir los directorios Python, bowtie, sombrero y una samtools a la variable de entorno $ PATH. Descarga pre-construido índices bowtie (hg19). Descargar rMATS versión 3.0.9.
      Nota: Para más detalles acerca de rMATS se proporcionan en el 19 y el 34.
    3. Detectar eventos de splicing alternativo mediante la comparación de cada línea celular Dex resistente al CEM-WT y Panc-1 a Panc-1R en MATS separada discurre según la Figura 5A.
    4. Para detectar eventos de splicing diferenciales de Previously secuenciación alineado lee (archivos .bam), esteras de ejecución mediante los comandos de la figura 5B para el CEM-WT vs CEM-C3, CEM-WT vs CEM-R5, CEM-WT vs CEM / R30dm y Panc1 a Panc- comparaciones 1R.
      NOTA: MATS creará una carpeta de salida con dos archivos .txt con resultados por tipo de empalme caso analizado (SE - omisión de exón, A5SS - alternativa 'del sitio de empalme, A3SS - la alternativa 3' del sitio de empalme 5, MEX - exones mutuamente excluyentes y RI - intrón retención): contienen los resultados de un solo archivo basados ​​en el recuento sólo de unión y un segundo archivo con los resultados basados ​​en el recuento de unión y se lee en el blanco. Por otra parte, un archivo .txt adicional con una visión general resultado se genera en la misma carpeta.
    5. Por SE, A5SS, A3SS e importación de RI a hojas de los archivos .txt en base a los recuentos de unión y lee en el blanco. Para MEX importar los archivos .txt en base a sólo cuenta unión.
      NOTA: el archivo de salida MATS está ordenada por orden ascendente los valores de P y contiene varios parámetros: Identificación de genes, genes símbolo, El cromosoma y la posición hebra, genómica coordenadas de los fragmentos empalmados alternativamente, cuenta, así como la longitud de la inclusión y saltar formas para ambas muestras analizadas, la longitud de la inclusión y saltarse forma utilizada para la normalización, p-valor, la tasa de falso descubrimiento (FDR ), nivel de inclusión para cada muestra en función de los recuentos normalizados y la puntuación de inclusión diferencial (promedio (IncLevel1) - media (IncLevel2)).
    6. Seleccionar los genes candidatos estadísticamente significativas con un FDR <10% para una validación adicional (por ejemplo, ddx5 y PKM2).
    7. Visualizar eventos de splicing alternativo con Integrativa Genómica Visor (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), como se informó en la Figura 5.

4. La validación de los resultados por RT-PCR y QRT-PCR ensayos

  1. Diseño de cebadores
    NOTA: Con el fin de proporcionar una validación fiable de los resultados obtenidos utilizando el gasoducto bioinformáticas, el ARNm transcriptas que resultan de eventos de empalme alternativos se amplifican mediante el uso de RT-PCR y se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. Cyanine tinte verde SYBR como QRT-PCR ensayo verde se utiliza para cuantificar empalme variantes específicas con respecto a un gen de mantenimiento. La Figura 7 representa la estrategia aplicada para visualizar el evento de la omisión del exón 12 del gen ddx5 y para cuantificar la mutuamente excluyentes exón 9 y el exón 10 del gen PKM.
    1. Para el ensayo de RT-PCR, pares de cebadores que hibridan con el diseño exones constitutivos (exón 10 y el exón 13) situados aguas arriba y aguas abajo de los sitios de splicing alternativo (Figura 7A).
      NOTA: El tamaño de amplificación debe cubrir entre 100 y 800 pares de bases con el fin de garantizar una clara separación de los productos de PCR en gel de agarosa predichos. La temperatura de hibridación de los cebadores debe estar entre 55 y 65 ° C y el contenido de GC no debe exceder de 60%.
    2. Ensayo con verde de cianina (Figura 7B). Compruebe la homología de secuencia de los dos exones que se excluyen mutuamente y el diseño de dos pares de cebadores cada uno de los cuales específicamente y exclusivamente detecta sólo una de las dos variantes de empalme.
      NOTA: Para PKM, el cebador inverso se hibrida con el exón 11 común a ambas variantes, mientras que los cebadores directos son la variante específica y recocido para el exón 9 (PKM1) o el exón 10 (PKM2).
    3. Con el fin de detectar ddx5 gen de longitud completa, fijar el iniciador inverso dentro del exón omitido (exón 12).
      NOTA: Para la detección específica de la variante ddx5 ΔEx12, el cebador inverso se extiende por la frontera exon11 / exon13. Utilice el mismo cebador directo que se hibrida con el exón constitutiva 10 para ambas reacciones.
      NOTA: El tamaño de amplificación debe estar entre 80 y 200 pb.
  • La primera cadena de cDNA Synthesis
    1. Configurar la transcripción inversa de 1 mg del ARN aislado en ADNc mediante el uso de 200 / l de Virus Moloney de la leucemia murina rever U (M-MLV)se transcriptasa en su tampón de reacción se diluyó 1: 5 con agua estéril. Añadir DTT 1 M, 0,05 g de hexámeros al azar, mezcla de desoxinucleótidos (dNTP) 1 mM, y 40 U / l de inhibidor de ribonucleasa.
    2. Vortex brevemente e incubar la mezcla de reacción a 37 ° C durante 2 hr.
    3. Incubar la mezcla de reacción a 70 ° C durante 5 minutos para inactivar la transcriptasa inversa, transferir la mezcla en hielo y girar hacia abajo utilizando una microcentrífuga. Las muestras se pueden utilizar inmediatamente o se almacenaron a - 20 ° C.
  • La reacción RT-PCR en gel de agarosa y
    1. Configurar la reacción de PCR en un tubo de PCR por cada muestra mediante la mezcla de 12,5 l de 2x concentra mezcla maestra de PCR, 1,25 l de 10 mM cebador directo y la misma cantidad para el cebador inverso hasta un volumen final de 25 l con agua estéril.
    2. Añadir 1 l de cDNA a la mezcla y colocar los tubos en el termociclador. Ejecutar el programa de la siguiente manera: desnaturalización inicial: 95 ° C durante 2 min.Reiterar los pasos siguientes durante 35 ciclos: desnaturalización a 95 ° C durante 25 s; recocido a 52 ° C durante 35 s; extensión a 72 ° C durante 1 min. Conjunto de extensión final a 72 ° C durante 5 min.
    3. Preparar 1% en gel de agarosa mediante la disolución de 1 g de agarosa en 100 ml de 1x tampón TBE. Añadir 2,5 l de bromuro de etidio a la solución. PRECAUCIÓN: bromuro de etidio es cancerígeno, manejar con cuidado mediante el uso de una campana de extracción química.
    4. Cargar las muestras y ejecutar el gel en tampón TBE 1x a 100 V durante aproximadamente 30 min en un sistema de electroforesis.
    5. Revelar el gel con una cámara digital UV y guardar la imagen.
  • QRT-PCR y análisis de datos
    1. Configurar la reacción de PCR verde Cyanine por cada muestra mediante la mezcla de 12,5 l de 2x verde PCR Mastermix, 2 l de cebador directo 5 micras y con la misma cantidad para el cebador inverso hasta un volumen final de 15 l con agua estéril en un tubo de PCR . Preparar una mezcla para cada empalme específicavariante a ser detectado (PKM1, PKM2, ddx5 longitud completa, ddx5 ΔEx12) y para la limpieza de genes (GUS).
    2. Cargar la mezcla maestra en una placa de 96 pocillos blanca y preparar duplicados por cada muestra.
    3. Diluir el ADNc de 10x en agua, añadir 5 l de cada mezcla y colocar la placa en el termociclador. Ejecutar el programa como sigue: desnaturalización inicial: 95 ° C durante 5 min. Reiterar los pasos siguientes durante 45 ciclos: desnaturalización a 95 ° C durante 10 s; recocido a 58 ° C (para ddx5 y ddx5 ΔEx12 mezcla) o 60 ° C (para PKM1 y PKM2 mezcla) durante 20 s. Conjunto de extensión final a 72 ° C durante 20 s. Set de fusión curva mediante la aplicación de un gradiente de 65 a 97 ° C.
    4. Con el fin de evaluar la especificidad de los conjuntos de cebadores a su objetivo, comprobar las curvas de fusión y verificar que un solo pico se forma por cada conjunto de cebadores.
    5. Calcular los segundos valores derivados de las curvas de amplificación y exportar los valores de ciclo umbral (Ct).
    6. Calculate los niveles de expresión relativos (REL) del empalme mRNA variantes en comparación con el servicio de limpieza GUS (de referencia) de genes en cada muestra mediante el método de "delta Ct (Ct)". La fórmula es: REL = 2 -? Ct, donde Ct = Ct diana variante de empalme - gen de referencia Ct
    7. Con el fin de cuantificar la abundancia relativa de variantes de empalme, calcular la relación REL mediante el uso de la fórmula: Relación de REL ratio = REL variante de empalme 1 / REL empalme variante 2.
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    Representative Results

    Los ensayos de citotoxicidad descritos en el protocolo proporcionan un método fiable y robusto para evaluar la resistencia de las células cancerosas a los agentes quimioterapéuticos in vitro. Mediante el ensayo de MTT, se determinó la sensibilidad a la Dex en cuatro líneas T-ALL de células, incluyendo las células CEM-WT parentales Dex-sensibles, y tres sublíneas Dex-resistentes: CEM / R30dm, CEM-R5 y CEM-C3. Dos rangos de concentración diferentes tuvieron que ser utilizado debido a la gran diferencia en la sensibilidad entre CEM-WT (2 M - 0,97 nM) y las líneas celulares resistentes a Dex (640 M - 0,33 nM). El ensayo MTT mostró claramente la resistencia Dex en CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 M), CEM-R5 (IC 50> 640 m) y CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 M) en comparación con el CEM células WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 m). Del mismo modo el ensayo SRB demostró alta resistencia a la gemcitabina en la línea celular Panc-1R (IC50 = 3.16 ± 0,01 M) en comparación con las células parentales Panc-1 (IC 50 = 0,077 ± 0,03 mM) como se muestra en la Figura 2.

    Tras la confirmación de la resistencia a los medicamentos en todas las líneas celulares consideradas, el próximo procedió al aislamiento de ARNm, la preparación y la biblioteca de ARN-secuenciación. La extracción de ARNm total usando columnas de centrifugación de la membrana de sílice es la opción preferida sobre otros métodos, ya que evita la contaminación de fenol y de la proteína y proporciona una alta pureza de la muestra con 260 nm / 280 nm relación de absorbancia muy por encima de 1,8. Este es un requisito crucial para las aplicaciones posteriores complejos tales como secuenciación profunda. El método utilizado para comprobar la integridad de las muestras de ARN por agarosa al 1% es especialmente adecuado para las células recién aisladas (Figura 3). Puesto que el propósito de este protocolo es la detección de variantes alternativas de empalme aberrante expresadas en líneas celulares resistentes a los fármacos, elegimos selectio positivon de ARNm poliadenilado para la preparación de la biblioteca de secuenciación, utilizando kit mRNA hebra. Electroferogramas de bibliotecas individuales y agrupados se representan en la Figura 4, que muestra un tamaño de fragmento medio de aproximadamente 300 pb, en consonancia con los requisitos del sistema de secuenciación. Las bibliotecas preparadas fueron secuenciados utilizando un chip con el solo modo de lectura de 100 pb. La elección de las lecturas de secuenciación de 100 pb es necesaria para detectar splicing alternativo a través de tuberías aguas abajo bioinformáticas.

    Después de los pasos de procesamiento de iniciales y de control de calidad, la limpieza lee alineado con genoma humano (hg19) se sometieron a análisis diferencial de empalme utilizando MATS. En este análisis se realizaron comparaciones entre la línea parental sensible drogas célula y cada uno de su fármaco sublíneas resistentes por separado (es decir, CEM WT vs CEM / R30dm, CEM WT vs CEM-C3, etc.). MATS se basa en un modelo estadístico flexible y precisautilizado para detectar corte y empalme diferencial entre las muestras. Mediante el uso de opciones de análisis predeterminado y un valor FDR <10% como una línea de corte (representado en la figura 5B), hemos sido capaces de identificar 38 ± 12 importantes genes candidatos empalmadas diferencialmente por comparación ordenado por tipo de evento splicing alternativo, con la mayoría de los golpes clasificada como la omisión de exón. Figura 6 ilustra un análisis típico de salida para la comparación Panc-1 vs. Panc-1R.

    Nos hemos centrado aún más nuestro estudio sobre dos tipos más comunes de los eventos de splicing alternativo: la omisión de exón y el exón eventos mutuamente excluyentes con un candidato representante de cada categoría se describe a continuación. Ddx5 (DEAD-box helicasa 5) se ha detectado mediante análisis MATS como estadísticamente significativa en la comparación CEM-WT vs CEM-C3 y CEM-R5, pero no significativa en la comparación CEM-WT vs CEM / R30dm. Dada su supuesto papel en la leucemia 25,26, noselegir este candidato para una validación adicional. Es muy recomendable para visualizar los datos de RNA-seq en una herramienta de navegación similar al genoma. IGV proporciona una interfaz versátil y fácil de usar para este propósito, como se muestra en la Figura 7 para el ddx5 gen candidato. PKM (piruvato quinasa isoenzima muscular) es un evento exón mutuamente excluyentes estadísticamente significativa en la comparación CEM-WT vs. todo sublíneas resistentes Dex, pero no en la comparación Panc-1 vs. Panc-1R. Dada la importancia de esta enzima en el metabolismo del tumor sólido 27,28 y el papel emergente de metabolismo celular en la resistencia a glucocorticoides en LLA-T 29, elegimos este candidato para su posterior validación por medio de RT-PCR.

    Primer diseño debe llevarse a cabo con extremo cuidado con el fin de amplificar el amplicón correcto, especialmente cuando los cebadores hibridan con el exón-exón límites (en el caso del cebador inverso detectar variante ddx5 ΔEx12) o cuando tHey hibridan con los exones mutuamente exclusivas con alta homología de secuencia (exón 9 y el exón 10 del PKM). La Figura 8 muestra la estrategia de diseño de cebadores, mientras que la Figura 9 muestra los resultados de una RT-PCR para gen candidato ddx5. Ddx5 ΔEx12 se detecta en la muestra CEM-WT y CEM / R30dm pero no en el CEM-C3 y CEM-R5, lo que confirma los datos de MATS de una manera cualitativa. Verde ensayo de QRT-PCR Cyanine cuantifica con precisión los niveles de expresión de mRNA de las variantes de corte y empalme y ddx5 PKM, como se muestra en la Figura 10 y la Figura 11, respectivamente.

    Figura 1
    Figura 1: Representación esquemática de empalme eventos alternativos. Representación esquemática de los posibles patrones de corte y empalme alternativo de un gen. Las cajas son exones discretos que pueden ser incluidos o excluidos del mR independienteNA transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 2
    Figura 2: Resultados de Ensayos de citotoxicidad. (A) ensayo de MTT para líneas de células leucémicas muestra altos niveles de resistencia a la dexametasona en CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC 50> 640 m) y CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 mu M ) en comparación con la parental CEM-WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 M). Ensayos (B) SRB para líneas celulares de carcinoma de páncreas revelan altos niveles de resistencia gemcitabina en Panc-1R (IC 50 = 3,16 ± 0,01 mM) en comparación con la parental Panc-1 (IC 50 = 77,22 ± 2,76 nM). Los gráficos de los informes de crecimiento celular medio% ± SEM de tres independent experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 3
    Figura 3: Evaluación de la Calidad de ARN usando un gel de agarosa. Doscientos ng de ARNm total se corrieron en gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. La presencia de bandas intactas correspondientes a 18S RNA ribosomal (rRNA) de especies y 28S y la ausencia de manchas en los pesos moleculares más bajos son indicativos de ARN de buena calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 4
    Figura 4: <strong> Las huellas Bioanalyzer de secuenciación Bibliotecas. (A) electroferogramas de bibliotecas de secuenciación muestran picos a aproximadamente 300 pb, que es indicativo de buena calidad. Muestra 1 a 6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 y Panc-1R. (B) electroferograma de las muestras combinadas (FU, unidades de fluorescencia).

    Figura 5
    Figura 5: La detección de empalme diferencial con esteras. Grupo comparaciones (A) y (B) las secuencias de comandos que se utilizan para ejecutar esteras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 6
    Figura 6: Lista de salida MATS. La figura representa una salida típica del análisis MATS en un software de hojas de cálculo: aquí se informan los candidatos empalmadas diferencialmente en la comparación Panc-1 vs. Panc-1R para eventos de la omisión de exón (FDR <10%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 7
    Figura 7: La visualización de empalme diferencial del gen candidato ddx5 través IGV Genome Browser. Los archivos con Alineados lee (.bam) correspondiente a las células leucémicas se han cargado en el navegador genoma IGV y se visualizaron mediante el uso de parcelas Sashimi (valor de recuento de unión mínimo = 10 para visualizar los eventos significativos de empalme). conteos nudo de empalme están representados por líneas de conexión yun número correspondiente a la RNA-seq lee que abarca los exones. CEM-WT y CEM / R30dm muestran los recuentos de saltarse las que abarca el exón 11 al exón 13 en comparación con el CEM-C3 y CEM-R5 que no muestran ninguna omisión de exón 12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 8
    Figura 8: Diseño de cebadores para la RT-PCR y Cyanine verde QRT-PCR. (A) RT-PCR: pares de cebadores de detección de corte y empalme diferencial de ddx5 recocido a los exones constitutivos (exón 10 y el exón 13) situados aguas arriba y aguas abajo de los exones empalmados alternativamente. (B) QRT-PCR ensayo: para la cuantificación relativa de las transcripciones resultantes de eventos omisión de exón en comparación con las transcripciones canónicas, el cebador inverso se hibrida ya sea dentro del exón omitido (variante alternativa) oal límite exon11 / exon13 (variante canónica) del gen ddx5. Para la cuantificación de los exones mutuamente excluyentes, el cebador inverso se hibrida al exón 11 común a las dos isoformas, mientras que el recocido de cebador directo o bien al exón 9 (PKM1) o el exón 10 (PKM2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 9
    Figura 9: RT-PCR Validación de ddx5 diferencial de empalme. El gel de agarosa 1% muestra corte y empalme diferencial del gen ddx5 en las células leucémicas. El fragmento correspondiente a ddx5 amplicón de longitud completa (650 pb) se amplifica en todas las muestras, mientras que ddx5 ΔEx12 (430 pb) variante se amplifica en la CEM y CEM-WT / R30dm muestras y el tamaño se corresponde con la omisión de exón 12. Esto no se detecta en las células CEM-C3 y CEM-R5, como disuadirminada por análisis MATS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 10
    Figura 10: Niveles de expresión de mRNA de ddx5 variantes de empalme en las células CEM. Ensayo (A) QRT-PCR. La media de los niveles de expresión relativos y error estándar de la media (REL ± SEM) de dos experimentos independientes. (B) Relación de REL (± SEM) de las variantes de empalme. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

    Figura 11
    Figura 11: ARNm nivel de expresións de PKM variantes de empalme en la CEM y Panc-1 células. Ensayo (A) QRT-PCR. La media de los niveles de expresión relativos y error estándar de la media (REL ± SEM) de dos experimentos independientes y la proporción de REL de las variantes de corte y empalme para las células CEM. Ensayo (B) QRT-PCR. Mean REL ± SEM de dos experimentos independientes y relación de REL (± SEM) de las variantes de empalme de las células Panc-1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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    Discussion

    Aquí se describe un nuevo método que combina las técnicas de detección de citotoxicidad bien establecidos y de gran alcance transcriptómica basada en NGS análisis para identificar los eventos de corte y empalme diferencial en relación con la resistencia a fármacos. Ensayos espectrofotométricos son de alto rendimiento métodos convenientes y robustas para evaluar la sensibilidad a fármacos en modelos de cáncer in vitro y representan la primera opción para muchos laboratorios que realizan pruebas de detección de citotoxicidad. Solución de problemas, así como las posibles variaciones de este método se describen extensamente en otro lugar de 4,5.

    genómica de alto rendimiento análisis actualmente utilizado para explorar los mecanismos de resistencia a los medicamentos se basan principalmente en la detección de SNPs y diferenciado estimación de la expresión de genes asociados con un determinado fenotipo resistente a fármacos. En este estudio, se describe el uso de métodos de secuenciación de ARN, junto con robustas tuberías de bioinformática para la anotación precisa de transcritos de ARNm y la detección de DIFempalme rencial. Una característica particularmente importante del protocolo descrito es la capacidad de identificar nuevas variantes de empalme entre dos grupos de muestra con perfiles de sensibilidad de drogas distintas. Uno de los pasos cruciales para un análisis preciso e imparcial es el aislamiento de ARN, que debe ser de alta pureza e integridad.

    MATS es el software que elegir entre una serie de herramientas bioinformáticas similares disponibles (por ejemplo, Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice y empalme del compás) para la detección de splicing alternativo 18. Las principales características clave que hacen que sea la opción preferida son su precisión superior y precisión, así como la posibilidad de identificar nuevos eventos. MATS genera dos tipos de salida que contiene el análisis diferencial de empalme: la primera se basa únicamente en los recuentos de unión exón y el segundo se basa en el recuento de unión, así como se lee en el blanco. Aunque se prefiere este último para la detección de la omisión de exón eventos, se recomiendautilizar la primera opción para el análisis de los exones mutuamente excluyentes ya que este enfoque reduce el número de falsos positivos candidatos para este tipo particular de alteración de empalme.

    Por otra parte, para el análisis se centra en la retención de intrón, eventos alternativos 3 'y 5' del sitio de empalme, un archivo .gtf con intrones anotados deben ser utilizados. En última instancia, con el fin de reducir la variabilidad biológica y técnica dentro de los grupos de muestra y garantizar altas tasas de positivos verdaderos, se recomienda encarecidamente a la secuencia de al menos tres repeticiones 34. La selección de candidatos de genes diferencialmente empalmadas basados ​​en la producción MATS se combinó con una etapa de validación mediante RT-PCR. Esto es muy importante para la selección de variantes verdaderos positivos entre una larga lista de candidatos estadísticamente significativas. El factor clave para una validación precisa es el diseño de oligonucleótidos y la optimización de las reacciones de PCR de acuerdo con los estándares de biología molecular. especial cuidadodebe ser tomado en el diseño de cebadores que abarcan exón-exón cruces y etapas de validación adicionales, tales como la secuenciación de los amplicones por el método de Sanger, están garantizados con el fin de confirmar su especificidad.

    El corte y empalme diferencial de ddx5 y PKM transcripciones detectadas por MATS representan dos ejemplos de un corte y empalme aberrante relacionada con la resistencia a los medicamentos. Ddx5 ΔEx12 no se expresó en las líneas celulares resistentes a GC (CEM-C3 y R5), que han sido seleccionados después de una exposición prolongada Dex. Ddx5 ΔEx12 se expresó en la línea celular parental, sino también en el subclon CEM / R30dm, que fue seleccionada para la resistencia al agente quimioterapéutico MTX en lugar de Dex. En las células cancerosas, PKM2 fue altamente expresado en comparación con su variante de empalme PKM1, pero la relación PKM2 / PKM1 era mayor en las células Dex-resistentes, como se sugiere por los resultados de NGS. Esto no se observó para Panc-1 muestra en comparación con su contraparte gemcitabina resistente y, de hecho, este gen candidato no estaba entrelos eventos estadísticamente significativas en el análisis esteras. Esto podría reflejar la diferente tipo de célula y el mecanismo de resistencia a las drogas inducida por la exposición gemcitabina.

    En conclusión, este protocolo constituye un enfoque adecuado para el descubrimiento de variantes de empalme que puede ser la base de resistencia a los medicamentos y se puede aplicar a cualquiera de las células leucémicas 30 o células de tumores sólidos 31. Una limitación clara es que las líneas de células tumorales capturar sólo una pequeña parte de la heterogeneidad cáncer. Por otra parte, la mayoría de líneas de células se han mantenido durante muchos años en monocapas en medios que promueven el crecimiento. Estas condiciones afectan a las características celulares, dando como resultado la selección de subpoblaciones que difieren drásticamente de las células de los tumores primarios de los que se originan. Sin embargo, muchos de los genes que están implicados en la resistencia a fármacos también están implicados en otras funciones celulares fundamentales, tales como el crecimiento celular y la apoptosis que pueden ser afectados por culturin largo plazo g en plástico. Por lo tanto, con el fin de mejorar el estudio de la resistencia a los medicamentos, más esfuerzo debe ser dirigido hacia el desarrollo de modelos preclínicos novedosos, tales como cultivos primarios y xenoinjertos, que imitan más de cerca el microambiente del cáncer in vivo a fin de evitar cambios relevantes en las características celulares causada por largos periodos de cultivo de células y condiciones de cultivo. 32 Sorprendentemente, nuestro protocolo se podría aplicar también a las células primarias, utilizando ensayos de citotoxicidad con el fin de determinar ex vivo valores de CI50. Otra limitación es que, puesto que existen muchos mecanismos de resistencia para cada fármaco contra el cáncer, los mecanismos similares o diferentes de resistencia podrían desarrollar en las células expuestas a los tratamientos idénticos pero independientes. Por lo tanto, una estrategia de selección comparativa debe involucrar a las selecciones y análisis paralelos, incluidos los análisis genéticos en las variantes de corte y empalme, de los mismos padres células tratadas con el mismo agente de quimioterapia.

    jove_content "> enfoques adicionales para la validación funcional debe estar dirigido a la sobreexpresión de la variante de empalme de interés en líneas celulares o específicamente regular a la baja su expresión mediante el uso de la interferencia de ARN o oligonucleótidos de empalme y cambio 33.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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