تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Immunology and Infection
 

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد جزيئات محملة حساسية التدفق الخلوي. المحيطة جزيئات الجسيمات يمكن أن يكون بمثابة ناقلات من المواد المسببة للحساسية كثف. نعرض هنا أن التدفق الخلوي، وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع لتوصيف المواد الصلبة العالقة> 0.5 ميكرون في القطر، ويمكن استخدامها لقياس هذه الجزيئات المحملة حساسية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Süring, K., Bach, S., Höflich, C., Straff, W. Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10. J. Vis. Exp. (117), e54721, doi:10.3791/54721 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

التدفق الخلوي هو الطريقة المستخدمة على نطاق واسع لقياس المواد الصلبة العالقة مثل الخلايا أو البكتيريا في نطاق حجم من 0.5 إلى عدة عشرات ميكرومتر في القطر. بالإضافة إلى توصيف خصائص مبعثر إلى الأمام وsideward، فإنه يمكن استخدام علامات الفلورسنت المسمى مثل الأجسام المضادة للكشف عن الهياكل المعنية. باستخدام تلوين الأجسام المضادة غير مباشر، التدفق الخلوي يعمل هنا لتحديد البتولا حساسية حبوب اللقاح (الرهان على وجه التحديد ضد 1) -loaded جزيئات 0.5 إلى 10 ميكرومتر في القطر في الجسيمات استنشاق (PM10، وحجم الجسيمات ≤10 ميكرون في القطر). الجسيمات PM10 قد تعمل كحاملات للحساسية كثف ربما تنقلهم إلى الجهاز التنفسي السفلي، حيث أنها يمكن أن تسبب الحساسية.

حتى الآن محتوى حساسية من PM10 تمت دراستها عن طريق انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISAs) والمجهر الإلكتروني. إليسا يقيس المنحل وليس الجسيماتحساسية -bound. مقارنة مع المجهر الإلكتروني، والتي يمكن تصور جزيئات محملة حساسية، التدفق الخلوي قد تقدير لهم بالإضافة إلى ذلك. كما محتوى حساسية من الهواء المحيط يمكن أن تحيد عن تعداد حبوب اللقاح البتولا، قد أعراض الحساسية ربما ترتبط بشكل أفضل مع التعرض لمسببات الحساسية من حبوب اللقاح مع العد. جنبا إلى جنب مع البيانات السريرية، والطريقة المعروضة يتيح الفرصة لاختبار في التجارب المستقبلية سواء من الحساسية لجلد ترتبط مستضدات حبوب اللقاح مع المحتوى حساسية بيت الخامس 1 من الجسيمات PM10> 0.5 ميكرون.

Introduction

ويجري النظر تلوث الهواء هو من الأسباب بيئيا هاما من ارتفاع نسبة وشدة الحساسية في الجهاز التنفسي لوحظ في العقود الأخيرة 1-3. وعلاوة على ذلك، كان هناك اهتمام متزايد في توزيع المواد المسببة للحساسية شيوعا في 4،5 الغبار.

البتولا حبوب اللقاح يمكن أن تثير حمى القش ولكن يمكن أيضا أن يكون الزناد هاما من الربو التحسسي 6-8. كله البتولا حبوب اللقاح ليس من المرجح أن يدخل الجهاز التنفسي السفلي أو التي يمكن العثور عليها في PM10 نتيجة لحجمه (22 ميكرون في القطر). ومع ذلك، المواد المسببة للحساسية حبوب اللقاح البتولا مثل بيت ت 1، المكون البتولا حبوب اللقاح المسببة للحساسية كبير، ويمكن الإفراج عن بعد لقاح تمزق 9 ويمكن ربط جزيئات الهواء المحيط 10، وبالتالي ربما يدخل الشعب الهوائية الجهاز التنفسي السفلي. وبالفعل، فقد تبين أن PM10 قد تحتوي على المواد المسببة للحساسية النشطة بيولوجيا كما يتبين من في المختبر تفعيل الأسسات من حبوب اللقاح المستلفت حساسية 11

وقد تمت دراسة الرهان ضد المحتوى 1 حساسية في عينات PM10 عن طريق استخراج المادة المسببة للحساسية منها والكمي لاحق مع إليسا 12-14. مع تقنية ELISA، تم قياس حساسية المنحل، ولكن كمية جزيئات محملة حساسية لا يزال مجهولا. وكشف المسح المجهر الإلكتروني الجسيمات محملة حساسية ولكن لم تسمح الكمي 10،15.

وتوظف هذه الدراسة التدفق الخلوي لقياس نسبة الجسيمات PM10 بيت ت 1 تحميلها في عينات الهواء المحيط. ويرجع ذلك إلى حد الكشف عن تدفق الكريات الجسيمات فقط أكبر من 0.5 ميكرون يمكن فحصها. و> 0.5 ميكرون جزء من PM10 سيتواصل يشار إلى PM10> 0.5.

Protocol

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تلطيخ غير مباشر من الجسيمات PM10 مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (وحيدة النسيلة الأجسام المضادة الماوس IgG1، استنساخ MA-3B4) ضد بيت ت 1، المكون البتولا حبوب اللقاح مستضد كبير، بالإضافة إلى Allophycocyanin (APC) -labeled الضد الثانوية (المضادة الأجسام المضادة -Mouse IgG1، استنساخ A85-1) وتحليلها لاحقا على تدفق عداد الكريات. مع الأجسام المضادة المناسبة الأخرى المتاحة، يمكن تمديد هذه الطريقة للكشف عن مستضدات أخرى متجهة إلى جزيئات الهواء المحيط.

1. PM10 أخذ العينات

  1. جمع PM10 من الهواء المحيط في تترافلوروإيثيلين (PTFE) مرشحات باستخدام حجم العينات منخفضة مع معدل تدفق 2.3 م 3 / ساعة (الشكل 1). تم العثور على توصيف العينات المستخدمة لوصف التجارب هنا في 16. إدارة الوقت يعتمد على مقدار PM10 الحاجة (عادة ما بين 1 و 10 يوما).
  2. في نهاية فترة الحضانة، وإزالة عامل التصفية من العينات وتجميده في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

شكل 1
الشكل 1. منخفضة العينات حجم PM10. مثال على انخفاض العينات حجم PM10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إزالة 2. PM10 وعدد الجسيمات

  1. السماح للذوبان تصفية PTFE لمدة 5 دقائق. ثم، وضع مرشح في polystyrol نظيفة طبق بتري (الشكل 2A). تأخذ طبق بيتري جديد لكل مرشح، إذا تم معالجة أكثر من مرشح واحد.
  2. وفي وقت لاحق، تراكب تصفية PTFE مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تم تأسيس هذا البروتوكول لتركيز PM10 النهائي من 8X10 6 الجسيمات لكل مليلتر (راجع الخطوة 3.3). للحصول على الأقل أن تركيز، استخدم حجم التجريبية التالية من برنامج تلفزيوني لتراكب تصفية مع: إذا كان وقت جمع PM10 < 2 أيام، استخدام 2 مل. لحضانة مرات ≥2 أيام، استخدام 4 مل.
    ملاحظة: من أجل زيادة تركيز الجسيمات من تعليق PM10، ومعلقات من مرشحات مختلفة يمكن تجميعها، إذا كان ذلك مناسبا.
  3. اضغط على فلتر PTFE مع ملاقط وفرشاة مع فرشاة الأسنان الكهربائية مع رئيس حساسة فرشاة لمدة 1 دقيقة (الأرقام 2B، 2C). نقل الجسيمات برنامج تلفزيوني تعليق، ووصف الآخرة تعليق PM10، إلى أنبوب رد فعل نظيفة.

الشكل 2
يتم وضع الشكل 2. إزالة PM10 مع فرشاة الأسنان الكهربائية. وهناك مرشح تترافلوروإيثيلين مع PM10 عينات في polystyrol طبق بتري (A) ومضافين مع 4 مل في برنامج تلفزيوني. ثم، يتم إزالة PM10 مع فرشاة الأسنان الكهربائية (B: وقبل تفريش وC: بعد تنظيف الأسنان بالفرشاة لمدة 1 دقيقة).= "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54721/54721fig2large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قياس تركيز الجسيمات PM10، على سبيل المثال، عن طريق استخدام عداد الجسيمات. تمييع على حجم كاف من PM10 تعليق مثل 50 ميكرولتر في 10 مل العازلة قياس متساوي التوتر، وقياس ثلاث مرات وحساب العدد الكلي متوسط ​​الجسيمات لكل مليلتر. تأكد من استخدام عداد الجسيمات التي يمكن الكشف عن الجسيمات من الحجم ذات الصلة.

3. بيت ت 1 تلطيخ

  1. حساب عدد من أنابيب رد فعل اللازمة لتحليل العينة: ثلاثة على الأقل هناك حاجة إلى أنابيب رد فعل: (ط) أنبوب واحد مع عينة فقط (مراقبة الأم) (ب) أنبوب واحد مع عينة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية (المراقبة السلبية)، و ( ج) أنبوب واحد مع عينة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأولية والثانوية (عينة محددة). إذا قيست لأول مرة، وإعداد اثنين على الأقل من أنابيب رد فعل ل(ط) (ب)،و (ج) أن يكون ما يكفي من المواد لضبط صحيح الكريات الإعدادات (راجع الخطوة 4.1).
  2. حساب كمية تعليق PM10 اللازمة لعدد من أنابيب رد فعل. كل أنبوب رد فعل يتطلب 50 ميكرولتر من تعليق.
  3. ضبط تركيز الجسيمات تقاس في الخطوة 2.4 لحجم تعليق المحسوبة في الخطوة 3.2 إلى تركيز النهائي من 8X10 6 جزيئات لكل مل عن طريق إضافة كمية مناسبة من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: قد يتم تجميد تعليق PM10 المتبقية في -20 درجة مئوية لمدة التجارب في المستقبل، على الرغم من هذا البروتوكول الطازجة ويوصى إعداد تعليق PM10.
  4. كتلة غير محددة ملزمة من قبل المكمل لتعليق PM10 مع زلال المصل البقري (BSA) بتركيز نهائي من 0.02٪، وذلك باستخدام محلول المخزون مثل 1٪ BSA أعد مع برنامج تلفزيوني. دوامة احتضان لفترة وجيزة ولمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. لكل عينة لتحليلها بواسطة التدفق الخلوي، ونقل 50 ميكرولتر من تعليق من الخطوة 3.4 إلى تيار مترددأنبوب رد فعل العجاف. إضافة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الماوس ضد بيت ت 1 بتركيز نهائي من 0.02 ميكروغرام / ميكرولتر للأنابيب رد الفعل المعينة لتلطيخ محددة، دوامة لفترة وجيزة واحتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    1. السماح للأنابيب رد فعل مع تعليق PM10-BSA المعينة لمراقبة الأم وسيطرة سلبية البقاء أيضا لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. غسل جميع العينات من خلال إضافة 500 ميكرولتر تستكمل برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ BSA لكل أنبوب رد فعل، لفترة وجيزة دوامة وأجهزة الطرد المركزي العينات في وقت لاحق في 4700 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف بعناية باستخدام مضخة فراغ.
  7. كرر الخطوة 3.6.
  8. تحديد المبلغ الإجمالي من الأجسام المضادة الثانوية المسمى APC المضادة للماوس IgG1 المطلوبة: 1 ميكروغرام الأجسام المضادة حله في 50 ميكرولتر تستكمل برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ BSA في أنبوب رد فعل. تخفيف كمية مناسبة من الأجسام المضادة مع حجم كل منها من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.02٪ BSA.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف لجميع أنابيب رد فعل إلا لأنبوب رد فعل معين للسيطرة الأم. تكملة هذا الأخير مع 50 ميكرولتر تستكمل برنامج تلفزيوني مع 0.02٪ BSA. دوامة جميع العينات لبضع ثوان.
  10. احتضان جميع العينات لمدة 30 دقيقة في الظلام.
  11. كرر الخطوة 3.6 ضعف.
  12. إضافة 50 ميكرولتر برنامج تلفزيوني على كل رد فعل أنبوب، دوامة وتحليل العينات على تدفق عداد الكريات.

4. تحليل التدفق Cytometric

  1. باستخدام جهاز التحكم الأم، وضبط ما يلي الكريات المعلمات لتحسين تحليل البيانات.
    1. باستخدام وحدة تحكم عتبة مبعثر إلى الأمام (FSC) المعروضة على لوحة التحكم الجهاز، تعيين عتبة FSC بأقل قيمة (200) والبدء في التحليل.
    2. باستخدام وحدة تحكم مبعثر الجهد، وضبط FSC والتشرذم sideward (SSC) بهذه الطريقة أن جميع الجسيمات PM10 يمكن الكشف عن وأن سكان جزيئات يقع تقريبا في عشرالبريد وسط محور FSC وفي النصف السفلي من محور SSC.
    3. باستخدام وحدة تحكم الجهد مضان، وضبط الجهد APC وآخر مضان الجهد مثل ثيوسيانات فلوريسئين (FITC)، التي لا تنبعث منها على نفس طول الموجة مثل APC، إذا لزم الأمر. تأكد من أن جميع الجسيمات واضحة في النصف السفلي من كلا المحورين مضان.
  2. على التوالي، فحص كل عينة بما في ذلك مراقبة الأم وتخزين البيانات FSC، SSC، APC، وFITC من لا يقل عن 10،000 الجزيئات في العينة.
  3. تقييم البيانات مع البرنامج منها. محتوى حساسية كثف في عينة محددة يمكن قياسها بطريقتين:
    1. تحليل كثافة مضان APC من جميع الجزيئات (القيمة الوسطية) كمقياس للبيت الخامس 1 تحميل على كل الجسيمات PM10.
      ملاحظة: إذا احتوت عينة محددة للحساسية، يجب أن APC كثافة مضان زيادة في عينة محددة بالمقارنة مع سيطرة سلبية. في المقابل، فلوري أخرىشدة escence (على سبيل المثال، FITC كثافة مضان) لا ينبغي أن تتغير بشكل ملحوظ.
    2. حساب النسبة المئوية من الجسيمات PM10 مع ملزمة لمكافحة بيت ت 1 الأضداد. وبالتالي، في السيطرة السلبية، تعيين بوابة حول الجزيئات تعتبر APC إيجابية، نسخ ولصق هذه البوابة في عينة محددة وطرح نسبة من الجسيمات الموجبة APC في سيطرة سلبية من نسبة الجسيمات الموجبة APC في عينة محددة.

Representative Results

وكميا الرهان ضد 1 حساسية الامتزاز في PM10> 0.5 الجزيئات التي تلطيخ الجسم المضاد غير المباشر وتحليلها لاحقا على تدفق عداد الكريات. خدم عينة PM10 من موسم حبوب اللقاح عالية كقالب. وكما ذكر في الخطوة 3.1، وتألفت سيطرة سلبية من الجسيمات PM10 حضنت مع APC المسمى الأجسام المضادة الثانوية فقط (الشكل 3A). الجسيمات PM10 ملطخة المضادة للبيت الخامس 1 الأجسام المضادة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية عرضها للحساسية تحميل الجسيمات (الشكل 3B). كما هو موضح في الخطوة 4.3، تم استخدام طريقتين لقياس حمولة حساسية: فمن ناحية، تم تحليل القيمة المتوسطة لكثافة مضان APC من جميع الجزيئات يجري 137 لسيطرة سلبية، و 904 لعينة محددة. من ناحية أخرى، تم تحديد نسبة الجزيئات مع ملزمة لمكافحة بيت ت 1 الأضداد: تم تعيين بوابة حول الجسيمات الموجبة APC في السيطرة السلبية وبعد ذلك شاركبييه ولصقها في عينة محددة. في سيطرة سلبية، اعتبرت 3٪ من الجسيمات PM10> 0.5 APC إيجابية. تم طرح هذه النسبة من الجسيمات إيجابية كاذبة من نسبة الجسيمات الموجبة في عينة محددة مما أدى إلى 77.5٪ APC PM10 الإيجابي> 0.5 الجزيئات في عينة محددة. لإثبات أن لاحظ ربط المضادة للبيت الخامس 1 الضد كان محددا، تم حجب قدرة ملزم مع المستضد المماثل السابق لتلطيخ. تقلص هذا الربط لمكافحة بيت ت 1 الأجسام المضادة بنسبة 69٪، إذا كان كميا بواسطة كثافة مضان APC، وبنسبة 84٪، إذا كان كميا عن طريق النسبة المئوية للبيت الخامس 1 PM10 الإيجابي> 0.5 الجسيمات (الشكل 3C).

الشكل (3)
الشكل 3. بيت ت 1 حساسية يمكن تصور التدفق الخلوي. APC كثافة مضان من عينة PM10 من عا محددة الجسيماتالموسم llen الملون فقط مع APC المسمى الأجسام المضادة الثانوية (A)، ملطخة المضادة للبيت الخامس 1 الأجسام المضادة الأولية وبعد ذلك مع APC المسمى الأجسام المضادة الثانوية (B)، وبعد منع الأجسام المضادة الأولية مع المؤتلف بيت ت 1 المستضد (C ). تم تعيين APC بوابة P + حول الجزيئات تعتبر APC الموجب (عرض باللون الأحمر) ويتم إعطاء نسب كل منها. وقد تم هذا الرقم معدلة بشكل طفيف من 11. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

لاختبار ما إذا كان يمكن اعتماد هذه الطريقة للكشف عن اختلافات في كمية كثف بيت ت 1 محتوى PM10> 0.5 عينات من ارتفاع ومن موسم حبوب اللقاح منخفضة، وقد تم تحليل 13 عينة PM10 من ارتفاع و 6 عينات PM10 من موسم حبوب اللقاح منخفضة. الشكل 4يصور اختلافات كبيرة في كثافة APC مضان وفي نسبة الرهان ضد 1 PM10 الإيجابي> 0.5 الجسيمات من العينات PM10 من موسم الذروة حبوب اللقاح مقارنة عينات PM10 من موسم حبوب اللقاح منخفضة. وأظهرت كلتا الطريقتين الكمي بموجب نتائج مماثلة.

الشكل (4)
الشكل 4. عينات PM10 من موسم حبوب اللقاح المنخفضة والعالية تختلف في قيمتها من بيت الخامس كثف وأخذت عينات 1. انخفاض PM10 موسم حبوب اللقاح في خريف / شتاء 2013 (ن = 6)، حبوب اللقاح موسم الذروة PM10 مايو 2012 و 2013 (ن = 13). (A) كثافة مضان APC من PM10> كانت 0.5 جزيئات من موسم حبوب اللقاح عالية أعلى بكثير من من موسم حبوب اللقاح منخفضة (متوسط / دقيقة / ماكس موسم الذروة حبوب اللقاح: 796/313/1097، متوسط / دقيقة / ماكس موسم منخفض حبوب اللقاح: 197 / 85/277). (ب) PM10 من موسم حبوب اللقاح عالية الواردة significanالمزيد من TLY بيت الخامس PM10 بفيروس 1> 0.5 الجسيمات PM10 من من موسم حبوب اللقاح منخفضة (متوسط / دقيقة / ماكس موسم الذروة حبوب اللقاح: 45.2 / 18.5 / 74.5، وأوسط / دقيقة / ماكس موسم منخفض حبوب اللقاح: 11.8 / 4.4 / 19.8). تظهر المؤامرات مربع القيم الوسيطة (الخط الداخلي للصندوق)، 25. و 75. النسب المئوية على التوالي (الحدود الدنيا والعليا من مربع) والحد الأدنى والحد الأقصى القيم (شعيرات). *** ع <0.001 مقابل موسم حبوب اللقاح منخفضة، مان ويتني U اختبار. وقد تم هذا الرقم معدلة بشكل طفيف من 11. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

خطوة مهمة من البروتوكول هو استخدام عامل تصفية مناسبة لجمع الجسيمات PM10 من الهواء المحيط (راجع الخطوة 1.1). المرشح يجب أن يكون قويا بما يكفي لتحمل تنظيف الأسنان بالفرشاة مع فرشاة الأسنان الكهربائية، وليس كل مواد التصفية الوفاء بهذا الشرط. تأسست بروتوكول تلطيخ مع تركيز الجسيمات PM10 من 8X10 6 الجسيمات لكل مليلتر. ولكن إذا كانت المادة محدودة وتجميع عينات غير مناسب، فإن الطريقة ربما تعمل بشكل جيد، ولكن تركيز الأجسام المضادة (انظر الخطوات 3.5 و 3.8) قد تضطر إلى تعديل.

لم الرهان ضد 1 تلطيخ الجسيمات PM10 لا يؤدي إلى السكان متميزة من الجسيمات ملطخة سلبا وإيجابا. قد يكون ذلك بسبب وكميات متفاوتة من بيت ت 1 حساسية كثف إلى كل من الجسيمات التي تتراوح بين القليل جدا حتى على كمية عالية. وهذا يمكن أن يؤدي إلى التوسع في إشارة APC وبالتالي تحول السكان نحوAPC الإيجابية. كما أنه من الصعب فصل إيجابية من الجزيئات السلبية، واستخدمت طريقتين الكمي لتحديد الاختلافات في المحتوى بيت الخامس 1 من PM10> 0.5 العينات: (ط) الكمي النسبي عن طريق قياس متوسط APC كثافة مضان من كل الجسيمات ، و (ب) تحديد نسبة الجسيمات الموجبة APC. وفيما يتعلق ضد 1 تحميل بيت من جزيئات من انخفاض وارتفاع حبوب اللقاح الموسم PM10> 0.5، كشفت كلتا الطريقتين نتائج مماثلة. ومع ذلك، ينصح الكمي النسبي كثافة مضان متوسط ​​جميع الجسيمات كما هو مستقل من وضع البوابة وبالتالي أقل على الأرجح عرضة للخطأ.

حتى الآن العديد من الدراسات بفحص محتوى حساسية في المحيط الجسيمات الهواء عن طريق استخراج المادة المسببة للحساسية منها والكمي لاحق مع إليسا 5،12-14،17. هناك فرق جوهري بين الإجراء وصفها هنا وquantificatioن مع إليسا: ELISA الكمي للمستضد استخراج وحلت، في حين أن التدفق الخلوي يحلل مستضد بالجسيمات. بواسطة ELISA الرهان ضد 1 تحميل من العينات PM10 اختبار (ن = 8) كان أقل من الحد الكشف عن 1.2 نانوغرام / مل (لا تظهر البيانات). وبالمثل، حدد Buters وغيرها لا رهان ضد 1 في PM <2.5 ميكرون جزء وحوالي 7٪ فقط في 10 ميكرون> PM> 2.5 ميكرون جزء، ولكن أكثر من 93٪ في PM> 10 ميكرون جزء من الهواء المحيط 13. ، قد يكون السبب في النتائج المتناقضة لإليسا من جهة وتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من جهة أخرى من خلال أوجه الاختلاف في طريقة الكشف بالتزامن مع الحساسية المختلفة. مزيد من البحث ولكن هناك حاجة إلى فهم كامل هذا الاختلاف.

وهناك طريقة لتصور الجسيمات ملزمة مستضد والمجهر الإلكتروني 10،14. بواسطة المجهر الإلكتروني، Ormstad آخرون بيت تصور الخامس 1 على سطح لامع الجسيمات العالقةجزيئات السخام ص العينات التي أخذت في موسم حبوب اللقاح عالية وبدرجة أقل على جزيئات العينة في موسم منخفض حبوب اللقاح 15. بالإضافة إلى ذلك، تم العثور على المواد المسببة للحساسية من حبوب اللقاح، لاتكس، وكذلك جلوكان بيتا إلى أن كثف لجسيمات الاحتراق في الهواء المحيط 10. هذه الطريقة، ومع ذلك، لا يسمح الكمي لحساسية محددة الجسيمات.

عن طريق استخدام التدفق الخلوي، يمكن أن يكون كميا-بالجسيمات بيت ت 1 حساسية. وهكذا، التدفق الخلوي قد توفر وسيلة جديدة لوصف جزء البيولوجي للPM10 10-،5 ميكرون كما هو الحال مع الأجسام المضادة أخرى مناسبة في متناول اليد، ويمكن تمديد هذه الطريقة للكشف عن مستضدات أخرى على جزيئات الهواء المحيط، على سبيل المثال، العفن، عث الغبار المواد المثيرة للحساسية أو لبس. كما الجسيمات PM10 كثف المواد البيولوجية فحسب، ولكن أيضا المواد الكيميائية والمعادن بسهولة تامة، غير محددة ملزمة من الأجسام المضادة يمكن، مع ذلك، يشكل مشكلة. إذا تم اختبار الأجسام المضادة الجديد، خطوة حاسمة هي لإثبات مأزق معينجي. ويمكن أن يتم ذلك من خلال، على سبيل المثال، وعرقلة قدرة ملزمة من الأجسام المضادة المحددة مع المستضد المماثل السابق لتلطيخ 11.

كما بيت ت 1 المحتوى من الهواء المحيط يمكن أن تختلف من البتولا عدد حبوب اللقاح 12،13،18، قد أعراض الحساسية ربما ترتبط بشكل أفضل مع مستوى حساسية من حبوب اللقاح مع الاعتماد 14،18. وبالتالي، فإن الطريقة المعروضة بالتزامن مع البيانات السريرية يمكن أن تدرس في التجارب المستقبلية سواء من الحساسية لالبتولا تتوافق مع الحمل حساسية بيت الخامس 1 من PM10> 0.5.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Teflon filter Pall Life Sciences, USA R2PL047 47 mm, 1.0 µm
low volume sampler Sven Leckel Ingenieur Büro GmbH, Germany LVS3 air flow of 2.3 m3/hr
Phosphate-buffered saline Biochrom, Germany L1825 without Ca/Mg, low endotoxin
electrical toothbrush  Braun, Germany Oral-B Vitality Sensitive
Casy cell counter  Schärfe System GmbH, Germany Model TTC range of detectable particle size: 0.7 µm to 45 µm
FACSCanto II  Becton Dickinson, USA 3-laser, 8-color (4-2-2)
FACS Diva Software v6.1.3  Becton Dickinson
bovine serum albumin (BSA)  Sigma-Aldrich, USA A2153-10G
monoclonal mouse IgG1 antibody against Bet v 1 Indoor Biotechnologies, UK  MA-3B4 clone MA-3B4
APC (Allophycocyanin)-labeled secondary anti-Mouse IgG1 antibody  Becton Dickinson 560089 clone A85-1
SPSSTM software version 18  PASW Statistics 18, Hongkong, China
Petri Dish Gosselin, France BP50-02 D 55 mm, H 15 mm
FACS Tube  Becton Dickinson, USA REF 352054 5 ml Polystyrene
CASYton Roche
Germany
REF 05651808001
Matrix Blank Tubes Thermo Scientific, USA 4140 1.4 ml, PP
Centrifuge Heraeus, Thermo Scientific Megafuge 40R
Vacuum Pump INTEGRA Biosciences AG, Switzerland Model 158 320 Inetrgra Vacusafe
recombinant Bet v 1a antigen  Indoor Biotechnologies, UK LTR-BV1A-1 Concentration: 2.0 mg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cakmak, S., Dales, R. E., Coates, F. Does air pollution increase the effect of aeroallergens on hospitalization for asthma? J Allergy Clin Immunol. 129, (1), 228-231 (2012).
  2. Barraza-Villarreal, A., et al. Air pollution, airway inflammation, and lung function in a cohort study of Mexico City schoolchildren. Environ Health Perspect. 116, (6), 832-838 (2008).
  3. Chen, B. Y., et al. The association of ambient air pollution with airway inflammation in schoolchildren. Am J Epidemiol. 175, (8), 764-774 (2012).
  4. Cyprowski, M., Buczynska, A., Szadkowska-Stanczyk, I. Indoor allergens in settled dust from kindergartens in city of Lodz, Poland. Int J Occup Med Environ Health. 26, (6), 890-899 (2013).
  5. Brough, H. A., et al. Distribution of peanut protein in the home environment. J Allergy Clin Immunol. 132, (3), 623-629 (2013).
  6. Galli, S. J., Tsai, M., Piliponsky, A. M. The development of allergic inflammation. Nature. 454, (7203), 445-454 (2008).
  7. World Health Organisation, R. O. f. E. Phenology and human health: allergic disorders: report on WHO meeting Rome, Italy. 16-17 January 2003, Copenhagen, Denmark, WHO Regional Office for Europe. Chicago. 256 (2003).
  8. Wuthrich, B., Schindler, C., Leuenberger, P., Ackermann-Liebrich, U. Prevalence of atopy and pollinosis in the adult population of Switzerland (SAPALDIA study). Swiss Study on Air Pollution and Lung Diseases in Adults. Int Arch Allergy Immunol. 106, (2), 149-156 (1995).
  9. Grote, M., Valenta, R., Reichelt, R. Abortive pollen germination: a mechanism of allergen release in birch, alder, and hazel revealed by immunogold electron microscopy. J Allergy Clin Immunol. 111, (5), 1017-1023 (2003).
  10. Namork, E., Johansen, B. V., Lovik, M. Detection of allergens adsorbed to ambient air particles collected in four European cities. Toxicol Lett. 165, (1), 71-78 (2006).
  11. Süring, K., et al. PM10 contains particle-bound allergens: Dust analysis by Flow Cytometry. Env Technol Inn. 5, 60-66 (2016).
  12. Schappi, G. F., Suphioglu, C., Taylor, P. E., Knox, R. B. Concentrations of the major birch tree allergen Bet v 1 in pollen and respirable fine particles in the atmosphere. J Allergy Clin Immunol. 100, (5), 656-661 (1997).
  13. Buters, J. T., et al. The allergen Bet v 1 in fractions of ambient air deviates from birch pollen counts. Allergy. 65, (7), 850-858 (2010).
  14. Buters, J. T. M., et al. Release of Bet v 1 from birch pollen from 5 European countries. Results from the HIALINE study. Atmos Environ. 55, 496-505 (2012).
  15. Ormstad, H., Johansen, B. V., Gaarder, P. I. Airborne house dust particles and diesel exhaust particles as allergen carriers. Clin Exp Allergy. 28, (6), 702-708 (1998).
  16. Sven Leckel Ingenieurburo GmbH. LVS3/MVS6. Available from: http://www.leckel.de/index.php?option=com_docman&task=doc_download&gid=18 (2016).
  17. Brough, H. A., et al. Peanut protein in household dust is related to household peanut consumption and is biologically active. J Allergy Clin Immunol. 132, (3), 630-638 (2013).
  18. Jochner, S., et al. Seasonal variation of birch and grass pollen loads and allergen release at two sites in the German Alps. Atmos Env. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics