उपयोग कार्यात्मक जीनोमिक्स स्क्रीनिंग कैंसर सेल उपगोल संस्कृतियों में संभावित उपन्यास ड्रग लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

Cancer Research
 

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Morrison, E., Wai, P., Leonidou, A., Bland, P., Khalique, S., Farnie, G., Daley, F., Peck, B., Natrajan, R. Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures. J. Vis. Exp. (118), e54738, doi:10.3791/54738 (2016).

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Abstract

कैंसर में कार्यात्मक चालक की घटनाओं की पहचान उपन्यास दवा लक्ष्यों की अगली पीढ़ी की खोज के लिए कैंसर जीव विज्ञान के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए केंद्रीय और अपरिहार्य है। यह स्पष्ट है कि कैंसर के और अधिक जटिल मॉडल पूरी तरह से योगदान कारक है कि इन विवो में tumorigenesis ड्राइव और उपन्यास चिकित्सा कि क्लिनिकल परीक्षण के लिए पूर्व नैदानिक मॉडल से संक्रमण बनाने की प्रभावकारिता को बढ़ाने की सराहना करने के लिए आवश्यक हैं होता जा रहा है।

यहाँ हम वर्दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर spheroids पैदा करने के लिए एक पद्धति है कि siRNA कार्यात्मक स्क्रीनिंग के अधीन किया जा सकता उपस्थित थे। ये spheroids कई विशेषताएं है कि ठोस ट्यूमर है कि परंपरागत दो आयाम संस्कृति में मौजूद नहीं हैं में पाया जाता है प्रदर्शित करते हैं। हम बताते हैं कि कई आमतौर पर इस्तेमाल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों इस प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी हैं। इसके अलावा, हम सबूत की सिद्धांत स्तन कैंसर कोशिका लाइन BT474 उपयोग डेटा प्रदान करते हैं, इस बात की पुष्टि उनकीepidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर HER2 और phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase (PIK3CA) के उत्परिवर्तन के प्रवर्धन पर निर्भरता जब ट्यूमर spheroids के रूप में हो। अंत में, हम आगे की जांच और इन immunohistochemistry का उपयोग निर्भरता के स्थानिक प्रभाव पुष्टि करने के लिए सक्षम हैं।

Introduction

ठोस ट्यूमर महत्वपूर्ण ऊतकीय, जेनेटिक और सूक्ष्म पर्यावरण इंट्रा-ट्यूमर विविधता है, जो रोगियों को सफलतापूर्वक इलाज करने में सक्षम होने के नाते में एक महत्वपूर्ण चुनौती के साथ चिकित्सकों प्रस्तुत प्रदर्शित करते हैं। उपन्यास की पहचान करने के लिए इस्तेमाल मॉडल के बहुमत लक्षित चिकित्सा इन सुविधाओं के कई शामिल नहीं है। दरअसल, वर्तमान लक्षित क्लिनिक में उपयोग उपचारों स्क्रीनिंग दृष्टिकोण है कि दो-आयामी (2 डी) संस्कृति परिस्थितियों में विकसित कैंसर कोशिका लाइनों पर भरोसा रोजगार पिछले एक दशक में विकसित किया गया है। हालांकि इस तरह के रिसेप्टर tyrosine काइनेज अवरोधकों के रूप में विभिन्न सफलताओं, के बारे में लाया गया है, यह स्पष्ट कैंसर के और अधिक जटिल मॉडल पूरी तरह से योगदान कारक है कि इन विवो में tumorigenesis ड्राइव और नए उपचारों कि से संक्रमण बनाने की संख्या में वृद्धि की सराहना करने के लिए आवश्यक हैं कि बनता जा रहा है क्लिनिकल परीक्षण के लिए पूर्व नैदानिक ​​मॉडल। इसके अलावा, यह अब अच्छी तरह से सराहना की है कि 2 डी संस्कृति प्रणालियों में प्रतिबिंबित करने के लिए असफलव्यवहार 1,2 विवो। उदाहरण के लिए, खराब vascularized ट्यूमर में, microenvironment के भीतर ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के लिए मांग आपूर्ति के रूप में आगे बढ़ना, उच्च और निम्न प्रसव के क्षेत्रों का विकास। कम ऑक्सीजन (हाइपोक्सिया) ट्यूमर में की उपस्थिति, के रूप में इस तरह के कार्बोनिक anhydrase IX (CAIX) के रूप में स्थापित hypoxic मार्करों के लिए ट्यूमर वर्गों के immunohistochemical धुंधला द्वारा पता लगाया, जैसे 3,4 इस प्रकार को शामिल सुविधाओं स्तन कैंसर में एक गरीब नैदानिक परिणाम के साथ संबद्ध स्क्रीनिंग मॉडल में हाइपोक्सिया उपन्यास दवा लक्ष्य है कि इन विवो में और अधिक प्रभावशाली हो जाएगा खोजने के लिए अपनी क्षमता में वृद्धि हो सकती है। दरअसल, सफलतापूर्वक लक्षित कर आक्रामक ट्यूमर है कि हाइपोक्सिया शामिल एक नैदानिक प्राथमिकता 5 है।

पारंपरिक 2 डी siRNA स्क्रीनिंग के फेरबदल, और अधिक सही शर्तों ट्यूमर microenvironment में कैंसर की कोशिकाओं द्वारा सामना की तत्वों पुनरावृत्ति करने की कोशिश में, कई जीनों की पहचान वीं के लिए प्रेरित कियापर इन विवो में ट्यूमर के विकास के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए पाया गया है। इन कार्यात्मक जीनोमिक कम सीरम की स्थिति 6, hypoxic शर्तों के तहत 7 और 8 संयोजन में प्रदर्शन स्क्रीन शामिल हैं। उदाहरण के लिए, 6-Phosphofructo-2-kinase / फ्रुक्टोज-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), एक प्रोटीन कार्बन में प्रवेश ग्लाइकोलाइसिस को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार के मुंह बंद करने के लिए, केवल प्रोस्टेट कैंसर मेटास्टेसिस से निकाली गई लाइनों में apoptosis जब कम सीरम में उगाया प्रेरित किया। एक ही परिस्थितियों में सामान्य प्रोस्टेट सेल लाइनों में PFKFB4 का मुंह बंद कोई प्रभाव नहीं पड़ा है, जबकि, PFKFB4 की कमी पूरी तरह से ablated प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन के विकास Xenografts 6।

स्तन कैंसर कोशिका लाइनों की एक विस्तारित पैनल में, मोनो carboxylase ट्रांसपोर्टर 4 (MCT4) का मुंह बंद करने रियायत के तौर पर कम ऑक्सीजन की शर्तों के तहत सेल लाइन के विकास की कमी के लिए नेतृत्व किया। इस कमजोरी का स्तन कैंसर कोशिका लाइन orthotropic xenogra इन विवो में मान्य किया गया थाFTS। पोषक तत्व तनाव की स्थिति के तहत शायद सबसे ऊँची, एसिटाइल सीओए synthetase 2 (ACSS2), एक एंजाइम एसिटाइल सीओए में एसीटेट बदलने के लिए जिम्मेदार का मुंह बंद करने, कम कैंसर सेल नंबर (कम ऑक्सीजन और सीरम), लेकिन सामान्य संस्कृति की शर्तों के तहत कम या कोई प्रभाव नहीं पड़ा 8। ACSS2 पृथक सुझाव है कि पोषक तत्वों की ढ़ाल ट्यूमर microenvironment के भीतर और कहा कि कोशिकाओं है कि इन क्षेत्रों में रहते हैं ट्यूमर प्रगति 8 के लिए आवश्यक हैं अलगाव में मौजूद नहीं है स्तन और प्रोस्टेट कैंसर xenografts के विकास को प्रभावित किया। इसके अलावा, ACSS2 भी ग्लियोब्लास्टोमा और हेपैटोसेलुलर कार्सिनोमा 9,10 में महत्वपूर्ण होने के लिए, सुझाव ट्यूमर में वृद्धि हुई ACSS2 गतिविधि एक मौलिक तंत्र प्रतिकूल परिस्थितियों के तहत विकास का समर्थन करता है कि हो सकता है कि पाया गया था।

सामूहिक रूप से, इन अध्ययनों साबित होता है कि स्थितियों में विवो का सामना करना पड़ा recapitulating और siRNA स्क्रीन प्रदर्शन जी की पहचान के लिए अनुमति देता हैकैंसर अस्तित्व के लिए आवश्यक Enes। के रूप में अच्छी तरह से पोषक तत्व तनाव की शर्तों के तहत 2 डी कैंसर कोशिकाओं के विकास को प्रभावित के रूप में, इन अध्ययनों में लक्ष्य जीन की कमी कैंसर कोशिका लाइन अंडाकार आकृति विकास हिचकते, मिरर क्या ट्यूमर xenografts 6.8 में मनाया गया। इस प्रकार, कैंसर कोशिका लाइन spheroids ट्यूमर microenvironment में सामना की स्थिति है कि ACSS2 मुंह बंद करने के लिए संवेदनशीलता प्रदान के कई होते हैं। दरअसल, spheroids पोषक तत्व ढ़ाल (सीरम और ऑक्सीजन), पीएच में परिवर्तन प्रदर्शित, तीन आयामी (3 डी) सेल सेल से संपर्क करें, लेकिन यह भी, सेल चक्र गिरफ्तारी और apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं के साथ proliferative ज्लदी में परिवर्तन। यह परिगलित क्षेत्रों के कैंसर spheroids में उपस्थिति द्वारा उदाहरण है, एक विशेषता यह पारंपरिक 2 डी संस्कृति में नहीं मिला।

कैंसर सेल spheroids पहले से ही छोटे अणु अवरोधकों स्क्रीन करने के लिए और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह केवल यौगिक प्रभावकारिता के सत्यापन या कम्पो की repurposing के लिए अनुमति देता हैunds मूल रूप से अन्य रोगों 11 के लिए डिजाइन। वर्तमान अंडाकार आकृति स्क्रीनिंग तरीकों उच्च सामग्री ढंग का एक उच्च throughput में विशिष्ट जीन की कमी के विश्लेषण के लिए अनुमति नहीं है। यहाँ, हम पहली बार के लिए का वर्णन है, कैंसर कोशिका लाइन spheroids में छोटे दखल शाही सेना (siRNA) तकनीक का उपयोग विशेष जीन निर्भरता को उजागर करने के लिए एक कार्यात्मक जीनोमिक्स पाइपलाइन। हम मानव स्तन कैंसर में 200 सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन को निशाना siRNAs के साथ एक bespoke पुस्तकालय बनाया गया है और BT474 स्तन कैंसर spheroids में अंडाकार आकृति आकार और चयापचय गतिविधि पर जीन की कमी के प्रभाव का आकलन किया। हम मजबूती के साथ और reproducibly ErbB2 और PIK3CA 3 डी संस्कृतियों में मुंह बंद के प्रभाव का पता लगाने में सक्षम थे। इसके अलावा, हम immunohistochemistry का उपयोग BT474 spheroids के स्थानिक संरचना पर जीन की कमी के प्रभाव का आकलन कर सकता है।

Protocol

1. 96 अच्छी तरह से siRNA प्लेट्स की तैयारी

नोट: एक 96 अच्छी तरह से थाली के बाहरी किनारों अधिक अन्य कुओं की तुलना में वाष्पीकरण होने का खतरा है, इस प्रकार 60 प्रति 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए siRNAs की राशि की सीमा। सादे मध्यम या पीबीएस के साथ बाहरी कुओं में भरें इस सीमा। इसके अलावा, हिट की एक मान्यता स्क्रीन प्लेट पूर्वाग्रहों को दूर करने के लिए सिफारिश की है।

  1. अल्ट्रा कम लगाव थाली के उचित कुओं को 10 μL 500 एनजी / कम सीरम माध्यम में μL (निर्माता की सिफारिशों के अनुसार) और विभाज्य - 250 siRNAs पतला। तीन प्रतियों में सभी स्क्रीन प्रदर्शन करना।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए अभिकर्मक दक्षता का आकलन किया जा सकता है प्लेट डिजाइन में उचित गैर-लक्ष्य (नकारात्मक) और (जैसे UBB और PLK1 के रूप में सकारात्मक,) की मौत हो गई siRNA नियंत्रण शामिल। siRNA काम के लिए कम लगाव प्लेटों का उपयोग महत्वपूर्ण है, के रूप में कोशिकाओं अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए जोड़ दिया जाएगा। हम इनकार नहीं कर सकते कि कुछ निर्माताओं अल्ट्रा कम लगावप्लेटों अंडाकार आकृति विकास पर सूक्ष्म प्रभाव हो सकता है। जैसे हम अनुशंसा करते हैं कि इन अंत उपयोगकर्ता द्वारा परीक्षण कर रहे हैं।
  2. चिपकने वाला जवानों और -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान के साथ कवर प्लेट।

2. सेल लाइन के रिवर्स अभिकर्मक

  1. स्क्रीन के दिन, कमरे के तापमान पर प्लेटों defrost और एक बेंच शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 1,000 XG पर 5 मिनट के लिए स्पिन। प्रत्येक अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए अनुकूलित अभिकर्मक अभिकर्मक युक्त सीरम कम हो माध्यम के 10 μL जोड़ें। अभिकर्मक siRNA युक्त फार्म के लिए परिसरों के लिए 15 मिनट के लिए प्लेटों छोड़ दें।
    नोट: इस अध्ययन कार्यात्मक जीनोमिक स्क्रीनिंग के लिए स्तन कैंसर कोशिका लाइन BT474 (उच्च ग्लूकोज DMEM में सुसंस्कृत (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक) का उपयोग किया।
  2. कोशिकाओं की जांच की जा करने के लिए (0.05% trypsin और 0.53 मिमी EDTA) जब तक वे कुप्पी से अलग, सेल लाइन विशिष्ट की उचित मात्रा का उपयोग बेअसर Trypsinizeआईसी मध्यम और 1000 XG पर 5 मिनट के लिए स्पिन एक बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र पर trypsin हटा दें। मध्यम का एक उचित मात्रा के साथ कोशिकाओं resuspend और एक सेल काउंटर का उपयोग सटीक सेल नंबर का निर्धारण।
    नोट: आमतौर पर अच्छी तरह से प्रति 5,000 कोशिकाओं सबसे सेल का परीक्षण लाइनों के पार अंडाकार आकृति गठन के लिए पर्याप्त हैं। यह सही सटीक आकार की तुलना के लिए एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में कोशिकाओं की गिनती करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. ठंड मध्यम (4 डिग्री सेल्सियस) में प्रति 180 μL 5000 कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं पतला।
    नोट: पुनर्गठन तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स घटकों के अलावा नकारात्मक अभिकर्मक दक्षता पर असर पड़ेगा और यह सिफारिश की है कि यह नहीं किया जाता है। सेल लाइन अनुकूलन अंडाकार आकृति बनाने की क्षमता की पुष्टि के लिए और पछाड़ना प्रभावकारिता स्क्रीन करने के लिए पहले किया जाना चाहिए।
  4. , Pipet मिश्रण और 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव siRNA पहले से तैयार (2.1) युक्त थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 180 μL जोड़ने के लिए एक जलाशय के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण।
  5. Centrifugई 10 मिनट के लिए एक precooled 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र में 1,000 XG पर प्लेट और उसके बाद एक 37 डिग्री सेल्सियस टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में लौटने।
  6. नोट: कोशिकाओं कुओं के तल में एक पच्चीकारी के रूप में दिखाई देगा। अगले 12 ओवर - 24 h कोशिकाओं को एक साथ कुल एक भी क्षेत्र के रूप में होगा।
  7. 24 घंटे के बाद, निरीक्षण कोशिकाओं अच्छी तरह से केंद्र में एक भी अंडाकार आकृति के रूप में। विकास को प्रोत्साहित करने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पूरा मध्यम के 100 μL जोड़ें।
  8. तीन दिनों के बाद मध्यम भरपाई होगी। धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक से माध्यम के 100 μL हटाने और ताजा माध्यम के 100 μL जोड़ें।
  9. 7 दिन, एक प्लेट रीडर है कि मात्रात्मक समय के साथ अंडाकार आकृति विकास निगरानी कर सकते हैं पर स्वचालित अंडाकार आकृति आकार यों (धारा 3 देखें)।
  10. बाद में, एक luminescent सेल व्यवहार्यता डाई (धारा 4 देखें) का उपयोग सेल व्यवहार्यता का निर्धारण।

3. स्वचालित छवि अधिग्रहण

  1. कोशिकामापी 7 दिन पर एक बेंच शीर्ष, सूक्ष्म अच्छी तरह से थाली इमेजिंग पर प्लेटें स्कैन करें।
      <li> सॉफ्टवेयर खोलें, निम्न चुनें: '96 -अच्छी तरह प्लेट ', उचित प्लेट प्रकार का चयन करें और एक प्रयोग के नाम दर्ज करें। नोट: किसी भी अतिरिक्त जानकारी भी सॉफ्टवेयर में जोड़ा जा सकता है।
    1. 'Tumorsphere' आवेदन का चयन करें। फोकस बदल कि अंडाकार आकृति ध्यान में है और इष्टतम विपरीत है।
      नोट: हम अनुशंसा करते हैं 'छवि आधारित फोकस' अंडाकार आकृति आकारों में के रूप में महत्वपूर्ण बदलाव की उम्मीद कर रहे हैं।
    2. कुओं कि स्कैनिंग और 'आरंभ स्कैन' की आवश्यकता का चयन करें।
    3. प्लेट स्कैनर सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, यह सुनिश्चित करें कि वस्तु मुखौटा सही अंडाकार आकृति आकार का प्रतिनिधित्व करता है। कॉलोनी व्यास, सीमा फैलाव, न्यूनतम मोटाई और सटीक सेटिंग्स का समायोजन करके यह मत करो, प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए विशिष्ट 11,12 परीक्षण किया।
      ध्यान दें: अंडाकार आकृति के क्षेत्र में तो सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म का उपयोग कर की गणना की जाएगी। उदाहरण के लिए, सही सात दिनों के लिए उगाया BT474 spheroids के क्षेत्र की गणना करने के लिए 'उच्च' एक सटीक समायोजितडी 200 माइक्रोन के लिए न्यूनतम कॉलोनी व्यास निर्धारित किया है। इस अंडाकार आकृति क्षेत्र का एक उचित अंडाकार आकृति मुखौटा प्रतिनिधि उत्पादन करना चाहिए।
      नोट: ये आंकड़े तो मशीन से, निर्यात समारोह का उपयोग, में एक एनोटेट डेटा फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जा सकता है। दिनांक प्लेट मंझला सामान्यीकृत, संयुक्त और या तो विश्लेषण किया जेड स्कोर या सख्ती से मानकीकृत मतलब अंतर (SSMD) द्वारा siRNAs कि अंडाकार आकृति क्षेत्र पर एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा पहचान है।

4. सेल व्यवहार्यता का निर्धारण

  1. बाद अंडाकार आकृति क्षेत्र गणना की गई है, व्यवहार्यता एक luminescent व्यवहार्यता सेल डाई का उपयोग का निर्धारण। निर्माता के निर्देशों के अनुसार अभिकर्मक तैयार करें।
  2. ध्यान से अच्छी तरह से प्रत्येक से माध्यम के 100 μL हटाने और व्यवहार्यता डाई के 100 μL जोड़ें। सेते 15 मिनट के लिए प्लेटें तो एक luminescent प्लेट रीडर का उपयोग स्कैन।
    नोट: ये आंकड़े तो मशीन से, निर्यात समारोह का उपयोग, में निर्यात किया जा सकताएक एनोटेट डेटा फ़ाइल के रूप में। दिनांक प्लेट मंझला सामान्यीकृत, संयुक्त और या तो विश्लेषण किया जेड स्कोर या सख्ती से मानकीकृत मतलब अंतर (SSMD) द्वारा siRNAs कि अंडाकार आकृति व्यवहार्यता पर एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा पहचान है।

Representative Results

अल्ट्रा कम लगाव 96 अच्छी तरह प्लेटें में अंडाकार आकृति assays के एक संदर्भ है कि और अधिक आसानी से विवो में ट्यूमर में पाया शारीरिक शर्तों के स्मरण दिलाता में संभावित oncogenicity के लिए एक उच्च throughput प्ररूपी मूल्यांकन प्रदान करते हैं। दरअसल, कैंसर कोशिका लाइनों MCF10DCIS.com और BT474 प्रपत्र तंग अंडाकार आकृति संरचनाओं (चित्रा 1 ए) और अंडाकार आकृति वर्गों के immunohistological जांच सेलुलर और परमाणु आकृति विज्ञान में अलग स्थानिक परिवर्तन दिखाया। समय के साथ, इस तरह के BT474 spheroids के रूप में कुछ spheroids परिगलित क्षेत्रों, आक्रामक ठोस ट्यूमर (चित्रा 1 बी) के एक आम सुविधा का विकास। कुछ ऐसे spheroids एमडीए MB-231 सेल लाइन के रूप में परिगलित कोर, विकसित नहीं है, लेकिन proliferative मार्कर Ki67, जो व्युत्क्रमानुपाती cleaved caspsase -3 अभिव्यक्ति, apoptosis के एक मार्कर (चित्रा 1 सी) के साथ संबद्ध में प्रदर्शन चिह्नित भिन्नता नहीं है। स्थापित करने के लिए है कि कई सेल लाइनों वास्तव में रिसेप हैंsiRNA मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने के लिए BT474 ेश्य, MCF10DCIS.com, एमडीए MB-231 और JIMT1 कोशिकाओं रिवर्स सात दिनों के लिए siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। जबकि सभी सेल लाइनों का परीक्षण (चित्रा -1) में आवश्यक जीन Ubiquitin बी (UBB) काफी कम अंडाकार आकृति व्यवहार्यता का मुंह बंद अभिकर्मक अभिकर्मक (नकली) या नियंत्रण siRNAs की अभिकर्मक की उपस्थिति, अंडाकार आकृति व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

हम एक मानव siRNA पुस्तकालय है कि अचयनित में सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन, ईआर +, HER2 + और ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर घेर बनाया गया है। इस पुस्तकालय में इस तरह के MYC, PIK3CA और TP53 और उन जिनके योगदान कैंसरजनन करने के लिए स्थापित नहीं है के रूप में जाना जाता समारोह के जीन, के होते हैं। स्क्रीन भी कई गैर-लक्ष्य नियंत्रण siRNAs होता है (नियंत्रण # 1, नियंत्रण # 2) और siRNAs ऐसे PLK1 और UBB के रूप में आवश्यक जीन है, जो हत्या के नियंत्रण (तालिका 1) के रूप में कार्य निशाना। हम स्तन CANC का उपयोग करने के लिए चुनाएर सेल लाइनों BT474 के रूप में वे आसानी से पुनर्गठन तहखाने झिल्ली के अलावा बिना spheroids फार्म, workhorse सेल लाइनों की स्थापना की और एक ज्ञात जीनोमिक वास्तुकला कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, BT474 कोशिकाओं, एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर +) के लिए सकारात्मक रहे हैं मानव epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर 2 (HER2 +) और बंदरगाह म्यूटेशन TP53 (E285K) और PIK3CA (K111N) 13 में overexpress।

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल को रोजगार, हम पर नजर रखी प्रभाव जीन कमी siRNA रिवर्स अभिकर्मक के सात दिनों (चित्रा 1E) के बाद अंडाकार आकृति आकार और व्यवहार्यता पर था। दिलचस्प है, जीन के बहुमत अंडाकार आकृति क्षेत्र या व्यवहार्यता (2A चित्रा) पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं था। FOXO3, PIK3CA, ErbB2 और SF3B1 का मुंह बंद अंडाकार आकृति आकार में सबसे महत्वपूर्ण प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य कमी के परिणामस्वरूप। यह कमी भी ErbB2 और SF3B1 मुंह बंद करने के बाद अंडाकार आकृति व्यवहार्यता में मनाया गया। बढ़ावे, हम confPIK3CA, ErbB2 और SF3B1 उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 बी) का उपयोग अंडाकार आकृति आकार पर मुंह बंद करने के प्रभाव irmed। हम पहले कई सेल लाइन मॉडल में एक आवश्यक जीन के रूप में पहचान की है और इस प्रकार SF3B1 siSF3B1 UBB 14 के अलावा एक अच्छा हत्या नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है। दिलचस्प है, सभी 200 जीनों का केवल ई-Cadherin का मुंह बंद करने अंडाकार आकृति व्यवहार्यता (2A चित्रा) में एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई। अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान की जांच से पता चला है कि ई-Cadherin मुंह बंद व्यवहार्य कोशिकाओं कम लगाव के तल पर अच्छी तरह से (चित्रा 2 बी) के आराम के साथ अंडाकार आकृति वास्तुकला की एक पूरी टूटने में हुई। अंडाकार आकृति मात्रा स्क्रीन डेटा के मैनुअल reinvestigation से पता चला कि यह भी देखा गया था, लेकिन क्षेत्र की मात्रा का ठहराव से समाप्त कर दिया गया था वस्तु सेट आकार प्रतिबंध से ऊपर होने की वजह से। पहले से प्रकाश डाला के रूप में, BT474 कोशिकाओं रिसेप्टर tyrosine काइनेज HER2 overexpress और में एक ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन बंदरगाह PIK3CA (K111N)। हम ErbB2 और PIK3CA की है कि मुंह बंद कम अंडाकार आकृति व्यवहार्यता में हुई है, जबकि गैर-लक्ष्य नियंत्रण के साथ अभिकर्मक कोई प्रभाव (चित्रा -2) था पुष्टि की।

अगले हम अंडाकार आकृति ऊतक विज्ञान पर siRNA कमी के प्रभाव की जांच की। BT474 spheroids रिवर्स नियंत्रण siRNA और siRNAs गैर-लक्ष्य को निशाना PIK3CA, ErbB2 और UBB साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। ErbB2 और UBB का मुंह बंद समर्थक proliferative मार्कर Ki67 siRNA (चित्रा 2 डी) को नियंत्रित करने के लिए तुलना की कमी के परिणामस्वरूप। समर्थक apoptotic मार्कर की सक्रियता के cleaved कस्पासे -3 केवल UBB मुंह बंद करने के बाद मनाया गया, HER2 और PIK3CA की कि कमी का सुझाव apoptosis में परिणाम नहीं था बल्कि साइटोटोक्सिक से cytostatic थे। दरअसल, HER2 और PIK3CA का मुंह बंद सेल चक्र गिरफ्तारी प्रोटीन p27 ट्रांसफ़ेक्ट spheroids पर नियंत्रण की तुलना में प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि का परिणाम था।

ईएनटी "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> साथ में ले ली, ये परिणाम बताते हैं कि BT474 कोशिकाओं ऑन्कोजेनिक HER2 और PIK3CA जब 3 डी spheroids के रूप में उगाया संकेत द्वारा संचालित कर रहे हैं इससे भी महत्वपूर्ण बात, इन परिणामों चलता है कि यह संभव है। डिजाइन और कैंसर कोशिका लाइन spheroids मजबूती के साथ और reproducibly में जीनों के सैकड़ों की एक bespoke siRNA स्क्रीनिंग पुस्तकालय को लागू करने।

आकृति 1
चित्रा 1: 3-आयामी विकास के लिए सेल लाइन अनुकूलन। स्तन कैंसर कोशिका लाइनों, MCF10DCIS.com और BT474 7 दिनों के लिए कम लगाव प्लेटों में सुसंस्कृत थे। Brightfield प्रतिनिधि छवियाँ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। बी MCF10DCIS.com और BT474 spheroids 28 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे। 4 दिन - ताजा मीडिया के 100 μL हर 3 मंगाया गया था। Spheroids में 3.8% formaldehyde, ई तय किया गयाmbedded, sectioned और hematoxylin और eosin (एच एंड ई) के साथ दाग। प्रतिनिधि छवियाँ कम और उच्च वृद्धि पर दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन और 33 माइक्रोन, क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं। सी एमडीए MB-231 spheroids 21 दिनों के लिए सुसंस्कृत थे। 4 दिन - ताजा मीडिया के 100 μL हर 3 मंगाया गया था। Spheroids 3.8% formaldehyde में तय किया गया है, एम्बेडेड, sectioned और Ki67 के साथ दाग और कस्पासे 3 cleaved। छवियों प्रतिनिधि दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। डी BT474, MCF10DCIS.com, एमडीए MB-231, और JIMT1 सेल लाइनों रिवर्स नकली (अभिकर्मक अभिकर्मक केवल) और नियंत्रण siRNAs और UBB साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे, अल्ट्रा कम लगाव प्लेटों तो spheroids के लिए फार्म काता थे। ताजा मध्यम (100 μl) दिन 1 और 4 7 के बाद के दिनों में जोड़ा गया है, सेल व्यवहार्यता मात्रा निर्धारित किया गया था। डेटा ± # 1 को नियंत्रित करने के सामान्यीकृत तीन प्रतियों में प्रदर्शन दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति के एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व एक यूएनपीए का उपयोग कर गणना की गईiRed छात्र टी परीक्षण (पी <0.05)। एक प्रवाह आरेख कार्यात्मक कैंसर कोशिका लाइन spheroids में जीन की निर्भरता से पूछताछ करने के लिए इस्तेमाल रिवर्स अभिकर्मक प्रोटोकॉल का सारांश। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: BT474 Spheroids Uncovers ऑन्कोजेनिक निर्भरता के कार्यात्मक जीनोमिक जांच। ए BT474 कोशिकाओं रिवर्स तीन प्रतियों में 200 जीन मानव siGENOME siRNA पुस्तकालय के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। अंडाकार आकृति आकार और व्यवहार्यता मनाया गया। कच्चे डेटा मानों प्लेट मंझला सामान्यीकृत और जेड स्कोर 1.7x की तुलना में अधिक महत्वपूर्ण outliers प्लेट मंझला 15 के मानक विचलन की पहचान करने की गणना की गई थी। नोट दूरस्थ जीन ErbB2, SF3B1, PLK1 और UBB एकएन डी ई-पाजी। siRNAs कि काफी वृद्धि हुई है या कम हो अंडाकार आकृति क्षेत्र और व्यवहार्यता नीले और लाल, जहां लाल को दर्शाया गया है नियंत्रण siRNA में छायांकित हैं। बी कोशिकाओं रिवर्स गैर लक्षित कर नियंत्रण, ई-Cadherin (ई-सीएडी), PIK3CA, ErbB2 या UBB siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे और फिर एक अल्ट्रा कम लगाव थाली में काता spheroids के रूप में। 7 दिनों के बाद, brightfield प्रतिनिधि अंडाकार आकृति छवियों एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। सी कोशिकाओं रिवर्स गैर लक्षित कर नियंत्रण, PIK3CA, ErbB2 या UBB siRNA साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे और फिर एक अल्ट्रा कम लगाव थाली में काता spheroids के रूप में। 7 दिनों के बाद, सेल व्यवहार्यता मात्रा निर्धारित किया गया था। डेटा ± # 1 को नियंत्रित करने के सामान्यीकृत तीन प्रतियों में प्रदर्शन दो स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति के एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय महत्व एक unpaired छात्र टी परीक्षण (पी <0.05) का उपयोग कर की गणना की गई। डी 7 दिनों के बाद, spheroids, तय एम्बेडेड sectioned, और दाग थेएच ई, Ki67, cleaved कस्पासे 3, और p27 के लिए। छवियों प्रतिनिधि दिखाए जाते हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। नोट एच एंड siControl spheroids के ई प्रसंस्करण और व्यक्तिगत बरकरार spheroids धुंधला के लिए चुना की एक मूर्ति के कारण छोटे दिखाई देते हैं। हालांकि इस स्कैन छवियों और सेल व्यवहार्यता परिणामों के साथ मनाया परिवर्तन से इनकार भी नहीं करता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12
गैर-लक्ष्य 1 TP53 डीएसटी KMT2C अनुपचारित 1 FCGBP ARID1B FBXM7 TTC40 गैर-लक्ष्य 2
GATA3 TTN MUC12 MUC4 AHNAK HUWEI1 DNAH11 ITPR2 ABCA13 CREBBP
MAP2K4 PIK3CA F5 ApoB ANKRD30A MUC17 DNAH17 LAMA2 ऐस CSMD2
STARD9 USH2A FAT3 LPR2 CSMD3 MYO18B DNAH5 MDN1 ARHGAP5 DNAH9
CXCR3 MUC16 RB1 PKHD1L1 DNAH2 SYNE2 DYNC1H1 PCLO CACNA1B ErbB2
PLK1 SYNE1 LYST PTEN SPTA1 इलाज 2 VHL RYR1 COL6A3 UBB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12
गैर-लक्ष्य 1 इनाम RYR2 बीआरसीए 2 अनुपचारित 1 FMN2 HECW1 LAMB4 एसआई गैर-लक्ष्य 2
FHOD3 MACF1 RYR3 C2ORF16 डीएमडी FRG1 HERC2 MYH11 STAB1 ZDBF2
GOLGA6L2 चंचु SMG1 CACNA1E DNA14 GCC2 HIVEP2 NIPBL TANC1 ZNF536
HMCN1 NF1 UBR5 CACNA1F DYNC2H1 GON4L HYDIN PKD1L1 टीएफ ANK3
HRNR OBSCN USP34 CYMA5 FAM208B GPR112 ITSN2 RNF213 TPR ASPM
PLK1 PCDH15 XIRP2 COL7A1 FLG2 इलाज 2 VHL SAGE1 UNC80 UBB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12
गैर-लक्ष्य 1 DCHS2 MUC5B ZFHX4 अनुपचारित 1 MYO9A SPHKAP CXORF22 NCOR1 VPS13D
DMXL2 MXRA5 ANK2 KIAA1210 PRUNE2 TCHH DANH6 NOTCH2 ANKRD12
BIRC6 DNAH10 TENM1 एटीएम LRP1 SCN10A VPS13C DNAH7 SPEN C5ORF42
CDH1 DNAH3 PEG3 DIDO1 MAP1A SCN2A IPTR3 ERBB3 SRRM2 CCDC88A
CUBN NOCK11 RELN DNAH8 MED12 SHROOM2 CEP350 FAT4 SZT2 CHD4
PLK1 EYS SACS KIAA1109 MED13 इलाज 2 KMT2A VPS13A UBB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12
गैर-लक्ष्यीकरण QSER1 ARID1A WDFY3 अनुपचारित 1 SDK1 TEX15 LAMA1 गैर-लक्ष्य 2
COL14A1 SHROOM3 ATRX EFCAB5 SF3B1 CBFB AHNAK2
CSMD1 TBX3 KIAA0947 FOXA1 ITPR1 DDX3X KIF4A
MEFV UBR4 MYCBP2 INPPL1 फ्लाइंग HECTD4 FAT2
MGAM VCAN NBEAL1 MAP3K1 AKAP9 GPR98 FOXO3
PLK1 ZNF462 SETX NRP1 HERC1 इलाज 2 VHL UBB

तालिका 1: थाली लेआउट और मानव siRNA लाइब्रेरी डी-कनवल्शनफ़िल्टर्स। तालिका siRNA पूल और स्क्रीन में इस्तेमाल कम लगाव प्लेटों के लिए लेआउट में से प्रत्येक की सामग्री है।

Discussion

कैंसर के तीन आयामी मॉडल तेजी से जाना जाता है और उपन्यास यौगिकों कि चुनिंदा कैंसर कोशिकाओं को मारने के लिए डिजाइन किया गया है की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जा रहा है। कैंसर सेल spheroids संरचनाओं कि अधिक विवो में ट्यूमर में आई उन लोगों के लिए इसी तरह की स्थिति प्रदर्शित इस प्रकार यौगिकों कि 3 डी में प्रभावकारिता में वृद्धि हुई है और अधिक विवो में एक प्रभाव है की संभावना है कर रहे हैं। हालांकि, इन तौर तरीकों संभावित उपन्यास लक्ष्य है कि है कि कैंसर के इलाज में काफी प्रभावकारिता हो सकता दवा डिजाइन का विषय रहा नहीं की पहचान के लिए अनुमति नहीं है।

हम एक siRNA कार्यात्मक जीनोमिक्स दृष्टिकोण है कि कैंसर कोशिका लाइन spheroids में सात दिनों के लिए टिकाऊ जीन मुंह बंद करने के लिए अनुमति दी विकसित की है। प्रोटोकॉल के लिए कई महत्वपूर्ण कदम है कि अनुकूलन की आवश्यकता एक siRNA स्क्रीन प्रदर्शन किया जा सकता से पहले कर रहे हैं। एक बड़े पैमाने पर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य व्यवहार्य spheroids फार्म की क्षमता जरूरी है। इसके अलावा, एकppropriate अभिकर्मक शर्तों कड़ाई से अनुकूलित किया जाना चाहिए। हम उचित गैर लक्ष्यीकरण के साथ कई अलग अलग अभिकर्मक अभिकर्मकों trialing और स्क्रीन प्रयास करने से पहले नियंत्रण की हत्या के सुझाव देते हैं। हम जानते हैं कि कई आमतौर पर इस्तेमाल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों, अर्थात् BT474, MCF10DCIS.com, एमडीए MB-231 और JIMT1 siRNA अभिकर्मक के लिए उत्तरदायी थे दिखाने के लिए सक्षम थे। इसके अलावा, हम सबूत की सिद्धांत डेटा BT474 spheroids में स्तन कैंसर में 200 सबसे अधिक बार उत्परिवर्तित जीन स्क्रीनिंग प्रदान करते हैं HER2 के प्रवर्धन और PIK3CA की ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्तन पर अपनी निर्भरता की पुष्टि की। दिलचस्प है, प्रतिलेखन कारक FOXO3 का मुंह बंद करने अंडाकार आकृति आकार में कमी लेकिन व्यवहार्यता पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव में हुई। FOXO3, हाइपोक्सिया के जवाब को विनियमित करने के लिए उन्हें अपने वातावरण से 16 अधिक आसानी से अनुकूलित करने के लिए अनुमति कैंसर कोशिकाओं के चयापचय क्षमता फेरबदल में जाना जाता है। इस भूमिका के संभावित सेल व्यवहार्यता पढ़ने के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, क्योंकि यह एटीपी बहुतायत का पता लगाता है, सेल चयापचय के मुख्य उत्पादों में से एक।

अंडाकार आकृति आकार में कमी के अवलोकन के समर्थन में, यह दिखाया गया है हेला में FOXO3 की है कि मुंह बंद ट्यूमर के विकास बिगड़ा और प्रेरित apoptosis 17 Xenografts। यह ध्यान रखें कि कुछ जीन कैंसर की कोशिकाओं की क्षमता उनके 3 डी वास्तुकला, जो झूठी सकारात्मक में परिणाम सकता है बनाए रखने के लिए प्रभाव हो सकता है महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, ई-Cadherin की पछाड़ना BT474 अंडाकार आकृति संरचना के विघटन में हुई। यह पहले से उपयोग कर ई-Cadherin लक्षित एंटीबॉडी 18 सूचित किया गया था। किसी भी स्क्रीनिंग मंच के साथ के रूप में, संभावित ठिकानों मनाया प्रभाव का आकलन करने के लिए reproducibility rescreened किया जाना चाहिए। वहाँ तकनीक, अर्थात् siRNA की मध्यस्थता जीन पछाड़ना के क्षणिक प्रकृति के लिए सीमाएं हैं। मुंह बंद निरंतर अब से सात दिन siRNA के साथ प्राप्त नहीं था।

इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह विभिन्न अन्य बायोम के साथ मिलकर किया जा सकता हैtric रंगों न सिर्फ उन है कि अंडाकार आकृति व्यवहार्यता का आकलन, उदाहरण के लिए, अंडाकार आकृति हाइपोक्सिया के स्थानिक जानकारी देने या apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं की निगरानी। इसके अलावा, क्योंकि प्लेट पाठक स्कैन अपेक्षाकृत जल्दी और गैर इनवेसिव हैं, अंडाकार आकृति आकार पर siRNAs के प्रभाव को समय के साथ के बजाय सिर्फ प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर मूल्यांकन किया जा सकता है। दरअसल, हम वर्तमान में हमारे स्क्रीनिंग पाइपलाइन के भीतर इन रास्तों में से कई तलाश रहे हैं। एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि 3 डी संस्कृतियों का इस्तेमाल उपन्यास निर्भरता की पहचान करने के लिए रासायनिक पुस्तकालयों कि लक्ष्य या प्रोटीन की विशेष परिवारों का एक व्यापक रेंज या तो बाधित का इस्तेमाल होता है। दरअसल, Bitler एट अल। डिम्बग्रंथि स्पष्ट सेल कार्सिनोमा 19 में ARID1A स्थिति और EZH2 अवरोधकों के बीच कृत्रिम मारक बातचीत की पहचान करने के लिए इस लक्षित दृष्टिकोण का उपयोग किया। CRISPR-Cas9 जीन संपादन प्रौद्योगिकी की खोज भी organoid संस्कृतियों और इन विवो में आनुवंशिक स्क्रीन के विकास के लिए अनुमति दी गई है। हालांकि, टीअपने दृष्टिकोण उपयुक्त पशु सुविधाओं वाले पर निर्भर है और निषेधात्मक 20 खर्च किया जा सकता है।

अंत में, हमें विश्वास है कि हम एक प्रोटोकॉल रेखांकित किया है कि और अधिक सही मॉडल ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की ढ़ाल, जो vivo में ट्यूमर microenvironment की सुविधाओं, उपन्यास कैंसर लक्ष्य या स्थापित लक्ष्यों की मजबूत सत्यापन की पहचान के लिए अनुमति दे रहे हैं। इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल सेल लाइन है कि spheroids रूपों और इसलिए नियमित तौर पर उच्च throughput siRNA स्क्रीन के लिए कैंसर अनुसंधान समुदाय में इस्तेमाल किया जा सकता है की किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lullaby Oz Biosciences LL70500  lipid-based transfection reagent
Viromer Lipocalyx VB-01LB-01 virus-like polymer transfection reagent
Ultra-low attachment plate Corning CLS7007 96 well plate
Foil plate seals ThermoFisher AB-0626
Luminescent cell viability dye Promega G7570 CellTitre-Glo
Pipette tips (200 μL) Starlab S1111-0806
Pipette tips (10 μL) Starlab S1111-3800
Pipette tips (1, 000 μL) Starlab S1122-1830
Serological pipettes (5 mL) Sarstedt 86.1253.025
Serological pipettes (10 mL) Sarstedt 86.1254.025
Serological pipettes (25 mL) Sarstedt 86.1685.020
RPMI Media GIBCO 11875-093
DMEM Media GIBCO 11965-084
Opti-MEM GIBCO 31985070
Feta bovine serum GIBCO 16140063
siRNA Dharmacon Cherry picked library
Countess Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10312
Celigo S Nexcelom contact company
Victor X5 Perkin Elmer contact company
Benchtop centrifuge Various
Axiovert Inverted brightfield microscope Zeiss contact company
Tissue culture CO2; Incubator Various
Mulitichannel pipette Various

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References

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