기능 유전체학에게 검사를 활용하여 암 세포 회전 타원체 문화에 잠재적으로 소설 약 표적을 식별하는

Cancer Research
 

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Morrison, E., Wai, P., Leonidou, A., Bland, P., Khalique, S., Farnie, G., Daley, F., Peck, B., Natrajan, R. Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures. J. Vis. Exp. (118), e54738, doi:10.3791/54738 (2016).

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Abstract

암 기능 드라이버 이벤트의 식별 새로운 약물 표적의 다음 세대의 발견을위한 암 생물학에 대한 우리의 이해를 발전의 중심과 필수적이다. 그것은 암의 더 복잡한 모델은 생체 내에서 종양을 유도하고 임상 시험에 대한 전임상 모델에서 전환을 새로운 치료법의 효능을 증가 기여 요인을 완벽하게 감사하는 데 필요한 것이 명백 해지고있다.

여기에서 우리는 siRNA의 기능 검사를 실시 할 수 균일하고 재현성 종양 회전 타원체를 생성하는 방법을 제시한다. 이 타원체는 기존의 두 차원 문화에 존재하지 않는 고형 종양에서 발견되는 많은 특성을 표시합니다. 우리는 일반적으로 사용되는 여러 유방암 세포주이 프로토콜 의무가있는 것으로 나타났다. 더욱이, 우리는 원리 증명 유방암 세포주 BT474을 이용하여 데이터를 제공하는, 그 확인포스파티딜 이노시톨 -4,5- biphosphate 3- 키나아제 (PIK3CA)의 상피 세포 성장 인자 수용체 및 HER2의 증폭에 돌연변이 의존성 종양 타원체로 성장 될 때. 마지막으로, 우리는 더 조사하고 면역 조직 화학 염색을 사용하여 이러한 종속성의 공간에 미치는 영향을 확인 할 수 있습니다.

Introduction

고형 종양은 성공적으로 환자를 치료할 수있는 상당한 도전 과제를 제시 상당한 임상 학적, 유전 미세 환경 내 종양 얼룩이 표시. 신규를 식별하는 데 사용되는 모델의 대부분은 이러한 치료의 많은 기능을 포함하지 않는 타겟. 실제로, 병원에서 사용되는 현재의 타겟 치료법 2 차원 배양 조건 하에서 성장 암세포에 의존하는 스크리닝 방법을 이용 지난 10 년간 개발되어왔다. 이 같은 수용체 티로신 키나제 억제제와 같은 다양한 성공, 초래되었지만, 이는 암의 더 복잡한 모델이 완전히 생체 내에서 종양을 유도으로부터 전환 할 새로운 치료법의 수를 늘리 요인을 인식하는 데 필요한 것을 알 수 있다는 임상 시험에 대한 전임상 모델. 또한, 이제도 2 차원 배양 시스템에 반영하지 못하는 것을 알 수있다동작 1, 2를 생체 내. 예를 들어, 종양 혈관 저조한에 미세 환경 내에서 산소 및 영양분에 대한 수요가 공급을 능가 같은 높고 낮은 배달 지역 개발한다. 같은 탄산 탈수 효소 IX (CAIX)로 설립 저산소 마커에 대한 종양 부분의 면역 조직 화학 염색에 의해 검출 된 종양에서 낮은 산소 (저산소증)의 존재는, 유방암에 가난한 임상 결과 3,4 따라서 통합 기능 등으로 상관 관계 심사 모델에 저산소증은 생체 내에서 더 효과가있을 것입니다 새로운 약물 표적을 발견하는 우리의 능력을 향상시킬 수있다. 사실, 저산소증을 포함 성공적 대상으로 공격적인 종양은 임상 우선 순위 5입니다.

보다 정확하게 종양 미세 암세포 의해 발생 조건 요소 요점을 되풀이하는 시도 전통적인 2D siRNA를 선별의 변질은 여러 유전자의 동정하게되었다 번째생체 내에서 종양 성장에 중요한 것으로 밝혀졌다. 이러한 낮은 혈청 조건 (6), 저산소 조건 7에서 조합 8에서 수행 기능 유전체학 화면을 포함한다. 낮은 혈청에서 성장 예를 들어, 6 Phosphofructo -2- 아제 / 프 룩토 오스 -2,6- Biphosphatase 4 (PFKFB4) 탄소 입력 당분 조절을 담당하는 단백질의 침묵 만 전이로부터 유래 전립선 암 라인 아폽토시스 유도. 동일한 조건 하에서 정상적인 전립선 세포주 PFKFB4의 침묵은 반면 PFKFB4 고갈 완전히 전립선 암 세포주의 성장은 6 이종 절제 아무런 영향을 미치지 않았다.

유방암 세포주 연장 패널의 모노 카르 복실 트랜스 -4- (MCT4)의 입을 우선적 저산소 조건에서 세포주 성장의 감소를 이끌었다. 이 취약점은 유방암 세포주 직교 이방성의 xenogra에서 생체 내에서 검증 된FTS. 영양 스트레스 조건에서 아마도 가장 현저하게, 아세틸 -CoA 신테 2 (ACSS2) 아세틸 -CoA로 아세트산 변환을 담당하는 효소의 입을 저감 암세포 번호 (저산소 혈청)하지만 정상 배양 조건에서 거의 또는 전혀 영향을 미치지 8. ACSS2의 절제 영양소 구배는 종양 미세 환경 내에서 이러한 영역들에있는 세포가 종양 진행 8에 필수적인 것을 단독으로 존재하지 않는 것이 제안 유방암과 전립선 암 이종 이식편의 성장에 영향. 또한 ACSS2은 종양에서 증가 ACSS2 활성이 바람직하지 않은 조건 하에서 성장을 지원하는 기본 메커니즘이 될 수 있음을 시사하고 교 모세포종, 간세포 암종 9,10 중요한 것으로 밝혀졌다.

종합적으로, 이러한 연구는 생체 내에서 발생하는 조건을 recapitulating와 siRNA의 화면을 수행하는 단계 (G)의 식별을 가능하게 증명암 생존을위한 필수 ENES. 뿐만 아니라 영양소의 스트레스 조건 하에서 2D 암 세포의 성장에 영향을 미치는, 이러한 연구에서 표적 유전자의 결핍 종양 이종 이식 6,8- 관찰되었다 미러링 어떤 암 세포주 타원체의 성장을 억제 하였다. 따라서, 암세포는 타원체 ACSS2 사일런 싱에 대한 민감성을 부여 종양 미세 환경에서 발생하는 조건의 몇몇 함유한다. 실제로 타원체 영양소 구배 (혈중 산소) pH의 변화를 표시, 3 차원 (3D) 세포 - 세포 접촉뿐만 아니라, 세포주기 정지 및 아폽토시스를받은 세포 증식 민첩함의 변화. 이는 괴사 지역의 암 회전 타원체의 존재에 의해 예로, 기능은 기존의 2D 문화에서 찾을 수 없습니다.

암세포 타원체 이미 소분자 억제제를 스크리닝하는 것이 더 중요한 생물학적 모델로 사용되고 있지만, 이것은 화합물의 효능 검증 또는 콤포넌트의 용도 변경을 허용했다unds 원래 다른 질병 (11)을 위해 디자인. 현재 구형 스크리닝 방법은 고 함량으로 높은 처리량의 특정 유전자 파괴의 분석을 허용하지 않는다. 여기서는 처음 설명 암 세포주 타원체 작은 간섭 RNA (siRNA를) 기술을 이용하여 특정 유전자의 의존성을 폭로하는 기능 유전체학 파이프 라인. 우리는 인간의 유방암에서 200 가장 자주 돌연변이 유전자를 대상으로 siRNA를 가진 주문품의 라이브러리를 설계 BT474 유방암 구 상체의 회전 타원체의 크기와 신진 대사 활동에 유전자 결핍의 영향을 평가 하였다. 우리는 견고하고 재현성 ERBB2와 PIK3CA는 3D 문화에서 침묵의 영향을 감지 할 수 있었다. 또한, 우리는 면역 조직 화학 법을 사용 BT474의 타원체의 공간 구조에 대한 유전자 파괴의 효과를 평가할 수있다.

Protocol

96 웰의 siRNA 플레이트 1. 준비

참고 : 96 웰 플레이트의 바깥 가장자리 따라서 60 96 웰 플레이트 당 siRNA의 양을 제한하는 다른 웰에 비해 증착 더 쉽다. 이를 제한하는 일반 매체 또는 PBS와 외부 우물를 입력합니다. 또한, 히트 확인 화면이 판 편견을 완화하는 것이 좋습니다.

  1. 초저 부착 판의 해당 우물에 500 NG / (제조업체의 권장 사항에 따라) 감소 혈청 배지에서 μL와 나누어지는 10 μL를 - (250)에 siRNA를 희석. 세중의 모든 화면을 수행합니다.
    참고 : 형질 전환 효율이 평가 될 수 있도록 플레이트 디자인에 적합한 비 대상 (음) (예 : UBB와 PLK1로, 긍정적 인) 죽이고 siRNA의 컨트롤을 통합. 세포가 형질 전환 혼합물에 첨가되는 바와 같이 siRNA의 작업 둘러 장착 플레이트의 사용은 중요하다. 우리는 배제 할 수없는 일부 제조 업체 초저 첨부 파일플레이트는 회전 타원체 성장에 미묘한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 우리는 이러한 최종 사용자가 테스트하는 것이 좋습니다.
  2. -20 ° C에서 접착 밀봉 저장과 커버 플레이트.

세포주의 2 역 형질

  1. 화면의 날에, 실온에서 해동 판 및 벤치 탑 원심 분리기를 이용하여 1,000 XG에서 5 분 동안 회전. 각 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 최적화 된 형질 시약을 포함하는 감소 된 혈청 배지 10 μL를 추가합니다. 형성의 siRNA를 포함하는 형질 단지 15 분 동안 접시를 남겨주세요.
    참고 : 본 연구 (10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 항생제가 보충 된 DMEM 고 글루코스 배양 (둘 베코 변형 이글 배지)) 기능 유전체학 스크리닝 유방암 세포주 BT474를 이용했다.
  2. 선별 된되는 세포 (0.05 % 트립신 및 0.53 mM의 EDTA)들이 플라스크에서 분리 될 때까지 세포주과 특이 적절한 양을 사용하여 중화를를 Trypsinize벤치 탑 원심 분리기에 IC 매체와 1,000 XG에 5 분 스핀 트립신을 제거합니다. 매체의 적절한 부피의 세포를 재현 탁하고 세포 계수기를 사용하여 정확한 세포 수를 결정한다.
    참고 : 일반적으로 잘 5,000 세포 검사 대부분의 세포 라인에 걸쳐 회전 타원체 형성에 충분하다. 정확하게 정확한 크기 비교를 위해 단일 세포 현탁액으로 세포 수를 계산하는 것이 중요하다.
  3. 차가운 매체 (4 °에 C) 180 μL 당 5,000 세포에 세포를 희석.
    주 : 재구성 기저막 매트릭스 성분의 첨가에 부정적인 형질 감염 효율에 영향을 미칠 것이며, 그것을 사용하지 않는 것이 좋다. 세포주 최적화 타원체 형성 능력을 확인하고 녹다운 효과가 화면에 앞서 수행되어야한다.
  4. 저수지에 세포 현탁액을 전송, 피펫 믹스와의 siRNA는 (2.1) 이전에 준비가 포함 된 96 웰 매우 낮은 부착 판의 각 웰에 180 μL를 추가합니다.
  5. Centrifug전자 10 분을위한 미리 냉각 된 4 ° C 원심 분리기 1000 XG에 판 다음은 37 ° C 조직 문화 인큐베이터로 돌아갑니다.
  6. 참고 : 세포가 우물의 바닥에 모자이크로 표시됩니다. 향후 12 이상 - 24 시간 세포는 하나의 영역을 형성하기 위해 함께 집계됩니다.
  7. 24 시간 후, 세포가 웰의 중앙에 하나의 타원체를 형성 관찰한다. 성장을 촉진하기 위해 각 웰에 전체 매체의 100 μL를 추가합니다.
  8. 삼일 후 매체를 보충. 부드럽게 잘 각에서 매체의 100 μL를 제거하고 신선한 매체의 100 μL를 추가합니다.
  9. 7 일째, 정량적 시간 경과 타원체 성장을 모니터링 할 수있는 플레이트 리더의 자동 회전 타원체의 크기를 정량화 (섹션 3 참조).
  10. 그 후, 발광 세포 생존 염료를 (제 4 장 참조)을 사용하여 세포 생존을 결정합니다.

3. 자동 이미지 인식

  1. 사이토 7 일에 벤치 탑, 마이크로 웰 플레이트 영상에 번호판을 검사합니다.
      <, 96 - 음 판 '적절한 플레이트 유형을 선택하고 실험의 이름을 입력 : 리> 다음을 선택, 소프트웨어를 엽니 다. 주 : 추가 정보는 소프트웨어에 추가 할 수 있습니다.
    1. 'Tumorsphere'응용 프로그램을 선택합니다. 회전 타원체 초점이 최적의 콘트라스트를 갖도록 초점을 변경합니다.
      참고 : 우리는 '이미지 기반의 초점을'예상되는 회전 타원체 크기로 상당한 변화를 권장합니다.
    2. 스캔 및 '시작 스캔'을 필요로 우물을 선택합니다.
    3. 평판 스캐너 소프트웨어를 이용하여 객체 마스크를 정확하게 회전 타원체의 크기를 나타내는 것을 보장한다. 식민지 직경, 국경의 팽창, 최소 두께 및 정밀 설정을 조정하여이 작업을 수행, 각 셀 라인에 특정는 11, 12을 테스트했다.
      주 : 구형 영역은 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 계산한다. 예를 들어, 정확하게 '하이'는로 정밀도를 조정 이레 동안 성장 BT474의 타원체의 면적을 계산d를 200 μM로 최소 식민지 직경을 설정합니다. 이는 구형 영역의 적절한 회전 타원체 마스크 대표를 생산한다.
      주의 : 이러한 데이터는 다음 주석 된 데이터 파일 형태로 내보내기 기능을 이용하여, 컴퓨터에서 반출 될 수있다. 날짜 판 중간 표준화, 통합 및 회전 타원체 지역에 통계적으로 유의 한 영향을 미치지 된 siRNA를 확인하기 위해 분석 중 Z 점수 또는 엄격하게 표준화 된 평균 차이 (SSMD)에 있습니다.

4. 세포 생존 확인

  1. 구형 영역이 계산 된 후, 발광 생존 세포 염색을 이용 가능성을 결정한다. 제조업체의 지침에 따라 시약을 준비합니다.
  2. 조심스럽게 각 웰로부터 매체의 100 μL를 제거하고 생존 염료의 100 μL를 추가합니다. 15 분 후, 플레이트 발광 플레이트 판독기를 사용하여 스캔 부화.
    참고 :이 데이터는 다음의에서, 내보내기 기능을 사용하여 컴퓨터에서 내보낼 수 있습니다주석 데이터 파일의 형태. 날짜 판 중간 표준화, 통합 및 회전 타원체 생존에 통계적으로 유의 한 영향을 미치지 된 siRNA를 확인하기 위해 분석 중 Z 점수 또는 엄격하게 표준화 된 평균 차이 (SSMD)에 있습니다.

Representative Results

매우 낮은 첨부 파일 96 웰 플레이트의 회전 타원체 분석은보다 쉽게 생체 내 종양에서 발견되는 생리 학적 조건을 되풀이되었습니다 컨텍스트의 잠재적 관련한 종양에 대한 높은 처리량 표현형 평가를 제공합니다. 실제로 암 세포주 BT474 및 MCF10DCIS.com 형태 꽉 구형 구조 (도 1a)와 회전 타원체 부분의 면역 조직 조사 세포 및 핵의 형태에 독특한 공간적 변화를 보였다. 시간이지나면서 이러한 BT474의 타원체와 같은 일부 타원체는 괴사 지역, 공격적인 고형 종양 (그림 1B)의 일반적인 기능을 개발한다. 일부 스페 로이드는 같은 MDA-MB-231 세포주로 괴사 코어를 개발하지만, 역으로 쪼개진 caspsase-3 발현, 세포 사멸의 마커 (그림 1C)와 상관 관계 증식 마커 사료된다에 표시 표시된 변화를하지 않습니다. 그 여러 세포주가 실제로 레셉입니다 설정하려면siRNA를 매개 유전자 침묵의 BT474에 포지티브,, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 JIMT1 세포는 역 칠일에 대한 siRNA를 형질 감염시켰다. 테스트 한 모든 세포주 (도 1D)에 필수적인 유전자 유비퀴틴 B (UBB) 상당히 감소 타원체 생존 침묵 동안 형질 감염 (가짜) 시약 또는 제어 된 siRNA의 형질 감염의 존재는, 구형의 생존에 영향을 미치지 않았다.

우리는 선택되지 않은에서 가장 자주 돌연변이 유전자, ER +, HER2 + 트리플 부정적인 유방암을 포위 인간의 siRNA 라이브러리를 설계했습니다. 이 라이브러리는 MYC, PIK3CA 및 TP53 누구의 기여 발암에 설정되지 않은 것과 알려진 기능의 유전자로 구성되어 있습니다. 스크린은 또한 몇몇 비 - 타겟팅 제어 siRNA를 포함 (컨트롤 # 1, # 2 제어)와 siRNA를 컨트롤 (표 1)을 죽이는 역할 등 PLK1 UBB와 같은 필수 유전자를 타겟팅. 우리는 가슴 canc를 사용하기로 결정했습니다그들은 쉽게 재구성 된 기저막의 첨가없이 회전 타원체로 형성 어 세포주 BT474는 주력 세포주를 확립되고 알려진 게놈 구조를 가진다. 예를 들어, BT474 세포가 에스트로겐 수용체 (ER의 +)에 대한 긍정적 인 TP53 (E285K) 및 PIK3CA (K111N) (13)은 인간 상피 성장 인자 수용체 2 (HER2 +) 및 항구 돌연변이 과발현.

위에서 설명한 프로토콜을 채택, 우리는 충격 유전자 파괴는 siRNA를 역 형질 7 일 (그림 1E) 후 회전 타원체의 크기와 생존에 미친 모니터링. 흥미롭게도, 유전자의 대부분은 구형 영역 또는 생존 (도 2A)에 유의 한 영향을 미치지 않았다. FOXO3, PIK3CA, ERBB2 및 SF3B1의 침묵은 회전 타원체의 크기에서 가장 중요한 재현 감소 결과. 이러한 감소는 ERBB2 및 SF3B1 사일런 후 구형 생존율 관찰되었다. 고무적, 우리는 conf의PIK3CA, ERBB2 및 SF3B1은 명 시야 현미경 (도 2B)를 사용하여 구형의 크기에 침묵의 영향을 irmed. 우리는 이전에 다양한 세포주 모델에 필수적인 유전자로 SF3B1 식별함으로써 siSF3B1는 UBB 14 이외에 좋은 살해 제어를 나타낸다. 흥미롭게도, E-cadherin의 모든 200 유전자의 침묵은 구형의 생존력 (도 2A)이 크게 증가 하였다. 회전 타원체 형태의 조사는 E-cadherin의 침묵이 가능한 세포가 잘 낮은 첨부 파일의 하단에 (그림 2B)을 쉬고, 회전 타원체 아키텍처의 전체 분석 결과 것으로 나타났다. 회전 타원체 체적 화면 데이타 수동 재조사이 때문에 세트 크기 제한되는 상기 오브젝트에 관찰되었다하지만 영역 정량화로부터 제거되었다는 것을 보여 주었다. 앞서 강조된 바와 같이, BT474 세포는 수용체 타이로신 키나아제 및 HER2 과발현에서 발암 돌연변이 항구 PIK3CA (K111N). 우리는 비 대상 컨트롤 형질이 효과 (그림 2C)을 없었다 동안 ERBB2와 PIK3CA의 침묵이 감소 된 회전 타원체 생존 결과 확인했다.

다음으로 구형 조직학 siRNA의 붕괴의 영향을 조사 하였다. BT474의 타원체는 역 비 대상 제어의 siRNA와 siRNA를가 PIK3CA, ERBB2와 UBB을 대상으로 형질 감염시켰다. ERBB2와 UBB의 침묵은 사료된다는 siRNA를 (그림 2D)를 제어에 비해 프로 증식 마커의 감소 결과. 프로 세포 사멸 마커의 활성화는 카스파 제 -3는 세포 사멸을 초래하지 않았다 HER2 및 PIK3CA의 고갈을 제안, UBB 침묵 후에 관찰 아니라 세포 독성보다 세포 증식 억제 하였다 된 절단. 실제로, HER2 및 PIK3CA의 침묵은 형질 타원체 대조군에 비해 세포주기 정지 단백질 p27의 단백질 발현의 증가를 초래했다.

천만에 "FO : 유지-together.within 페이지 ="1 "> 함께 찍은, 이러한 결과는 BT474 세포 종양 HER2 및 PIK3CA 3 차원 회전 타원체로 성장하면 신호에 의해 구동되는 것을 보여 더 중요한 것은, 이러한 결과는가 가능하다는 것을 보여줍니다. 디자인은 견고하고 재현성 암세포 타원체 유전자의 수백 맞춤 siRNA를 선별 라이브러리를 구현한다.

그림 1
그림 1 : 3 차원 성장을위한 세포주 최적화. A. 유방암 세포주는 MCF10DCIS.com BT474 및 7 일 동안 낮은 부착 플레이트에서 배양 하였다. 시야 대표 이미지는 거꾸로 현미경을 사용하여 촬영 하였다. 스케일 바는 100 μm의 =. B. MCF10DCIS.com 및 BT474 회전 타원체 28 일 동안 배양 하였다. 4 일 - 새로운 미디어의 100 μL는 매 3 보충했다. 회전 타원체는 3.8 % 포름 알데히드, 전자에서 수정 된mbedded, 절단 및 헤 마톡 실린 및 에오신 (H & E) 염색. 대표 이미지는 낮은과 높은 배율에 표시됩니다. 스케일 바는 각각 100 μm의 33 μm의를 나타냅니다. C. MDA-MB-231 타원체 21 일 동안 배양 하였다. 4 일 - 새로운 미디어의 100 μL는 매 3 보충했다. 타원체는 3.8 %의 포름 알데히드에 고정 포함, 사료된다으로 구분하고 염색 및 카스파 제 -3을 절단했다. 대표 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 100 μm의 =. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 및 JIMT1 세포주 역방향 모의 (형질 감염 시약 만)와 제어 된 siRNA와 UBB 형질 하였다 초저 부착 플레이트는 타원체를 형성하도록 방사시켰다. 새로운 배지 (100 μL)를 1 일 및 제 7 일 이후에 첨가하고, 세포 생존력을 정량 하였다. 데이터는 # 1를 제어하기 위해 정규화 세중 수행 두 개의 독립적 인 생물 복제의 SD ± 평균을 나타냅니다. 통계적 유의성은 UNPA을 사용하여 계산 하였다IRED 학생 t 테스트 (P <0.05). E. 기능적 암 세포주 타원체 유전자 의존성 심문하는 데 사용되는 역 형질 감염 프로토콜을 요약하는 흐름도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : BT474 타원체 폭로 암 유전자 종속 기능 게놈 조사. A. BT474 세포 중으로 역에서 200 인간 유전자 siGENOME의 siRNA의 라이브러리로 형질 감염시켰다. 회전 타원체의 크기와 생존이 관찰되었다. 원시 데이터 값은 중간 플레이트 정규화하고, Z 스코어가 1.7보다 크게 특이점 15 중간 플레이트의 표준 편차를 계산 하였다 식별 하였다. 외곽 유전자를 참고 ERBB2, SF3B1, PLK1와 UBB차 E-CAD. 크게 구형 영역과 생존을 증가 또는 감소 된 siRNA는 빨간색 제어의 siRNA의 묘사 곳, 파란색과 빨간색으로 음영 처리됩니다. B. 세포는 역 비 타겟팅 제어, E-cadherin의 (E-CAD), PIK3CA, ERBB2 또는 UBB siRNA를 형질 전환 한 후 회전 타원체를 형성하기 위해 매우 낮은 부착 판에 방사했다. 7 일 후, 대표 회전 타원체의 이미지가 거꾸로 현미경을 사용하여 촬영 한 시야. 스케일 바는 100 μm의 =. C. 세포는 역 비 타겟팅 제어, PIK3CA, ERBB2 또는 UBB siRNA를 형질 전환 한 후 회전 타원체를 형성하기 위해 매우 낮은 부착 판에 방사했다. 7 일 후, 세포 생존율을 정량화 하였다. 데이터는 # 1를 제어하기 위해 정규화 세중 수행 두 개의 독립적 인 생물 복제의 SD ± 평균을 나타냅니다. 통계적 유의성은 부대 학생 t 테스트 (p <0.05)를 사용하여 계산 하였다. D. 7 일 후, 타원체는 고정 포함, 절단 및 염색H & E, 사료된다, 절단 된 카스파 제 3, P27합니다. 대표 이미지가 표시됩니다. 스케일 바는 100 μm의 =. siControl의 회전 타원체의 H & E 인해 염색을 위해 선택 처리 및 개별 그대로 회전 타원체의 인공물에 작게 표시됩니다. 그러나이 스캔 된 이미지 및 세포 생존 결과를 관찰 변경을 손상하지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 4 (5) 6 (7) 8 9 (10) (11) (12)
한 비 - 타겟팅 TP53 DST KMT2C 치료 1 FCGBP ARID1B FBXM7 TTC40 이 비 - 타겟팅
GATA3 TTN MUC12 MUC4 AHNAK HUWEI1 DNAH11 ITPR2 ABCA13 CREBBP
MAP2K4 PIK3CA F5 형 ApoB ANKRD30A MUC17 DNAH17 LAMA2 에이스 CSMD2
STARD9 USH2A FAT3 LPR2 CSMD3 MYO18B DNAH5 MDN1 ARHGAP5 DNAH9
CXCR3 MUC16 RB1 PKHD1L1 DNAH2 SYNE2 DYNC1H1 PCLO CACNA1B ERBB2
PLK1 SYNE1 촉매제 PTEN SPTA1 치료 2 VHL RYR1 COL6A3 UBB
1 4 (5) 6 (7) 8 9 (10) (11) (12)
한 비 - 타겟팅 ENAM RYR2 BRCA2 치료 1 FMN2 HECW1 LAMB4 이 비 - 타겟팅
FHOD3 MACF1 RYR3 C2ORF16 DMD FRG1 HERC2 MYH11 STAB1 ZDBF2
GOLGA6L2 SMG1 CACNA1E DNA14 GCC2 HIVEP2 NIPBL TANC1 ZNF536
HMCN1 NF1 UBR5 CACNA1F DYNC2H1 GON4L HYDIN PKD1L1 TF ANK3
HRNR OBSCN USP34 CYMA5 FAM208B GPR112 ITSN2 RNF213 TPR ASPM
PLK1 PCDH15 XIRP2 COL7A1 FLG2 치료 2 VHL SAGE1 UNC80 UBB
1 4 (5) 6 (7) 8 9 (10) (11) (12)
한 비 - 타겟팅 DCHS2 MUC5B ZFHX4 치료 1 MYO9A SPHKAP CXORF22 NCOR1 VPS13D
DMXL2 MXRA5 ANK2 KIAA1210 PRUNE2 TCHH DANH6 NOTCH2 ANKRD12
BIRC6 DNAH10 TENM1 ATM LRP1 SCN10A VPS13C DNAH7 SPEN C5ORF42
CDH1 DNAH3 PEG3 DIDO1 MAP1A SCN2A IPTR3 ERBB3 SRRM2 CCDC88A
CUBN NOCK11 RELN DNAH8 MED12 SHROOM2 CEP350 FAT4 SZT2 CHD4
PLK1 EYS SACS KIAA1109 MED13 치료 2 KMT2A VPS13A UBB
1 4 (5) 6 (7) 8 9 (10) (11) (12)
비 타겟팅 QSER1 ARID1A WDFY3 치료 1 SDK1 TEX15 LAMA1 이 비 - 타겟팅
COL14A1 SHROOM3 ATRX EFCAB5 SF3B1 CBFB AHNAK2
CSMD1 TBX3 KIAA0947 FOXA1 ITPR1 DDX3X KIF4A
MEFV UBR4 MYCBP2 INPPL1 FLG HECTD4 FAT2
MGAM VCAN NBEAL1 MAP3K1 AKAP9 GPR98 FOXO3
PLK1 ZNF462 SETX NRP1 HERC1 치료 2 VHL UBB

표 1 : 플레이트 레이아웃 및 인간의 siRNA 라이브러리 드 - 컨볼 루션. 표는 화면에 사용되는 낮은 부착 판에 대한 siRNA를 풀 및 레이아웃 각각의 콘텐츠가 포함되어 있습니다.

Discussion

암의 3 차원 모델을 더욱 선택적으로 암세포를 죽이기 위해 설계되었다 공지 및 신규 화합물의 효능을 평가하기 위해 이용되고있다. 암세포 타원체 따라서, 3 차원의 효능을 증가 화합물을 생체에 영향을 미칠 가능성이 생체 내 종양에서 발견 된 것과 더 유사한 조건을 표시하는 구조이다. 그러나, 이러한 양상은 암 치료에 상당한 효과를 가질 수있는 약물 설계의 대상이되지 않은 잠재적으로 새로운 타겟들의 식별을 허용하지 않는다.

우리는 암 세포주 타원체에서 최대 7 일 동안 내구성 유전자 침묵 허용 siRNA의 기능 유전체학 접근 방식을 개발했다. siRNA를 화면이 수행되기 전에 최적화를 요구하는 프로토콜 몇몇 중요한 단계가있다. 대규모로 재현 가능한 타원체를 형성 할 수있는 능력은 필수적이다. 또한,ppropriate 형질 전환 조건은 엄격하게 최적화되어야한다. 우리는 적절한 비 타겟팅 여러 가지 형질 전환 시약을 시운전하고 화면을 시도하기 전에 컨트롤을 죽이는 것이 좋습니다. 우리는 MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 JIMT1은 siRNA를 형질 의무가 있었다 즉 BT474이 일반적으로 사용되는 여러 유방암 세포주를 표시 할 수 있었다. 또한, 우리는 원리 증명 BT474의 타원체에 유방암에서 200 가장 자주 돌연변이 유전자를 선별 데이터를 제공, HER2의 증폭 및 PIK3CA의 발암 돌연변이에 대한 자신의 의존성을 확인했다. 흥미롭게도, 전사 인자 FOXO3의 침묵은 회전 타원체 크기의 감소하지만 생존에 큰 영향 귀착되었다. FOXO3는 그들의 환경 (16)에 더 쉽게 적응할 수 있도록 암 세포의 신진 대사 능력을 변경하는 저산소증에 대한 반응을 조절하는 것으로 알려져있다. 이 ATP의 풍요 로움을 감지하는이 역할은 잠재적으로 세포 생존 판독을 방해 할 수세포 대사의 주요 제품 중 하나.

회전 타원체 소형화 관찰 지원에서는, 헬라에 FOXO3의 침묵은 종양 성장을 손상과 세포 사멸을 유도 17 이종 나타났다. 어떤 유전자 가양 초래할 수 그들의 3 차원 구조를 유지하기 위해 암 세포의 능력에 영향을 미칠 수 있다는 점이다. 예를 들어, E-cadherin의의 최저은 BT474의 회전 타원체 구조의 용해 결과. 이것은 이전에 E-cadherin의 항체 (18)를 대상으로 사용하여보고했다. 모든 선별 플랫폼과 같이, 잠재적 인 타겟이 관찰 결과의 재현성을 평가하기 rescreened한다. 이 기술은 siRNA의 중재 유전자 최저, 즉 과도 특성에 제한이 있습니다. 침묵 지속 이상 칠일은 siRNA를 함께 달성하지 않았다.

이 방법의 장점은 여러 가지 다른 바이 옴과 결합 될 수 있다는⚻에 정해진 염료뿐만 아니라 구형 저산소증의 공간 정보를 제공 또는 아폽토시스를받은 셀을 모니터링, 예를 들면, 회전 타원체의 생존력을 평가 것과. 플레이트 판독기 스캔 비교적 빠르고 비파괴 때문에 또한, 구형의 크기 된 siRNA의 영향은 시간이 지남보다는 실험 종료 시점에서 평가 될 수있다. 사실, 우리는 현재 우리의 심사 파이프 라인 내에서 이러한 도로의 몇몇을 모색하고 있습니다. 새로운 종속성을 식별하기 위해 3 차원 배양을 이용하는 다른 방법은 대상 또는 단백질의 특정 패밀리의 넓은 범위를 억제하는 화학 라이브러리의 사용이다. 사실, Bitler 등. 난소 투명 세포 암종 19 ARID1A 상태 및 EZH2 저해제의 합성 사멸 작용을 확인하는 방법이 타겟을 이용했다. CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술의 발견은 organoid 배양 물 및 생체 내에서의 유전자 스크린의 개발이 허용되었다. 그러나, t그의 접근 방식은 적절한 동물 시설을 가지고에 의존하고 20 금지 비용이 될 수있다.

결론적으로, 우리는 우리가 프로토콜을 설명했다고 생각이 더 정확하게 모델 소설 암 대상 또는 설립 목표의 강력한 검증의 식별을 허용 생체 내 종양 미세 환경의 특징 인 산소와 영양소 그라디언트. 더욱이, 우리는 프로토콜 타원체를 형성하고, 따라서 통상적으로 높은 처리량의 siRNA 스크린의 암 연구 커뮤니티에서 사용할 수있는 세포주의 임의의 타입에 적용될 수있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lullaby Oz Biosciences LL70500  lipid-based transfection reagent
Viromer Lipocalyx VB-01LB-01 virus-like polymer transfection reagent
Ultra-low attachment plate Corning CLS7007 96 well plate
Foil plate seals ThermoFisher AB-0626
Luminescent cell viability dye Promega G7570 CellTitre-Glo
Pipette tips (200 μL) Starlab S1111-0806
Pipette tips (10 μL) Starlab S1111-3800
Pipette tips (1, 000 μL) Starlab S1122-1830
Serological pipettes (5 mL) Sarstedt 86.1253.025
Serological pipettes (10 mL) Sarstedt 86.1254.025
Serological pipettes (25 mL) Sarstedt 86.1685.020
RPMI Media GIBCO 11875-093
DMEM Media GIBCO 11965-084
Opti-MEM GIBCO 31985070
Feta bovine serum GIBCO 16140063
siRNA Dharmacon Cherry picked library
Countess Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX1000
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10312
Celigo S Nexcelom contact company
Victor X5 Perkin Elmer contact company
Benchtop centrifuge Various
Axiovert Inverted brightfield microscope Zeiss contact company
Tissue culture CO2; Incubator Various
Mulitichannel pipette Various

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References

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