Die Verwendung einer Filterpatrone für die Filtration von Wasserproben und Extraktion von Umwelt-DNA

Environment

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Miya, M., Minamoto, T., Yamanaka, H., Oka, S. i., Sato, K., Yamamoto, S., Sado, T., Doi, H. Use of a Filter Cartridge for Filtration of Water Samples and Extraction of Environmental DNA. J. Vis. Exp. (117), e54741, doi:10.3791/54741 (2016).

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Abstract

Introduction

Umwelt DNA (EDNA) in der aquatischen Umwelt bezieht sich auf genetisches Material in der Wassersäule gefunden. Jüngste Studien zeigten den Nutzen von Edna für Fische aus verschiedenen Gewässern zu erfassen, einschließlich Teiche 1-3, Flüsse 4-8, Ströme 9 und Meerwasser 14.10. Die meisten dieser Studien konzentrierten sich auf Nachweis eines einzelnen oder wenigen invasive 1,4-6,8,14 und seltene oder bedrohte Arten 3,9, während einige neuere Studien gleichzeitigen Nachweis mehrerer Spezies in lokalen Fischgemeinschaften 7,9 versuchte, 12,13,15 und Mesokosmen 11,12.

Der zweite Ansatz ist "metabarcoding" genannt und Edna metabarcoding verwendet einen oder mehrere Sätze von PCR-Primer über taxonomisch diverse Proben eine Genregion auf coamplify. Dies wird durch die Bibliotheksvorbereitung mit Indexierungs- und Adapter-Addition und die indizierten Bibliotheken von einem Hochdurchsatz-Sequenzierung analysiert parallel sindPlattform. Kürzlich Miya et al. 12 entwickelte Universal-PCR - Primer für metabarcoding EDNA von Fischen (genannt "MiFish"). Die MiFish Primer zielen auf eine hypervariablen Region des mitochondrialen 12S-rRNA-Gens (163-185 bp), die ausreichende Informationen enthält Fische zu taxonomischen Familie, Gattung und Art zu identifizieren, mit Ausnahme einiger eng verwandten Artgenossen. Mit der Verwendung dieser Primer in EDNA metabarcoding, Miya et al. 12 erfasst mehr als 230 subtropische Meeresarten von Aquarien mit bekannten Artenzusammensetzung und Korallenriffe in der Nähe des Aquariums.

Während das Protokoll metabarcoding Optimierung natürlichem Meerwasser aufzunehmen mit einem Gehalt an EdNA Konzentration von Fischen unterschiedlicher haben wir bemerkt, dass die MiFish Primer gelegentlich die Zielregion für die nachfolgende Herstellung Bibliothek zu amplifizieren fehlgeschlagen. Eine der häufiger Grund für diese nicht erfolgreich PCR-Amplifikation ist der Mangel an ausreichender Mengen der template DNA in kleinen Mengen Wasser enthielt gefiltert (dh 1-2 L). Obwohl EDNA-Konzentration von einer bestimmten taxonomischen Gruppe vor der Verstärkung unerkennbar ist, Filtration von großen Wassermengen (> 1-2 L) wäre ein einfaches und wirksames Mittel sein, um mehr EDNA aus den Gewässern mit knappen Fischreichtum und Biomasse zu sammeln, wie zum Beispiel im offenen Meer und Tiefseeökosysteme.

Bezogen auf Platte Faserfiltern üblicherweise in einer Reihe von Fisch EDNA Forschung 16 verwendet, Filterpatronen haben den Vorteil , größere Wassermengen vor 17 Verstopfung zuvorkommend . Eigentlich eine aktuelle Studie zeigte großes Volumen (> 20 L) Filtration von Küstenmeerwasser Proben unter Verwendung von Filterkartuschen 18. Darüber hinaus werden sie einzeln verpackt und steril, und mehrere Schritte des experimentellen Arbeitsablauf kann in das Filtergehäuse durchgeführt werden, wodurch die Wahrscheinlichkeit einer Kontamination aus der Labor 19 reduziert wird . letztereMerkmal ist entscheidend für die EDNA metabarcoding, in denen die Gefahr einer Kontamination bleibt unter den größten experimentellen 20,21 herausfordert. Trotz dieser technischen Vorteile von Filterpatronen, es war nicht in EdNA Studien von Fischen mit zwei Ausnahmen 8,15 verwendet.

Hier bieten wir ein Protokoll für die Filtration von Wasserproben mit der Filterpatrone und Extraktion von Edna aus seinem Filter, ohne das Gehäuse öffnen zu schneiden zu müssen. Wir bieten auch zwei alternative Wasserfiltersysteme in Abhängigkeit von den Wassermengen (≤4 L oder> 4 l). Um die Leistungsfähigkeit des neu entwickelten Protokoll vergleichen und ein zuvor verwendetes Protokoll ein Glasfaserfilter in unserer Forschungsgruppe mit 12,14,22,23, führen wir EDNA metabarcoding Analyse von Meerwasser aus einem riesigen Aquarium (7500 m 3 ) mit bekannten Artenzusammensetzung und zeigen die Anzahl der nachgewiesenen Spezies aus den beiden Protokollen als repräsentative Ergebnisse abgeleitet. Dieses Protokoll hwie für metabarcoding EDNA von Fischen entwickelt, ist aber auch für Edna aus anderen Organismen.

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Protocol

Hinweis: Dieses Protokoll befasst sich nicht mit Wasser Probenahme und metabarcoding Methoden. Wasser kann auf verschiedene Arten je nach Studienzwecke 16 und siehe Miya et al. 12 Einzelheiten zu den metabarcoding Methoden MiFish Primer zu beproben. Beachten Sie, dass das abgetastete Wasser sollte sehr kalt und innerhalb weniger Stunden gefiltert gehalten, um den Abbau von Edna zu vermeiden. Beachten Sie auch, dass dieses Protokoll die Verwendung eines Rotationsschüttler beinhaltet und einen Inkubator, und dieser muss groß genug sein, um den ehemaligen zubringen. Zusätzlich kann eine Zentrifuge, Das beherbergen jeweils 15 ml und 50 ml konische Röhrchen ist unerlässlich, um die restliche Flüssigkeit aus dem post-Filtrationsfilter zu entfernen und extrahierte DNA innerhalb der Kassette zu sammeln, respectively.

1. Die Verarbeitung einer Schraubkappe und einem 1 L-Plastiktasche

HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Filtrationsvolumen> 4 L.

  1. Bohren Sie ein Loch durch die Mitte einer Schraube cap (befestigt an einem wegwerfbaren 1 L Plastiktüte) mit gleichem Durchmesser (4,8 mm) als das Rohr aus einem männlichen Luer-Lock Anschluss vorsteht. Verwendung Beißzange, verkürzen die Röhre des männlichen Luer-Lock - Anschluss auf eine geeignete Länge (ca. 3 mm) Zusetzen einer kleinen Menge an Wasser innerhalb der Kappe nach der Filtration zu vermeiden.
  2. Tragen Sie einen Klebstoff Klebstoff spezialisiert für Polyethylen (PE) und Polypropylen (PP) sowohl mit dem Boden und der Oberfläche des männlichen Luer-Lock-Anschluss und Schraubverschluss sind. Warten Sie ein paar Minuten für eine gute Verklebung (siehe Anweisungen des Herstellers).
  3. Setzen Sie den männlichen Luer-Lock-Anschluss in das Loch der Schraubkappe. Warten, bis eine vollständige Verklebung der beiden Teile (in der Regel> 24 h). Sterilisieren Sie die Schraubkappe mit dem männlichen Luer-Lock - Anschluss mit 10% handelsübliche Bleiche (ca. 0,6% Natriumhypochlorit) vor dem Gebrauch.
  4. Lochen Sie zwei Löcher an den beiden unteren Ecken des 1 L Plastikbeutel, um sie von einem mes zu hängenh Panel (Schritt 3). Sicherzustellen, dass der Durchmesser der Löcher größer ist als die der Zacken auf dem Netzeinsatz.

2. Montage des Filtrationssystems

  1. Bringen Sie Hochvakuumschlauch an den Eingangsanschluss einer Saugpumpe und das andere Ende des Schlauchs an einem Verteiler. Achten Sie darauf , dass die drei roten T-Ventile des Verteilers in der "Aus - Position" sind (dh horizontal).
  2. Das Tragen eines sauberen Reihe von Handschuhen, legen Sie eine weibliche Luer-Fitting und ein Vakuum-Anschluss an den oberen und unteren Ende des Vakuumgummischlauch für die Filtration, respectively.
  3. Sorgfältig befestigen den Vakuumverbinder mit einem Silikonstopfen den weiblichen Luer-Fitting an einem Auslassanschluss der Filterpatrone und befestigen.

3. Filtration von Wasserproben (≤4 L), um die Filterpatrone mit

HINWEIS: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn das Filtrationsvolumen> 4 L. Dieses Filtrationssystem erfordert eine selbststehende Platte foder hängen Sie den Plastikbeutel mit 1 l Wasser gefüllt. Ein Mesh-Panel, mehrere Zinken, und ein Ständer für das Panel, die alle von Online-Shops, würde für die Montage dieses Gerät nützlich sein. den Einlass Autoklav und Luer-Kappen für die Filterpatrone vor dem Gebrauch Steckdose.

  1. Gießen Sie die 1 L abgetastet Wasser in den Plastikbeutel und schließen Sie die Schraubkappe mit dem männlichen Luer-Lock-Anschluss.
  2. eine Einlaßöffnung des zusammengebauten Filterpatrone mit dem männlichen Luer-Lock Anschluss des Kunststoffbeutels sorgfältig verbinden. Sie nicht zu fest anziehen, den Luer-Lock-Anschluss; sonst wird das Gerät auslaufen, sobald die Pumpen beginnt. Seien Sie sicher, dass alle Verbindungen sicher sind, bevor die Plastikbeutel von einem Mesh-Panel hängen.
  3. hängen Sie vorsichtig den Plastikbeutel mit der Filterpatrone aus zwei Zinken auf dem Mesh-Panel und einsetzen des Verteilers einen Silikonstöpsel in einer Einlassöffnung.
  4. Schalten Sie die Saugvorrichtung. Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Führen Sie den Verteiler, bis die Filterpatrone ist trocken, tHenne die roten T-Ventil in die Stellung drehen.
  5. Wiederholen 3.1-3.4 Schritte, bis die gewünschte Menge Wasser gefiltert wird.
    HINWEIS: Für 1 l Wasser aus den subtropischen Korallenriffen genommen, es etwa drei Minuten für die Filtration erfolgt.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die Filterpatrone aus dem Plastikbeutel und dem Vakuumanschluss.
  7. Kappe an beiden Enden der Patrone mit den Einlass- und Auslass-Luer-caps.
  8. Beschriften Sie die Patrone und Einlass Luer-Kappe in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird.
  9. Lagern Sie die Filterpatrone bei -20 ° C vor der DNA-Extraktion.

4. Filtration von Wasser (> 4 L) Proben die Filterpatrone mit

Hinweis: Überspringen Sie diesen Schritt, wenn der Wasserfiltrationsvolumen ist ≤4 L. Dieses Filtrationssystem 10 L Buch-Flasche mit einem Ventil und einem Einweg-10-ml-Pipettenspitze ausgestattet erfordert. Ein Innendurchmesser der Pipettenspitze 10 ml (15,0 mm) und eine Verjüngung der SpitzeEnde sollte zu einem Außendurchmesser des das Ventil (15,0 mm) passen und Einlassöffnung der Filterpatrone sind. Beide Verbindungen werden sicher während der Filtration in einer Reibungspassung gehalten wird. Sterilisieren Sie die Pipettenspitze mit 10% handelsübliche Bleiche (ca. 0,6% Natriumhypochlorit) vor dem Gebrauch.

  1. Bereiten Sie eine angemessene Menge an abgetasteten Wasser in dem Buch Flasche. Dicht legen Sie die 10 ml Pipettenspitze in das Ventil von 10 L Buch Flasche.
  2. die Auslassöffnung der Filterpatrone in die Pipettenspitze Ende fest einsetzen und den Silikonstopfen in die Einlaßöffnung des Verteilers ein. Schalten Sie die Saugvorrichtung. Öffnen Sie die roten T-Ventile für die Filtration. Führen Sie den Verteiler, bis die Filterpatrone trocken ist, dann drehen Sie den roten T-Ventil in die Stellung.
    HINWEIS: Für 10 l Meerwasser aus den subtropischen Außen Korallenriffe genommen, es ca. 30-40 min für die Filtration erfolgt.
  3. Entfernen Sie vorsichtig die Filterpatrone aus dem Plastikbeutel und dem Vakuumanschluss. Cap beidedie Kartusche Enden mit den Einlass- und Auslass-Luer-caps. Beschriften Sie die Patrone und Einlass Luer-Kappe in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird. Lagern Sie die Filterpatrone bei -20 ° C vor der DNA-Extraktion.

5. Extraktion von Edna aus dem Filter

HINWEIS: In den Schritten 4 und 5, verwenden wir einen kommerziellen Kit, weitgehend nach einem Protokoll für "nukleierten Blut" von dem Kit zur Verfügung gestellt. Der Einfachheit halber beschreiben wir das Verfahren zur Verarbeitung einer einzelnen Patrone. In der Praxis empfehlen wir die Verarbeitung 8 (oder die maximale Anzahl der Zentrifuge) oder weniger Filter auf einmal.

  1. Wärmen Sie einen Inkubator auf 56 ° C.
  2. Bereiten Sie eine 2,0-ml-Röhrchen durch den Klappdeckel aus dem Rohr zu schneiden. Entsorgen Sie die Kappe.
    HINWEIS: Dieser Schlauch wird als Sammelrohr für die restliche Flüssigkeit in dem Filter verwendet.
  3. Entfernen Sie den Einlass (NICHT Auslass) Luer-Kappe aus der Filterpatrone und setzen Sie die Einlassöffnung inde Sammelröhrchen. dicht schließen eine Verbindung zwischen der Patrone und dem Sammelrohr eine selbstdichtende Folie verwendet wird.
  4. Legen Sie die kombinierte Einheit in ein Zentrifugen Adapter für einen 15-ml konischen Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Patrone bei 5.000 × g für 1 min die restliche Flüssigkeit in dem Filter zu entfernen.
  5. Entfernen Sie die Sammelröhrchens aus der Filterpatrone und dem Rohr zu verwerfen. Re-Kappe die Einlassöffnung der Patrone.
  6. Bereiten einer Mischung aus 20 & mgr; l Proteinase-K-Lösung, 220 ul PBS (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, nicht von dem Kit bereitgestellt) und 200 & mgr; l AL puffern.
    HINWEIS: Die Filterpatrone für bis zu vier Mal die Volumina des Gemisches (. Ca. 1,8 ml).
  7. Entfernen Sie die Einlasskappe und fügen Sie die Mischung (440 ul) in die Filterkartusche mit einer Pipettenspitze. Legen Sie die Pipette vollständig in die Einlassöffnung, so dass die Pipettenspitze nur oberhalb der Membran in der Kassette sichtbar.
  8. Re-Kappe die Einlassöffnung und setzen Sie den Filter AutoTridge auf einem Rotationsschüttler.
  9. Setzen Sie den Rotationsschüttler im vorgeheizten Inkubator bei 56 ° C und schalten Sie den Schüttler bei einer Geschwindigkeit von 20 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten.
  10. Während der Inkubation bereiten ein neues 2,0-ml-Röhrchen, beschriften Sie das Rohr in geeigneter Weise ein Lösungsmittel sichere Stift und legen Sie sie in einem 50 ml konischen Röhrchen.
    HINWEIS: Die ehemalige (2,0 ml) und letztere Rohre (50 ml) für die Erfassung der extrahierten DNA und zum Halten der 2,0-ml-Röhrchen verwendet wurden.
  11. Nach der Inkubation die Einlasskappe entfernen und den Einlass (NICHT Auslass) -Anschluss der Patrone in die 2,0-ml-Röhrchen in der 50 ml konischen Röhrchen ein. Schließen die 50 ml konischen Röhrchen mit Schraubverschluss.
  12. Zentrifugieren der 50-ml konischen Röhrchen bei 5.000 × g für 1 min die extrahierte DNA aus der Patrone zu sammeln. Entfernen Sie die Filterpatrone und das 2,0-ml-Röhrchen mit sterilisierten Zange und die Kappe der Röhre. Entsorgen Sie die Filterpatrone.

6. Reinigung von extrahierter DNA

HINWEIS: Wir eluieren EDNA mit 100 ul Puffer AE anstelle von 200 & mgr; l in der Bedienungsanleitung des kommerziellen Kits angegeben.

  1. In 200 ul Ethanol (96-100%) zu der extrahierten DNA in der 2,0-ml - Röhrchen aus dem obigen Schritt (ca. 440 & mgr; l) und gründlich mischen durch Vortexen.
  2. Pipettieren der Mischung in eine Spin-Säule in ein Sammelröhrchen 2 ml gebracht. Zentrifuge bei 5000 × g für 1 min. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr.
  3. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen, 500 & mgr; l Puffer AW1 und Zentrifuge für 1 min bei 5.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr.
  4. Legen Sie die Spin-Säule in ein neues 2 ml Sammelröhrchen, 500-ul Puffer AW2 und Zentrifuge für 3 min bei 20.000 x g. Verwerfen Sie den Durchfluss durch und das Sammelrohr.
  5. Bereiten Sie einen neuen 1,5-ml-Röhrchen (nicht im Kit enthalten) und beschriften Sie das Rohr entsprechend einem wasserfesten Stift für schnell trocknende und nicht schmier Kennzeichnung verwendet wird. Übertragen Sie die Spin-Säule to der 1,5-ml-Röhrchen.
  6. Eluieren der DNA durch Zugabe von 100 & mgr; l Puffer AE zu der Mitte der Spinsäule Membran. Inkubieren für 1 min bei Raumtemperatur und dann bei 6.000 × g für 1 min zentrifugiert.
  7. Entsorgen Sie die Spin-Säule und die Kappe der Röhre. Lagern Sie die gereinigte DNA bei -20 ° C.

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Representative Results

Es ist technisch schwierig zu isolieren und nur Fische EdNA aus dem extrahierten bulk EdNA quantifizieren, da die MiFish Primern den Zielbereich von einigen nicht-Fisch Vertebraten, wie Vögel und Säugetiere, mit PCR - Produkten der gleichen Größe coamplify (ca. 170 bp ) 12. Statt Fisch EDNA der Quantifizierung führen wir MiFish von Edna aus einem Aquarium Tank mit bekannten Artenzusammensetzung metabarcoding Analyse der zwei verschiedenen Methoden der Filtration und DNA-Extraktion und die Zahl der nachgewiesenen Spezies pro Bibliothek aus den beiden Protokollen vergleichen. Dieses einfache Experiment wurde entworfen, Machbarkeit des vorliegenden Protokolls als "repräsentative Ergebnisse" zu zeigen und nicht streng gegenüber anderen seine Überlegenheit zu demonstrieren.

Wir probierten insgesamt 30 l Meerwasser aus einem Kuroshio Tank im Okinawa Churaumi Aquarium, Okinawa, Japan (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). Der Kuroshio Tank Marine Megafauna ist so konzipiert , für die Ausstellung von 35 mx mit den Abmessungen (L x B x T) 27 x 10 m und einer Gesamtwassermenge von 7500 m 3. Es ca. 60 große Häuser -Aussparung Meeresfischarten charakteristisch Gebiete rund um den Kuroshio, einer der westlichen Randströme entlang der gesamten Länge von Japan fließt in nordöstlicher. In einer früheren MiFish metabarcoding Studie, Miya et al. 12 erfasst 61 der 63 Arten (97%) enthielt im Tank aus fünf 2 l Meerwasser-Proben.

Für die Filtration des Meerwassers, haben wir Filterpatronen (Porengröße = 0,45 & mgr; m) und Glasfaserscheibenfilter (Porengröße = 0,70 um). Wir gefiltert gleichzeitig das Meerwasser auf dem gleichen Verteiler für vier Wassermengen, die beiden Protokolle (1, 2, 3 und 4 L; insgesamt acht Filter). Nach der Filtration von Meerwasser, wir 1 l PCR-grade Wasser mit den beiden Filtern gefiltert auch (filter Patrone und Glasfaserfilter) als die negativen Kontrollen (zwei Filter Rohlingen). Aus diesen Typen von Filtern, extrahierten wir EdNA die neuen und bisher verwendeten Protokolle 12 verwendet, die beide die gleichen kommerziellen Kits verwenden. Insgesamt 10 EdNA Proben (einschließlich der beiden negativen Kontrollen) wurden metabarcoding Analyse in Miya beschrieben et al MiFish unterzogen. 12

Kurz gesagt, führten wir PCR 1. Runde die Zielregion (mitochondrialen 12S rRNA - Gen. Ca 170 bp) zu verstärken und anfügen Adapter für gepaarte-End - Sequenzierung. Acht EdNA Proben (mit Ausnahme der zwei negativen Kontrollen), führten wir 10 PCR Variationen in der Anzahl der detektierten Spezies innerhalb jeder Probe (insgesamt 80 PCRs) zu sehen, repliziert. Außerdem haben wir den Filter und PCR-Rohlinge zu je acht EDNA Proben (insgesamt 16 PCRs). Insgesamt erhalten wir 96 PCR-Produkte aus der ersten Runde PCR und sie wurden als Matrizen für die zweite Runde P verwendetCR für Dual - Indizierung und Anhängen zusätzlicher Adapter für Bibliothek Vorbereitung folgende Miya et al. 12

Die Paired-End-Sequenzierung (2 x 150 bp) der 96-Bibliotheken ergaben 4.127.546 liest, mit einem Durchschnitt von 42.995 liest pro Bibliothek (40.539 liest in der Filterpatrone und 43.121 liest in dem Glasfaserfilter). Nach dem Demultiplexen und anschließender Vorverarbeitung der Rohdaten, liest 1.068.266 wurden für die BLAST-Suchen für taxonomische Zuordnung beibehalten. Von diesen liest, liest 830.788 wurden die Arten in der Kuroshio Tank (Tabelle 1) enthielt identifiziert. Wir haben festgestellt 60 Tank Arten von 830.788 liest und die durchschnittliche Zahl der nachgewiesenen Spezies für die 10 PCR repliziert aus den acht EDNA Proben lag im Bereich von 29 für 1 L (Glasfaserfilter) bis 55 für 4 L (Filterpatrone) (Tabelle 1) . Lesen Zahlen der beiden Zuschnitte aus den acht EDNA Proben waren gering, im Bereich von 0bis 12 für die Behälterarten.

Wir fanden , dass die Anzahl der detektierten Spezies durch die Filterpatrone war signifikant höher als die der Glasfaserfilter (ANCOVA, F = 381,8, p <0,001, Figur 1) über 1-4 L Meerwasser Volumen. Anzahl der detektierten Spezies durch die Filterpatrone betrug etwa das 1,5 - fache höher als die unter Verwendung der Glasfaserfilter und in beiden Verfahren, die Anzahl der detektierten Spezies mit dem Wasservolumen erhöht filtriert (ANCOVA, F = 164.2, P <0,001).

Filtration des abgetasteten Wasser durch (1) unterschiedliche Materialien (hydrophile PVDF [Polyvinylidendifluorid] vs. Glasmikrofaser) und / oder: höhere Anzahl von detektierten Spezies durch die Filterkartusche aus einer oder mehreren der folgenden Schritte in den experimentellen Arbeitsabläufe ergeben (2) unterschiedliche Nennporengrößen (0,4581; m gegenüber 0,70 um) in den Filterpatronen und Glasfaserfilter könnte mehr EDNA von Fischen auf dem ehemaligen Filter zu halten; (3) Verwendung eines Rotationsschüttler in den vorgeheizten Inkubator produziert mehr DNA Ausbeute aus den Filterpatronen als von den gefalteten Glasfaserfilter in einer Spin-Säule auf einem bewegungs Heizblock gelegt; (4) Sammeln der extrahierten DNA durch Zentrifugation aus der Filterpatrone ist effizienter als die aus dem Glasfaserfilter aufgrund unterschiedlicher Filtermaterialien und / oder unterschiedliche Zentrifugationsverfahren. Offensichtlich ist ein strenger ausgelegt Studie erforderlich, um die Faktoren, die für die durchweg höhere Anzahl detektierter Spezies durch die Filterpatrone in der vorliegenden Studie zu lokalisieren.

Abbildung 1
Abbildung 1: Die Anzahl der nachgewiesenen Spezies Aufgetragen gegen gefiltertes Wasser Volumes in MiFish Metabarcoding Ana Lyse von Edna aus dem Kuroshio - Behälter, Okinawa Churaumi Aquarium. Die Anzahl der nachgewiesenen Spezies zu Spezies im Tank enthaltene beschränkt ist. Aus 30 l Meerwasser, wir 1 gefiltert, 2, 3 und 4 L Proben , die die Filterkartuschen und glasfaser~~POS=TRUNC und extrahierte EdNA aus diesen Filter , um die Gegenwart und die zuvor beschriebenen Protokolle bzw. 12 verwendet wird . Wir führten MiFish metabarcoding Analyse (gleichzeitigen Nachweis mehrerer Spezies) für 10 PCR repliziert von den vier Wassermengen unter Verwendung von zwei Protokollen. Die horizontale Leiste in der Box stellt den Median; die oberen und unteren Kanten der Box entsprechen inter Quartile entsprechen die vertikalen Balken bis 1,5 x Quartile, und die Punkte Ausreißer dar. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Tabelle 1:.. Taxonomische Zusammensetzung und lesen Nummern der 60 Arten Erkannte in MiSeq Analysen von Edna Proben aus dem Kuroshio - Behälter werden nur die Arten , die in den Tank mit Referenzsequenzen in der benutzerdefinierten Datenbank enthalten sind , gezeigt Bitte klicken Sie hier um eine größere Version zu sehen dieser Tisch.

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Discussion

In vielen metabarcoding Studien unter Verwendung von Umweltproben wie Wasser und Boden, post-Filtrationsbehandlung der Filterpatrone ist in der Regel wie folgt 24,25: 1) Aufschneiden oder rissiger das Gehäuse mit Handwerkzeugen (Rohrschneider oder Zange); 2) Entfernen des Filters aus der Patrone; und 3) Schneiden des Filter in kleine Stücke mit einer Rasierklinge für die DNA-Extraktion. Um derartige umständliche und zeitraubende Verfahren zu vermeiden, die zu einer Verunreinigung im Labor anfällig sind, haben wir mehrere DNA-Extraktionsverfahren in dem Gehäuse der Filterpatrone unter Verwendung eines weitverbreiteten, kostengünstigen kommerziellen Kit versucht und erfolgreich entwickelt, die dieses Protokoll mit vorteilhaftem Ergebnisse von EDNA metabarcoding Analyse (Abbildung 1).

Einer der kritischen Schritte im vorliegenden Protokoll in einem vorgewärmten Inkubator die Verwendung eines Rotationsschüttler ist, ist, dass der Lage, gute DNA-Ausbeute für die nachfolgende Bibliothek prepar Bereitstellungation in der EDNA metabarcoding Analyse. Stetigem Rühren der Proteinase-K-Lösung innerhalb des Gehäuses bei optimaler Temperatur erleichtert wahrscheinlich DNA Extraktion aus Teilchen auf dem Filter aufgefangen. Beachten Sie jedoch, dass dieses Protokoll den beiden beinhaltet die Verwendung eines Rotationsschüttler und einem Inkubator und letztere muß der Lage, den ehemaligen aufzunehmen. Zusätzlich ist eine Zentrifuge dass beide 15 ml aufnehmen und 50 ml konische Röhrchen ist unverzichtbar für die restliche Flüssigkeit aus dem post-Filtrationsfilter entfernt und in der Kassette Sammeln extrahierten DNA, respectively.

Es gibt eine andere Möglichkeit ist, eine solche DNA-Extraktion zu erreichen, ohne die Kassette zu schneiden mit öffnen (siehe Tabelle der Materialien / Reagenzien). Das Kit verwendet keine Enzyme zur DNA-Extraktion; Stattdessen verwendet es eine spezielle Lysepuffer in Kombination mit zusätzlichen mechanischen Lyse mit bead zu schlagen. In Vorversuchen auf Basis von natürlichem Meerwasser aus der gemäßigten Küsten Pazifik, wir attempted DNA-Extraktionen dieses Kit zusammen mit einem Prototyp des vorliegenden Protokolls unter Verwendung des kommerziellen Kits. Mit der Verwendung des letzteren Prototyp-Protokoll, wir verschiedene Amplifikationsprodukte in Gelelektrophorese für die erste Runde PCR durchgängig erfasst. Im Gegensatz dazu scheiterte wir keine PCR - Produkte durch die Verwendung eines anderen Kits (siehe Materialien / Reagenzien Table) trotz folgenden zwei alternative Protokolle des Herstellers zu erhalten. Bedenkt man, dass in den beiden Protokollen des zweiten Kit Inhibitor Entfernung PCR - Schritte enthalten sind (siehe Materialien / Reagenzien Tabelle), schlägt diese Beobachtung einen Mangel an ausreichende Mengen an DNA in der Vorlage. Solche relativ geringen DNA - Ausbeuten aus Umweltproben des zweiten Kit verwenden , sind in den letzten Studien 26,27 berichtet.

Im vorliegenden Protokoll haben wir die Filterpatrone mit großer Nennporengröße (0,45 & mgr; m), während Wasser mikrobielle Untersuchungen Konventione gewähltverwenden lly die kleinere (0,22 & mgr; m) nach der Vorfiltration durch größere Porengrößen Filter (1 bis 3 um) 28. Die Gründe der Wahl sind einfach und unkompliziert, und auf theoretischen Argumente basieren nicht: 1) die Porengröße ist sehr viel näher an demjenigen der Glasfaserfilter (0,70 um) wir üblicherweise in früheren EdNA verwendet haben Studien 12,14, 22,23; 2) ist zu erwarten, größere Wassermengen erlauben als die kleinere gefiltert werden. Letzteres Merkmal ist von besonderer Bedeutung für unsere aktuellen Forschungsprojekte in den offenen Ozean und Tiefseeökosysteme mit seltenen Fischreichtum und Biomasse unterziehen. In der Tat haben wir bestätigt, erfolgreiche Filtration eines unabhängig abgetastete 10-L von Meerwasser aus dem Tank Kuroshio ohne merkliche Verstopfung (Ergebnisse nicht gezeigt). Vor kurzem jedoch Turner et al. 29 gezeigt , dass 0,2 & mgr; m Filtration maximiert Karpfen EdNA capture (85% ± 6%) , während insgesamt minimiert (dh nicht-target) EdNACapture (48% ± 3%), aber Filter diese Porengröße zu einem Probenvolumen von weniger als 250 ml Verstopfung begrenzt. Weitere Studien sind notwendig, um die optimale Filterporengröße und Wasserfiltervolumen der Filterpatrone für Edna metabarcoding in verschiedenen Arten von Gewässern mit unterschiedlichem Fischreichtum und Biomasse zu bestimmen.

Eine der Beschränkungen dieses Protokolls ist, daß der Wasserfiltration sollte im Labor durchgeführt werden, wenn eine Stromversorgung zur Verfügung steht. Wegen der begrenzten chemischen Stabilität von DNA beginnt EdNA so schnell abbauen , wie es von einem Organismus vergossen wird und detektierbar ist nur für einen kurzen Zeitraum in Wasserumgebungen (Stunden bis Tage) 30. Deshalb ist es ideal, um die Wasserprobe unmittelbar nach der Entnahme zu filtern signifikanten Abbau von Edna zu vermeiden. In dieser Hinsicht Entwicklungen der Vor-Ort-Filtrationsverfahren die Filterpatrone wäre eine viel versprechende nächste Schritt sein. Die Portabilität und Sterility der Filterpatrone ermöglichen Entwicklung der Vor-Ort-Filtrationsverfahren, die liefert mehr intakt Edna, die Artenzusammensetzung der Fischgemeinschaft genauer in EDNA metabarcoding reflektieren kann. Die gesammelte EdNA auf den Filterpatronen können durch die Injektion eines handelsüblichen Reagens 31 (siehe Materialien / Reagenzien Table) oder Longmire 32 in die Patrone Puffer stabilisiert werden , bevor es wieder in das Labor gebracht.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mesh panel Iris Ohyama MPP-3060-BE
Metal prong Iris Ohyama MR12F
Stand for the mesh panel No brand 4184-9507 available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap Yanagi DP16-TN1000
Male luer-lock connector ISIS 11620
10 ml pipette tip Eppendorf 0030 000.765
10 L book bottle with valve As One 1-2169-01
Sterivex-HV filter Millipore SVHVL10RC denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting As One 1-7379-04
Female luer fitting As One 5-1043-14  
Inlet luer cap ISIS VRMP6
Outlet luer cap ISIS VRFP6
High vacuum tubing As One 6-590-01
Vacuum connector As One 6-663-02
Silicone stopper As One 1-7650-07
Manifold As One 2-258-01
Aspirator-GAS-1 As One 1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit MO BIO 14600-50-NF denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge Kubota Model 4000 Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor Kubota AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube Kubota 055-1280
RNAlater Stabilization Solution Thermo Fisher Scientific AM7020
Parafilm PM992 denoted as "self-sealing film"

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References

  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
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  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
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