合成与阿司匹林富马酸酯前药的表征抑制NFκB活动和乳腺癌干细胞

Cancer Research

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Kastrati, I., Delgado-Rivera, L., Georgieva, G., Thatcher, G. R., Frasor, J. Synthesis and Characterization of an Aspirin-fumarate Prodrug that Inhibits NFκB Activity and Breast Cancer Stem Cells. J. Vis. Exp. (119), e54798, doi:10.3791/54798 (2017).

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Abstract

炎症是癌症标志的underlies癌症发病率和推广,并最终发展为转移。因此,加入一种抗炎药物标准癌症团可改善患者的预后。一种这样的药物,阿司匹林(乙酰水杨酸,ASA),已探索用于癌症的化学预防和抗肿瘤活性。除了抑制环氧合酶2 - 前列腺素轴,ASA的抗癌活性也被归因于核因子ĸB(NFĸB)抑制。由于长时间使用ASA可能引起胃肠道毒性,前体药的策略已成功实施。在这个前药设计的ASA的羧酸被掩蔽和附加药效并入。

这个协议描述了我们如何合成的阿司匹林富马酸盐的前药,GTCpFE,并且其特征在于它的NFĸB途径的抑制乳腺癌细胞和癌症的衰减干细胞样正确联系,一个重要的NFĸB依赖性表型。 GTCpFE有效抑制乳腺癌细胞系NFĸB通路而ASA缺乏任何抑制活性,这表明加入富马酸盐向ASA结构显著有助于其活性。此外,GTCpFE示出了通过阻断微球体形成并衰减所述癌症干细胞相关的CD44 + CD24显著抗癌干细胞活性-免疫。这些结果建立一个可行的策略开发改进的抗炎药为化学预防和治疗癌症。

Introduction

炎症是肿瘤underlies的多个方面,如发病率和推广,并转移1最终进展的标志。在乳腺癌中,这进一步通过流行病学观察显示,经常使用经典的非类固醇抗炎药阿司匹林(乙酰水杨酸,ASA)与在两个乳腺癌发病率的降低,并转移和复发的风险相关联的支持2,3。 ASA主要是通过抑制环氧合酶-2的活性,这是常常在乳腺癌4,5-上调作用。然而,ASA的抗癌作用,也可以通过抑制异常核因子κB(NFκB)信令6-8介导的。这是重要的,因为一个失调NFκB途径促进肿瘤细胞存活,增殖,迁移,侵入,血管发生和抗治疗9-11。 NFκB途径激活也用于安装临界的免疫应答。因此,对于其中需要延长的NFκB抑制作用抗癌治疗时,必须考虑的有害副作用涉及长效免疫抑制。因此,ASA可以作为一个很好的起点治疗优化。

用于癌症治疗的ASA应用之一限制是对环加氧酶2和NFκB抑制所需的升高的剂量,这是与胃肠道毒性相关联,如溃疡和胃出血12,13。然而,转换成ASA作为酯前体药物,可降低ASA的胃肠毒性。为了进一步增强效价和/或增加功能性,另外的结构元件或辅助药效也可以并入酯前药设计。一个这样的药效加入以增强ASA效力针对NFκB通路是富马酸盐,这是我们先前已经显示出对于NFκB途径抑制14,15重要。

15,GTCpFE,并推测这种杂交分子是安全而对NFκB途径有力。我们测试在乳腺癌细胞中的抗NFκB活动及其阻断乳腺癌干细胞(CSCS)。15,依赖于NFκB信令生存和发展16-21能力。我们发现,GTCpFE兑NFκB途径的效力超过ASA 15被显著改善。此外,GTCpFE块形成微球体和衰减CSC表面标志物CD44 + CD24 -免疫,表明GTCpFE能够消灭肿瘤干细胞15。这些结果建立了阿司匹林富马酸前药作为有效抗炎剂也可以定位乳房的CSCs。在乳腺癌治疗而言,GTCpFE可能具有治疗侵略性和致命的疾病的潜力。

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Protocol

1.阿司匹林富马酸前药GTCpFE的合成

  1. 使用塑料柱塞注射器,测量甲醇为0.81毫升(20毫摩尔)和它在水(10毫升)在圆底烧瓶中混合。将烧瓶在冰水浴冷却所得混合物至0℃。添加4-羟基苄基醇(2.48毫克,20毫摩尔),搅拌反应混合物,直到溶液澄清。
  2. 通过称量的O- -acetylsalicyloyl氯化物所需量,并在一个单独的烧瓶中它溶解在溶剂中制备的无水甲苯(10ml)中的O- -acetylsalicyloyl酰氯(3.77毫克,19毫摩尔)。使用塑料柱塞注射器,这种溶液添加到在步骤1.1中制备的混合物中,离开该反应在0℃下搅拌。
  3. 监视用薄层色谱(TLC)的反应。的TLC板应具有的二氧化硅作为固定相。
    1. 制备20:80乙酸乙酯(AcOEt)纯化/己烷组成的流动相。在TLC室(或小容器)加入5 mL流动相以覆盖所述室的底部。
      注:流动相的量取决于所选的腔室中。随时添加足以覆盖底部,但一旦TLC放在里面,溶剂线不应超过在哪里发现的化合物的高度。
    2. 采取用注射器(0.2ml)中的反应的样品,将其放置在一个小管形瓶中,并用乙酸乙酯(2-3滴)稀释。随着TLC去污剂,小心地稀释反应混合物的样品,并在TLC发现它。
      注:点应是1-2毫米,这应该在TLC板的下端1/4英寸来完成。
    3. 在相同的薄层,放置的O-乙酰水杨酰氯的溶液的光斑(0.2毫克0.5毫升乙酸乙酯)作为比较。一旦点是干的,将其放置在室内,并让它运行,直到溶剂前沿几乎已经达到了TLC的顶部。
    4. 就拿出来TLC,待其干燥和紫外线灯下进行可视化。该REAC化完成后,将O -acetylsalicyloyl氯化物点从反应混合物中消失。
    5. 当反应完成时,除去冰 - 水浴,并且使反应在室温下搅拌20小时。
  4. 筛选使用布氏漏斗具有中等孔隙率的多孔盘的沉淀物。放置固体在闪烁瓶中,并留下在真空中化合物在室温下的干燥器过夜。用五氧化二磷(P 2 O 5)作为干燥剂。
  5. 通过设置该反应前,在80℃将其放置在烘箱中至少两天干燥的圆底烧瓶中。可替代地,密封件用隔膜的烧瓶中,并与连接到真空泵系统针戳。打开真空泵上,并用空气加热枪干燥烧瓶中。使其冷却,然后重复该步骤2次以上。
  6. 使用氩气充气气球,它连接到一个塑料注射器(其柱塞ħ作为被移除)用针。关掉真空泵和除去附着其在针被插入到现在干燥的圆底烧瓶中。插入通过隔膜密封圆底烧瓶连接到氩气球针头。
    1. 添加4-羟甲基苯酚酯的2- acetyloxybenzoic酸(100毫克,0.349毫摩尔),4-二甲氨基吡啶(4毫克,0.033毫摩尔)和三乙胺(53毫克,0.523毫摩尔)到一个单独的烧瓶中,然后溶于它们在无水四氢呋喃(5毫升)中。与附连到针上的塑料注射器中,添加这种溶液到密封圆底烧瓶中。通过将烧瓶置于冰水浴冷却该混合物至0℃。
  7. 到先前的混合物中,加入在无水四氢呋喃(5毫升)的乙基fumaroyl酰氯(68毫克,0.419毫摩尔),逐滴历时10分钟。搅拌在0-5℃2-4小时将所得溶液。
  8. 用乙酸乙酯萃取(100毫升)和盐水(50毫升)的反应混合物中。<登记/>注:盐水是氯化钠(NaCl)饱和溶液。为了制备它,放置200ml水在一个干净的玻璃容器中,然后开始加入NaCl(同时搅拌),直到它已不溶解。
    1. 萃取后,除去水相,并重复后面的步骤两次以上。
    2. 加入硫酸钠,以将有机相干燥混合物,直到当玻璃器皿搅拌该固体不结块的。使用另一个布氏漏斗有烧结盘,将混合物过滤至一个圆底烧瓶中,除去硫酸钠,然后用设定在40℃的温度下在旋转蒸发器蒸发至干。
  9. 使用薄层色谱法,确定一个合适的流动相在柱色谱法中使用。
    注意:在这个实验中,使用20:80乙酸乙酯/己烷的梯度。
  10. 准备用硅胶和适当的溶剂相的柱。一旦化合物已被添加,添加硫酸钠(或沙)的一个层至Pr努力保护的列作为溶剂加入。
    1. 作为列运行时,监视通过TLC洗脱液。因为它们是从该柱收集的斑点每隔试管。当感兴趣的产物洗脱,混合含有纯产品成一个大圆底烧瓶中的所有样品,并使用与所述浴温设定在40℃的旋转蒸发器干燥。
      注:产品应显示为白色固体。
  11. 以确认GTCpFE的结构,收集质子和碳(1 H和13 C,分别地)核磁共振(NMR)光谱按照制造商的说明。
    注:在本研究中一个400 MHz的FT NMR光谱仪用来收集1 H和13 C谱。运行在室温下至少25次扫描,以获得足够的数据的分辨率。所观察到的NMR峰是以下,1 H核磁共振(CDCl 3):δ1.29(叔,3H,3 J = 7.0赫兹,CH 3); 2.31(S,3H,CH 3); 4.26(Q,2H,3 J = 7.0赫兹,COOCH 2); 5.25(S,2H,OCH 2); 6.89(S,2H,HC = CH); 7.19(M,3H中,Ar); 7.42(M,3H中,Ar); 7.65(M,1H,氩); 8.22(DD,1H,3 J = 7.8,4J = 1.2赫兹,氩)。 13 C核磁共振(CDCl 3)δ:169.70,164.86,164.75,162.89,151.28,150.69,134.76,134.32,133.26,133.16,132.25,129.81,126.26,124.11,122.47,122.04,66.40,61.43,21.05,14.15。
  12. 另外,使用液相色谱质谱结合精确质量测量根据制造商的说明离子阱和时间的飞行技术作为(LCMS-IT-TOF)收集高分辨率质谱。
    注:在本研究(M + NH 4 +)计算:430.1496;观察:430.1477。

2. GTCPFE抑制NFĸB活动乳腺癌细胞

  1. 细胞培养条件
    1. 维持人体乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231按照标准细胞尽头TURE技术和传播中,在37℃的潮湿培养箱,用5% CO 2。
      1. 从罗斯韦尔园区纪念研究所(RPMI)用补充有10%胎牛血清(FBS)的酚红,1%非必需氨基酸,2mM的L-谷氨酰胺,1%抗生素青霉素 - 链霉素1640培养基制备的MCF-7细胞培养基和6纳克/ ml胰岛素。准备从改进的最小必需培养基(IMEM),补充了5%FBS,1%非必需氨基酸,2mM的L-谷氨酰胺和1%抗生素青霉素 - 链霉素的MDA-MB-231细胞中。
  2. NFκB-RE荧光素酶报告分析
    1. Trypsinize乳腺癌MCF-7细胞用0.25%胰蛋白酶在37℃5分钟,人工计数,每孔的密度90000细胞使用血细胞计数器和种子在24孔板中。
    2. 翌日,共转染细胞与NFκB应答元件(NFκB-RE)的萤光素酶构建体,1微克的质粒DNA /孔,人翁与启动子Renilla荧光素酶构建体,0.2微克/孔。为一式三份各治疗组进行转染。
      1. 洗涤细胞两次,用PBS,并用质粒DNA的混合物在无血清培养基每转染试剂( 例如脂质体Lipofectamine)孔的1微升孵育。 6小时后,改变培养基到1ml正规培养基(无抗生素青霉素和链霉素)。
    3. 16小时后,加入1微升车辆或GTCpFE不同储备溶液或ASA药物的每个孔中。在1000倍的浓度溶解在二甲基亚砜药物储备溶液(100,50,20,10和1毫米)。添加药物后,孵育细胞2小时,在37℃。
    4. 以激活NFκB途径,添加促炎细胞因子TNFα(10μg/ ml的储备液)到每个孔中的10毫微克/ ml的终浓度,孵育4小时。包括TNFα单独控制。吸出介质并存储单元■在-80℃。
    5. 使用根据制造商的说明萤光素酶报道测定系统测量荧光素酶。
      注意:使用在第一次的荧光素酶测定系统( 例如双荧光素酶检测系统),通过重新悬浮它在10ml缓冲液中,并在1毫升等份在-80℃下将其存储制备萤光素酶测定试剂的溶液。
      1. 通过稀释5倍的股票缓冲液与水准备1X裂解液。裂解细胞,每孔用100μl的1×裂解缓冲液。孵育轨道摇床在板15分钟,以中速。
      2. 标记每采样1 1.5mL管中。解冻萤光素酶测定试剂到室温(将需要每个样品50微升),并保持在箔。在玻璃小瓶中制备1×淬火试剂,1点49稀释在缓冲液中并涡旋它(将需要每个样品50微升)。
      3. 添加10微升的细胞裂解物,以标记的离心管中。然后加入50微升荧光素酶检测试剂和轻轻的旋涡。紧接着,将管中的支架和测量经由在光度计的双荧光素酶程序的发光。选择,然后按下列操作:运行Promega公司的协议→双→格洛OK。
      4. 添加50微升猝灭试剂至试管中并轻轻涡旋。测量发光。重复这些步骤每个样品。
      5. 通过标准化NFκB-RE的海肾内部控制(NFκB-RE /海肾)分析使用电子表格数据。比较抑制剂数据TNFα仅控制(TNFα仅被设定在100%)。
  3. NFκB-靶基因的转录
    1. 种子MCF-7细胞在6孔板中,每孔250,000个细胞在2ml培养基体积如在第2.1节描述的方法制备。
    2. 次日,加入TNFα为10ng / ml的另外2小时之前添加2微升不同GTCpFE 1000倍股(100,50,20,10和11毫米)2小时的。运行间隔治疗一式三份。包括车辆和TNFα单独控制。
    3. 使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取方法根据制造商22的指示的RNA分离。确定RNA浓度(在焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水),并用分光光度计RNA的纯度。 RNA应放在冰上或储存在-80℃。处理RNA时,只能使用无RNase障碍提示。
    4. 扭转使用莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的市售的试剂盒转录0.5微克总RNA。
      注:该套件包括5倍与dNTP混合液,和随机六聚体混合物缓冲液和二硫苏糖醇(DTT),在一起。
      1. 加入RNA的0.5微克至200个单位M-MLV,0.5毫米的dNTP,100ng的随机六聚体,10毫摩尔DTT,1×缓冲液和DEPC水至最终的10微升反应体积。进行使用50分钟的PCR仪的逆转录酶反应在37℃,并在70然后15分钟#176;下加热-酶失活。
    5. 稀释得到的cDNA产物至100μl用双蒸水,并使用2微升每个后续定量聚合酶链反应(PCR)反应。
      1. 混合的正向和反向引物的兴趣在每个1.25微米浓度的基因。制备主混合物与2微升双蒸水,1.25μM引物混合物1和5μl染料2倍的,以使双链DNA的检测。加载cDNA的2微升和8微升主混合物到96孔PCR板。
    6. 使用实时PCR系统会根据制造商的说明并手动分析数据(40个循环,95-60℃)进行定量PCR。
      注意:使用已经过验证的和以前23日报道所有PCR引物。
    7. 通过ΔΔCT方法,使用电子表格计算基因表达倍数变化,与核糖体蛋白36B4表达作为内部控制23。

3. GTCpFE抑制乳腺癌干细胞的体外

  1. 微球体形成分析
    1. 通过补充的Dulbecco改良Eagle培养基制备微球体(MS)培养基:用1%甲基纤维素营养混合物F-12(DMEM / F12)无酚红培养基。允许通过在4℃下轻轻摇动过夜以溶解。过滤消毒介质和补充有B27 1倍,1%青霉素和链霉素,5微克/毫升胰岛素,1微克/ ml氢化可的松和20纳克/ ml重组人表皮生长因子。
    2. 通过(在37℃的胰蛋白酶0.25%,5分钟)单层培养的胰蛋白酶消化制备的MDA-MB-231细胞系的单细胞和通过目筛进行筛选。在400个细胞的密度手动计数单个游离细胞和板在96孔超低附着板/孔。第二天,加入不同浓度的GTCpFE( 例如 ,最终GTCpFE浓度:1,10,20,50μM)至最终体积为100微升。进行一式三份的每个治疗。
    3. 后在培养箱培养7天后,获得使用倒置显微镜通过成像软件图像。手动计数直径数MS> 75微米。比较药物治疗车辆控制。
      注意:使用成像软件被确定的MS> 75微米的直径。
  2. CD44 + CD24 - CSC免疫表型
    1. Trypsinize的MDA-MB-231细胞用0.25%胰蛋白酶进行5分钟,在37℃。伯爵在10毫升中使用10 cm的培养皿血球计数器和种子在每盘300万细胞2.1节所述。添加车辆(10微升二甲基亚砜)或GTCpFE(10微升50毫米股票)细胞72小时。
    2. 用于车辆或GTCpFE处理组,trypsinize细胞(如在步骤3.2.1),并分发万个单元格在“测试&#39;或含2ml 1X Hank氏平衡盐溶液(HBSS)中的“控制”5毫升聚苯乙烯管缓冲补充有2%FBS的。
    3. 染色为表面标志物CD44和CD24,旋细胞向下并添加每个缀合的抗体的20微升和HBSS + 2%FBS中,以测试管为一个最终100μl的总体积(1:5稀释)。加入100微升HBSS + 2%FBS来控制管。包括CD44-APC结合的抗体和CD24-PE抗体单染控制或IgG的immunoisotype控制。
    4. 孵育细胞在黑暗中在4℃下30分钟。降速细胞5分钟,在400 XG和在200μlHBSS缓冲液,用2%FBS的重建。继续在黑暗中冰细胞。
    5. 执行使用根据制造商的说明在FACS分析仪仪器活细胞的荧光激活细胞分选(FACS)。收集每个管至少50,000个事件。运行处理一式三份。
      注意:门控是基于从没有染色对照(钴ntrol管),IgG的immunoisotypes和CD44-APC和CD24-PE单污渍。
    6. 分析使用可用的流式细胞仪软件数据。
      注:与CD44 + CD24 GTCpFE处理的细胞的百分比-免疫估计相比,车辆控制。

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Representative Results

图1中 ,阿司匹林富马酸盐的前药,GTCpFE,其抑制活性的对细胞因子的化学结构诱导乳腺癌细胞NFĸB通路表示。 GTCpFE既抑制NFĸB端点,NFĸB-RE萤光素酶活性( 图1B)和表达NFĸB靶基因,如细胞间粘附分子1(ICAM1),趋化因子CC基序配体2(CCL2),以及肿瘤坏死因子(TNF)( 图1C)在MCF-7乳腺癌细胞。在50%计算出的抑制浓度上的两个端点(IC 50)值是〜20微米。 IC 50值是用绘图软件计算。通过比较ASA本身即使在200微米(10倍GTCpFE的IC 50值)表示在乳腺癌细胞没有抑制活性( 图1B,蓝线)。这表明,添加富马酸药效到ASA标志意义的前药策略ntly提高其抗NFĸB活动。

为了测量抗CSC活性,我们使用两种测定:所述微球体(MS)的形成分析和表达CD44 + CD24细胞群-免疫,在乳腺癌24 善意的CSC表面标记。 GTCpFE抑制在图2A中所示的剂量依赖性方式的MS形成的MDA-MB-231乳腺癌细胞。类似于在贴壁培养NFĸB通路的抑制作用,对形成微球体的IC 50值是〜20微米。这种一致性的预期,考虑到肿瘤干细胞依赖NFĸB信令的生存和繁殖16-21。此外,GTCpFE预处理导致CD44 + CD24的一个显著耗尽-在MDA-MB-231细胞群体( 图2B)。总之,这些结果建立GTCpFE的有效地针对乳腺肿瘤干细胞的能力。

图1
图1:GTCpFE抑制乳腺癌细胞的NFĸB通路。 )阿司匹林富马酸药,GTCpFE的化学结构。 (B - C)MCF-7细胞进行预处理2小时,用各种浓度GTCpFE,ASA,或者车辆随后用TNFα(10纳克/ ml)处理2-4小时。 (B)NFκB-RE活动由双荧光素酶报告基因检测测量。用RT-QPCR测量NFκB靶基因,ICAM1,CCL2和TNF的(C)中的表达。药物抑制活性绘制成TNFα的单独%。数据表示为平均值±SEM表示。这个数字已经从15参考修改。 请点击此处查看该figu的放大版本回覆。

图2
2:GTCpFE 抑制乳腺球形成和CD44 + CD24 - 在乳腺癌细胞免疫。 (A)的微球体(MS)形成的MDA-MB-231细胞在处理后测定与不同浓度GTCpFE的。 MS生长(左)和在20X的MS的代表画面的定量(右)中示出。 GTCpFE的效果被绘制为%车辆控制。 (B)中的CD44 + CD24 -群体通过用50μM的GTCpFE 72小时处理的MDA-MB-231细胞的FACS分析确定。每个种群百分比(左)和具有代表性的散点图从FACS(右)的定量被示出。数据表示为平均值±SEM和2因素ANOVA FOLL的统计分析由杜克后测拖欠。 *** P <0.001。这个数字已经从15参考修改。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Red Medium Life Technologies  11875-093 Warm up to 37 °C before use
IMEM Corning 10-024-CV Warm up to 37 °C before use
DMEM / F12 Medium ThermoFisher 21041-025 Warm up to 37 °C before use
MEM NEAA 10 mM 100x Life Technologies  11140
Penicillin Streptomycin Life Technologies  15140-122
L-Glutamine 100x Life Technologies  25030-081
Insulin Sigma-Aldrich I-1882
Fetal Bovine Serum  Atlanta Biologicals S11150
Trypsin 2.5% 10x Invitrogen 15090046
Methyl Cellulose Sigma  M0262
B27 Supplement 50x Gibco 17504-044
EGF Gibco PHG0311L
NFκB-RE Luciferase Construct  Clontech  pGL4.32
Renilla Luciferase Construct  Promega pGL4.70
Lipofectamine 2000 ThermoFisher 11668-019
Dual-Luciferase Reporter Assay  Promega 120000032
NanoDrop Spectrophotometer ThermoFisher
Eppendorf Mastercycler  Eppendorf
StepOne Real Time PCR System Thermo Scientific
Eclipse Microscope Nikon
CyAn ADP Analyzer  Beckman Coulter
QCapture Software QImaging
Summit Software Beckman Coulter
GraphPad Software Prism
TRIzol ThermoFisher 15596-018
M-MLV Reverse Transcriptase Invitrogen 28025-013
100 mM dNTP Set Invitrogen 10297-018
Random Hexamers  Invitrogen 48190-011
Fast SYBR Green Master Mix ThermoFisher 4385612
Costar 96W, ultra low attachment  Corning 3474
HBSS, 1x ThermoFisher 14025134
CD44-APC conjugated antibody  BD Pharmingen 560990 Store at 4 °C, protect from light
CD24-PE antibody BD Pharmingen 560991 Store at 4 °C, protect from light
Recombinant Human TNFα Fisher 210TA100 
CCL2 Primer Forward Sequence AGAATCACCAGCAGCAAGTGTCC
CCL2 Primer Reverse Sequence TCCTGAACCCACTTCTGCTTGG
ICAM1 Primer Reverse Sequence TGACGAAGCCAGAGGTCTCAG
ICAM1 Primer Forward Sequence AGCGTCACCTTGGCTCTAGG
TNF Primer Forward Sequence AAGGGTGACCGACTCAGCG
TNF Primer Reverse Sequence ATCCCAAAGTAGACCTGCCCA
36B4 Primer Forward Sequence GTGTTCGACAATGGCAGCAT
36B4 Primer Reverse Sequence GACACCCTCCAGGAAGCGA
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S5881-500G
4-Hydroxybenzyl Alcohol Sigma-Aldrich 20806-10G
O-Acetylsalicyloyl Chloride Sigma-Aldrich 165190-5G
Phosphorous Pentoxide Sigma-Aldrich 79610-100G
Ethyl Fumaroyl Chloride Sigma-Aldrich 669695-1G
Sodium Sulfate Sigma-Aldrich 246980-500G
4-Dimethylaminopyridine Sigma-Aldrich 714844-100ML 0.5 M in tetrahydrofuran
Triethylamine Sigma-Aldrich T0886-100ML
Toluene Sigma-Aldrich 244511-100ML
Ethyl Acetate Sigma-Aldrich 270989-100ML
Tetrahydrofuran Sigma-Aldrich 401757-2L
400 MHz FT NMR spectrometer  See Bruker’s Avance User’s Manual, version 000822 for details

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References

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