मास प्रोटोकॉल में Neurodegeneration यों

Neuroscience

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Summary

ड्रोसोफिला व्यापक रूप से neurodegeneration अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल एक तरीका है जिसके द्वारा अध: पतन, के रूप में मस्तिष्क में रिक्तिका गठन के द्वारा निर्धारित मात्रा निर्धारित किया जा सकता है वर्णन करता है। यह भी एक नमूने के रूप में प्रसंस्करण और सेक्शनिंग नियंत्रण और प्रयोगात्मक मक्खियों द्वारा प्रयोगात्मक प्रक्रिया के कारण प्रभाव को कम करता है।

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Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

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Abstract

अल्जाइमर रोग (ई) या पार्किंसंस रोग (पीडी) की तरह प्रगतिशील neurodegenerative रोगों दुनिया भर में मानव स्वास्थ्य के लिए एक बढ़ती हुई खतरा हैं। हालांकि स्तनधारी मॉडल pathogenicity की अंतर्निहित तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, साथ में उनके उच्च लागत के साथ स्तनधारी प्रणाली की जटिलता उनके उपयोग को सीमित कर रहे हैं। इसलिए, सरल लेकिन अच्छी तरह से स्थापित ड्रोसोफिला मॉडल-प्रणाली आणविक मार्ग है कि इन बीमारियों में प्रभावित कर रहे हैं की जांच के लिए एक विकल्प प्रदान करता है। व्यवहार घाटे इसके अलावा, neurodegenerative रोगों में इस तरह के neuronal मौत और axonopathy के रूप में ऊतकीय phenotypes की विशेषता है। न्यूरोनल अध: पतन यों और निर्धारित करने के लिए कैसे यह आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों से प्रभावित होता है, हम एक ऊतकीय दृष्टिकोण है कि वयस्क मक्खी दिमाग में रिक्तिकाएं मापने पर आधारित है का उपयोग करें। व्यवस्थित त्रुटि के प्रभाव को कम करने के लिए और सीधे नियंत्रण और विस्तार से वर्गों की तुलना करनाएक तैयारी में erimental मक्खियों, हम आयल वर्गों के लिए 'कॉलर' विधि का उपयोग करें। Neurodegeneration तो आकार और / या रिक्तिकाएं कि मक्खी के मस्तिष्क में विकसित किया है की संख्या को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है। यह या तो ब्याज की एक विशेष क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करके या धारावाहिक वर्गों है कि पूरा सिर अवधि प्राप्त करने के द्वारा पूरे मस्तिष्क का विश्लेषण करके किया जा सकता है। इसलिए, इस विधि के रूप में सामान्य उम्र बढ़ने के दौरान होता है, एक न केवल गंभीर अध: पतन, लेकिन यह भी अपेक्षाकृत हल्के phenotypes कि कुछ वर्गों में ही पहचाने जा रहे हैं मापने के लिए अनुमति देता है।

Introduction

जीवन प्रत्याशा में वृद्धि के साथ, अल्जाइमर या पार्किंसंस जैसे neurodegenerative रोगों आम जनता के लिए एक बढ़ती हुई स्वास्थ्य खतरा बन गए हैं। राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के अनुसार, 115 मिलियन लोग दुनिया भर में, अंतर्निहित 2050 में पागलपन से प्रभावित होने की हालांकि महत्वपूर्ण प्रगति उनमें से कई के लिए, जीन और जोखिम कारकों इन रोगों के कम से कम कुछ में शामिल की पहचान करने में किया गया है भविष्यवाणी कर रहे हैं आणविक तंत्र अभी भी अज्ञात है या नहीं अच्छी तरह से समझ रहे हैं।

Caenorhabditis एलिगेंस और ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर की तरह सरल अकशेरुकी मॉडल जीवों एक छोटे जीवन चक्र, संतान की बड़ी संख्या है, और अच्छी तरह से स्थापित है और कभी कभी अद्वितीय आनुवंशिक और आणविक विधियों 1 की उपलब्धता सहित neurodegenerative रोगों के तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रयोगात्मक लाभ में से एक किस्म की पेशकश -12। इसके अलावा, इन जीवों निष्पक्ष लिए उत्तरदायी हैंबातचीत स्क्रीन है कि neurodegenerative phenotypes पर अपने उत्तेजक या सुधारने प्रभाव से इन रोगों के लिए योगदान कारकों की पहचान कर सकते हैं।

ऐसे आनुवंशिक बातचीत का विश्लेषण करने और उम्र बढ़ने के प्रभाव का आकलन करने neurodegeneration पता लगाने के लिए और इसकी गंभीरता को मापने के लिए मात्रात्मक प्रोटोकॉल की आवश्यकता है। यह आकलन अपेक्षाकृत आसानी से किया जा सकता है जब इस तरह की घ्राण सीखने, नकारात्मक geotaxis, या तेजी से phototaxis के रूप में ड्रोसोफिला में व्यवहार सभी पहलुओं, जो एक अंकीय प्रदर्शन मूल्य 13-21 प्रदान मापने। यह भी न्यूरॉन्स की गणना के द्वारा neuronal अस्तित्व पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए संभव है। हालांकि, यह तभी संभव है जब एक विशिष्ट जनसंख्या है कि स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य है, डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स कि पीडी में प्रभावित कर रहे हैं, और फिर भी, परिणाम विवादास्पद 22-24 गया है की तरह पर ध्यान केंद्रित कर रहा है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल कॉलर विधि का उपयोग करता आयल धारावाहिक वर्गों प्रदर्शन करने के लिए एक विधिकि मूल रूप से हाइजेनबर्ग और Bohl, जो इसे इस्तेमाल किया ड्रोसोफिला 25 में संरचनात्मक मस्तिष्क म्यूटेंट को अलग-थलग करने के लिए विकसित किया गया था। कॉलर विधि के प्रयोग के बाद cryosections, vibratome वर्गों, और प्लास्टिक वर्गों 26-28 में शामिल है, अनुकूलित किया गया है। इधर, इस विधि पूरे उड़ सिर, जो तब रिक्तिकाएं कि neurodegenerative phenotypes 16,21,29-32 साथ मक्खियों में विकसित मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का धारावाहिक वर्गों प्राप्त करने के लिए कार्यरत है। इन मापों विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में किया जा सकता है या पूरी मस्तिष्क को कवर कर सकते हैं; बाद के दृष्टिकोण के रूप में उम्र बढ़ने के दौरान मनाया एक भी कमजोर अपक्षयी phenotypes की पहचान करने की अनुमति देता है। अंत में, जब कॉलर का उपयोग, 20 मक्खियों के लिए एक तैयारी है, जो के रूप में संसाधित किया जा सकता है न केवल कम समय लेने वाली है, लेकिन यह भी में मामूली परिवर्तन की वजह से कलाकृतियों को कम करने, नियंत्रण और एक ही तैयारी में प्रयोगात्मक मक्खियों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है तैय़ारी।

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Protocol

1. कॉलर पर सिर फिक्सिंग और आयल में एम्बेड

नोट: निर्धारण प्रक्रिया में कदम सब के सब एक धूआं हुड में किया जाना चाहिए। Methylbenzoate, जबकि एक स्वास्थ्य जोखिम प्रस्तुत नहीं, एक बहुत ही अलग गंध है, जो भारी हो सकता है अगर एक धूआं हुड में नहीं संभाला है।

  1. मक्खियों anesthetizing पहले, क्लोरोफॉर्म के 15 एमएल और 99% इथेनॉल के 30 एमएल हिमनदों एसिटिक एसिड के 5 एमएल (क्लोरोफॉर्म और एसिटिक एसिड मिश्रण नहीं है) जोड़कर Carnoy समाधान के 50 एमएल तक है। इस तरह के एक crystalizing डिश के रूप में एक फ्लैट नीचे, के साथ एक ग्लास कंटेनर में डाल देना सुनिश्चित करने के लिए है कि कॉलर फ्लैट रखना कर सकते हैं और पूरी तरह से समाधान द्वारा कवर कर रहे हैं।
  2. सीओ 2 या आकाश के साथ मक्खियों anesthetize।
  3. धागा मक्खियों (अप सबसे कॉलर के साथ करने के लिए 20) अपनी गर्दन से संदंश का उपयोग कॉलर में। चित्रा 1 ए के रूप में देखा ही ओरिएंटेशन में सिर के सभी के लिए पंक्ति में है, और यह सुनिश्चित करें कि कोई नुकसान सिर या आंखों के लिए होता है कोमल हो याद रखें।
  4. यादृच्छिक पदों इतना है कि मक्खियों के आदेश आसानी से वर्गों में पहचाना जा सकता है पर साइन oculis मक्खियों (तीर, चित्रा 1 ए) को शामिल करें। इसके अलावा, अगर प्रयोगात्मक मक्खियों एक प्रकाश या सफेद आँख का रंग है, इस तरह के जंगली प्रकार के रूप में कुछ लाल आंखों मक्खियों, धागा उन दोनों के बीच यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त वर्णक स्लाइड दाग मौजूद है। कॉलर संख्या के साथ एक साथ एक प्रोटोकॉल शीट पर मक्खियों के आदेश रिकॉर्ड यदि एक से अधिक कॉलर का उपयोग कर।
  5. 4 घंटे - एक बार एक कॉलर समाप्त कर दिया गया है, 3.5 के लिए तैयार Carnoy समाधान में जगह है।
  6. उचित निपटान कनस्तर में Carnoy समाधान बाहर डंप और इथेनॉल washes शुरू करते हैं। धीरे धीरे डालना के रूप में तो कंटेनर में कॉलर के स्थान को परेशान करने के लिए नहीं सुनिश्चित करें।
  7. दो बार 99% इथेनॉल में 30 मिनट के लिए कॉलर धो लें।
  8. 1 घंटे के लिए 100% इथेनॉल में कॉलर धो लें। overdehydration रोकने के लिए समय पर washes बदलने के लिए सुनिश्चित करें।
  9. methylbenzoate में कॉलर रखोहे / आरटी पर एन। methylbenzoate के वाष्पीकरण को रोकने के लिए parafilm के साथ कंटेनर सील।
  10. धूआं हुड में उचित डिस्पोजेबल कंटेनर में methylbenozate डालो। (- 57 डिग्री सेल्सियस 56) पैराफिन मोम और methylbenzoate 1 कम पिघलने बिंदु: 1 के एक पहले से तैयार मिश्रण जोड़ें। पर इस बिंदु से, कॉलर सुनिश्चित करें कि आयल कठोर नहीं करता है सुनिश्चित करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में रखा जाना चाहिए।
  11. methylbenozate और उचित डिस्पोजेबल कंटेनर में पैराफिन मिश्रण बाहर डालो, और पिघला हुआ शुद्ध पैराफिन मोम डालना, 65 डिग्री सेल्सियस पर रखा कॉलर पर।
  12. 30 मिनट के बाद आयल बदलें और यह कम से कम 5 बार दोहराएँ। कम से कम 6 - 8 washes किया जाना चाहिए।
  13. एक बार washes पूरा कर रहे हैं, स्लॉट्स लगभग कॉलर के आकार के साथ एक रबर आइस क्यूब ट्रे में कॉलर जगह है। उन पर पिघला हुआ आयल डालो जब तक पूरी तरह से कवर किया और यह हे कड़ा करने की अनुमति / एन (हवा के बुलबुले से बचने की कोशिश)।
  14. पैराफिन ब्लॉकों contai हटायेनिंग आइस क्यूब ट्रे से कॉलर। कॉलर एक रेजर ब्लेड का उपयोग से पैराफिन ब्लॉक को अलग करें, धीरे कॉलर बंद तोड़ने। सिर पैराफिन ब्लॉक में किया जाएगा, जबकि शव कॉलर में रहना होगा। ब्लॉक के कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है।
  15. कॉलर को साफ करने के लिए, 65 डिग्री सेल्सियस पर एक deparafinization एजेंट में उन्हें सोख आयल, प्रकाश स्क्रबिंग के साथ स्वच्छ हटाने, और पुन: उपयोग से पहले इथेनॉल में धोने के लिए।

2. सेक्शनिंग और बढ़ते

  1. 50 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म थाली गर्म। वस्तु धारकों (या धातु बढ़ते ब्लॉक) और रेज़र ब्लेड प्लेट पर रखें और उन्हें गर्म करते हैं।
  2. सेक्शनिंग के लिए वांछित उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है, या तो पक्ष की ओर सिर (क्षैतिज वर्गों के लिए) के साथ पैराफिन ब्लॉक या एक गर्म बढ़ते ब्लॉक करने के लिए (ललाट वर्गों के लिए) ऊपर की ओर का सामना करना पड़ (संक्षेप में संपर्क पक्ष में ब्लॉक पिघलने) देते हैं। हीटिंग थाली से ब्लॉक निकालें और यह कम से कम 10 मील के लिए शांत करने की अनुमतिn सुनिश्चित करने के लिए कि आयल बढ़ते ब्लॉक पर एक उचित मुहर के लिए काफी कठोर है। असमान वर्गों को रोकने के लिए जितना संभव हो उतना ब्लॉक की सतह के साथ समानांतर में गठबंधन प्रमुखों की पंक्ति रखें।
  3. एक रेजर ब्लेड ले लो और अतिरिक्त आयल ट्रिम मक्खी सिर से दूर केवल इतना है कि एम्बेडेड प्रमुखों के साथ एक छोटी सी पंक्ति रहता है (धार आसान trimming के लिए गरम किया जा सकता है)। बहुत ज्यादा ट्रिम तो यह है कि आयल (अधिक ट्रिमिंग सेक्शनिंग के दौरान किया जा सकता है) सेक्शनिंग दौरान तोड़ नहीं है नहीं करना सुनिश्चित करें।
  4. बढ़ते ब्लॉक microtome की वस्तु धारक में रखें और यह सुनिश्चित करें कि सिर की पंक्ति के संरेखण ब्लेड के किनारे करने के लिए संभव के रूप में समानांतर है।
  5. उन्हें पाली एल Lysine (पीएलएल) समाधान की एक पतली परत के साथ कवर द्वारा खुर्दबीन स्लाइड तैयार है और उन्हें 5 मिनट के लिए सूखी। उन्हें पानी के साथ कवर कुछ ही समय पहले का उपयोग करें।
  6. 7 माइक्रोन वर्गों में कटौती और स्लाइड पानी पर तैर वर्गों के रिबन हस्तांतरण। <br /> नोट: क्षैतिज वर्गों के लिए पूरे मस्तिष्क को प्राप्त करने के लिए, हम जब तक पूरी तरह से सिर काट दिया गया है (मस्तिष्क में सूंड से काटने) आंख में कटौती करने के लिए शुरू से रिबन इकट्ठा। एक से अधिक स्लाइड पूरे सिर के लिए आवश्यक हो सकता है।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी की थाली पर स्लाइड प्लेस और रिबन के बारे में 1 मिनट के लिए विस्तार करने के लिए अनुमति देते हैं।
  8. अतिरिक्त पानी निकालने (इसे बंद कर डालने का कार्य या एक ऊतक का उपयोग करके) और स्लाइड हे / एन सूखी।
  9. एक deparafinization एजेंट (पूरी तरह से वर्गों को शामिल करते हुए) के साथ भरा एक लंबा, खड़ी स्लाइड धुंधला जार में स्लाइड्स रखकर स्लाइड से पैराफिन मोम निकालें। 60 मिनट प्रत्येक - 30 मिनट के 3 washes प्रदर्शन करना।
  10. अंतिम धोने से स्लाइड निकालें। embedding मीडिया के 2 बूँदें स्लाइड पर प्लेस और एक बड़े coverslip के साथ कवर।

3. Photographing और धारा का विश्लेषण

  1. 2 डी - तैयार स्लाइड के लिए 1 सूखे की अनुमति दें। फिर, उन्हें एक प्रतिदीप्ति microsc पर जांचनीले रंग की रोशनी के तहत ope।
  2. मक्खियों के उन्मुखीकरण का निर्धारण करने के लिए और ब्याज के क्षेत्र खोजने के लिए यदि एक विशिष्ट क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित कर एक कम बढ़ाई प्रयोग करें।
    नोट: SWS मक्खियों (देखें चित्र 2) के लिए, हम अनुभाग है कि महान संयोजिका शामिल खोजने के लिए और एक छवि लेने के लिए (आमतौर पर 40x बढ़ाई पर)। जब पूरे दिमाग का विश्लेषण (चित्रा 3) के रूप में, हम एक सिर से सभी वर्गों के माध्यम से स्क्रॉल और इस खंड की तस्वीर सबसे गंभीर phenotype या सभी वर्गों है कि रिक्तिकाएं दिखाने के साथ हैं या तो।
  3. एक डबल अंधा विश्लेषण के लिए, जीनोटाइप जानने के बिना ले और नंबर छवियों और बाद में उन्हें पहचान करने के लिए पंक्ति में कॉलर संख्या और सिर की स्थिति रिकॉर्ड है।
  4. एक बार छवियों को ले लिया गया है, उनमें एक इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण।
  5. अनुभाग प्रति या प्रति सिर रिक्तिकाएं की संख्या की गणना। रिक्तिका आकार को मापने, एक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में छवियों को खोलने के लिए और भी एक चयन के साथ रिक्तिकाएं चयन करने के लिएएल। चुने गए रिक्तिकाएं में पिक्सल की राशि का निर्धारण करते हैं।
  6. माइक्रोन से 2 रूपांतरण के लिए, तस्वीरें प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया बढ़ाई पर एक मंच सुक्ष्ममापी कैलिब्रेशन स्लाइड की एक तस्वीर ले लो। 100 माइक्रोन 2 में पिक्सल की राशि का निर्धारण एक रूपांतरण कारक गणना करने के लिए।
  7. माइक्रोन 2 में रूपांतरण कारक ऊपर चरण में गणना द्वारा पिक्सेल की संख्या से विभाजित करके कुल पिक्सेल संख्या में परिवर्तित।

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Representative Results

आंख वर्णक 33 कि पूरे उड़ सिर धरना द्वारा दाग धारावाहिक वर्गों में वर्णित विधि परिणामों का उपयोग करना। इस का एक हिस्सा चित्रा 1 बी, जहां एक व्यक्ति के सिर से वर्गों ऊपर से नीचे तक दिखाए जाते हैं, में दिखाया गया है। विभिन्न वर्गों मक्खियों से इस उदाहरण में बाएं से दाएं देखा जाता है। अभिविन्यास और मक्खियों की पहचान की सुविधा के लिए, एक अंधा मक्खी (साइन oculis) की स्थिति 3 (तीर, चित्रा 1 बी) पर एक मार्कर के रूप में डाला जाता है।

neurodegeneration यों, हम रिक्तिकाएं है कि इन वर्गों में पता लगाया जा सकता है के गठन को मापने। रिक्तिकाएं दौर के रूप में परिभाषित कर रहे हैं, काले धब्बे कि हरी फ्लोरोसेंट neuropil भीतर (चित्रा 2 में तीर और 3) कर रहे हैं या कोर्टेक्स और उस मक्खी के मस्तिष्क के कम से कम 2 लगातार वर्गों में दिखाई दे रहे हैं। द्वारा neurodegeneration बढ़ातामापने रिक्तिकाएं या तो एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करके या पूरे मस्तिष्क का विश्लेषण करके किया जा सकता है। मस्तिष्क के एक विशेष क्षेत्र के लिए विश्लेषण सीमित मामलों में जहां एक उत्परिवर्तन केवल futsch 'OLK उत्परिवर्ती 34 में घ्राण पालियों की तरह, एक विशिष्ट क्षेत्र को प्रभावित करता है में उपयोगी है, लेकिन यह भी है कि जब सभी या कई में गंभीर अध: पतन इस्तेमाल किया जा सकता मस्तिष्क के क्षेत्रों के। बाद के लिए एक उदाहरण स्विस पनीर (SWS) उत्परिवर्ती (चित्रा 2) है, जहां सभी रिक्तिकाएं मापने भी समय लगता होगा है। इसलिए हम केवल एक छवि ले लिया है और यह सुनिश्चित करना है कि माप हमेशा एक ही स्तर पर किया गया है, हम महान संयोजिका (जीसी, चित्रा 2A) है, जो केवल एक या दो वर्गों में निहित है के स्तर पर सभी छवियों को ले लिया। जबकि हम 1 दिन पुरानी SWS '1 मक्खियों में रिक्तिका गठन पता नहीं लगा था (डेटा नहीं दिखाया गया है), एक नुकसान के समारोह एलील 35, कुछ रिक्तिकाएं पहचाने जा रहा थेn 7 दिन पुरानी SWS '1 मक्खियों (तीर, चित्रा 2A)। 14 डी (चित्रा 2 बी) और 21 डी (चित्रा 2 सी) के लिए मक्खियों एजिंग आगे इस phenotype वृद्धि हुई है, अपनी प्रगतिशील प्रकृति को दर्शाता है। deutocerebral neuropil (डी.एन.) में वर्णित विधि का प्रयोग करने में रिक्तिकाएं की संख्या की गणना उम्र के साथ रिक्तिकाएं की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि की पुष्टि की। इसके अलावा, संयुक्त क्षेत्र रिक्तिकाएं से घिरा काफी उम्र बढ़ने (चित्रा 2 डी) के साथ वृद्धि हुई थी।

हालांकि, सभी म्यूटेंट SWS के रूप में इस तरह के एक गंभीर phenotype दिखाने के लिए, और उन मामलों में, अध: पतन में मतभेदों को निर्धारित करने के लिए जब एक छोटे से क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं मुश्किल है। इसी तरह, अध: पतन है कि उम्र बढ़ने के दौरान होता है काफी हल्का है (चित्रा 3 ए - सी) और इसलिए, हम पूरे मस्तिष्क जब इस phenotype बढ़ाता का विश्लेषण किया। मस्तिष्क का पता चला सभी रिक्तिकाएं की राशि का निर्धारणउम्र के साथ एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है, और इस मामले में भी जब इन रिक्तिकाएं (चित्रा 3 डी) के संयुक्त क्षेत्र को मापने था।

आकृति 1
चित्रा 1. आयल धारावाहिक वर्गों। ए) कॉलर विधि का प्रयोग, प्रयोगात्मक और नियंत्रण मक्खियों उन्हें एक कॉलर पर सूत्रण से एक नमूने के रूप में कार्रवाई की जा सकती। अंधा साइन oculis मक्खियों अभिविन्यास (तीर) के लिए डाला जाता है। बी) योजनाबद्ध कॉलर में मक्खी सिर के उन्मुखीकरण दिखा। सी) इस छवि में, अलग-अलग मक्खी सिर से वर्गों स्लाइड पर बाएं से दाएं उन्मुख होते हैं। स्लाइड पर ऊपर से नीचे तक, एक ही उड़ सिर से धारावाहिक वर्गों देखा जा सकता है। इस मामले में, एक साइन oculis मक्खी स्थिति तीन (तीर) पर डाला गया था। वर्गों फ्लोरोसेंट आंख वर्णक है कि अधिक washes के द्वारा दाग रहे हैं काटने के बाद वर्गों। एक = 5 मिमी में और सी = 0.5 मिमी में स्केल बार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
स्विस पनीर उत्परिवर्ती में आंकड़ा 2 प्रगतिशील Neurodegeneration। 7-दिन (ए), 14-दिन (बी) और 21-दिन (सी) वर्ष SWS '1 मक्खियों से पैराफिन सिर अनुभाग। तीर रिक्तिकाएं है कि उम्र बढ़ने के साथ विकसित किया है को इंगित करें। उम्र से संबंधित अध: पतन रिक्तिकाएं की संख्या की गणना और उनके संयुक्त क्षेत्र (डी) को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित है। SEM और विश्लेषण किया मक्खियों की संख्या संकेत दिया है। स्केल बार = 25 माइक्रोन। *** पी <0.001।csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Neurodegeneration उम्र के साथ होता है। 10-दिन (ए), 30 दिन (बी) और 60 दिन (सी) वर्ष प्रकार के जंगली मक्खियों से पैराफिन सिर अनुभाग। तीर रिक्तिकाएं कि वृद्ध मक्खियों में विकसित किया है को इंगित करें। उम्र से संबंधित अध: पतन रिक्तिकाएं की संख्या की गणना और उनके संयुक्त क्षेत्र (डी) को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित है। SEM और विश्लेषण किया मक्खियों की संख्या संकेत दिया है। स्केल बार = 25 माइक्रोन। *** पी <0.001। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ A>

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Discussion

वर्णित विधि ड्रोसोफिला के मस्तिष्क में neurodegeneration यों के लिए एक साधन प्रदान करता है। एक विशेष प्रकार की कोशिका गिनती जैसे अन्य तरीकों, neurodegeneration की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस विधि का लाभ यह है कि यह अधिक आम तौर पर लागू किया जा सकता है। कोशिकाओं की गिनती की आवश्यकता है कि इन कोशिकाओं को मज़बूती से या तो एक विशिष्ट एंटीबॉडी या एक सेल विशिष्ट मार्कर की अभिव्यक्ति है, जो हमेशा उपलब्ध नहीं है का उपयोग कर पहचाना जा सकता है। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि नाटकीय रूप से अलग-अलग परिणाम शायद लेबलिंग के लिए और पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया परिस्थितियों के कारण, कि विधि 24 के साथ प्राप्त किया जा सकता है। degenerating कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक और तरीका है, कोशिका मृत्यु मार्कर का इस्तेमाल होता है विरोधी सक्रिय कस्पासे 3. हालांकि तरह, यह केवल सक्रिय रूप से कोशिका मृत्यु के दौर से गुजर कोशिकाओं को दिखाता है और कोशिकाओं को एक बार मर चुके हैं, वे अब पता लगता है। विधि यहाँ प्रस्तावित का एक अन्य लाभ यह है कि कोई धुंधला autoflu के कारण की आवश्यकता हैआंख वर्णक, जो समय की बचत होती है और धुंधला स्थितियों में बदलाव की वजह से कलाकृतियों को कम करता है की वजह से orescence। यह ध्यान रखें कि, जब इस पद्धति का उपयोग करके, मक्खियों की आंखों स्लाइड दाग करने के लिए पर्याप्त है वर्णक महत्वपूर्ण है। अगर आँख का रंग भी प्रकाश है, कुछ जंगली प्रकार जोड़ने कॉलर के लिए मक्खियों पर्याप्त और स्लाइड के पार भी धुंधला हो जाना सुनिश्चित करने के लिए उचित होगा। इस विधि का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कई क्षेत्रों की जांच की जा सकती है, भले ही सिर में है। हालांकि हम डेटा दिखाने के लिए नहीं है, हम इन वर्गों का इस्तेमाल किया है पटल कोर्टेक्स 30,36 में रेटिना और glial सेल नुकसान में neurodegeneration जांच करने के लिए। यहाँ के रूप में वर्णित है, इस विधि क्षैतिज वर्गों प्रदान करता है, लेकिन 90 डिग्री से पैराफिन ब्लॉक मोड़ जब यह वस्तु धारक पर पिघलने से, एक भी ललाट वर्गों प्राप्त कर सकते हैं। इस प्रकार, इस विधि के लिए एक बहुमुखी प्रक्रिया है कि मक्खी के मस्तिष्क में neurodegeneration की समय पर और कुशल माप के लिए अनुमति देता है। VAC के गठन की वजह सेuoles मानव neurodegenerative रोगों के कई फ्लाई मॉडल, ई के लिए मॉडल शामिल है, में देखा गया है, पीडी, Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस (ए एल एस), और पॉलीग्लूटमाइन-दोहराता 16,37-40 से होने वाली बीमारी, इस विधि में neurodegenerative phenotypes यों इस्तेमाल किया जा सकता है रोग मॉडल की एक किस्म है।

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल सरल और एक बार उपकरणों की प्रारंभिक सेटअप के बाहर किया जाता है आसानी से पूरा कर लिया है। कुछ नोटों को ध्यान में रखने के लिए सावधानी से इथेनॉल washes समय के लिए अधिक-निर्जलीकरण सिर के बचने के लिए, ध्यान से पैराफिन ब्लॉकों ट्रिम करने के लिए इतनी के रूप में वर्गों या सिर नहीं खोने के लिए, और पानी पर रिबन overexpand नहीं करने के लिए जब स्लाइड है गर्मी ब्लॉक पर। रिबन और बहुत दूर का विस्तार करने के लिए, मक्खी सिर के फाड़ परिणाम कर सकते हैं अनुमति दी जाती है तो रिबन में सिर के आदेश खो दिया जा सकता है। इसके अलावा, जीनोटाइप को अंधा किया जा रहा है, जबकि विश्लेषण कर रही पूर्वाग्रह से बचने के लिए आवश्यक है। यह सबसे अच्छा एक व्यक्ति SLI तैयारी होने से हासिल की हैडेस और जबकि एक अन्य व्यक्ति तस्वीरें लेने और माप कर रही है रिकॉर्ड रखने। इस विधि की सीमाओं में से एक है कि केवल कुछ कोशिकाओं के पतन का पता लगाने के लिए बहुत मुश्किल हो जाएगा। उस मामले में, प्रभावित सेल की आबादी का एक विशिष्ट दाग अधिक जानकारीपूर्ण किया जाएगा। इसके अलावा, इस विधि से एक कोशिका मृत्यु, जो apoptotic कोशिका मृत्यु का निर्धारण करने के लिए इस तरह के एक TUNEL के धुंधला के रूप में अधिक विशिष्ट तरीके की आवश्यकता है, के विभिन्न प्रकार के बीच अंतर करने की अनुमति नहीं है। अन्त में, इस विधि कोशिका मृत्यु और axonal अध: पतन, जो भी neuropil में रिक्तिकाएं के रूप में पहचाने जाने होगा के बीच अंतर नहीं कर सकते हैं।

जैसा कि हमारे परिणामों में दिखाया गया है, इस विधि विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में या पूरे मस्तिष्क में अध: पतन को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हमारे अनुभव में, यह केवल एक विशिष्ट क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए उपयोगी है जब phenotype काफी मजबूत है, तब भी जब सब मस्तिष्क क्षेत्रों प्रभावित कर रहे हैं। यह काफी काम के बोझ को कम कर देता है और प्रभावित नहीं करता हैपरिणाम। हम मूल रूप से SWS उत्परिवर्ती में कई क्षेत्रों का विश्लेषण किया और phenotype की प्रगति में बहुत ही परिणाम मनाया जब केवल एक ही क्षेत्र की तुलना और जब सभी क्षेत्रों का विश्लेषण (नहीं दिखाया डेटा)। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य क्षेत्र में विभिन्न स्तरों पर अलग-अलग क्षेत्रों या क्षेत्रों के विश्लेषण की वजह से कलाकृतियों से बचने के लिए चुना जाना चाहिए।

इसके विपरीत, उन मामलों में जहां phenotype अपेक्षाकृत हल्के है, यह बेहतर पूरे मस्तिष्क का विश्लेषण करने के लिए है, क्योंकि एक विशिष्ट क्षेत्र में रिक्तिकाएं पाने की संभावना कम है। 60 दिन पुरानी मक्खियों में पूरे मस्तिष्क में 5 रिक्तिकाएं - उदाहरण के लिए, इस रूप में चित्रा 3, जो केवल 4 में परिणाम में दिखाया गया है जब उम्र से संबंधित neurodegeneration का निर्धारण करने के मामले में भी है। जब पूरे दिमाग में रिक्तिकाएं गिनती, एक खाते है कि छोटे रिक्तिकाएं केवल एक खंड में दिखाई देगा जबकि बड़े लोगों के कई वर्गों के ऊपर का विस्तार होगा में ले लिया है। बाद के संबंध में, adj के करीब निकटताक्योंकि यह अपेक्षाकृत आसानी से निर्धारित करने के लिए कि क्या एक ही रिक्तिका कई वर्गों में मौजूद है Acent वर्गों जब इस पद्धति का उपयोग (चित्रा 1), एक और लाभ प्रदान करता है।

अंत में, इस प्रोटोकॉल अलग neurodegenerative रोगों के कई ड्रोसोफिला मॉडल के अध्ययन के लिए उपयोगी साबित हो सकते हैं। बातचीत प्रोटीन कि उन्नति या अपक्षयी phenotype अंतर्निहित तंत्र का कारण है कि या अल्जाइमर और पार्किंसंस जैसे रोगों को संशोधित बारे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं बढ़ पहचान करना। इस प्रकाशन में, हम अध: पतन कि प्रगतिशील है, जहां जानवरों सामान्य रूप से विकसित पता लगाने, लेकिन उम्र बढ़ने के दौरान बढ़ती अध: पतन को दिखाने के लिए इस विधि का उपयोग करें। साथ ही, इस विधि को भी अध: पतन कि विकास दोष है, जो पहले से ही नव eclosed मक्खियों में मौजूद होना चाहिए के कारण होता है यह निर्धारित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

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References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

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