La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

enfermedades neurodegenerativas progresivas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la enfermedad de Parkinson (EP) son una amenaza creciente para la salud humana en todo el mundo. Aunque los modelos de mamíferos han aportado importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de la patogenicidad, la complejidad de los sistemas de mamíferos, junto con sus altos costos están limitando su uso. Por lo tanto, la simple pero bien establecido modelo de sistema de Drosophila ofrece una alternativa para la investigación de las vías moleculares que se ven afectados en estas enfermedades. Además de anomalías de comportamiento, enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por fenotipos histológicos tales como la muerte neuronal y axonopatía. Para cuantificar la degeneración neuronal y para determinar cómo se ve afectada por factores genéticos y ambientales, usamos un enfoque histológico que se basa en la medición de las vacuolas en el cerebro de moscas adultas. Para minimizar los efectos del error sistemático y la comparación directa de las secciones de control y experimental moscas en una preparación, que utilizan el método de "cuello" de las secciones de parafina. La neurodegeneración se evalúa a continuación, midiendo el tamaño y / o número de vacuolas que se han desarrollado en el cerebro de la mosca. Esto se puede hacer ya sea centrándose en una región específica de interés o mediante el análisis de todo el cerebro mediante la obtención de secciones en serie que abarcan la cabeza completa. Por lo tanto, este método permite medir no sólo la degeneración severa, pero también fenotipos relativamente suaves que sólo son detectables en algunas secciones, como ocurre durante el envejecimiento normal.

Introduction

Con el aumento de la esperanza de vida, las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson se han convertido en una amenaza creciente para la salud de la población en general. De acuerdo con los Institutos Nacionales de la Salud, 115 millones de personas en todo el mundo se prevé que se afectados por la demencia en 2050. Aunque se han hecho progresos significativos en la identificación de los genes y los factores de riesgo implicados en al menos algunas de estas enfermedades, para muchos de ellos, el subyacente mecanismos moleculares aún no se conocen o no se entiende bien.

Simples organismos modelo de invertebrados como Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster ofrecen una variedad de ventajas experimentales para estudiar los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo un ciclo de corta vida, gran número de progenie, y la disponibilidad de métodos genéticos y moleculares bien establecidos y, a veces únicos 1 -12. Además, estos organismos son susceptibles de imparcialpantallas de interacción que pueden identificar los factores que contribuyen a estas enfermedades por sus efectos agravantes o mejorar en fenotipos neurodegenerativos.

El análisis de estas interacciones genéticas y la evaluación de los efectos del envejecimiento requiere protocolos cuantitativos para detectar la neurodegeneración y para medir su gravedad. Esta evaluación puede hacerse con relativa facilidad en la medición de los aspectos de comportamiento en Drosophila, como el aprendizaje olfativo, geotaxis negativos, o fototaxis rápido, que proporcionan un valor numérico rendimiento 13-21. También es posible determinar los efectos sobre la supervivencia neuronal contando las neuronas. Sin embargo, esto sólo es posible cuando se centra en una población específica que se pueda identificar claramente, al igual que las neuronas dopaminérgicas que se ven afectados en la enfermedad, e incluso entonces, los resultados han sido controvertidos 22-24.

El protocolo descrito aquí utiliza el método de cuello para realizar secciones en serie de parafina, un métodoque fue desarrollado originalmente por Heisenberg y Böhl, que lo utilizó para aislar mutantes anatómicas cerebrales en Drosophila 25. El uso del método de cuello posteriormente se ha adaptado, incluso en criosecciones, vibratome secciones y secciones de plástico de 26-28. Aquí, se emplea este método para obtener secciones en serie de toda la cabeza de la mosca, que luego se puede utilizar para medir las vacuolas que se desarrollan en las moscas con fenotipos neurodegenerativas 16,21,29-32. Estas mediciones se pueden hacer en áreas específicas del cerebro o pueden cubrir todo el cerebro; el último enfoque permite identificar incluso débiles fenotipos degenerativas, como se observa durante el envejecimiento. Por último, cuando se utilizan los collares, hasta 20 moscas pueden ser procesados ​​como una preparación, que no sólo es menos tiempo, sino que también permite el análisis de control y las moscas experimentales en la misma preparación, minimizando artefactos debido a ligeros cambios en la preparación.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. La fijación de la cabeza sobre los cuellos y inclusión en parafina

Nota: Todos los pasos en el proceso de fijación debe hacerse en una campana de humos. Metilbenzoato, mientras que no plantean un riesgo para la salud, tiene un olor muy distinto, que puede ser abrumador si no se manejan en una campana de humos.

  1. Antes de anestesiar las moscas, conforman 50 ml de solución de Carnoy mediante la adición de 15 ml de cloroformo y 5 ml de ácido acético glacial y 30 ml de etanol al 99% (no mezcle el cloroformo y ácido acético). Se vierte en un recipiente de vidrio con un fondo plano, como por ejemplo un plato de cristalizar, para asegurar que los collares pueden quedar plano y están completamente cubiertas por la solución.
  2. Anestesiar las moscas con CO 2 o éter.
  3. moscas de rosca (hasta 20 con la mayoría de los collares) por sus cuellos en los cuellos utilizando fórceps. Recuerde que debe alinear todas las cabezas en la misma orientación, como se ve en la figura 1A, y ser suave para asegurar que no se produzcan daños en la cabeza o los ojos.
  4. Incluir moscas seno oculis (flechas, Figura 1A) en posiciones aleatorias por lo que el orden de las moscas pueden ser fácilmente identificados en las secciones. Además, si las moscas experimentales tienen un color de ojos claros o blancos, enhebrar algunas moscas de ojos rojos, como el tipo salvaje, entre ellos para garantizar que el pigmento está presente suficiente para teñir la diapositiva. Registrar el orden de las moscas en una hoja de protocolo junto con el número de cuello si se utiliza más de un collar.
  5. Una vez que un collar se ha terminado, colocarlo en la solución de Carnoy preparado durante 3,5 - 4 h.
  6. Volcar la solución de Carnoy en el recipiente eliminación adecuada y comenzar los lavados de etanol. Asegúrese de verter lentamente a fin de no perturbar la colocación de los collares en el contenedor.
  7. Lavar los cuellos de 30 min en 99% de etanol dos veces.
  8. Lavar los collares en 100% de etanol durante 1 h. Asegúrese de cambiar los lavados a tiempo para evitar overdehydration.
  9. Poner los collares en metilbenzoatoO / N a temperatura ambiente. Sellar el recipiente con parafilm para evitar la evaporación de la metilbenzoato de metilo.
  10. Verter la methylbenozate en el recipiente desechable adecuado en la campana de humos. Añadir una mezcla previamente preparada de 1: 1 punto de fusión bajo (56 - 57ºC) cera de parafina y benzoato de metilo. A partir de ahora, los collares necesitan ser mantenidos en una incubadora a 65 ° C para asegurarse de que la parafina no se endurece.
  11. Vierte el methylbenozate y la mezcla de parafina en el recipiente desechable adecuada, y se vierte cera fundida de parafina pura, se mantiene a 65 ° C, en los cuellos.
  12. Cambiar la parafina después de 30 minutos y repetir esto por lo menos 5 veces. Al menos 6 - 8 lavados deben realizarse.
  13. Una vez que los lavados son completos, colocar los collares en una bandeja de cubitos de hielo de goma con ranuras aproximadamente del tamaño de los collares. Verter la parafina fundida sobre ellos hasta que esté completamente cubierto y deje que se endurezca O / N (tratar de evitar burbujas de aire).
  14. Retire los bloques de parafina contaiNing los collares de la bandeja de cubitos de hielo. Separar el bloque de parafina desde el collar usando una hoja de afeitar, rompiendo suavemente del collar. Las cabezas estarán en el bloque de parafina, mientras que los cuerpos permanecerán en el cuello. Los bloques se pueden mantener a temperatura ambiente.
  15. Para limpiar los collares, remojar en un agente deparafinization a 65 ° C para eliminar la parafina, limpio, con luz de lavado, y se lava en etanol antes de reutilizar.

2. seccionamiento y de montaje

  1. Calentar una placa de calentamiento a 50 ° C. Colocar los portaobjetos (o bloques de montaje de metal) y hojas de afeitar en la placa y dejar que se caliente.
  2. Dependiendo de la orientación deseada para seccionar, sujetar el bloque de parafina, ya sea con las cabezas hacia el lado (por secciones horizontales) o hacia arriba (para secciones frontales) a un bloque de montaje calentada (fusión brevemente el bloque en el lado de contacto). Retire el bloque de la placa de calentamiento y dejar que se enfríe durante al menos 10 millasn de asegurar que la parafina se ha endurecido lo suficiente para un sellado adecuado en el bloque de montaje. Mantenga la fila de cabezas alineadas en paralelo con la superficie del bloque tanto como sea posible para evitar que las secciones irregulares.
  3. Tome una hoja de afeitar y recortar el exceso de parafina lejos de las cabezas de la mosca de modo que sólo una pequeña fila con las cabezas incrustadas permanece (la hoja de afeitar puede ser calentado por el recorte más fácil). Asegúrese de no recortar demasiado para que la parafina no se rompa durante el corte (más ajuste se puede hacer durante el corte).
  4. Coloque el bloque de montaje en el soporte objeto de la microtomo y asegurarse de que la alineación de la fila de cabezas es lo más paralelo posible al borde de la hoja.
  5. Preparar portaobjetos de microscopio cubriéndolos con una capa delgada de solución de poli-L-lisina (PLL) y dejarlos secar durante 5 minutos. Cubrirlos con agua poco antes de su uso.
  6. Cortar 7 micras secciones y transferir la cinta de las secciones a la diapositiva flotando en el agua. <br /> NOTA: Para obtener todo el cerebro para las secciones horizontales, recogemos la cinta desde el momento de iniciar el corte en el ojo hasta que la cabeza ha sido completamente cortada (corte de la trompa en el cerebro). Más de una diapositiva puede ser necesario para toda la cabeza.
  7. Colocar el portaobjetos en una placa de calor a 37 ° C y deje que la cinta se expanda durante aproximadamente 1 minuto.
  8. Eliminar el exceso de agua (mediante el vertido de su alimentación o el uso de un pañuelo de papel) y secar el portaobjetos S / N.
  9. Quitar la cera de parafina de la diapositiva mediante la colocación de las diapositivas en una, vertical tarro deslizable tinción alto lleno de un agente deparafinization (cubriendo completamente las secciones). Realizar 3 lavados de 30 min - 60 min cada uno.
  10. Retire el porta del lavado final. Colocar 2 gotas de medios de incrustación sobre el portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos grande.

3. Fotografiar y análisis de las Secciones

  1. Dejar que las muestras preparadas se sequen durante 1 - 2 d. Entonces, examinarlas en un microsc de fluorescenciaope bajo luz azul.
  2. Use un aumento menor para determinar la orientación de las moscas y para encontrar la región de interés si se centra en una región específica.
    NOTA: Para los moscas SWS (ver Figura 2), nos encontramos con la sección que contiene el gran comisura y tomar una imagen (por lo general a un aumento de 40X). Al analizar el cerebro entero (como en la figura 3), que desplazarse por todas las secciones de una cabeza y, o bien fotografiar la sección con el fenotipo más grave o todas las secciones que muestran vacuolas.
  3. Para un análisis doble ciego, tomar y número de imágenes sin conocer el genotipo y registrar el número de cuello y la posición de la cabeza de la fila para identificarlos más tarde.
  4. Una vez que se han tomado las imágenes, analizarlos utilizando un software de imágenes.
  5. Contar el número de vacuolas por sección o por cabeza. Para medir el tamaño vacuola, abrir las imágenes en un programa de software y seleccione las vacuolas con una selección demasiadol. Determinar la cantidad de píxeles en las vacuolas seleccionados.
  6. Para la conversión a 2 micras, tomar una foto de una diapositiva de calibración micrómetro en el aumento que se usa para la adquisición de fotos. Determinar la cantidad de píxeles de 100 micras 2 para calcular un factor de conversión.
  7. Convertir el número total de píxeles en micras 2 dividiendo el número de píxeles por el factor de conversión calculada en el paso anterior.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utilizando los resultados método descrito en secciones seriadas teñidas por el pigmento del ojo 33 que abarcan toda la cabeza de la mosca. A parte de esto se muestra en la Figura 1B, donde las secciones de una cabeza individuales se muestran de arriba a abajo. Las secciones de diferentes moscas son vistos de izquierda a derecha en este ejemplo. Para facilitar la orientación y la identificación de las moscas, una mosca sin ojos (oculis sinusoidales) se inserta como un marcador en la posición 3 (flecha, Figura 1B).

Para cuantificar la neurodegeneración, medimos la formación de vacuolas que se pueden detectar en estas secciones. Las vacuolas se definen como redondo, manchas oscuras que están dentro del neurópila verde fluorescente (puntas de flecha en la Figura 2 y 3) o de la corteza y que son visibles en al menos 2 secciones consecutivas del cerebro de la mosca. La cuantificación de la neurodegeneración porvacuolas de medición o bien se puede hacer por centrarse en una región específica del cerebro o mediante el análisis de todo el cerebro. La limitación del análisis a una región específica del cerebro es útil en los casos en que una mutación solamente afecta a una región específica, como los lóbulos olfativos en el futsch 'olk mutante 34, pero también se puede utilizar cuando hay degeneración severa en todos o muchos regiones del cerebro. Un ejemplo de esto último es el queso suizo (SWS) mutante (Figura 2), donde la medición de todas las vacuolas sería demasiado tiempo. Por lo tanto, tomamos sólo una imagen y, para asegurar que las mediciones se realizaron siempre en el mismo nivel, tomamos todas las imágenes a nivel de la gran comisura (GC, figura 2A), que sólo está contenida en una o dos secciones. Mientras que no se detectó la formación de vacuolas en SWS 1 día de edad '1 Las moscas (datos no mostrados), un alelo de pérdida de función 35, algunas vacuolas eran detectables in 7 días de edad SWS '1 Las moscas (puntas de flecha, Figura 2A). Envejecimiento las moscas a 14 d (Figura 2B) y 21 d (Figura 2C) aumentado aún más este fenotipo, mostrando su naturaleza progresiva. Contar el número de vacuolas en el neuropilo deutocerebral (dn) utilizando el método descrito confirmó un aumento significativo en el número de vacuolas con la edad. Además, el área combinada comprendida por vacuolas aumentó significativamente con el envejecimiento (Figura 2D).

Sin embargo, no todos los mutantes muestran un fenotipo tan severa como SWS, y en esos casos, las diferencias en la degeneración son difíciles de determinar cuando se centra en un área pequeña. Del mismo modo, la degeneración que se produce durante el envejecimiento es bastante suave (Figura 3A - C) y por lo tanto, se analizó la totalidad del cerebro cuando la cuantificación de este fenotipo. La determinación de la suma de todas las vacuolas en el cerebro reveladoun aumento significativo con la edad, y esto también fue el caso cuando se mide el área combinada de estas vacuolas (Figura 3D).

Figura 1
Figura 1. parafina secciones en serie. A) Usando el método de cuello, moscas experimentales y de control se pueden procesar como una muestra enroscando ellos en una sola collar. Sin ojos moscas oculis seno se insertan de orientación (flechas). B) Esquema que muestra la orientación de las cabezas de moscas en el cuello. C) En esta imagen, las secciones de diferentes cabezas de moscas están orientados de izquierda a derecha en la diapositiva. De arriba a abajo en la diapositiva, las secciones de serie de la misma cabeza de mosca se pueden ver. En este caso, una mosca oculis sine se insertó en la posición tres (flecha). Las secciones se tiñeron por el pigmento fluorescente ojo que lava sobre el secciones después del corte. La barra de escala en A = 5 mm y en C = 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. La neurodegeneración progresiva en el mutante queso suizo. Jefe de sección de parafina de 7-día-(A), 14-día-(B) y 21-día-(C) viejos SWS '1 Las moscas. Las puntas de flecha apuntan a vacuolas que se han desarrollado con el envejecimiento. La degeneración relacionada con la edad se cuantificó contando el número de vacuolas y midiendo su área combinada (D). El SEM y el número de moscas analizadas se indica. La barra de escala = 25 micras. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3. La neurodegeneración se produce con la edad. Sección de la cabeza de parafina de 10-día-(A), 30-día-(B) y 60-día-(C) de edad de tipo salvaje moscas. Las puntas de flecha apuntan a vacuolas que se han desarrollado en las moscas de edad. La degeneración relacionada con la edad se cuantificó contando el número de vacuolas y midiendo su área combinada (D). El SEM y el número de moscas analizadas se indica. La barra de escala = 25 micras. *** P <0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. </ A>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El método descrito proporciona un medio para cuantificar la neurodegeneración en el cerebro de Drosophila. Mientras que otros métodos, como contar un tipo celular específico, se pueden utilizar para identificar la neurodegeneración, la ventaja de este método es que se puede aplicar de forma más general. Contando las células requiere que estas células pueden ser identificados de forma fiable utilizando un anticuerpo específico o la expresión de un marcador específico de célula, lo que no siempre está disponible. Además, se ha demostrado que los resultados dramáticamente diferentes se pueden obtener con el método 24, presumiblemente debido a las condiciones usadas para el etiquetado y para la detección. Otro método para detectar las células en degeneración es el uso de marcadores de muerte celular, como anti-caspasa 3. Sin embargo, esto sólo identifica las células sometidas activamente la muerte celular y una vez que las células han muerto, ya no son detectables. Otra ventaja del método propuesto aquí es que no se requiere tinción debido a la autofluorescence causada por el pigmento de los ojos, lo que ahorra tiempo y reduce al mínimo los artefactos causados ​​por los cambios en las condiciones de tinción. Es importante tener en cuenta que, al utilizar este método, los ojos de las moscas tienen suficiente pigmento para teñir la diapositiva. Si el color de los ojos es demasiado clara, añadiendo un poco de tipo salvaje vuela al collar sería aconsejable asegurar suficiente e incluso manchar través de la diapositiva. Una ventaja adicional de este método es que múltiples áreas pueden ser examinadas, incluso en la misma cabeza. Aunque no mostramos los datos, hemos utilizado estas secciones para examinar la neurodegeneración en la pérdida de células gliales retina y en la corteza lámina 30,36. Como se describe aquí, este método proporciona secciones horizontales, pero girando el bloque de parafina por 90 °, cuando la fusión que en el soporte de objeto, también se puede obtener secciones frontales. Por lo tanto, este método es un procedimiento versátil que permite la medida oportuna y eficiente de la neurodegeneración en el cerebro de la mosca. Debido a que la formación de vacuoles se ha observado en muchos modelos de mosca de enfermedades neurodegenerativas humanas, incluyendo modelos para AD, PD, la esclerosis lateral amiotrófica (ALS), y las enfermedades causadas por poliglutaminas repite 16,37-40, este método se pueden utilizar para cuantificar fenotipos neurodegenerativos en una variedad de modelos de enfermedad.

En general, este protocolo es simple y fácil completado una vez que la configuración inicial del equipo se lleva a cabo. Algunas notas a tener en cuenta son a tiempo con cuidado los lavados de etanol para evitar la sobre-deshidratación de las cabezas, para recortar cuidadosamente los bloques de parafina a fin de no perder secciones o cabezas, y para no overexpand la cinta en el agua cuando la tapa está en el bloque de calor. Si se permite que la cinta de ampliar demasiado, el desgarro de las cabezas de moscas y puede dar lugar a la orden de las cabezas de la cinta se puede perder. Además, ser ciego para el genotipo mientras se hace el análisis es esencial para evitar el sesgo. Esto se logra mejor por tener una persona que prepara el SLIdes y el mantenimiento de los registros, mientras que otra persona está tomando las fotos y hacer las mediciones. Una de las limitaciones de este método es que la degeneración de sólo unas pocas células, será muy difícil de detectar. En ese caso, un colorante específico de la población de células afectada sería más informativo. Además, este método no permite distinguir entre diferentes tipos de muerte celular, que requiere métodos más específicos, tales como una tinción de TUNEL para determinar la muerte celular apoptótica. Por último, este método no puede diferenciar entre la muerte celular y la degeneración axonal, que también sería detectable como vacuolas en el neuropilo.

Como se muestra en nuestros resultados, este método se puede utilizar para tratar la degeneración en áreas específicas del cerebro o en todo el cerebro. En nuestra experiencia, es útil para analizar sólo un área específica cuando el fenotipo es bastante fuerte, incluso cuando se ven afectadas todas las regiones cerebrales. Esto reduce significativamente la carga de trabajo y no afecta a laresultado. Se analizaron originalmente varias zonas en el mutante SWS y observaron resultados muy similares en la progresión del fenotipo cuando se compara sólo un área y en el análisis de todas las áreas (datos no mostrados). Sin embargo, hay que señalar que una región claramente identificable debería ser elegido para evitar los artefactos debido al análisis de diferentes áreas o zonas a diferentes niveles.

En cambio, en los casos en que el fenotipo es relativamente suave, es mejor analizar todo el cerebro, ya que la probabilidad de encontrar vacuolas en una región específica es baja. Por ejemplo, este es el caso cuando la determinación de la neurodegeneración relacionada con la edad, como se muestra en la Figura 3, lo que resulta en solo 4-5 vacuolas en todo el cerebro en las moscas de 60 días de edad. Al contar vacuolas en todo el cerebro, hay que tener en cuenta que las pequeñas vacuolas solamente se mostrarán en una sección, mientras que los más grandes se extienden por varias secciones. Con respecto a este último, la estrecha proximidad de adjsecciones ACENT al utilizar este método (Figura 1) proporciona otra ventaja, ya que es relativamente fácil para determinar si la misma vacuola está presente en varias secciones.

En conclusión, este protocolo puede ser útil para el estudio de muchos modelos de Drosophila de diferentes enfermedades neurodegenerativas. La identificación de proteínas interactuantes que mejoran o agravan el fenotipo degenerativo puede proporcionar información crucial sobre los mecanismos subyacentes que causan o modifican enfermedades como el Alzheimer y el Parkinson. En esta publicación, se utiliza este método para detectar la degeneración que es progresiva, donde los animales se desarrollan normalmente, pero muestran el aumento de la degeneración durante el envejecimiento. Además, este método también puede ser adaptado para determinar la degeneración que es causada por defectos en el desarrollo, que ya deben estar presentes en las moscas eclosed recién.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics