Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sunderhaus, E. R., Kretzschmar, D. Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila. J. Vis. Exp. (118), e54809, doi:10.3791/54809 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Progressieve neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD) is een toenemend gevaar voor de volksgezondheid wereldwijd. Hoewel zoogdierlijke modellen belangrijke inzichten verschaft in de onderliggende mechanismen van pathogeniciteit, de complexiteit van zoogdierlijke systemen met hun hoge kosten beperken het gebruik ervan. Daarom is de eenvoudige, maar goed ingeburgerde Drosophila model-systeem biedt een alternatief voor het onderzoeken van de moleculaire pathways die worden beïnvloed bij deze ziekten. Naast afwijkend gedrag, zijn neurodegeneratieve ziekten gekenmerkt door histologische fenotypes zoals neuronale dood en axonopathie. Neuronale degeneratie kwantificeren en te bepalen hoe deze wordt beïnvloed door genetische en omgevingsfactoren, gebruiken we een histologische benadering die is gebaseerd op het meten van de vacuolen bij volwassen vliegen hersenen. Om de effecten van systematische fout te minimaliseren en om direct te vergelijken secties van de bedienings- en experimental vliegen in één preparaat, gebruiken we de 'kraag' methode voor paraffine secties. Neurodegeneratie wordt vervolgens beoordeeld door het meten van de afmeting en / of het aantal vacuolen die zijn ontstaan ​​in de vlieg hersenen. Dit kan worden gedaan door te focussen op een specifiek gebied van belang of door analyse van de hele hersenen door het verkrijgen van seriecoupes dat de volledige kop overspannen. Daarom is deze werkwijze kan men niet alleen de degeneratie maar ook relatief mild fenotypes die alleen detecteerbaar in enkele secties te meten, zoals optreedt tijdens normale veroudering.

Introduction

Met de stijging van de levensverwachting, hebben neurodegeneratieve ziekten als Alzheimer of Parkinson's een steeds grotere bedreiging voor de algemene bevolking gezondheid geworden. Volgens de National Institutes of Health, 115 miljoen mensen wereldwijd wordt voorspeld te worden getroffen door dementie in 2050. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de identificatie van genen en risicofactoren betrokken bij ten minste enkele van deze ziekten, voor velen van hen, de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onbekend of niet goed begrepen.

Eenvoudige ongewervelde modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans en Drosophila melanogaster bieden een verscheidenheid aan experimentele voordelen aan de mechanismen van neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van een korte levenscyclus, groot aantal nakomelingen, en de beschikbaarheid van gevestigde en soms unieke genetische en moleculaire methoden 1 bestuderen -12. Bovendien zijn deze organismen vatbaar onbevooroordeeldeinteractie schermen die factoren die bijdragen aan deze ziekten door hun verzwarende of verbetering van effecten op neurodegeneratieve fenotypes kunnen identificeren.

Het analyseren van dergelijke genetische interacties en de beoordeling van de vergrijzing effecten vereist kwantitatieve protocollen tot neurodegeneratie te detecteren en de ernst ervan te meten. Deze beoordeling kan relatief eenvoudig worden gedaan bij het meten van gedragsaspecten in Drosophila, zoals olfactorische leren, negatief geotaxis, of snel phototaxis, die een numerieke voorstelling waarde 13-21 te bieden. Het is ook mogelijk om de effecten op neuronale overleving te bepalen door het tellen van neuronen. Dit is echter alleen mogelijk wanneer gericht op een specifieke populatie, dat is duidelijk herkenbaar, net als de dopaminerge neuronen die worden beïnvloed in PD, en zelfs dan zijn de resultaten controversieel 22-24 geweest.

De hier beschreven protocol gebruikt de kraag methode paraffine seriecoupes voeren, een werkwijzedat werd oorspronkelijk ontwikkeld door Heisenberg en Böhl, die het gebruikt om anatomische hersenen mutanten te isoleren in Drosophila 25. Het gebruik van de kraag methode is vervolgens aangepast, zoals in vriescoupes, vibratoomcoupes en plastic secties 26-28. Hier wordt deze werkwijze toegepast op opeenvolgende coupes van de hele vlieg kop, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de vacuolen die zich ontwikkelen in vliegen met neurodegeneratieve fenotypes 16,21,29-32 meten verkrijgen. Deze metingen kunnen worden gedaan in specifieke hersengebieden of kan de gehele hersenen bedekken; de laatste benadering maakt het mogelijk om zelfs zwakke degeneratieve fenotypes te identificeren, zoals waargenomen tijdens veroudering. Tenslotte, bij gebruik van de kragen, tot 20 vliegen worden verwerkt als één preparaat, dat niet alleen minder tijdrovend, maar ook zorgt voor de analyse van controle en experimentele vliegen in hetzelfde preparaat, geminimaliseerd artefacten als gevolg van kleine veranderingen in de voorbereiding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Vaststelling van de Hoofd op Kragen en insluiten in paraffine

Opmerking: Alle stappen in het bevestigingsorgaan proces moet worden uitgevoerd in een zuurkast. Methylbenzoaat, terwijl niet het stellen van een risico voor de gezondheid, heeft een zeer aparte geur, die overweldigend kan zijn als niet in een zuurkast behandeld.

  1. Voordat verlamming de vliegen, make-up 50 ml Carnoy-oplossing door het toevoegen van 15 ml chloroform en 5 ml ijsazijn en 30 ml van 99% ethanol (niet de chloroform en azijnzuur niet mengen). Giet het in een glazen houder met een vlakke bodem, zoals kristalliseren schotel, zodat de kragen plat kan liggen en zijn volledig bedekt door de oplossing.
  2. Verdoven de vliegen met CO 2 of ether.
  3. Draad vliegen (maximaal 20 meeste kragen) van de nek in de kragen behulp van een tang. Probeer alle koppen uitgelijnd in dezelfde oriëntatie, zoals in figuur 1A en zijn jegens zodat er geen schade ontstaat aan het hoofd of ogen.
  4. Omvatten sinus oculis vliegen (pijlen, Figuur 1A) op willekeurige posities zodat de volgorde van de vliegen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd in de secties. Bovendien, als de experimentele vliegen hebben een lichte of witte kleur van je ogen en haal een paar rood-eyed vliegen, zoals wild-type, tussen hen om ervoor te zorgen dat er voldoende pigment aanwezig zijn om de dia vlek is. Noteer de volgorde van de vliegen op een protocol blad samen met de kraag nummer als u meer dan een kraag.
  5. Zodra een kraag is afgerond, plaatst u deze in de voorbereide Carnoy oplossing voor 3,5-4 uur.
  6. Dump de Carnoy oplossing in de juiste verwijdering bus en beginnen met het ethanol wasbeurten. Zorg ervoor langzaam gieten om niet de plaatsing van de kragen in de houder verstoren.
  7. Was de kragen gedurende 30 minuten in 99% ethanol tweemaal.
  8. Was de kragen in 100% ethanol gedurende 1 uur. Zorg ervoor dat u de wasbeurten op tijd veranderen overdehydration voorkomen.
  9. Zet de kragen in methylbenzoaatO / N bij kamertemperatuur. Verzegel de container met parafilm de verdamping van de methylbenzoaat voorkomen.
  10. Giet de methylbenozate in de juiste wegwerp container in de zuurkast. Voeg een eerder bereide mengsel van 1: 1 laag smeltpunt (56-57 ° C) paraffine en methylbenzoaat. Vanaf dit punt moeten de kragen in een incubator worden gehouden bij 65 ° C om ervoor te zorgen dat de paraffine niet verhard.
  11. Giet de methylbenozate en paraffine mengsel in de juiste wegwerp container, en giet gesmolten pure paraffine, gehouden op 65 ° C, op de kragen.
  12. Wijzig de paraffine na 30 min en herhaal dit ten minste 5 maal. Tenminste 6-8 wasbeurten worden uitgevoerd.
  13. Zodra de wasbeurten zijn voltooid, zet de kragen in een rubber ijsblokjesvorm sleuven ongeveer ter grootte van de kragen. Giet gesmolten paraffine over hen tot het volledig bedekt en laat het O harden / N (proberen om luchtbellen te vermijden).
  14. Verwijder de paraffineblokken containing de kragen van het ijsblokje lade. Scheid de paraffine blok van de kraag met behulp van een scheermesje, zachtjes breken van de kraag. De hoofden zullen in de paraffine blok, terwijl de lichamen zullen blijven in de kraag. De blokken kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard.
  15. Om de kragen schoon te maken, laat ze in een deparafinization middel bij 65 ° C om de paraffine, schoon met licht schrobben verwijderen en wassen in ethanol alvorens opnieuw te gebruiken.

2. Snijden en montage

  1. Verwarm een ​​verwarmingsplaat tot 50 ° C. Plaats het object houders (of metaal montage blokken) en scheermesjes op het bord en laat ze opwarmen.
  2. Afhankelijk van de gewenste oriëntatie voor het snijden, bevestigt het paraffineblok hetzij met de kop naar de zijkant (voor horizontale secties) of naar boven (frontale secties) om een ​​verwarmde montageblok (kort smelt het blok aan de contactzijde). Verwijder het blok van de verwarming bord en laat hem afkoelen gedurende minstens 10 min dat de paraffine voldoende is uitgehard om een ​​goede afdichting op het montageblok. Houd de rij koppen lijn parallel aan het oppervlak van het blok zo veel mogelijk te oneffenheden te voorkomen.
  3. Neem een ​​scheermesje en trim de overtollige paraffine uit de buurt van de vlieg hoofden zodat slechts een kleine rij met de embedded hoofden blijft (het scheermesje kan worden opgewarmd voor eenvoudiger trimmen). Zorg ervoor dat niet te veel te trimmen, zodat de paraffine niet breekt tijdens het snijden (meer trimmen kan worden gedaan tijdens het snijden).
  4. Plaats het montageblok in de objecthouder van het microtoom en zodat de stand van de rij koppen zo evenwijdig mogelijk aan de rand van het blad.
  5. Bereid microscoopglaasjes door bedekken met een dunne laag poly-L-lysine-oplossing (PLL) en laat ze drogen gedurende 5 minuten. Bedek ze met water kort voor gebruik.
  6. Snijd 7 um secties en breng het lint van de punten aan de dia op het water drijven. <br /> OPMERKING: Om het hele brein voor horizontale secties te verkrijgen, verzamelen wij het lint uit bij het starten in het oog te snijden totdat het hoofd volledig is gesneden (het snijden van de snuit in de hersenen). Meer dan een slide kan nodig zijn voor de gehele kop.
  7. Plaats het preparaat op een warmte plaat bij 37 ° C en laat het lint te breiden gedurende 1 min.
  8. Verwijder het teveel aan water (door het gieten van het af of het gebruik van een weefsel) en droog de slides O / N.
  9. Verwijder de paraffinewas van de schuif door het plaatsen van de objectglaasjes in een lange, verticale slide-kleuring pot gevuld met een deparafinization middel (volledig bedekken volgende secties). Voer 3 wasbeurten van 30 min - 60 min elk.
  10. Verwijder de dia uit de laatste wasbeurt. Plaats 2 druppels van het inbedden van de media op de glijbaan en bedek het met een groot dekglaasje.

3. fotograferen en analyseren van de secties

  1. Laat de voorbereide dia's drogen 1-2 d. Daarna onderzoeken ze op een fluorescentie Microscope onder blauw licht.
  2. Gebruik een lagere vergroting om de oriëntatie van de vliegen te bepalen en de regio van belang vinden als gericht op een specifieke regio.
    LET OP: Voor de SWS vliegen (zie figuur 2), vinden we het gedeelte dat de grote commissure bevat en neem een afbeelding (meestal op 40x vergroting). Bij het analyseren van de gehele hersenen (zoals in figuur 3), schuiven we door alle secties van een kop en ofwel fotograferen het gedeelte met de meest ernstige fenotype of alle secties die vacuolen vertonen.
  3. Voor een dubbel-blinde analyse over te gaan en het aantal foto's zonder te weten het genotype en noteer de kraag aantal en de positie van het hoofd in de rij om ze later te identificeren.
  4. Zodra de foto's zijn genomen, te analyseren met behulp van een imaging software.
  5. Tel het aantal vacuolen per afdeling of per hoofd. Om de vacuole maat te meten, opent u de beelden in een softwareprogramma en selecteer de vacuolen met een selectie ookl. Bepaal het aantal pixels in de geselecteerde vacuolen.
  6. Voor de conversie naar um 2, neem een foto van een podium micrometer kalibratie dia bij de vergroting wordt gebruikt voor het verwerven van foto's. Bepaal het aantal pixels in 100 urn 2 een conversiefactor te berekenen.
  7. Converteren het totale aantal pixels in 2 urn door het aantal pixels te delen door de conversiefactor berekend in de bovenstaande stap.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van de beschreven methode resulteert in seriecoupes gekleurd door het oog pigment 33 die de hele vlieg kop omvatten. Een gedeelte hiervan wordt getoond in figuur 1B, waarbij de secties van een individu kop getoond van boven naar beneden. De secties van verschillende vliegen worden gezien van links naar rechts in dit voorbeeld. Oriëntatie en identificatie van de vliegen te vergemakkelijken, is een eyeless fly (sinus oculis) ingevoegd als een marker op positie 3 (pijl, figuur 1B).

Tot neurodegeneratie kwantificeren meten we de vorming van vacuolen die in deze secties kunnen worden gedetecteerd. Vacuolen worden gedefinieerd rond, donkere vlekken die binnen het green fluorescent neuropil (pijlen in figuur 2 en 3) of cortex en die toegankelijk zijn in ten minste 2 opeenvolgende secties van de vlieg hersenen. Het kwantificeren van neurodegeneratie doormeten vacuolen kan hetzij worden gedaan door te focussen op een bepaald hersengebied of door analyse van de gehele hersenen. Het beperken van de analyse tot een specifiek gebied van de hersenen is nuttig wanneer een mutatie alleen invloed op een bepaald gebied, zoals het olfactorische kwabben in het Fütsch 'KOL mutant 34, maar kan ook worden gebruikt wanneer er degeneratie in alle of vele gebieden van de hersenen. Een voorbeeld van het laatste is de Zwitserse kaas (SWS) mutant (figuur 2), waarbij het meten al vacuolen te tijdrovend zou zijn. Slechts één beeld We hebben derhalve en om ervoor te zorgen dat de metingen werden altijd uitgevoerd op hetzelfde niveau, hebben we alle afbeeldingen op het niveau van de grote commissure (gc figuur 2A), die slechts in één of twee delen. Terwijl wij niet vacuoles detecteerde in 1 dag oud SWS 1 vliegen (gegevens niet getoond), een verlies-van-functie allel 35, wat vacuolen detecteerbaar in 7 dagen oude sws "1 vliegen (pijlpunten, figuur 2A). Veroudering de vliegen tot 14 d (Figuur 2B) en 21 d (figuur 2C) verder toegenomen dit fenotype, toont zijn progressieve karakter. Tellen van het aantal vacuolen in de deutocerebral neuropil (dn) met de beschreven werkwijze bevestigde een aanzienlijke toename van het aantal vacuolen met de leeftijd. Ook was het gecombineerde gebied omsloten door vacuolen aanzienlijk toegenomen met de vergrijzing (figuur 2D).

Niet alle mutanten zo'n ernstige fenotype SWS en in die gevallen verschillen degeneratie moeilijk te bepalen bij het scherpstellen op een klein gebied. Ook de degeneratie die optreedt bij het ouder worden is vrij mild (figuur 3A - C) en daarom, analyseerden we de hele hersenen wanneer het kwantificeren van dit fenotype. Het bepalen van de som van vacuolen in de hersenen onthuldeduidelijk hoger leeftijd en dit was ook het geval bij het meten van de totale oppervlakte van deze vacuolen (Figuur 3D).

Figuur 1
Figuur 1. Paraffine Serial secties. A) Met de kraag methode kunnen experimentele en controle vliegen als een monster worden verwerkt door ze te rijgen op één kraag. Eyeless sine oculis vliegen worden ingebracht voor oriëntatie (pijlen). B) Schematische toont de oriëntatie van de vlieg koppen in de kraag. C) In het beeld secties van verschillende vlieg hoofden zijn gericht links naar rechts op de dia. Van boven naar beneden op de glijbaan, kan seriële secties van dezelfde vlieg hoofd worden gezien. In dit geval werd een sine oculis vlieg ingevoegd op positie drie (pijl). De secties worden gekleurd door de fluorescerende oog pigment dat wast over de secties na het snijden. Schaalbalk in A = 5 mm en met C = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Progressieve Neurodegeneratie in de Zwitserse kaas Mutant. Paraffine hoofddeel van 7-dag- (A), 14-dag- (B) en 21-dag- (C) oude sws "1 vliegen. De pijlpunten wijzen naar vacuolen die zijn ontwikkeld met veroudering. De leeftijdsgerelateerde degeneratie wordt gekwantificeerd door het tellen van het aantal vacuolen en het meten van de totale oppervlakte (D). De SEM en het aantal geanalyseerde vliegen is aangegeven. De schaal bar = 25 pm. *** P <0,001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Neurodegeneratie Treedt op met de leeftijd. Paraffine hoofd sectie van 10-dag- (A), 30-dag- (B) en 60-dag- (C) oude wild-type vliegt. De pijlpunten wijzen naar vacuolen die zijn ontstaan ​​bij oude vliegen. De leeftijdsgerelateerde degeneratie wordt gekwantificeerd door het tellen van het aantal vacuolen en het meten van de totale oppervlakte (D). De SEM en het aantal geanalyseerde vliegen is aangegeven. De schaal bar = 25 pm. *** P <0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. </ A>

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De beschreven werkwijze verschaft een middel om neurodegeneratie te kwantificeren in de hersenen van Drosophila. Terwijl andere methoden, zoals het tellen van een bepaald celtype, kan worden gebruikt om neurodegeneratie te identificeren, het voordeel van deze methode is dat het algemeen kan worden toegepast. Tellen cellen vereist dat deze cellen op betrouwbare wijze kunnen worden geïdentificeerd met behulp van een specifiek antilichaam of de expressie van een cel-specifieke marker, die niet altijd beschikbaar is. Verder is aangetoond dat drastisch verschillende resultaten kunnen worden verkregen met deze methode 24, waarschijnlijk als gevolg van de gebruikte etikettering en detectieomstandigheden. Een andere methode om degenererende cellen sporen is het gebruik van celdood markers, zoals anti-geactiveerde caspase 3. De onderhavige identificeert alleen cellen celdood ondergaan actief en zodra de cellen gestorven, zij niet langer detecteerbaar. Een ander voordeel van de hier voorgestelde werkwijze is dat er geen kleuring is vereist wegens de autofluorescence veroorzaakt door het oog pigment, bespaart tijd en minimaliseert artefacten veroorzaakt door veranderingen in de kleuring omstandigheden. Het is belangrijk op te merken dat, bij gebruik van deze methode, de ogen van de vliegen 'voldoende pigment om de dia vlekken. Als de oogkleur te licht is, het toevoegen van enkele wild-type vliegt naar de kraag raadzaam om voldoende en zelfs kleuren in de schuif garande- ren. Een bijkomend voordeel van deze methode is dat meerdere gebieden kunnen worden onderzocht, zelfs in dezelfde weg. Hoewel we niet de gegevens blijkt, hebben we deze secties gebruikt om neurodegeneratie in de retina en gliale cel verlies in de lamina cortex 30,36 te onderzoeken. Zoals hier beschreven, deze methode horizontale secties, maar door de paraffineblok van 90 ° bij smelten op de objecthouder, kan men ook frontaal verkrijg. Aldus is deze werkwijze is een veelzijdige werkwijze die het mogelijk maakt voor de tijdige en efficiënte meting van neurodegeneratie in de vlieg hersenen. Vanwege de vorming van vacuoles is waargenomen in vele diermodellen van humane neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van modellen voor AD, PD, Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), en ziekten veroorzaakt door polyglutamine-herhalingen 16,37-40 deze methode kan worden gebruikt om neurodegeneratieve fenotypes kwantificeren diverse ziektemodellen.

Kortom, dit protocol is eenvoudig en gemakkelijk voltooid wanneer de eerste installatie van de apparatuur wordt uitgevoerd. Sommige noten in gedachten te houden zijn om zorgvuldig te timen de ethanol wast om te voorkomen dat over-uitdroging van de koppen, zorgvuldig trim de paraffineblokken om niet te delen of koppen te verliezen, en om het lint niet overexpand op het water wanneer de schuif op het vuur blok. Als het lint wordt toegestaan ​​te ver uit te breiden, het scheuren van de vlieg koppen kunnen leiden en de volgorde van de koppen in het lint verloren kan gaan. Bovendien blind het genotype terwijl doet de analyses essentieel om vertekening te voorkomen. Dit wordt het beste bereikt door het hebben van een persoon die de slides en bijhoudt, terwijl een andere persoon is het nemen van de foto's en het doen van de metingen. Een van de beperkingen van deze methode is dat degeneratie van slechts enkele cellen zeer moeilijk te detecteren zijn. In dat geval zou een specifieke kleurstof van de betrokken celpopulatie meer informatief. Bovendien is deze methode geen onderscheid kan worden gemaakt tussen verschillende soorten van celdood, die meer specifieke methoden, zoals een TUNEL kleuring vereist om apoptotische celdood te bepalen. Tenslotte kan deze methode geen onderscheid maken tussen celdood en axonale degeneratie, die ook detecteerbaar als vacuolen in de neuropil zou zijn.

Zoals in onze resultaten, kan deze methode worden gebruikt om degeneratie in specifieke hersengebieden of in de gehele hersenen pakken. Onze ervaring is het nuttig om slechts een bepaald gebied te analyseren wanneer het fenotype is vrij sterk, zelfs wanneer alle hersengebieden worden beïnvloed. Dit vermindert de werkdruk en laat deresultaat. We oorspronkelijk geanalyseerd verschillende gebieden SWS mutant en zeer vergelijkbare resultaten in de progressie van het fenotype waargenomen bij het vergelijken van één stippellijn bij de analyse van alle gebieden (gegevens niet getoond). Er moet echter worden opgemerkt dat een duidelijk herkenbaar gebied moet worden gekozen om artefacten te vermijden door de analyse van verschillende gebieden of verschillende niveaus.

Daarentegen, wanneer het fenotype relatief mild, is het beter om de gehele hersenen te analyseren, omdat de kans op het vinden vacuolen in een bepaald gebied is laag. Zo is dit het geval bij het bepalen van leeftijdsgebonden neurodegeneratie, zoals weergegeven in figuur 3, waardoor slechts 4-5 vacuolen in de gehele hersenen in 60-dagen oude vliegen. Bij het tellen van vacuoles in het gehele brein, moet men rekening mee houden dat kleine vacuolen alleen zal verschijnen in een sectie, terwijl grotere zal zich uitstrekken over meerdere secties. Wat dat laatste betreft, de nabijheid van adjAcent gedeelten bij gebruik van deze methode (figuur 1) verschaft een voordeel, omdat het relatief gemakkelijk te bepalen of hetzelfde vacuole aanwezig in verschillende secties.

Concluderend kan dit protocol nuttig zijn voor het bestuderen van vele Drosophila modellen van verschillende neurodegeneratieve ziekten bewijzen. Het identificeren interagerende eiwitten die verbeteren of verergeren degeneratieve fenotype kan cruciaal inzichten over de moleculaire mechanismen die veroorzaken of ziekten zoals Alzheimer en Parkinson wijzigen verschaffen. In deze publicatie, maken we gebruik van deze methode om degeneratie dat is progressief, waar de dieren normaal ontwikkelen sporen, maar tonen toenemende degeneratie bij het ouder worden. Bovendien kan deze werkwijze ook worden aangepast aan degeneratie die wordt veroorzaakt door defecten in de ontwikkeling, die reeds aanwezig dient te zijn bij pas Bijlage In vliegen bepalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the Reagent/Equipment Company Catalog Number
Collar Genesee Scientific TS 48-100 We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html 
Rubber ice cube tray for embedding Household store The size can be made-to-fit by glueing in additional walls 
Crystallizing dish Fisher Scientific company 08-762-3
Ether Fisher Scientific Company E138-1
Ethanol Decon Laboratories Inc. 2701
Choloroform Fisher Scientific Company C298-500
Glacial Acetic Acid Fisher Scientific Company A38-212
Methylbenzoate Fisher Scientific Company M205-500 Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax Fisher Scientific Company T565 Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome Leica Biosystems Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher Scientific Company 12-550D
Microscope Cover Glass Fisher Scientific Company 12-545-M
SafeClear Fisher Scientific Company 314-629 Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover Ted Pella Inc.  432-1
Permount Fisher Scientific Company SP15-500
Poly-L-Lysine Solution (PLL) Sigma Life Science P8290-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
  3. Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
  4. Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
  5. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
  6. Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
  7. Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
  8. Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
  9. Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
  10. Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
  11. Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
  12. Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
  13. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (2011).
  14. Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. e50339 (2013).
  15. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. (2015).
  16. Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
  17. Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
  18. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
  19. Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
  20. Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
  21. Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
  22. Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
  23. Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
  24. Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
  25. Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
  26. Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
  27. Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
  28. Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
  29. Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
  30. Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
  31. Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
  32. Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
  33. Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
  34. Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
  35. Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
  36. Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
  37. Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
  38. Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
  39. Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
  40. Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics