Die Colon-26-Karzinom Tumor-tragenden Maus als Modell für die Untersuchung von Krebs Kachexie

Cancer Research

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Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, R., Zimmers, T. A. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (117), e54893, doi:10.3791/54893 (2016).

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Abstract

Introduction

Muskelschwund ist eine ernste Komplikation bei verschiedenen klinischen Zuständen wie Krebs, Sepsis, Leberzirrhose, Herz- und Nierenversagen, chronische obstruktive Lungenerkrankung und AIDS. Insbesondere ist Muskelschwund in mindestens 50% der Patienten mit Krebs 1 evident. Der Verlust der Skelettmuskulatur bei Krebs resultiert aus einer erhöhten Proteinabbau aufgrund der Überaktivierung der Skelettmuskulatur proteolytischen Systeme und / oder verringerte Proteinsynthese 6. Lipolyse ist auch offensichtlich, zum Abbau von Fettgewebe führt. Klinisch Kachexie ist mit verminderter Qualität und Länge des Lebens verbunden und geschätzt wird , in 20 die Ursache des Todes zu sein - 30% der Krebspatienten 7. Verwendung von experimentellen Modellen, die die menschliche Krankheit möglichst genau ähneln vorteilhaft wäre. Eine optimale Tiermodell wird durch eine hohe Reproduzierbarkeit sowie durch begrenzte Interferenz von verschiedenen Therapien und unvorhersehbaren Faktoren gekennzeichnetDiät, Geschlecht und genetischen Hintergrund, der 8 mit dem klinischen Zustand in der Regel verbunden sind. Bisher hat Krebskachexie sucht hauptsächlich in Tiermodellen durch Transplantation von Krebszellen oder Injektion von Karzinogenen gekennzeichnet, obwohl eine neue Methode zu verwenden, ist genetisch veränderte Mäuse anfällig für die Entwicklung von Krebs.

Mäuse , denen das C26 - Karzinom Lager stellen eine gut charakterisierte und extensiv genutzte Modell der Tumorkachexie 2,5 (auch als Kolon-26 und Adenokarzinom bezeichnet). Das Wachstum der C26 Tumor Ergebnisse in Körper und Muskelgewichtsverlust, vor allem durch eine verbesserte Fett- und Proteinabbau 9. Im allgemeinen wird eine 10% ige Tumorgewicht gegenüber der Gesamtkörpergewicht mit einer Reduktion von 20-25% in der Skelettmuskelmasse und eine größere Abreicherung von Fett 3,10 zugeordnet. Hepatomegalie und Splenomegalie sind auch mit Tumorwachstum, zusammen mit der Aktivierung der Akutphasenreaktion und der Erhöhung von pro-INFLA beobachtetmmatory Cytokinspiegel 3,11. Unter diesen ist bekannt , dass IL-6 eine entscheidende Rolle spielt , Muskelschwund in der C26 - Modell in der Vermittlung, obwohl dieses Zytokin ist wahrscheinlich nicht der einzige Induktor von Kachexie 12. Erhöhte IL-6 verursacht Muskelatrophie durch Aktivierung des JAK / STAT3 Pathway, und kann diesen Transkriptionsfaktor Hemmen verhindern 3,4 Muskelschwund.

Während C26-induzierte Muskelschwund, wie in vielen Bedingungen der Muskelatrophie, wird Muskelmasse weitgehend durch die Verringerung der Muskelproteingehalt über Muskelfasern verloren, nicht durch den Zelltod oder den Verlust von Fasern 13. In C26 Kachexie, eine Verschiebung hin zu kleineren Querschnittsflächen ist sowohl in glykolytischen und oxidativen Fasern 2 beobachtet. Dies ist auch mit reduzierter Muskelkraft 5 konsistent. Viele Gruppen haben weltweit Vorteil des C26-Modell genommen, um neue Vermittler von Muskelschwund entdecken oder klinisch relevante Medikamente gegen Krebs cacHexia. Jedoch haben viele verschiedene Verfahren für die Verwendung dieses Modells wurde, berichtet Bedenken hinsichtlich der Konsistenz der erhaltenen Daten Anheben und Barrieren Reproduzierbarkeit in verschiedenen experimentellen Bedingungen darstellen. Hier berichten wir über eine typische Anwendung dieses Modell für die Untersuchung von Tumorkachexie, die standardisierte und reproduzierbare Daten liefert.

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Protocol

Ethikerklärung: Alle beschriebenen Studien genehmigt wurden durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen der Thomas Jefferson University und der Indiana University School of Medicine.

1. C26 Zellwachstum und die Vorbereitung

  1. Erhalten C26 Darmkrebszellen (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) und bereiten vollständigen Wachstumsmedium (dh mit hoher Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 1% Glutamin und 1% Streptomycin / Penicillin).
    HINWEIS: Um eine bessere inter experimentelle Reproduzierbarkeit zu ermöglichen, ist es vorzuziehen, C26-Zellen bei einer Passage so gering wie möglich zu verwenden.
  2. Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Zellzähler 50.000 Zellen / cm 2 in Flaschen mit komplettem Wachstumsmedium auf die Platte. Sie in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5% CO 2 bis zum subkonfluenten. Vermeiden sie in hoher Dichte Kultivierung zur vorherigenent Differenzierung und Driften der Zelle Phänotypen.
  3. Nach dem ersten Durchgang, genügend Zellen Platte werden in der geplanten Anzahl von Tieren implantiert. Am Tag der Zellimplantation, dissoziieren die Zellen durch Trypsinierung mit 0,02 ml von 0,25% Trypsin-EDTA - Lösung pro cm 2, Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von mindestens 3 ml frisches Medium pro ml Trypsin, Zellkonzentration in Zellen / ml bestimmen , und die Zahl der Zellen für das Experiment (1 x 10 6 Zellen pro Maus) in sterilem PBS benötigt resuspendieren.
    HINWEIS: Die C26 - Zellen Konfluenz erreichen , wenn die Dichte beträgt etwa 500.000 Zellen / cm 2.

2. Mäuse

  1. Randomize Erwachsenen CD2F1 Mäuse (mindestens 8 Wochen alt) in Gruppen (in der Regel kontrolliert und Tumor-Träger) mit mindestens n = 6 pro Gruppe.
    HINWEIS: C26 Tumoren wachsen in Balb / c-Mäusen als auch. Doch aufgrund unserer Erfahrung stellen CD2F1 Mäuse eine vielseitigere und wirtschaftlichen Gastgeber für dieses bestimmte Tumormodell. Außerdem,ähnlich den klinischen Einstellungen und die Feststellungen in anderen experimentellen Modellen von Krebs-assoziierten Muskel berichtet 14-16, geschlechtsspezifische Unterschiede in der Reaktion auf C26 Kachexie verschwenden auch 17 beobachtet werden kann (siehe auch Tabelle 1).
  2. Anesthetize die Maus durch Inhalation (3% in Sauerstoff) unter Verwendung von Isofluran. Pflegen Sie das Tier unter Narkose ausschließlich für die Zeit notwendig, um die Tumorimpfung durchzuführen. Sicherstellen, dass die Maus liegt auf einem Heizkissen, um den Verlust von Körperwärme zu verhindern. Vor der Tumorinjektion Verfahren beginnen, überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch sanft die hinteren Zehen einklemmen.
    HINWEIS: Aufgrund der Dauer dieses Verfahrens (im allgemeinen einige Sekunden) wird die Verwendung von Tieraugensalbe nicht erforderlich. Aus dem gleichen Grund, den Kontrolltieren, die Scheinoperation unterzogen werden nicht, Gewicht zu verlieren erwartet.
  3. Mit einer sterilen 1-ml Insulinspritze mit einer Nadel 26 Gauge, schnell 250 ul der Lösung injizieren, um die t enthält,umor Zellen subkutan und intrascapularly in das Fettpolster der Maus.
    HINWEIS: Die Kontrolltiere 250 ul steriler Kochsalzlösung intrascapularly in das Fettpolster erhalten.
  4. Legen Sie das Tier zurück in seinen Käfig. Direkt beobachten mindestens einmal mit der Maus alle 15 Minuten, bis es auf sanfte Manipulation reagieren kann und einen aufrichtenden Reflex zurückgewonnen.
    HINWEIS: Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt und halten Sie sie in einem warmen Erholungskäfig, die ein festes Substrat enthält. Darüber hinaus bringen nicht die Maus an den Tierraum, bis es vollständig aus der Narkose zurückgewonnen wird. Im Allgemeinen Mäuse müssen nicht einzeln gehalten werden, es sei denn, der Prüfer individuelle Nahrungsaufnahme zu beurteilen soll. Wenn dies der Fall ist, und die Verwendung von automatischen metabolischen Käfigen ist nicht verfügbar, manuelle Aufnahme der Nahrungsaufnahme durchgeführt werden müssen, möglicherweise täglich und in der gleichen Zeit jeden Tag.
  5. Schauen Sie sich die Mäuse täglich und nehmen ihre Körpergewichte.
    Hinweis: Die Aufnahme der Körperzustand Partitur undKäfig Verhaltensweisen können Grad der Kachexie und Krankheitsverhalten unterscheiden, die für die Behandlung Studien 18 nützlich ist.

3. Euthanasie und Blutentnahme

  1. Wenn die Körpergewichtsverlust in den Tumor Hosts im Vergleich zu Kontrollen von 5% erreicht hat, 10% oder 15% (leicht, mittel und schwere Kachexie, respectively) im Vergleich zu ihren ursprünglichen Körpergewichte, einschläfern die Mäuse.
    HINWEIS: Ein typisches Experiment wird durchgeführt, bis eine Gruppe von 10% Gewichtsverlust erreicht, bei welcher Zeit alle Gruppen eingeschläfert werden. Körpergewichtsverlust wird durch Messen des Körpergewichts, einschließlich des Tumor beurteilt.
  2. Platzieren Sie die Maus unter Isofluran-Narkose (3% in Sauerstoff). Zeichnen Blut mittels Herzpunktion (ca. 1-1,5 ml).
  3. Sammeln Sie das Blut in K 2 EDTA (18 mg) Leerrohre und legen Sie sie auf Eis. Zentrifuge das Blut (2.000 xg für 15 min bei 4 ° C) und das Plasma / Serum zu sammeln.
  4. Euthanize die Maus mit Hilfe von cervical Luxation. Gehen Sie zur Gewebeentnahme und Organsammlung.

4. Gewebe- und Organ Excision

HINWEIS: Bei Verwendung von Gewebe in biochemischen oder molekularbiologischen Tests planen jedes Organ und Gewebe zu wiegen und ein Fragment sofort in voretikettierten Cryotubes platzieren. Schnellfrost in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C.

  1. Um eine Kontamination von Gewebeproben mit Fell zu vermeiden, Spray 70% Ethanol über den ganzen Körper.
  2. Platzieren Sie die Maus auf einer Dissektion Bett in Rückenlage und erweitern ein Glied vertikal durch den Fuß auf eine erhöhte buret Klemme befestigt wird.
  3. Fassen Sie die Haut der unteren Extremität mit Dumont Pinzette und verwenden Sie die gebogenen feinen Schere sanft die Haut und Faszien zu entfernen, um die darunter liegende Muskelbäuche der unteren Extremität auszusetzen.
  4. Identifizieren Sie den Musculus gastrocnemius auf der hinteren unteren Extremität durch seinen Ursprung an den lateralen und medialen Kondylen am hinteren Oberschenkel und seine Insertion ander Calcaneus über die Fersensehne.
    1. Gehen die gastrocnemius Fersensehne zu schneiden. Fassen Sie das distale Ende des Gastrocnemius mit Dumont Zange und ziehen Sie den Muskelbauch in Richtung auf seine Herkunft. Mit einer Schere, schneiden Sie den Muskel am Ursprung so nah wie möglich an den Oberschenkelknochen. Setzen Sie den Muskel in einer Schale. Wiegen Sie es sofort und frieren sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht die Soleusmuskel zusammen mit dem gastrocnemius auszuschneiden. Wenn das geschieht, sorgfältig soleus entfernen, indem Sie es vorsichtig aus mit der Zange herausziehen.
  5. Gehen Sie zu identifizieren und die Tibialis-anterior-Muskel von seinem Ursprung an der anterolateralen Oberfläche der Tibia und seine Einführung am medialen Keilschrift über seinem distalen Sehne auszuschneiden.
    1. Um Einfluss zu haben, halten Sie den Fuß durch die Ziffern mit dem Zeigefinger und Daumen zu erfassen. Führen Sie die Spitze Dumont Zange unmittelbar unter der oberflächlichen distalen Sehne des Tibialis und bewegen Sie die solche Zange, dass die blunt Seite kann die tibialis Muskelbauch aus dem zugrunde liegenden Bindegewebe zu lösen verwendet werden.
    2. Schneiden Sie die distale Sehne der feinen gekrümmten Schere, und dann schneiden Sie den Muskel am Ursprung, so nah wie möglich an der Tibia.
  6. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch einen sagittalen Schnitt Durchführung im Unterbauch beginnen und oben auf der Magengegend zu bewegen, Stoppen der Einschnitt knapp über der Membran.
    HINWEIS: Die Tiefe des Einschnitts sollte nur genug sein, um die Bauchmuskelwand und die darunter liegende Peritonealdialyse Faszie zu durchbrechen.
  7. Entfernen Sie vorsichtig die Leber, indem sie es mit den stumpfen Pinzette, und verwenden Sie die feinen gebogenen Schere greifen keine Blutgefäße oder Bindegewebe zu sezieren entfernt, die die Leber zu dem Hohlraum zu halten. Achten Sie darauf, keine Lappen hinter sich zu lassen. Wiegen Sie und lassen Sie die Leber in einem Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren.
  8. Unter Verwendung der stumpfen Pinzette, den Darm weg bewegen, und dann aussetzen und zart entfernendie Milz. Fassen Sie die Milz sanft mit den stumpfen Pinzette und verwenden Sie die Rückseite oder stumpfen Seite der feinen gebogenen Schere Ankleben der Milz zu dem Hohlraum keine Bindegewebe oder Blutgefäße zu sezieren entfernt. Wiegen Sie und lassen Sie sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren.
  9. Identifizieren Sie die Gonaden Fettpolster, angrenzend an den Nebenhoden (bei Männern) oder der Gebärmutter (bei Frauen). Fassen Sie die epididymal Fettpolster mit den stumpfen Pinzette und ziehen des Hohlraums des Gewebes aus. Mit Hilfe der feinen gekrümmten Schere, schnitt jede Gonadengewebe entfernt, die mit dem Fettpolster befestigt werden kann. Wiegen Sie die Fettpolster und gefrieren lassen Sie sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
    HINWEIS: Im Allgemeinen ist dies Fettgewebe als repräsentativ für die Gesamtkörperfettmasse bei Mäusen und sinkt in Gewicht mit Kachexie. Andere Fettpolster können in ähnlicher Weise identifiziert, seziert, entfernt und gewogen.
  10. Verwenden Sie die gebogenen feinen Schere, um die Brust des Tieres zu öffnen. Schneiden Sie die Rippen an den beiden Seitenrändern des st wegernum. Entfernen Sie das Brustbein. Mit zwei Paar Zangen, greifen auf jeder Seite des Brustkorbs und jede Seite ziehen seitlich die Brusthöhle zu öffnen.
  11. ziehen Zart das Herz mit der Zange. das Herz mit den gekrümmten feinen Schere vorsichtig auszuschneiden durch die Aorta in den linken Vorhof trennt. Stellen Sie sicher, das Organ aller Restblut zu leeren, indem fein es gegen einige saugfähiges Papier aufnehmen. Wiegen Sie und lassen Sie sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren.

5. Muscle Einfrieren und Montage

  1. Tauchen Sie die untere Hälfte eines kleinen Plastikbecher (50 ml), das Isopentan in flüssigen Stickstoff. Das Isopentan ist einsatzbereit, wenn es etwas zähflüssig wird und bildet eine solide weißem Laminat Futter in das Innere des Bechers (Temperatur: -160 ° C).
    HINWEIS: Immer funken Bronze oder Aluminium Handwerkzeug verwenden. Vermeiden Produktdampf einatmen. Bei ausreichender Belüftung verwenden. Wenn Umgang mit einem Spill und Belüftung ist unmöglich oder impractical, einen geeigneten Atemschutz tragen.
  2. Gefriert einige Einbettmedium auf einem Spannfutter (Kork) durch kurzes Eintauchen (10 sec) in Isopentan.
  3. Behandeln Sie den Muskel (z. B. die tibialis oder gastrocnemius) , indem sie von der Sehne, vertikal zur Kork, um Halten der Ausrichtung der Fasern zu erhalten und für die Querschnitte zu ermöglichen.
  4. Vorsichtig Position den Endteil des frischen Muskel oben auf dem gefrorenen Einbettmedium.
    HINWEIS: Der Muskel wird bleiben. Es ist wichtig, nicht vollständig um den Muskel zu umgeben mit Medium eingebettet wird. Es ist auch wichtig, um die vertikale Ausrichtung für die nachfolgende Bestimmung der Querschnittsfläche zu erhalten.
  5. Dip das Spannfutter mit dem daran befestigten Muskel in das Isopentan-Bad (die übliche Gefrierzeit ist 7-15 sec, je nach Probengröße und Zusammensetzung).
    HINWEIS: Das Eintauchen in der Gefrierlösung sollte nicht länger dauern als vollständig benötigt wird, um die Probe einzufrieren. Einfrieren zu lang ist die Fracture den Gewebeblock, während eine zu kurze Zeit die Bildung von Eiskristallen führen wird. Eine gut gefrorene Probe wird kreideweiß sein.
  6. Nach der Probe Einfrieren, legen Sie sie in einen kleinen Plastikbeutel oder Probenröhrchen (50 ml) und speichern Sie es sofort in einem Tiefkühlschrank bei -80 ° C oder in flüssigem Stickstoff.

6. Analyse der Rohdaten

  1. Um Variationen in der Größe der zu Kontrollmäusen, normalisieren die endgültige Körpergewicht (FBW); tumorfreien Körpergewicht; und Karkasse, Orgel und Gewebegewicht (in Gramm) nach dem anfänglichen Körpergewicht (IBW) und Express sie als "Gewicht / 100 mg IBW".
    HINWEIS: Alternativ normalisieren einige Forscher die Muskelmasse an der Tibia Länge.
  2. Verwenden Sie eine Software für die Datenanalyse. Finden Sie den Mittelwert und SD der normalisierten Gewichte. Führen Sie eine statistische Analyse mit ungepaarten Student-t-Tests zwischen den Kontrollen und C26 tragenden Mäusen.
    HINWEIS: Die Ergebnisse können auf Körper relativ dargestellt werden (IBWund tumorfreien FBW), Tumor, Organ und Gewebegewichte.

7. Muscle Sectioning

  1. Stellen Sie die Arbeitstemperatur des Kryostaten inneren Kammer auf etwa -23 ° C.
  2. Erlauben der Probe (zuvor bei -80 ° C gelagert) bei der Arbeitstemperatur zu akklimatisieren (ein paar Stunden sollte genug sein).
  3. Cut mehrere 8 um dicke Abschnitte der Probe (vorzugsweise der tibialis anterior oder gastrocnemius Muskeln) und sammeln sie auf Glasobjektträger.
    HINWEIS: Schneiden Sie den Abschnitt in der Mitte Bauchregion des Muskels. Auch aus Gründen der Genauigkeit, schneiden die Abschnitte senkrecht zu der Montageachse.
  4. Halten Sie die Glasplättchen im Inneren der Kryostatkammer. Lassen Sie sie nicht auftauen, wenn das Ziel auszuführen IF / IHC Studien oder enzymatische Färbung ist.
  5. Lagern Sie die Folien bei -80 ° C für weitere Analysen.

8. Bewertung von myofiber Größe von Laminin Immunofluoreszenz (Alternative 1)

19 bestimmen. Obwohl die H & E - Färbung der Muskelschnitte für die Analyse der Morphologie eine wertvolle und bequeme Methode darstellt, ist die Verwendung eines IF Ansatz 14 wesentlich schneller und bescheiden genauer als die H & E-basierte Methode. H & E-Methoden sind unten beschrieben.

  1. Entfernen Gewebeschnitte von entweder dem Kryostaten oder -80 ° C Lagerung und damit sie sich auf Raumtemperatur äquilibrieren (ca. 5 - 10 min).
    HINWEIS: Um unspezifische Wechselwirkungen mit primären in Mäusen Antikörper, assoziiert zu vermeiden, ist es ratsam, entweder Verwendung Antikörper in einer anderen Spezies erhöht oder die Verwendung von im Handel erhältlichen "Maus-on-Maus" Immunnachweis-Kits zu machen.
  2. Tauchen Sie die Abschnitte in der Vor-kühlened Methanol (-20 ° C) für 10 min.
  3. Waschen Sie die Abschnitte in Raumtemperatur 1x PBS für 5 min.
  4. Entfernen Sie die PBS und mit einem Stift für immunhistochemischen Anwendungen die Abschnitte auf der Folie zu umschließen. Lassen Sie sich nicht Abschnitte an jedem Punkt vollständig trocken.
  5. Ein geeignetes Blockierungspuffer (5 bis 8% FBS in PBS oder 5% Ziegenserum in PBS) auf die Abschnitte für 1 h bei RT.
  6. Entfernen Sie den Blockierungspuffer.
  7. Gelten entweder ein Kaninchen anti-Laminin (1:30) oder eines Maus-Anti-Dystrophin (1:30) primärem Antikörper in Blockierungspuffer zu den Abschnitten für 2 h bei RT (oder über Nacht bei 4 ° C) in einer feuchten Kammer.
  8. Waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5 min.
  9. Entfernen Sie den Waschpuffer und wasche Abschnitte wieder in 1x PBS für 5 min.
  10. Entfernen der Waschpuffer und wenden eine richtige fluoreszierenden Sekundärantikörper (1: 1000 in Blocking-Puffer) in den Abschnitten in einer feuchten Kammer für 1 Stunde bei RT.
  11. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5Minute
  12. Entfernen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Wäsche mit 1x PBS für 5 min. Entfernen der Waschpuffer und bedecken die Abschnitte mit einem Deckglas ein Medium auf wässriger Basis verwendet wird.
  13. Identifizieren Sie die morphologischen Merkmale des Muskels durch digitale Bilder des gefärbten Abschnitt verwenden. Um dies zu tun, einen invertierten Fluoreszenzlichtmikroskop verwenden für IF Abschnitte (a 10X oder 20X Vergrößerung Ziel angemessen ist), zusammen mit einer Digitalkamera und Bildaufnahmesoftware. Legen Sie eine Maßstabsleiste in jedem digitalen Bild (20 - 30 Zufallsfelder sind für jeden Muskel Abschnitt empfohlen) die Quantifizierung der CSA zu erleichtern. Die Bilder sollten im .tif-Format gespeichert werden mit der Bildanalyse-Software kompatibel zu sein, die ImageJ Programm.
  14. Verwenden ein ImageJ Makro Bindegewebe von kontraktilen Gewebe (myofiber Größe) durch die Anwesenheit des fluoreszierenden Sekundärantikörpers in der Endomysium 20 unterscheiden.
    HINWEIS: Das Makro und Anweisungen sind vom Auth verfügbarors, Richard Lieber und Shannon Bremner.
  15. Öffnen Sie das ImageJ Programm durch einen Doppelklick auf das Symbol auf dem Desktop.
  16. Legen Sie das CSA Makro, indem Sie einmal die Registerkarte "Plugins" klicken. Bewegen Sie den Cursor zu wählen Sie die Option "Installieren", indem Sie einmal darauf klicken.
  17. Laden Sie die Querschnitts Makro indem es aus dem Ordner auswählen es in gespeichert wurde, und klicken Sie dann auf "Öffnen".
  18. Sobald das Makro geöffnet wurde, öffnen Sie das histologische Bild der Maßstabsleiste enthält, die durch "Datei" klicken und "Öffnen" aus dem ImageJ Symbolleiste dann.
  19. Nachdem das Bild geöffnet wird, wählen Sie die "Gerade-Tool" in der ImageJ Programm, indem sie mit der geraden Linie auf das Symbol klicken.
  20. Sobald die "Gerade-Tool" ausgewählt ist, klicken Sie einmal auf der äußersten linken Ende der Skala bar und dann klicken Sie einmal auf der äußersten rechten Ende der Skala bar. Wenn es richtig gemacht, sollte es eine gelbe Linie auf der Skala bar überlagert werden.
  21. Sicherzustellen, dass die yellow Linie immer noch auf der Skala bar überlagert wird, wählen Sie die "Analyse" Registerkarte aus der ImageJ Symbolleiste durch einmaliges Anklicken.
  22. Im "Analysieren" Registerkarte, bewegen Sie den Cursor nach unten und wählen "Skala" durch einmaliges Anklicken.
  23. In der "Set-Skala" Fenster, ändern Sie nicht den Wert in der "Abstand in Pixeln" -Box. Geben Sie den bekannten Abstand der Maßstab in der "bekannten Abstand" -Box. Ändern Sie die Einheiten in der "Längeneinheit" Box mit den Maßstabsbalken Einheiten entsprechen (dh & mgr ; m = & mgr; m). Schließlich wählen Sie "global" durch das Feld auf der linken Seite "Global" einmal klicken.
  24. Schließen Sie das "Set-Skala" Fenster.
  25. Öffnen Sie das erste Bild werden gemessen, indem die "O" -Taste auf der Tastatur drücken. Beachten Sie ein Fenster Pop-up, dass der Benutzer das Bild zu finden und auswählen können aus dem Ordner gemessen werden, um es in gespeichert wurde. Wählen Sie das Bild auf einmal, klicken und dann auf "Öffnen".
  26. <li> Nach dem Öffnen eines Fensters sollte für die Auswahl des akzeptablen Bereichs für CSA-Messungen und für Zirkularität erscheinen.
    HINWEIS: Diese Einstellungen werden in der Regel links auf die Standardwerte. Wenn man jedoch wünscht, diese Einstellungen zu ändern, müssen Sie die Werte gleich für jedes aufeinanderfolgende Bild zu halten, in dem Experiment gemessen werden.
  27. Nach dem CSA-Bereich und Zirkularität Einstellung, beobachten Sie das Bild in roten Pixeln mit einem "Threshold" Fenster abgedeckt. Stellen Sie die Schwelle des Bildes mit Hilfe der Bars in der "Threshold" Fenster, bis die Muskelfasern genau gefüllt mit roten Pixeln in.
    HINWEIS: Der Versuch, die größte Anzahl von Fasern zu erhalten, die einander nicht berühren; wenn Fasern berühren, werden sie als eine große Faser gemessen werden, der stromabwärts bearbeitet werden müssen.
  28. Nach dem Einstellen der Schwelle, drücken Sie die Taste "1" auf der Tastatur, um die Muskelfasern zu messen.
  29. Kreisen Sie die einzelnen Muskelfasern mit einer gelben Linie.Navigieren Sie durch das Bild, und entfernen Sie Artefakte oder Doppel Fasern, die durch das Programm ausgewählt wurden. Um dies zu tun, wählen Sie die Strukturen, die keine Fasern sind, indem sie einmal darauf klicken, und drücken Sie dann die "D" -Taste auf der Tastatur. Dies wird ihnen von den Messungen zu löschen.
  30. Wählen Sie und die Messungen von dem kopieren "Messwertfenster", und fügen Sie sie in eine Tabelle für die weitere Analyse.
    HINWEIS: Die erhaltenen Werte können auch die Faserverteilungsanalyse zur Beurteilung verwendet werden, die im Allgemeinen ein nützlicher Parameter stellt eine Verschiebung zu kleineren Muskelfasern zu bestimmen, ob das Tumorwachstum fördert.
  31. Schließen Sie alle geöffneten Fenster in ImageJ durch das "X" in der oberen linken Ecke des Fensters klicken.
  32. Öffnen Sie ein neues Bild zu werden, indem man die Taste "O" gemessen und Schritte 8,24 Wiederholung - 8.29.

9. Auswertung von myofiber Größe von H & E-gefärbten Schnitten (Alternative 2)

  1. Das GlasDias in Färbetrog für Harris Hämatoxylin 8 min gefiltert enthält.
    HINWEIS: Alternativ kann Mayer Hämatoxylin verwendet werden, wenn eine weniger intensive Fleck erwünscht ist.
  2. Spülen Sie die Folien in VE-Wasser.
  3. Tauchen Sie die Folien in Leitungswasser für bis zu 5 min.
  4. spülen Sie sie schnell in VE-Wasser, und sie dann für weniger als 2 min in gefilterten 1% Eosin Lösung inkubiert.
    HINWEIS: Wenn eine intensivere Fleck gewünscht wird, fügen Sie 1 bis 2 Tropfen Essigsäure (0,01% oder weniger) an die Eosin-Lösung.
  5. Beginnen Sie die Entwässerung Schritte. Spülen Sie die Folien in 70% Ethanol für weniger als 1 min.
  6. Tauchen Sie die Folien in 90% Ethanol für 1 min.
  7. Tauchen der Objektträger in 95% Ethanol für 1 min.
  8. Tauchen der Objektträger in 100% Ethanol für 2 min.
  9. Tauchen Sie die Folien in Xylol 2 min. Verschieben Sie die Folien in ein anderes Copley Glas mit frischem Xylol für weitere 2 min.
    HINWEIS: Halten Sie die Folien in Xylen (nicht länger als 1 Stunde), bis sie eingedeckt werden.
  10. Legen Sie die coverslips an den Muskelpartien mit Permount oder Xylen-basierten Montage Medium der Wahl.
  11. Beachten Sie die H & E-gefärbten Glasobjektträger unter einem Mikroskop mit einer 20-facher Vergrößerung, und erwerben Bilder des gesamten Muskelquerschnittsfläche. Erhalten Sie Bilder durch ein helles Lichtmikroskop, Digitalkamera und Bildaufnahmesoftware.
    HINWEIS: Die Anwesenheit eines Maßstabsbalken oder ein Bild von einem Mikrometer bei der gleichen Vergrößerung aufgenommen wird benötigt, um die CSA zu bestimmen. Wie oben Rekord mindestens 20 - 30 Zufallsfelder für jeden Muskel Abschnitt.
  12. Bewerten Sie die myofiber Größe mit ImageJ Software. Öffnen Sie alle digitalen Bild. Stellen Sie wie oben die Waage. Messen Sie mindestens 1.500-2.000 Muskelfasern pro Muskel mit der freihändigen Auswahlwerkzeug, das Aufspüren der Faserumfang mit einer Maus oder, für eine schnellere Eingabe, mit einem Tablet-Eingabegerät und Stift.

10. Datenerhebung und Analyse

  1. Um Muskelfasergröße, beurteilen die durchschnittliche Faser "Bereich zu etablieren."Berechnen Mittel und SD für die Messungen für jeden Muskel erhalten, die sowohl den Bereich und den Durchmesser des Feret. Darüber hinaus, um zu beurteilen, ob die experimentelle Einstellung mit einer Verschiebung in Richtung entweder kleiner oder größer Muskelfasern verbunden ist, analysieren die" Faserverteilung . "
  2. Bewerten Sie die Bedeutung des Ergebnisses durch eine ungepaarte T-Test für zwei Gruppen durchgeführt wird. Bestimmen Sie die Verhältnisse zwischen den Werten für den C26-Mäuse-Gruppe und der Kontrollgruppe erhalten. Zeichnen Sie die Werte auf einem Diagramm, das die Mittel SD Berichterstattung und die Frequenzverteilung / Histogramm zeigt die Verschiebung der Fasergrößen ausgerichtet.

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Representative Results

C26 Tumorwachstum Kinetiken zeigen eine lag-Phase für den ersten 7 - 8 d nach der Injektion, gefolgt von einer exponentiellen Zellwachstums (4 bis 5 d). Die Tumormasse erreicht schließlich ~ 10% des Körpergewichts (etwa 2 g; 1A-B). Während der ersten Phase kann der Tumor nur durch Palpation lokalisiert werden und erscheint als eine kleine Vorwölbung der Haut. In der zweiten Phase wird der Tumor als eine Masse unter der Haut beobachtet. Selten wird der Tumor ulzeriert, in einer offenen Wunde resultiert; in diesem Fall wird die Maus von der experimentellen Gruppe ausgeschlossen und auf humane Weise eingeschläfert wird.

Körpergewicht unverändert in der ersten Phase, aber es wird deutlich in der zweiten Phase reduziert wird , wenn es 10 erreicht - 15% des ursprünglichen Körpergewichts (30% im Falle der tumorfreien Gewicht; 1A). Tumor-tragenden Mäusen erscheinen verschwendet und zeigte disheveled Fell am Ende derVersuchszeitraum, mit einem Körperzustand (BC) Partitur gleich 1 18 (1C). BC1 stellt eine stark abgemagert Maus, wo Skelettstrukturen sind evident und die Wirbel sind deutlich segmentiert. Körpergewichtsverlust ist in erster Linie sowohl von der Skelettmuskulatur und Fettgewebe Wasting (Abbildung 1B) entfielen. Körpergewichtsverlust ist mit einer Reduktion von etwa 20 konsistent - 30% in der Skelettmuskelmasse, insbesondere in der gastrocnemius, tibialis anterior und Quadrizeps (Abbildung 2). Der Herzmuskel wird auch deutlich im Gewicht reduziert, wenn auch in geringerem Ausmaß als die anderen Skelettmuskeln im Vergleich (Bild 2). Interessanterweise Hepatomegalie (+ 16%, p <0,01) und Splenomegalie (+ 110%, p <0,01) in Tumor-Hosts im Allgemeinen nachgewiesen, während die Fettmasse, ähnlich wie Skelettmuskel, stark dezimiert wird (-70%, p <0,001 ; 3).

(4A-B). Insbesondere zeigte die Häufigkeitsverteilung Analyse eine Verschiebung hin zu kleineren Größe Fasern in C26 tragenden Mäusen, was darauf schließen lässt , dass die ganze Muskelatrophie in Gegenwart eines C26 - Tumor (4C) unterzogen wird . Ähnliche Ergebnisse können durch die Nutzung einer herkömmlichen H & E-basierte Methode zur Quantifizierung der Fasergröße beobachtet werden, obwohl die Größe der Änderung in CSA Muskel mit Krebswachstum assoziiert ist etwas anders (38% gegenüber der Kontrolle, p <0,01 für die IF -basiertes Verfahren; -18% gegenüber der Kontrolle, p <0,01 für die H & E-basierten Verfahren, Figur 5).

Abbildung 1
Abbildung 1: Körpergewicht in Steuer- und C26-tragenden Mäuse. A) Körpergewichtskurve bei der Kontrolle und C26 - Hosts über die gesamte Versuchsdauer (14 Tage nach der Tumorinjektion). B) Anfangskörpergewicht (IBW), endgültige tumorfreien Körpergewicht (FBW) und Tumorgewicht in der Kontrolle und C26- tragenden Tieren. C) Repräsentative Bilder von Kontrollen und C26-Träger zum Zeitpunkt des Opfers (Tag 14 nach der Tumorimpfung). Die Daten werden als Mittelwert SD ausgedrückt. n = 6. Signifikanz der Unterschiede: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 im Vergleich zu der Kontrollgruppe Student-t-Test. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Muskel - Gewichte in der Kontrolle und C26 tragenden Mäuse. Die tibialis, Gastrocnemius, Quadrizeps und Herzgewichte in Steuer- und C26 Tumorträger werden als Gewicht / 100 mg IBW berichtet. Die Daten sind als Mittelwert SD ausgedrückt. n = 6. Signifikanz der Unterschiede: ** p <0,01 und *** p <0,001 im Vergleich zu der Kontrollgruppe Student-t-Test.

Figur 3
Abb . 3: Organgewichte in Kontroll- und C26 tragenden Mäusen Die Leber, Milz und epididymalen Fettpolsters Gewichte in Kontroll- und C26 tumorTräger werden als Gewicht / 100 mg IBW berichtet. Die Daten sind als Mittelwert SD ausgedrückt. n = 6. Signifikanz der Unterschiede: ** p <0,01 im Vergleich zu der Kontrollgruppe.

Abbildung 4
Abbildung 4: Morphometry für myofiber Größe von Immunofluoreszenz. A) Fluorescent immunhistochemischen Reaktion von tibialis Abschnitte unter Verwendung eines Anti-Dystrophin - Antikörper (Vector Laboratories) von der Kontrolle und C26 - Hosts. Vergrößerung: 10x. Größe bar. 100 & mgr; m B) Quantifizierung der CSA in den Tibialis Muskel mit dem Makro ImageJ gemessen C) Häufigkeitsverteilung der CSA in den Tibialis Muskel der Kontrolle und C26 tragenden Mäusen.. Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt. n = 6 für jede Gruppe. Signifikanz der Unterschiede: ** p <0,01 im Vergleich zu der Kontrollgruppe Student-t-Test.

Abbildung 5
Abbildung 5: Morphometry für myofiber Größe von H & E. A) Hematoxylin & Eosin - Färbung von tibialis Abschnitte von Kontrolle und C26 - Hosts. Vergrößerung: 20x. Größe bar. 100 & mgr; m B) Quantifizierung und HäufigkeitsverteilungCSA in den Tibialis Muskel. Die Daten sind als Mittelwert SD ausgedrückt. n = 6. Signifikanz der Unterschiede: *** p <0,001 im Vergleich zu der Kontrollgruppe Student-t-Test.

Autoren Mausstamm Maus Geschlecht Handynummer Herkunft Implantierte als solider Tumor? Injektionsstelle Tage
Lazarus et al., 1999 CD2F1 M 5 x 10 & sup5 ; NCI NEIN Dorsalgegend 17
Al-Majid und McCarthy, 2001 CD2F1 F 2,5 x 10 & sup6 ; OSUMC NEIN Dorsalgegend 17
Samuels et al., 2001 Balb / c M 0,5 g / ml Suspension Tumor ns JA Dorsalgegend Bis zu 11
Acharyya et al., 2004 CD2F1 M 1 x 10 & sup7 ; OSUMC NEIN rechte Flanke Bis zu 24
Aulino et al., 2010 Balb / c ns 0,5 mm 3 NCI JA Dorsalgegend 21
Benny-Klimek et al., 2010 CD2F1 F 1 x 10 & sup6 ; OSUMC NEIN Dorsalgegend 14
Bonetto et al, 2011. 2012 CD2F1 F 1 x 10 & sup6 ; OSUMC NEIN Dorsalgegend
Cosper und Leinwand, 2010 CD2F1 M + F 5 x 10 & sup5 ; ns NEIN rechte Flanke Bis zu 27
Murphy et al., 2012 , CD2F1 ns 5 x 10 & sup5 ; NCI / OSUMC NEIN Dorsalgegend 14
Cornwell et al., 2014 CD2F1 M 5 x 10 & sup5 ; NCI NEIN Rechts und links flankieren Bis zu 26
Assi et al., 2016 Balb / c ns 1 x 10 & sup6 ; Zell Line Service NEIN Dorsalgegend Bis zu 22

Tabelle . 1: Vergleich der verschiedenen Protokolle verwendet für C26 Implantierung Different-Protokolle für C26 Implantation vorgesehen sind, insbesondere in Bezug auf die Mausstamm verwendet wird, die Zellzahl und Art des Tumors inokuliert, die Zellursprung, die Injektionsstelle und die Länge des Versuchszeitraums. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NCI: National Cancer Institute. Gewerbe-Zelllinie Dienst NS: keine Angabe.

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Discussion

Vor allem in seinen letzten Stadien ist Darmkrebs mit der Entwicklung von Kachexie, die schlechtere Ergebnisse und Verringerung der Lebensqualität des Patienten verantwortlich ist. Viele Studien haben sich auf die Behandlung von Zuständen Sekundar zu Krebs fokussiert; jedoch trotz vieler Bemühungen in dieser Richtung gibt es noch keine zugelassene Therapie für Krebs Kachexie 21. Daher ist es zwingend notwendig, dass die Tiermodelle der menschlichen Pathologie so eng wie möglich, um ähneln Übersetzung der Ergebnisse zu maximieren.

C26 tumortragenden Mäuse sind ein häufig verwendetes Versuchsmodell von Krebs Kachexie 22-24. Dieses Modell ähnelt sehr der menschlichen Krankheit, Verringerung der Körper, Muskeln und Fettmasse sowie Muskelfaser Atrophie und eine erhöhte Expression von inflammatorischen Genen und Ubiquitinligasen im Einklang mit markierten Protein Hyperkatabolismus zeigt 2,5. Trotz dieser, erhalten einige Unterschiede mit Daten in der Krebs patients wurden 25,26 berichtet. Tatsächlich einige Merkmale des Modells, einschließlich der nicht physiologischen Wachstumsumgebung (zB ein ektopische Tumor subkutan statt orthotop im GI - Trakt implantiert gewachsen), die relativ kurze Versuchsdauer im Vergleich zu anderen Modellen (zB genetische oder orthotoper Injektion von Tumoren), die Abhängigkeit von IL-6 Aktion, und der notwendige Einsatz von CD2F1 oder Balb / c-Mäuse können schwerwiegende Einschränkungen darstellen und die Interpretation der Ergebnisse einschränken könnte.

Das aktuelle Protokoll hat über viele Experimente in unserem Labor durchgeführt , in hohem Maße reproduzierbar erwiesen, die gleichen Eigenschaften beibehalten und ermöglicht Vergleiche zwischen den Ergebnissen zu unterschiedlichen Zeiten erhalten, in verschiedenen geografischen Standorten und von verschiedenen Forschern 3,10. Um jedoch die Reproduzierbarkeit der Daten zu fördern, ist es wichtig, klare und gemeinsame Leitlinien zu etablieren.

als gathered aus der Literatur einige Einschränkungen könnten die Wiedergabe der gleichen Daten in zwei verschiedenen Laboratorien verhindern. Aus den gleichen Gründen, erzeugen die Verwendung verschiedener Protokolle können verschiedene Phänotypen und Ergebnisse, sowie Blei zu widersprüchlichen und fragwürdigen Ergebnissen. Tatsächlich haben Unterschiede in der Durchführung dieses Tiermodell berichtet worden, hauptsächlich aus dem Stamm resultierende (Balb / c oder CD2F1) 2,5,27-29 oder Geschlecht von Mäusen 17 verwendet, der Art des Tumors , die implantiert wurde (eine Zellsuspension 3 , 29 statt eines festen Tumors in einem Pfropf - 2,30), dem Tumorquelle (NCI, ATCC oder OSUMC), die Anzahl von C26 - Zellen , die injiziert wurden, und die Stelle der Injektion oder Implantation (die Flanken 6,17, 31 oder das Rückenbereich 3,10,32). Kein direkter Vergleich der mit der Implantation von C26-Zelllinien aus verschiedenen Quellen erhalten damit verbundenen Auswirkungen (vor allem im Vergleich zu OSUMC NCI) hat jemals durchgeführt wurde, so dass wir von der Zeichnung jede definitive conclusi verhindernons. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass die Wahl der Quelle der Zellen signifikant die erwarteten Ergebnisse beeinflussen können. Bei der Wahl der Männer im Vergleich zu Frauen erwägen, sollten die Ermittler von signifikanten Unterschiede in den Ergebnissen erinnert werden. Wie durch Cosper und Leinwand Tatsächlich 17 berichtet, männlich tumortragenden Mäusen, auf die Abwesenheit von Östrogenen durch, kann eine schwerere Phänotyp als Frauen zeigen, einschließlich größere Herzmassenverlust und Mortalität, eine robustere proinflammatorische Antwort auf den Tumor und eine größere Herz Autophagie.

Vor allem für jene Forscher, die nicht vertraut sind mit diesem Modell und können zunächst mit Problemen konfrontiert, basiert sowohl auf einer Leistungsanalyse und unsere bisherigen Erfahrungen, die Verwendung von mindestens 6 Tiere pro Versuchsbedingung (n = 6) ist ratsam, um statistisch zu erfassen, deutliche Unterschiede. Es ist auch wichtig, dass die Randomisierung sorgfältig durchgeführt wird, so dass die anfängliche Körpergewichte bei den Versuchstierennicht signifikant zwischen den Gruppen unterscheiden. In ähnlicher Weise ist es ratsam, dass, um Inter-Operator-Variabilität zu vermeiden, die gleichen Ermittler auf jedes Tier, das Gewebe und Organsammlung durchführen. Ferner ist es zwingend notwendig, dass Gewebe (insbesondere Muskel) möglichst schnell eingefroren werden, um die RNAs und enzymatische Struktur und Aktivität, insbesondere wenn das Ziel der Studie zu erhalten ist, die Genexpression zu bewerten oder enzymatische Aktivitäten zu bewerten. Darüber hinaus wird in dem Versuch, Muskel CSA zu bestimmen, haben wir gezeigt, dass die Faserbereich Berichterstattung ist allgemein anerkannt, und repräsentativ für Muskelfasergröße. Hier präsentieren wir zwei verschiedene Methoden Muskel CSA zu beurteilen. Wie in den Figuren 4-5 gezeigt, waren beide Methoden der Lage , eine signifikante Reduktion in myofiber Größe zwischen Kontrollen und Tumor - Hosts zu erkennen, obwohl der Grad der verschwenden verschiedenen erschienen.

Diese Diskrepanz kann aus der Tatsache ergeben, dass, obwohl beide Methoden akzeptable Wege zu Esel sinds Muskelfasergröße, Quantifizierung von Muskeleigenschaften von H & E-gefärbten Objektträger ist immer noch eine manuelle oder halbautomatische Verfahren, meist arbeitsintensiv, zeitaufwendig und durch die begrenzte Genauigkeit beeinflusst. Basierend auf unserer Erfahrung sind wir der Meinung, dass die IF-basierte Methode eine genauere Technik ist Muskel CSA zu melden. Tatsächlich ist die Anzahl der Fasern, die automatisch Vorteil dieser Technik gemessen werden kann, indem sie wesentlich größer ist, wodurch die Genauigkeit der Messung zu erhöhen. Zu beachten ist, für beide Techniken wird eine alternative Methode der Berichterstattung Muskelgröße der Durchmesser des Feret zu beurteilen. Interessanterweise ist dies ein sehr zuverlässiges Werkzeug betrachtet aufgrund der Tatsache, dass dieser Parameter des Winkels der Schnitt weitgehend unabhängig ist. Andere Parameter, wie zum Beispiel die "minimale Innendurchmesser" und die "minimale Außendurchmesser" sind auch unempfindlich gegenüber der Ebene des sectioning und kann anstelle des Feret-Durchmesser als alternative Hinweise auf die fib verwendet werdener Größe.

Hieraus folgt, dass eindeutig die Kachexie Gemeinschaft braucht mehr physiologischen Modelle für die Untersuchung von Tumor-assoziierten Muskelschwund zu schaffen, glauben wir, dass Mäuse, die das C26 Kolonkarzinom stellen eine gut standardisiert und einfach zu bedienende Modell Lager molekularen Veränderungen zu untersuchen und physiologischen Abnormitäten der Regel nach dem Auftreten eines Tumors nachgewiesen. Zukünftige Anwendungen wird die Untersuchung, ob orthotope Implantation von C26-Zellen in den Darm betreffen könnte eine richtige und physiologischen Modell von Darmkrebs Kachexie darstellen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Flasks Falcon - Becton Dickinson 35-5001
DMEM Cellgro 10-017-CV
FBS Gibco 26140
Streptomycin-Penicillin  Cellgro 30-002-CI
CD2F1 mice Harlan 060
Anesthesia apparatus EZ-Anesthesia EZ-7000
2-Methyl Butane Sigma-Aldrich M32631
OCT Tissue-Tek 4583
Cryostat Leica CM1850
Cork disks Electron Microscopy Sciences 63305
Superfrost plus glass slides VWR 48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody Vector Laboratories VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG Life Technologies A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG Life Technologies A21211
Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS216
Eosin Sigma-Aldrich HT110332
Xylene Acros Organics 422680025
Cytoseal-XYL Thermo 8312-4
Microscope Zeiss Observer.Z1 
Bamboo Tablet Wacom CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011 Microsoft Corp.
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer BD 365873

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References

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