O Colon-26 Carcinoma Tumor-rolamento Mouse como um modelo para o estudo do câncer caquexia

Cancer Research

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Bonetto, A., Rupert, J. E., Barreto, R., Zimmers, T. A. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (117), e54893, doi:10.3791/54893 (2016).

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Abstract

Introduction

perda de massa muscular é uma complicação séria de várias condições clínicas, tais como o cancro, sépsis, fígado, cirrose, insuficiência cardíaca e renal, doença pulmonar obstrutiva crónica, e AIDS. Em particular, a perda de massa muscular é evidente em, pelo menos, 50% dos pacientes com cancro 1. A perda de músculo esquelético nos resultados de cancro de aumento da degradação de proteínas, devido à sobre-activação dos sistemas proteolíticos do esqueleto muscular e / ou a diminuição da síntese de proteína 6. A lipólise também é evidente, conduzindo ao esgotamento de tecido adiposo. Clinicamente, caquexia está associada com a redução da qualidade e duração de vida e é estimada como sendo a causa de morte em 20 - 30% dos doentes com cancro 7. A utilização de modelos experimentais que se assemelham a doença humana, tanto quanto possível, seria benéfico. Um modelo animal óptima é caracterizada por uma elevada reprodutibilidade, assim como por interferência limitado de diferentes terapias e os factores imprevisíveis dedieta, sexo e antecedentes genéticos que são normalmente associados com a condição clínica 8. Até agora, caquexia do cancro tem sido estudada principalmente em modelos animais caracterizados por transplante de células cancerosas ou de injecção de substâncias cancerígenas, embora um novo método é a utilização de ratinhos geneticamente modificados susceptíveis para o desenvolvimento de cancro.

Os ratinhos portadores de carcinoma do C26 (também referido como cancro do cólon e adenocarcinoma-26) representam um modelo bem caracterizado e amplamente utilizado de caquexia do cancro 2,5. O crescimento dos resultados de tumores C26 no corpo e perda de peso muscular, principalmente através de gordura melhorada e catabolismo protéico 9. Geralmente, um peso do tumor de 10% em relação ao peso total do corpo está associada com uma redução de 20-25% em peso do músculo esquelético e uma maior depleção de gordura 3,10. Hepatomegalia e esplenomegalia também são observados com o crescimento tumoral, juntamente com a activação da resposta de fase aguda e a elevação da pró-Inflaos níveis de citocinas mmatory 3,11. Entre estes, é bem sabido que a IL-6 desempenha um papel fundamental na mediação da perda de massa muscular no modelo de C26, embora esta citocina não é provavelmente o único indutor de caquexia 12. Elevados de IL-6 provoca atrofia do músculo através da activação da via de JAK / STAT3, e inibindo deste factor de transcrição pode prevenir perda muscular 3,4.

Durante a perda muscular induzida por C26, como em muitas condições de atrofia muscular, perda de massa muscular em grande parte, através de reduções do teor de proteína muscular através fibras musculares, não por meio de morte celular ou perda de fibras 13. Em C26 caquexia, uma mudança para menores áreas transversais é observada em ambos os glicolíticas e oxidativos fibras 2. Isso também é consistente com a redução da força muscular 5. Muitos grupos em todo o mundo têm aproveitado o modelo C26, a fim de descobrir novos mediadores da perda de massa muscular ou drogas clinicamente relevantes para CAC câncerHexia. No entanto, muitos procedimentos diferentes para o uso deste modelo têm sido relatados, levantando preocupações sobre a consistência dos dados obtidos e posando barreiras à reprodutibilidade em diferentes condições experimentais. Aqui nós relatamos um uso típico deste modelo para o estudo da caquexia associada ao câncer que produz dados padronizados e reprodutíveis.

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Protocol

Declaração de Ética: Todos os estudos descritos foram aprovados pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Thomas Jefferson e Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana.

1. C26 crescimento celular e Preparação

  1. Obter C26 células de cancro colorectal (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) e preparar o meio de crescimento completo (Modificado de Eagle Médium da Dulbecco ou seja, alta glucose (DMEM) contendo 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), piruvato de sódio 1 mM, 1% glutamina, e 1% de estreptomicina / penicilina).
    NOTA: De modo a permitir uma melhor reprodutibilidade inter-experimental, é preferível utilizar células de C26 a uma passagem tão baixo quanto possível.
  2. Utilizar um contador de células disponíveis comercialmente para a chapa células 50.000 / cm 2 em frascos com meio de crescimento completo. Incubar-los numa atmosfera humidificada a 37 ° C e 5% de CO 2 até sub-confluentes. Evitar cultivando-as a uma densidade elevada a prevdiferenciação ent e deriva de fenótipos celulares.
  3. Após a primeira passagem, as células suficientes chapa a ser implantado no número previsto de animais. No dia da implantação de células, dissociar as células por tripsinização com solução de tripsina-EDTA a 0,02 ml de 0,25% por cm 2, neutralizar a tripsina por adição de, pelo menos, 3 ml de meio fresco por ml de tripsina, determinar a concentração de células em células / ml , e ressuspender o número de células necessárias para o experimento (1 x 10 6 culas por ratinho) em PBS estéril.
    NOTA: As células C26 atingem a confluência quando a densidade é de cerca de 500.000 células / cm2.

2. Ratos

  1. Randomizar adultos ratinhos CD2F1 (pelo menos 8 semanas de idade) em grupos (normalmente controla e portadores de tumor) com, pelo menos, n = 6 por grupo.
    NOTA: C26 tumores crescer em ratinhos Balb / c bem. No entanto, com base na nossa experiência, os ratos CD2F1 representam uma série mais versátil e econômica para este modelo de tumor particular. Além disso,semelhante aos ambientes clínicos e achados de outros modelos experimentais de músculo associado a um cancro desperdiçando 14-16, diferenças entre os sexos na resposta ao C26 caquexia também pode ser observada 17 (ver também Quadro 1).
  2. Anestesiar o rato usando isofluorano por inalação (3% em oxigénio). Manter o animal sob anestesia exclusivamente durante o tempo necessário para realizar a inoculação do tumor. Certifique-se o rato encontra-se numa almofada aquecida, a fim de evitar a perda de calor do corpo. Antes de iniciar o procedimento de injeção tumor, confirme anesthetization adequada apertando suavemente os dedos dos pés traseiros.
    NOTA: Devido à duração deste processo (em geral de alguns segundos), o uso de pomada veterinária não é necessária. Pela mesma razão, os animais de controlo submetidos a operação simulada não são esperados para perder peso.
  3. Usando uma seringa esterilizada de insulina de 1 ml com uma agulha de calibre 26, injectar rapidamente 250 pi da solução que contém o tumor células por via subcutânea e intrascapularly na almofada de gordura do mouse.
    NOTA: Os animais de controlo receberão 250 ul de solução salina estéril intrascapularly na almofada de gordura.
  4. Coloque a parte traseira animal em sua gaiola. Observe directamente o mouse pelo menos uma vez a cada 15 minutos até que possa responder à manipulação delicada e recuperou um reflexo de endireitamento.
    NOTA: Não deixe o mouse sem vigilância, e mantê-lo em uma gaiola de recuperação quente que contém um substrato sólido. Além disso, não devolva o mouse para a sala de animal até que ele está totalmente recuperado da anestesia. Geralmente, os ratos não precisa ser alojados individualmente, a menos que o investigador tem como objetivo avaliar o consumo alimentar individual. Se este for o caso, e o uso de gaiolas metabólicas automatizados não está disponível, a gravação manual do consumo de alimentos deve ser realizado, possivelmente diária e, ao mesmo tempo cada dia.
  5. Confira os ratos diariamente e registrar seu peso corporal.
    NOTA: Gravando o escore de condição corporal ecomportamentos casa gaiola pode diferenciar graus de caquexia e doença comportamento, o que é útil para estudos de tratamento 18.

3. Eutanásia e coleta de sangue

  1. Quando a perda de peso corporal nos hospedeiros de tumor versus controlos que chega a 5%, 10%, ou 15% (caquexia suave, moderado, e severo, respectivamente) em comparação com os seus pesos corporais iniciais, sacrificar os ratinhos.
    NOTA: Uma experiência típica irá ser levada a cabo até um grupo atinge 10% de perda de peso, em cima do qual todos os grupos são sacrificados. perda de peso corporal é determinada medindo o peso do corpo, inclusive do tumor.
  2. Posicione o mouse sob anestesia geral isoflurano (3% em oxigênio). Extrair o sangue por meio de uma punção cardíaca (cerca de 1 - 1,5 mL).
  3. Recolher o sangue em K 2 EDTA (18 mg) tubos vazios e colocá-los no gelo. Centrifugar o sangue (2000 x g durante 15 min a 4 ° C) e recolher o plasma / soro.
  4. Euthanize o mouse por meio de cluxação ervical. Proceder à excisão de tecido e recolha de órgãos.

4. Tecidos e Órgãos Excision

NOTA: Para utilização de tecidos em ensaios de biologia bioquímicos ou moleculares, o plano para pesar cada órgão e tecido e coloque um fragmento imediatamente em criotubos pré-rotulados. Snap congelar em azoto líquido e armazenar a -80 ° C.

  1. A fim de evitar a contaminação das amostras de tecido com pêlo, spray de 70% de etanol ao longo de todo o corpo.
  2. Posicione o mouse sobre uma cama de dissecção em decúbito dorsal e estender um membro verticalmente, anexando o pé para uma pinça buret elevada.
  3. Segure a pele do membro inferior com uma pinça Dumont e usar a tesoura finas curvas para remover suavemente a pele e fáscia, expondo as barrigas musculares subjacentes do membro inferior.
  4. Identificar o músculo gastrocnêmio no posterior do membro inferior por sua origem nos côndilos lateral e medial no fêmur posterior e sua inserção nacalcâneo através do tendão calcâneo.
    1. Continuar a cortar o tendão calcâneo gastrocnêmio. Segure a extremidade distal do músculo gastrocnêmio com uma pinça Dumont e puxe o ventre muscular em direção a sua origem. Com uma tesoura, cortar o músculo na origem o mais próximo possível ao fémur. Coloque o músculo em um prato. Pesá-lo imediatamente e congelá-lo em um tubo em azoto líquido.
      NOTA: Tenha cuidado para não extirpar o músculo sóleo, juntamente com o gastrocnêmio. Se isso ocorrer, remova cuidadosamente sóleo, puxando-o delicadamente fora com a pinça.
  5. Avance para identificar e extirpar o músculo tibial anterior de sua origem na superfície ântero-lateral da tíbia e sua inserção no cuneiforme medial através de seu tendão distal.
    1. Para se ter alavancagem, segurar o pé, segurando os dígitos com o dedo indicador eo polegar. Insira a ponta do fórceps Dumont imediatamente sob o tendão distal superficial do tibial e mover a pinça de modo que o blunt lado pode ser utilizado para separar a barriga do músculo tibial do tecido conjuntivo subjacente.
    2. Cortar o tendão distai utilizando as curvas finas tesouras, e depois cortar o músculo na origem, tão próximo quanto possível da tíbia.
  6. Abrir a cavidade abdominal através da realização de uma incisão sagital começando na região hipogástrica e movendo-se superiormente à região epigástrica, parando a incisão logo acima do diafragma.
    NOTA: A profundidade da incisão deve ser apenas o suficiente para romper a parede do músculo abdominal e fáscia peritoneal subjacente.
  7. Remova cuidadosamente o fígado, segurando-o com a pinça de ponta romba, e usar os finos tesoura curva para dissecar afastado qualquer vasos sanguíneos ou o tecido conjuntivo que aderem ao fígado para a cavidade. Tome cuidado para não deixar qualquer lobos para trás. Pesar e encaixe congelar o fígado num tubo em azoto líquido.
  8. Usando a pinça de ponta romba, afaste-se do intestino e, em seguida, expor e delicadamente removao baço. Segure o baço suavemente com a pinça de ponta romba e usar a parte traseira ou lateral sem corte dos bons tesoura curva para dissecar afastado qualquer tecido ou vasos sanguíneos conjuntivos aderentes do baço para a cavidade. Pesar e encaixe congelá-lo em um tubo em azoto líquido.
  9. Identificar as bolsas de gordura gonadal, ao lado do epidídimo (em homens) ou do útero (nas mulheres). Gentilmente segure a gordura epididimal com a pinça de ponta romba e puxe o tecido para fora da cavidade. Usando as finas tesoura curva, cortar qualquer tecido gonadal que podem ser anexado à almofada de gordura. Pesa-se a almofada de gordura e encaixe congelá-lo em um tubo em azoto líquido.
    NOTA: Geralmente, este tecido adiposo é considerada representativa da massa de gordura corporal total em ratos e redução de peso com caquexia. Outros almofadas de gordura podem ser identificados de modo semelhante, dissecado, removido e pesado.
  10. Use as tesouras finas curvas para abrir o peito do animal. Cortar as costelas ligados a ambas as bordas laterais do sternum. Remover o esterno. Usando dois pares de fórceps, segure cada lado da caixa torácica e puxar cada lado lateralmente para abrir a cavidade torácica.
  11. Delicadamente puxar o coração com a pinça. Cuidadosamente extirpar o coração com as tesouras finas curvas, cortando a aorta no átrio esquerdo. Certifique-se de esvaziar o órgão de qualquer sangue residual borrando-a delicadamente contra algum papel absorvente. Pesar e encaixe congelá-lo em um tubo em azoto líquido.

5. Freezing muscular e Montagem

  1. Imergir a metade inferior de um pequeno copo de plástico (50 ml) contendo isopentano no azoto líquido. O isopentano é pronto para usar quando se torna ligeiramente viscoso e forma um sólido branco revestimento laminado no interior do copo (temperatura: -160 ° C).
    NOTA: Utilize sempre nonsparking bronze ou alumínio ferramentas manuais. Evite respirar o vapor do produto. Use com ventilação adequada. Se lidar com um derrame e ventilação é impossível ou impractical, usar um respirador adequado.
  2. Congelar algum meio de incorporação de um mandril (cortiça), mergulhando-o brevemente (10 segundos) em isopentano.
  3. Pega do músculo (por exemplo., O tibial ou gastrocnémio), segurando-o pelo tendão, verticalmente em relação à rolha, de modo a manter a orientação das fibras e para permitir secções transversais.
  4. Cuidadosamente posicionar a porção de extremidade do músculo fresco no topo do meio de incorporação congelado.
    NOTA: O músculo vai ficar. É importante não se envolver completamente o músculo com a incorporação médio. É também importante para manter a orientação vertical para posterior determinação da área em corte transversal.
  5. Mergulhar o mandril com o músculo em anexo para o banho de isopentano (o tempo de congelação usual é de 7-15 segundos, dependendo do tamanho e composição do tipo).
    NOTA: A imersão na solução de congelação não deve durar mais do que o necessário para congelar completamente a amostra. Congelamento muito tempo frac vontadetura do bloco de tecido, enquanto um tempo muito curto fará com que a formação de cristais de gelo. Um espécime bem congelados será giz branco.
  6. Após o congelamento da amostra, coloque-o em um saco plástico pequeno ou tubo de amostra (50 ml) e imediatamente armazená-lo em um congelador a -80 ° C ou em azoto líquido.

6. Análise dos dados brutos

  1. A fim de controlar as variações no tamanho dos ratinhos, normalizar o peso corporal final (PCF); peso corporal livre de tumor; e carcaça, órgãos, tecido e o peso (expressa em gramas) de acordo com o peso corporal inicial (PI), e expressá-las como "peso / 100 mg IBW".
    NOTA: Como alternativa, alguns investigadores normalizar a massa muscular ao comprimento da tíbia.
  2. Usar um software para análise de dados. Encontre a média e SD dos pesos normalizados. Realizar a análise estatística com os testes t de Student não pareado entre os controles e camundongos C26-rolamento.
    Nota: Os resultados podem ser apresentados em relação ao corpo (IBWe pesos FBW) livre de tumor, tumores, órgãos e tecidos.

7. Muscle Seccionamento

  1. Definir a temperatura de funcionamento da câmara interior criostato para cerca de -23 ° C.
  2. Permitir que o espécime (anteriormente armazenado a -80 ° C) para aclimatar à temperatura de trabalho (um par de horas deverá ser suficiente).
  3. múltiplo corte de 8 mm de espessura da amostra (de preferência o tibial anterior ou músculo gastrocnêmio) e recolhê-las em lâminas de vidro.
    NOTA: Corte o setor na região mid-ventre do músculo. Além disso, por uma questão de precisão, cortar as seções perpendicularmente ao eixo de fixação.
  4. Mantenha as lâminas de vidro dentro da câmara de criostato. Não deixá-los descongelar se o objetivo é realizar IF / estudos de IHC ou coloração enzimática.
  5. Armazenar as lâminas a -80 ° C para posteriores análises.

8. Avaliação de miofibras por Tamanho Laminina Imunofluorescência (Alternativa 1)

19. Embora a coloração com H & E de secções do tecido muscular é um método valioso e conveniente para a análise de morfologia, a utilização de uma abordagem IF 14 é significativamente mais rápido e modestamente mais preciso do que o método baseia-E H &. H & E métodos são descritos a seguir.

  1. Remover secções de tecido a partir de qualquer criostato ou o armazenamento de -80 ° C e permitir que eles atinjam a temperatura ambiente (cerca de 5 - 10 min).
    NOTA: De modo a evitar interacções não específicas associadas com anticorpos primários criados em ratinhos, é aconselhável a utilização tanto de anticorpos criados em outras espécies ou para fazer uso de kits de imunodetecção de rato "-em-rato", disponíveis comercialmente.
  2. Mergulhe as seções de pré-coolEd metanol (-20 ° C) durante 10 min.
  3. Lavam-se as secções em PBS 1x temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Remover o PBS e usar uma caneta para aplicações de imuno-histoquímica para cercar as seções no slide. Não deixe que as seções completamente seco em qualquer ponto.
  5. Aplicar um tampão adequado de bloqueio (5 - 8% de FBS em PBS ou soro de cabra a 5% em PBS) para as secções durante 1 hora à TA.
  6. Remover o tampão de bloqueio.
  7. Aplicar tanto um anticorpo de coelho anti-laminina (01:30) ou um anti-distrofina de ratinho (1:30) de anticorpo primário em tampão para as secções de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 ° C) numa câmara húmida.
  8. Lavam-se as secções com PBS 1X durante 5 min.
  9. Remover o tampão de lavagem e lava-se secções de novo em 1x PBS durante 5 min.
  10. Remover o tampão de lavagem e aplicação de um anticorpo secundário fluorescente apropriado (1: 1000 em tampão de bloqueio), para as secções numa câmara húmida durante 1 h à TA.
  11. Remover o anticorpo secundário e lava-se as secções com 1x PBS durante 5min.
  12. Remover o tampão de lavagem e repetir a lavagem com PBS 1X durante 5 min. Retire o tampão de lavagem e cobrir as seções com uma tampa de vidro usando um meio de base aquosa.
  13. Identificar as características morfológicas do músculo usando imagens digitais da seção manchada. A fim de fazer isso, use um microscópio de luz fluorescente invertida para IF seções (um objectivo ampliação de 10x ou 20x é o caso), juntamente com um software da câmera e captura de imagem digital. Colocar uma barra de escala em cada imagem digital (20 - 30 campos aleatórios são recomendadas para cada secção do músculo) a fim de facilitar a quantificação do CSA. As imagens devem ser guardadas em formato .TIF para ser compatível com o software de análise de imagem utilizando o programa ImageJ.
  14. Usar uma macro ImageJ para distinguir do tecido conjuntivo a partir de tecido contráctil (tamanho da fibra muscular), através da presença do anticorpo secundário fluorescente no endomísio 20.
    NOTA: A macro e as instruções estão disponíveis a partir do authRUP, Richard Lieber e Shannon Bremner.
  15. Abra o programa ImageJ clicando duas vezes no ícone na área de trabalho.
  16. Carregar o macro CSA, clicando uma vez na guia "Plugins". Mova o cursor para baixo para selecionar a opção "Instalar" clicando nele uma vez.
  17. Carregar o macro transversal, selecionando-o a partir da pasta que ele foi salvo, e, em seguida, clique em "Abrir".
  18. Uma vez que a macro foi aberto, abra a imagem histológica contendo a barra de escala, clicando em "Arquivo" e depois "Open" na barra de ferramentas ImageJ.
  19. Depois que a imagem é aberta, selecione a ferramenta "linha reta" no programa ImageJ, clicando sobre o ícone com a linha reta.
  20. Uma vez que a "ferramenta de linha reta" é selecionada, clique uma vez no final mais à esquerda da barra de escala e, em seguida, clique uma vez no mais à direita final da barra de escala. Quando feito corretamente, não deve haver uma linha amarela sobreposta na barra de escala.
  21. Certificar-se de que o yellolinha w ainda é sobreposto na barra de escala, selecione a guia "Analisar" na barra de ferramentas ImageJ clicando nele uma vez.
  22. Na guia "Analisar", mova o cursor para baixo e selecione "escala set" clicando nele uma vez.
  23. Na janela "escala de Ajuste", não altere o valor na caixa "Distância em pixels". Introduza a distância conhecida da barra de escala na caixa "distância conhecida". Alterar as unidades na caixa "Unidade de comprimento" para corresponder com as unidades de barra de escala (ou seja, micrômetros = m). Por fim, selecione "global", clicando na caixa à esquerda de "Global" uma vez.
  24. Feche a janela "escala de Ajuste".
  25. Abrir a primeira imagem a ser medida pressionando a tecla "S" no teclado. Observe uma janela pop-up que permite ao usuário para localizar e selecionar a imagem a ser medido a partir da pasta que ele foi salvo no. Selecione a imagem clicando sobre ela uma vez e, em seguida, clicar em "Abrir".
  26. <li> Uma vez aberto, uma janela deve aparecer para a seleção do intervalo aceitável para medições CSA e de circularidade.
    NOTA: Essas configurações normalmente são deixados para seus valores padrão. No entanto, se se deseja alterar essas configurações, certifique-se de manter os valores da mesma para cada imagem consecutiva a ser medido no experimento.
  27. Depois de definir o intervalo de CSA e circularidade, observar a imagem coberta de pixels vermelhos com uma janela "Threshold". Ajuste o limite da imagem usando as barras na janela "Threshold" até que as fibras musculares são preenchidos com precisão com pixels vermelhos.
    NOTA: tentar obter o maior número de fibras que não estão tocando um ao outro; Se as fibras estão a tocar, eles serão medidos como uma grande fibra, as quais terão de ser editada a jusante.
  28. Depois de definir o limite, pressione o botão "1" no teclado para medir as fibras musculares.
  29. Circundar as fibras musculares individuais com uma linha amarela.Mova-se através da imagem e remover artefatos ou fibras duplas que foram selecionados pelo programa. Para fazer isso, selecione as estruturas que não são fibras clicando neles uma vez e, em seguida, pressione o botão "D" no teclado. Isto irá excluí-los a partir das medições.
  30. Selecione e copie as medições da "janela Valor de medição", e colá-los em uma planilha para análise posterior.
    NOTA: Os valores obtidos podem também ser utilizados para avaliar a análise da distribuição de fibra, o que representa, geralmente, um parâmetro útil para determinar se o crescimento do tumor promove uma mudança no sentido de fibras menores.
  31. Feche todas as janelas abertas em ImageJ, clicando no "X" no canto superior esquerdo das janelas.
  32. Abra uma nova imagem a ser medido com a tecla "O" e repetindo os passos 8,24-8,29.

9. Avaliação de miofibras Tamanho da H & E manchado secções (Alternativa 2)

  1. Coloque o coposlides em frascos Coplin contendo filtrada hematoxilina de Harris por 8 min.
    NOTA: Como alternativa, Mayer hematoxilina pode ser utilizado se uma mancha menos intensa é desejada.
  2. Lavar as lâminas em água deionizada.
  3. Mergulhar as lâminas em água da torneira para até 5 min.
  4. Rapidamente enxaguar em água desionizada, e em seguida incubam-los em solução filtrada eosina 1% para menos de 2 min.
    NOTA: Se uma mancha mais intensa for desejado, adicionar 1 - 2 gotas de ácido acético (0,01% ou menos) para a solução de eosina.
  5. Começa os passos de desidratação. Lavar as lâminas em etanol a 70% para menos de 1 min.
  6. Mergulhar as lâminas em etanol a 90% durante 1 min.
  7. Mergulhar as lâminas em etanol a 95% durante 1 min.
  8. Mergulhar as lâminas em etanol a 100% por 2 min.
  9. Mergulhar as lâminas em xileno por 2 min. Mover os slides para outro frasco contendo Copley xileno fresco por mais 2 min.
    NOTA: Mantenha os slides em xileno (não mais do que 1 hora) até que sejam lamínulas.
  10. Coloque a coverslips nas seções musculares usando Permount ou um meio de montagem com base em xileno de escolha.
  11. Observe as lâminas de vidro H & E-coradas ao microscópio com uma ampliação de 20X, e adquirir imagens de toda a área de secção muscular. Obter imagens usando um microscópio de luz brilhante, câmera digital e software de captura de imagem.
    NOTA: A presença de uma barra de escala ou a imagem de um micrómetro feita com a mesma ampliação será necessário para determinar a CSA. Como acima, grave pelo menos 20 - 30 campos aleatórios para cada seção muscular.
  12. Avaliar o tamanho myofiber usando software ImageJ. Abra cada imagem digital. Defina a escala como acima. Medir pelo menos 1.500-2.000 fibras musculares por músculo usando a ferramenta de seleção à mão livre, traçando a circunferência da fibra com um mouse ou, para a entrada de mais rápido, com um dispositivo de entrada tablet e caneta.

Recolha de Dados e Análise 10.

  1. A fim de determinar o tamanho da fibra muscular, avaliar a área média da fibra "."Calcular médias e SD para as medições obtidas para cada um dos músculos, incluindo a área e o diâmetro de Feret. Além disso, a fim de avaliar se a configuração experimental está associado com uma mudança no sentido de fibras musculares menores ou maiores, analisar a" distribuição de fibras . "
  2. Avaliar a significância do resultado através da realização de um teste-t não emparelhado de dois grupos. Determinar as relações entre os valores obtidos para o grupo de ratinhos C26 e para o grupo de controlo. Traçar os valores em um gráfico relatando o meio SD e da frequência de distribuição / histograma destinado a demonstrar a mudança de tamanhos de fibra.

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Representative Results

C26 cinética de crescimento do tumor mostrar uma fase de latência para o primeiro 7-8 d após a injecção, seguido de crescimento celular exponencial (4-5 d). A massa tumoral atinge finalmente ~ 10% do peso corporal (cerca de 2 g; Figura 1A-B). Durante a primeira fase, o tumor pode ser localizado por palpação única e aparece como uma pequena protuberância da pele. Na segunda fase, o tumor é observado como uma massa sob a pele. Raramente, o tumor torna-se ulcerada, resultando numa ferida aberta; Neste caso, o rato é excluído do grupo experimental e é humanamente eutanasiados.

O peso corporal é inalterada na primeira fase, mas é significativamente reduzida na segunda fase, quando atinge de 10 - 15% do peso corporal inicial (30% no caso de peso livre de tumor; Figura 1A). ratinhos portadores de tumor apareça desperdiçado e mostrou pele desgrenhada no final doperíodo experimental, com uma condição corporal (CC) pontuação igual a 1 18 (Figura 1C). BC1 representa um rato severamente emagrecido, onde as estruturas esqueléticas são evidentes e as vértebras são distintamente segmentada. Perda de peso corporal é contabilizado principalmente para tanto esquelético perda de massa muscular e gordura dos tecidos (Figura 1B). Perda de peso corporal é consistente com uma redução de cerca de 20 - 30% em peso do músculo esquelético, em particular no gastrocnémio, tibial anterior, e quadríceps (Figura 2). O músculo cardíaco também é significativamente reduzida em peso, embora em menor grau, quando comparada com os outros músculos esqueléticos (Figura 2). Curiosamente, hepatomegalia (+ 16%, P <0,01) e esplenomegalia (+ 110%, p <0,01) são geralmente detectada em hospedeiros de tumor, enquanto a massa de gordura, semelhante ao músculo esquelético, está severamente reduzida (-70%, p <0,001 ; Figura 3).

(Figura 4A-B). Em particular, a análise da distribuição de frequência mostrou uma mudança no sentido de fibras de tamanho menor em ratinhos C26-rolamento, sugerindo assim que todo o músculo é submetido a atrofia na presença de um tumor em C26 (Figura 4C). Resultados semelhantes podem ser observados, tirando partido de uma metodologia baseada-E H & tradicional para a quantificação do tamanho das fibras, embora a magnitude da mudança de CSA muscular associada com o crescimento do cancro é ligeiramente diferente (38% versus o controlo, P <0,01 para o IF método baseado; -18% versus o controlo, P <0,01 para o método baseia-e H &; Figura 5).

figura 1
Figura 1: Pesos em Controle e Ratos C26-rolamento. A) curva de peso corporal no controle e anfitriões C26 ao longo de todo o período experimental (14 dias após a injecção do tumor). B) Initial peso corporal (IBW), último livre de tumor peso corporal (FBW), e peso do tumor no controle e C26- animais portadores. C) imagens representativas dos controles e C26-portadores no momento do sacrifício (dia 14 após a inoculação do tumor). Os dados são expressos como a média SD. n = 6. significância das diferenças: * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 versus o grupo de controlo utilizando o teste t de Student. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Pesos musculares no controle e C26 portadores de ratos. Os tibial, gastrocnêmio, quadríceps, e pesos cardíacos em controle e C26 tumorais portadores são relatados como o peso / 100 mg IBW. Os dados são expressos como a média de SD. n = 6. A significância das diferenças: ** P <0,01 e *** p <0,001 versus o grupo de controlo utilizando o teste t de Student.

Figura 3
Figura 3:. Peso de orgãos nos Controle e Ratos C26-rolamento O fígado, baço e epidídimo pesos das camadas de gordura no controle e C26 tumorais portadores são relatados como o peso / 100 mg IBW. Os dados são expressos como a média de SD. n = 6. A significância das diferenças: ** p <0,01 versus o grupo de controlo.

Figura 4
Figura 4: A morfometria de miofibras Tamanho por imunofluorescência. A) reação imunohistoquímica fluorescente de secções tibial usando um anticorpo anti-distrofina (Vector Laboratories) a partir de hosts C26 controle e. Ampliação: 10x. Bar Tamanho:. 100 mm B) Quantificação da CSA no músculo tibial medida com a distribuição de frequência ImageJ macro C) da CSA no músculo tibial de controle e ratos C26-rolamento.. Os dados são expressos como a média ± DP. n = 6 para cada grupo. A significância das diferenças: ** p <0,01 versus o grupo de controlo utilizando o teste t de Student.

Figura 5
Figura 5: A morfometria de miofibras Tamanho pela H & E. A) Hematoxilina & eosina de secções tibial de hosts C26 controle e. Ampliação: 20X. Bar Tamanho:. 100 mm B) distribuição de Quantificação e frequência deCSA no músculo tibial. Os dados são expressos como a média de SD. n = 6. A significância das diferenças: *** p <0,001 versus o grupo de controlo utilizando o teste t de Student.

autores estirpe de ratinhos rato de gênero Número do celular Origem Implantado como tumor sólido? Local da injecção Dias
Lazarus et al., 1999 CD2F1 M 5 x 10 5 NCI NÃO região dorsal 17
Al-Majid e McCarthy, 2001 CD2F1 F 2,5 x 10 6 OSUMC NÃO região dorsal 17
Samuels et al., 2001 Balb / c M 0,5 g / ml de suspensão de tumores ns SIM região dorsal Até 11
Acharya et ai., 2004 CD2F1 M 1 x 10 7 OSUMC NÃO flanco direito Até 24
Aulino et al., 2010 Balb / c ns 0,5 milímetros 3 NCI SIM região dorsal 21
Benny-Klimek et al., 2010 CD2F1 F 1 x 10 6 OSUMC NÃO região dorsal 14
Bonetto et al, 2011.; 2012 CD2F1 F 1 x 10 6 OSUMC NÃO região dorsal
Cosper e Leinwand de 2010 CD2F1 M + F 5 x 10 5 ns NÃO flanco direito Até 27
Murphy et al., 2012 CD2F1 ns 5 x 10 5 NCI / OSUMC NÃO região dorsal 14
Cornwell et al., 2014 CD2F1 M 5 x 10 5 NCI NÃO Direito & flanco esquerdo Até 26
Assi et al., 2016 Balb / c ns 1 x 10 6 Serviço de linha celular NÃO região dorsal Até 22

Tabela 1:. Comparação entre os diferentes protocolos utilizados para C26 Implantação Different protocolos para implantação C26 são fornecidos, com particular referência à estirpe de ratinhos utilizada, o número de células e do tipo de tumor inoculados, a origem celular, o local da injecção, e o comprimento do período experimental. OSUMC: Ohio State University Medical Center. NCI: National Cancer Institute. Comercial linha de células de serviço NS: não especificado.

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Discussion

Especialmente em suas últimas fases, cancro colo-rectal está associada com o desenvolvimento de caquexia, que é responsável por resultados mais pobres e reduções na qualidade de vida do paciente. Muitos estudos têm focado no tratamento de condições secundárias de cancro; No entanto, apesar de muitos esforços nesse sentido, ainda não existe uma terapia aprovada para caquexia associada ao câncer 21. Assim, é imperativo que os modelos animais assemelham-se a patologia humana, tanto quanto possível, a fim de maximizar a tradução dos resultados.

Ratinhos portadores de tumores C26 é um modelo experimental utilizada de caquexia do cancro 22-24. Este modelo se assemelha à doença humana, que mostra as reduções no corpo, músculo, e a massa de gordura, bem como a atrofia da fibra muscular e aumento da expressão de genes inflamatórios e ubiquitina ligases consistentes com hipercatabolismo proteína marcada 2,5. Apesar disso, algumas disparidades com dados obtidos em patie câncerNTS foram relatados 25,26. De facto, algumas características do modelo, incluindo o ambiente de crescimento não-fisiológico (por exemplo, um tumor ectópica crescido subcutaneamente em vez de ortotopicamente implantado no tracto GI), o período experimental relativamente curto em comparação com outros modelos (por exemplo, injecção, genética ou ortotópico de tumores), a dependência de IL-6 ação, bem como a utilização necessária de CD2F1 ou camundongos Balb / c podem representar sérias limitações e poderá condicionar a interpretação dos resultados.

O protocolo atual provou ser altamente reprodutível em muitos experimentos realizados em nosso laboratório, mantendo as mesmas características e permitindo comparações entre os resultados obtidos em diferentes momentos, em diferentes localizações geográficas, e por diferentes pesquisadores 3,10. No entanto, a fim de promover a reprodutibilidade dos dados, é importante estabelecer normas claras e comuns.

como gathered a partir da literatura, muitos cuidados pode impedir a reprodução dos mesmos dados em dois laboratórios diferentes. Pelas mesmas razões, o uso de diferentes protocolos podem gerar diferentes fenótipos e os resultados, assim como levar a resultados conflitantes e questionáveis. Na verdade, as diferenças de realização deste modelo animal ter sido relatado, o que resulta, principalmente, a partir da estirpe (BALB / c ou CD2F1) 2,5,27-29 sexo ou de ratinhos 17 utilizado, o tipo de tumor que foi implantado (uma suspensão de células três , 29, em vez de um tumor sólido em um enxerto 2,30), a origem do tumor (NCI, ATCC, ou OSUMC), o número de células que foram injectados C26, e o local da injecção ou implantação (nos flancos 6,17, 31 ou região dorsal 3,10,32). Sem comparação direta dos efeitos associados com a implantação de linhas de células C26 obtidos de diferentes fontes (principalmente OSUMC contra NCI) já foi realizada, impedindo-nos assim de tirar qualquer conclusi definitivaons. No entanto, é provável que a escolha de uma fonte de células pode também influenciar significativamente os resultados esperados. Ao considerar a escolha dos homens contra as mulheres, os investigadores devem ser lembrados de diferenças significativas nos resultados. Com efeito, como relatado por Cosper e Leinwand 17, os ratos portadores de tumores masculinos, devido à ausência de estrogénios, podem exibir um fenótipo mais severa do que as fêmeas, incluindo uma maior perda de massa cardíaca e mortalidade, uma resposta pro-inflamatório mais robusto ao tumor , e maior autofagia cardíaca.

Especialmente para os investigadores que não estão familiarizados com este modelo e podem, inicialmente, enfrentam problemas, com base tanto uma análise de potência e a nossa experiência anterior, a utilização de, pelo menos, 6 animais por condição experimental (n = 6) É aconselhável a fim de detectar estatisticamente diferenças significantes. É também crítico que a randomização é realizada cuidadosamente, de modo que os pesos corporais iniciais nos animais experimentaisnão diferem significativamente entre os grupos. Da mesma forma, é aconselhável que, a fim de evitar variabilidade inter-operador, o mesmo investigador realizar a recolha de tecidos e órgãos em todos os animais. Além disso, é imperativo que os tecidos (particularmente musculares) são congelados tão rápido quanto possível, a fim de preservar os ARN e a estrutura e a actividade enzimática, especialmente se o objectivo do estudo é o de avaliar a expressão do gene ou para avaliar as actividades enzimáticas. Além disso, na tentativa de determinar CSA muscular, mostrámos que a comunicação a área da fibra e é geralmente aceite representante de tamanho da fibra muscular. Aqui, apresentamos dois métodos distintos para avaliar CSA muscular. Como mostrado nas Figuras 4-5, ambos os métodos foram capazes de detectar uma redução significativa no tamanho da fibra muscular entre os controlos e hospedeiros de tumor, embora o grau de desperdício apareceu diferente.

Esta discrepância pode resultar do fato de que, embora ambos os métodos são maneiras aceitáveis ​​para avaliartamanho da fibra muscular s, quantificação das características musculares de lâminas H & E-manchadas ainda é um processo manual ou semi-automática, na maioria das vezes, demorado e que sofrem de precisão limitada de trabalho intensivo. Com base em nossa experiência, acreditamos que o método baseado-IF é uma técnica mais precisa para relatar CSA muscular. De facto, o número de fibras que podem ser medidos automaticamente, tomando vantagem desta técnica é significativamente maior, aumentando assim a precisão da medição. De nota, para ambas as técnicas, um método alternativo de tamanho do músculo de informação é avaliar o diâmetro de Feret. Curiosamente, esta é considerada uma ferramenta muito fiável, devido ao facto de que este parâmetro é bastante independente do ângulo de corte. Outros parâmetros, tais como o "diâmetro interno mínimo" e o "diâmetro exterior mínimo" também são insensíveis em relação ao plano de corte e pode ser usado em vez de o diâmetro de Feret como indicações alternativas da FIBtamanho er.

Em conclusão, embora a comunidade caquexia necessita claramente de estabelecer os modelos mais fisiológicas para o estudo de perda de massa muscular associada a tumor, acreditamos que a ratinhos portadores de carcinoma do cólon C26 representam um modelo bem-padronizada e de fácil utilização para investigar alterações moleculares e anomalias fisiológicas normalmente detectado depois da ocorrência de um tumor. As aplicações futuras envolvem a investigação sobre se o implante ortotópico de células C26 para o cólon pode representar um modelo adequado e mais fisiológica da caquexia associada ao câncer colorretal.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture Flasks Falcon - Becton Dickinson 35-5001
DMEM Cellgro 10-017-CV
FBS Gibco 26140
Streptomycin-Penicillin  Cellgro 30-002-CI
CD2F1 mice Harlan 060
Anesthesia apparatus EZ-Anesthesia EZ-7000
2-Methyl Butane Sigma-Aldrich M32631
OCT Tissue-Tek 4583
Cryostat Leica CM1850
Cork disks Electron Microscopy Sciences 63305
Superfrost plus glass slides VWR 48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody Vector Laboratories VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG Life Technologies A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG Life Technologies A21211
Hematoxylin Sigma-Aldrich GHS216
Eosin Sigma-Aldrich HT110332
Xylene Acros Organics 422680025
Cytoseal-XYL Thermo 8312-4
Microscope Zeiss Observer.Z1 
Bamboo Tablet Wacom CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011 Microsoft Corp.
ImageJ US National Institutes of Health IJ1.46 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer BD 365873

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References

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