ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

* These authors contributed equally
Developmental Biology
JoVE Journal
Developmental Biology
AccessviaTrial
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Houston, D. A., Staines, K. A., MacRae, V. E., Farquharson, C. Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification. J. Vis. Exp. (118), e54978, doi:10.3791/54978 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

الهيكل العظمي هو جهاز معقد للغاية، ودينامية ومعقد يحتوي على مجموعة من الوظائف التي تمتد من الحركة، إلى التوازن الأيوني. تتألف من العظام والغضاريف، والهيكل العظمي يتكون من السكان خلية متميزة وظيفيا والتي تعمل للحفاظ على انها الهيكلية، والكيمياء الحيوية والميكانيكية النزاهة 1. واحدة من المهام الرئيسية للهيكل عظمي هو دورها في التنمية والنمو. تتطلب هذه العمليات تزامن السكان الخلوية المتعددة التي يتم تنظيمها من خلال الغدد الصماء ضيق والتحكم الجيني.

باستثناء عظام مسطحة مثل لوح الكتف، الجمجمة والقص، ويتكون الهيكل العظمي الثدييات من خلال عملية تعرف باسم التعظم غضروفي. هذه العملية، تنظم كل من جزيئيا ومكانيا، ويبدأ مع التكثيف من خلايا اللحمة المتوسطة المستمدة أساسا من الأديم المتوسط 2. تحت تأثير عامل SOX9 النسخ، والخلايا في الالبريد الداخلية من تكثفات تفرق في غضروفية، معربا عن وإفراز الغضروف المصفوفة خارج الخلية (ECM) مكونات محددة مثل النوع الثاني من الكولاجين وaggrecan. خلايا على هامش التكثيف، تعبر عن النوع الأول من الكولاجين وتشكيل سمحاق الغضروف، ترسيم العظام المحتملين 3. وفي وقت لاحق، وosteoprogenitors من سمحاق الغضروف تفرق في الخلايا بانية العظم، من إخراج التعبير عن عوامل النسخ، Runx2 وosterix 4. وهذا يؤدي إلى غلبة بانيات وتتم إعادة تسمية هذه الطبقة السمحاق الذي يشكل طوق عظمي المعادن في جميع أنحاء منتصف القسم من العظام. اختراق الأوعية الدموية في غشاء العظم وغزو السقالة الغضروفية يحدث تجلب معها، تستمد haematopoetically العظام resorbing الخلايا الآكلة، الذي يرتشف بقايا خلية غضروفية والكثير من مصفوفة الغضروفية 5. ملء الفراغات التي شكلتها osteoprogenitors مما أدى إلى التحجر الأساسيالمركز الذي يحتل تدريجيا جوهر diaphysis ويدمج مع السمحاق. خلايا أخرى تؤدي إلى نخاع العظام. حول الولادة، والأوعية الدموية وosteoprogenitors اختراق الغضروف مصفوفة الغنية في أي من الجانبين (الكردوس) من diaphysis النامية لتشكيل مركز التعظم الثانوي. تقع بين الكردوس وdiaphysis إما في نهاية العظام الطويلة هي الفرقة الغضروف - لوحة epiphyseal النمو - والتي هي المسؤولة عن تنسيق النمو الخطي من جميع العظام الطويلة (6).

غضروفية داخل لوحة النمو في البداية تتكاثر وتتطور في وقت لاحق من خلال مناطق متميزة شكليا، بتنسيق من التعبير متتابعة من عوامل النسخ والنمو. وتتويجا لهذه السلسلة من الأحداث هو الخروج من دورة الخلية وتضخم في غضروفية في وسط هذه السلائف الغضروف. غضروفية الضخامي تعبر بقوة نوع X الكولاجين والفلزي مصفوفة-13 (MMP13) والتي كبيرا توسيع حجم في اتجاه النمو الطولي تقدم أكبر مساهمة في نمو العظام في الثدييات 7،8. وعلاوة على ذلك، غضروفية الضخامي يتمعدن ECM المحيط بهم من خلال الافراج عن حويصلات مصفوفة، متخصصة غشاء يحدها هياكل لإنتاج فوسفات الكالسيوم غير المتبلور من خلال إدراجها من فوسفاتاز (الأنسجة غير محددة الفوسفاتيز القلوية (TNAP) وPHOSPHO1) والكالسيوم توجيه البروتينات (annexins ) 9-11. وغزت هذه الغضاريف متكلسة بواسطة الأوعية الدموية من نخاع الأساسي مما أدى إلى تجنيد ناقضة العظم وارتشاف المصفوفة. ويعقب ذلك الهجرة بناء العظم والمواءمة إلى السطح من بقايا الغضروف متكلسة حيث وضع طبقة من عظماني وهو المتمعدنة بسرعة. وتشكيلها العظام المنسوجة من الإسفنجي الأولية في وقت لاحق إلى العظام رقائقي من الإسفنجي الثانوية 12. النتائج الانصهار المشاشية فيوقف التحجر غضروفي 13.

التعظم داخل الغضروف تحت تنظيم محكم من قبل العديد من الغدد الصماء ونظير الصماوي الهرمونات وعوامل النمو وذلك لمنع تطوير بالانزعاج و / أو نمو العظام الطولية 14. فهم أفضل للآليات الجزيئية والخلوية التي تقوم عليها هذه العمليات وبالتالي من الضروري في سعينا لتحقيق التقدم السريرية نحو مصلحة الإنسان. وكانت دراسات سابقة إلى أوجه الشبه والاختلاف بين لوحات النمو من مختلف الأعمار والمواقع والأنواع قد تحسنت بشكل كبير من فهمنا للآليات الفيزيولوجية المحيطة ديناميات النمو لوحة 15،16. ومع ذلك، فإن دراسة غضروفية المعزولة صعبة، وإزالة غضروفية من بيئتهم يمكن أن يؤدي إلى فقد التمايز، يرافقه فقدان التعبير عن علامات رئيسية مثل Col2a1 17.

الماوس مشط القدم الجهاز ثقافة يزدرع، بيoneered البروفيسور إليزابيث برغر والزملاء في هولندا، هو خارج الجسم الحي نموذج الفسيولوجية للغاية لدراسة التحجر غضروفي ونمو العظام ومعدل نمو العظام في الثقافة تحاكي تلك التي شوهدت في الجسم الحي 18. فريد والثقافة الجهاز المشط يسمح للفحص غضروفية في مراحل مختلفة من الغضروف ويحافظ على خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة، وبالتالي توفير ظروف أقرب إلى الوضع في الجسم الحي من الخلايا في الثقافة 19-21. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج يسمح للفحص المباشر لنمو العظام الطولية والتي لم يكن ممكنا في الثقافات خلية غضروفية الأولية. كما يسمح لفصل العوامل النظامية والمحلية وبالتالي السماح لتحليل محدد للآثار المحلية على لوحة النمو.

ثقافة الأمشاط تتيح للتحقيق في العديد من المعلمات. القياسات اليومية من الطول الكلي والمناطق المعدنية لللا يمكن أن يؤديها اساسيات مع معيار المجهر مرحلة التباين وبرمجيات تحليل الصور. النسيجي، في التهجين وتلطيخ immunohistological يمكن أداؤها بسهولة على أقسام مشط القدم، والذي يسمح للقرار المكاني لكلا الكيانين الخلوية والجزيئية، وهي ميزة كبيرة على طرق زراعة الخلايا التقليدية. ويشمل النهج المناعى للكشف والقياس من 5 برومو-2'-deoxyuridine (BrdU) امتصاص المتكاثرة غضروفية 22. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم تنفيذ مزيد من المعالجة من الأنسجة مشط القدم للسماح لتحليل المصب التعبير مرنا (RT-QPCR) والبروتين وتحليل الخلايا الإشارات (النشاف الغربي) أو تكوين الدهون (مطياف الكتلة). معظم الدراسات حتى الآن استخدام الأمشاط الجنينية مثقف بدلا من الأمشاط من الحيوانات بعد الولادة. بينما كلا النموذجين يمكن أن يكون بالمعلومات، ودراسة العظام الجنينية لديها العديد من المزايا: أنها تنمو بشكل أسرع ويمكن أن تكون EXPLOited لدراسة بدء وتطور من 23-25 عملية تمعدن.

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل تشريح المعقد لالأمشاط الجنينية من أطرافهم هند من اليوم الجنينية 15 (E15) أجنة الفئران. وعلاوة على ذلك، يظهر النمو وتمعدن الأمشاط مميزة تشريحيا.

Protocol

أجريت الإجراءات التي تجرى على الحيوانات في الامتثال للحيوانات في المملكة المتحدة (الإجراءات العلمية) وأبقى قانون عام 1986، والحيوانات وفقا للوزارة الداخلية نشرت مدونة الممارسات للإسكان ورعاية الحيوانات ولدت، الموردة أو المستخدمة للأغراض العلمية.

ملاحظة: التجارب التي أجريت باستخدام النوع البري C57BL / 6J الفئران راسخة وهو موضح أدناه. الأمشاط الجنينية من سلالات مختلفة الماوس قد يكون بالمثل مثقف في المختبر، على الرغم من معدلات النمو وتمعدن بهم قد تختلف لتلك المفصلة هنا.

1. شروط تشريح وإعداد الأدوات

  1. أداء جميع إعداد وسائل الاعلام، والأنسجة تشريح والعمل والثقافة في غطاء تدفق الصفحي لضمان العقم وسائل الإعلام وأساسيات جنينية.
  2. سيتيح للثقافة وتشريح وسائل الإعلام لكي تتوازن لا يقل عن 1 ساعة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 حاضنة قبل استخدامها.
  3. تعقيم تشريحمقص، دومون # 5 و دومون # 4 ملاقط جنبا إلى جنب مع زوج من رقيق Vannas المقص الصغير (8 سم على التوالي، شفرات 3 مم) من خلال التعقيم. بعد التعقيم، تزج المعدات تشريح في الايثانول 70٪ قبل استخدامها.

2. إعداد تشريح والثقافة وسائل الإعلام

  1. إعداد المتوسطة تشريح
    1. تمييع وسائل الإعلام الأساسية α-الحد الأدنى (بدون نوكليوسدس، αMEM) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (01:13) و resuspend زلال المصل البقري (BSA) في 2 ملغ / م ل قبل فلتر تعقيم من خلال حقنة قطرها 0.22 ميكرون، 33 مم فلتر.
      ملاحظة: يمكن أن يتم المتوسطة تشريح، فلتر تعقيمها وتخزينها في aliquots في -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
  2. إعداد مستنبت
    1. الأمشاط ثقافة الجنينية في 300 ميكرولتر من مستنبت (في كل بئر من لوحة الثقافة 24 أيضا). إعداد مستنبت بإضافة 0.2٪ ث / ت جيش صرب البوسنة. 5 ميكروغرام / مل L-ASCOالفوسفات حمض rbic. 1 ملم β-سكرولي (βGP؛ اختياري - انظر القسم النتائج)؛ 0.05 ملغ / مل الجنتاميسين و 1.25 ميكروغرام الامفوتريسين إلى αMEM وتصفية تعقيم من خلال 0.22 ميكرون، 33 مم مرشح قطر حقنة.

3. الفئران الجنينية الأمشاط تشريح والثقافة

  1. اعدام الماوس حاملا أو إيواء أجنة عمرها 15 يوما، عن طريق خلع عنق الرحم وفقا للمبادئ التوجيهية زارة الداخلية في المملكة المتحدة
  2. وضع مستلق الحيوان وتطهير الجلد عن طريق الرش مع الايثانول 70٪. باستخدام مقص تشريح جعل شق كبير في خط الوسط، واختراق كل من الجلد والغشاء البريتوني لفضح تجويف البطن.
  3. تحديد قرون الرحم اثنين من الحيوانات في المنطقة الظهرية من تجويف الجسم. إزالة قرون الرحم عن طريق تحرير أولا كل الرحم من مسراق الرحم عن طريق شقوق دقيقة مع مقص تشريح ثم أخيرا قطع قرون الرحم مجانا في قاعدتهم. PLACقرون الرحم ه إلى المتوسطة تشريح.
  4. فصل كل الجنين عن طريق خفض بين المواقع زرع طول قرن الرحم وإزالة الأجنة من الحويصلات الفردية باستخدام ملقط. الأجنة إعدام بقطع الرأس وفقا للمبادئ التوجيهية زارة الداخلية في المملكة المتحدة
  5. بعد تطهير الجلد عن طريق الرش مع الايثانول 70٪، استخدم Vannas المقص الصغير لإزالة أطرافه الخلفية من الأجنة عن طريق عمل قطع في جميع أنحاء الفخذ القريبة. وهذا يضمن أكبر قدر من أطرافهم هند ممكن تتم إزالة. وضع أطرافه الخلفية في طبق بتري غارقة في المتوسط ​​تشريح قبل تشريح مشط القدم.
  6. تحت المجهر تشريح، والبدء في إزالة الجلد المحيطة القدم الجنينية، التي معسر وبجذبه باستخدام # 5 ملاقط حين عقد أطرافه الخلفية ثابتة باستخدام رقم 4 ملاقط. يتم تنفيذ هذا أكثر فعالية من خلال استيعاب الجلد حول مستوى من الساق وسحب نحو السلاميات. استخدام مقص في هذه المرحلة لقطعليس مطلوبا الجلد رقيقة جدا.
  7. عقد بعناية tarsals القدم الجنينية مع # 4 ملاقط وإزالة الأمشاط الأولى والخامسة عن طريق معسر قبالة بالقرب من tarsals باستخدام # 5 ملاقط وتجاهل.
  8. مع القدم الذي عقد في نفس الموقف، استخدم رقم 5 ملاقط لتعطيل الأنسجة الضامة بين الكتائب الثلاث المتبقية والأمشاط. إدراج غيض من # 5 ملاقط في المفصل بين السلاميات والأمشاط لإزالة السلاميات من الأمشاط.
  9. وأخيرا، استخدام # 5 ملاقط لتعطيل الأنسجة الضامة بين tarsals والأمشاط. وضع مرة أخرى غيض من # 5 ملاقط في الفضاء المشترك بين tarsals والأمشاط وبلطف حرة والأمشاط من tarsals.
  10. اختيار بلطف صعودا والأمشاط الآن مجانا مع رقم 4 ملاقط ومكان في المتوسطة تشريح جديدة.
    ملاحظة: تشريح دقيق وينبغي أن توفر 6 الأمشاط من كل جنين.
  11. عندما تم تشريح جميع الأمشاط المطلوبة، يتنبهLLY الأمشاط مكان بشكل فردي في 24 لوحات جيدا استعد مسبقا يحتوي على 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام الثقافة. الأمشاط الثقافة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة تصل إلى 14 يوما.
    ملاحظة: لا تغيير وسائل الإعلام من الثقافات E15 على الأقل حتى يوم 5 من الثقافة لأن هذا يؤثر على قدرة تمعدن من 26. أسباب ذلك غير واضحة ولكن النمو الخطي وتمعدن المصفوفة قد تكون تعتمد على التحفيز عن طريق عوامل النمو التي صدرت من الأمشاط.

4. تحليل والتلاعب الثقافات الأمشاط

  1. في يوم من تشريح (يوم 0) إجراء قياسات الطولية الأولية باستخدام المجهر مع كاميرا مثبتة وتحليل الصور البرمجيات الرقمية. قياس طول منطقة التمعدن المركزية عند ظهوره بعد أيام قليلة من الثقافة.
  2. بصفة دورية حسب الحاجة، تقديم مزيد من القياسات (عادة كل يوم 2 الثانية) حتى اليوم الأخير من ثقافة وعند هذه النقطة متتم معالجة العظام etatarsal تعتمد على النتائج المطلوبة (التي نوقشت في المقدمة).
  3. الملحق المتوسطة الثقافات مشط القدم الجهاز مع العوامل الخارجية المختلفة مثل عوامل النمو والهرمونات وكلاء الدوائية من يوم 0 الثقافة 22،24. في جميع الدراسات من هذا النوع، والسيطرة يطلب الأمشاط غير المعالجة.
    ملاحظة: على الرغم من أنه من المستحسن أن عظام السيطرة هي رديم ما يعادلها من الساق المقابل، لم تكن هناك أي اختلافات في النمو الخطي أو إمكانات تمعدن مثقف E15 الثانية3 و الأمشاط ال 4 (انظر أدناه، الشكل 2) .

Representative Results

وكان الهدف من هذا الأسلوب لعزل الأمشاط والثقافة لهم الجنينية لفحص نمو العظام الطولية وECM تمعدن. باستخدام بروتوكول لدينا الموصوفة هنا، تم تشريح العظام مشط القدم الجنينية بنجاح، كما تصور بواسطة المجهر الضوئي. قياسات عظام مشط القدم، أجرى كما هو مبين في الشكل رقم 1، وأظهرت قدرتها على النمو في طول طولي ويتمعدن ECM الخاصة بهم (أرقام 2 و 3). وأشارت تمعدن مصفوفة لأول مرة في منتصف diaphysis من رديم العظام ويلاحظ بسهولة بواسطة المجهر الضوئي. لا يلزم تلطيخ على الرغم من أن الإقبال على calcein قد تقدم التصور تعزيز المعدنية التي شكلت حديثا.

دراسات استخدام الأمشاط الجنينية حتى الآن 22،27،28 وتجميع تشريح الثانية3 و 4 تشرين (CENترال ثلاثة) الأمشاط، على افتراض نمو المختبر وتمعدن لتكون قابلة للمقارنة. المجراة التنموية من الأمشاط الفئران، ومع ذلك، يكشف عن أن 3 و 4 تشرين الأرقام لديها أدلة تمعدن قبل جميع الأمشاط والسلاميات 29 أخرى. تقييم إمكانات النمو وتمعدن معزولة بشكل فردي ومثقف E15 2 الثانية، كشفت 3 و الأمشاط ال 4 عدم وجود فروق كبيرة في المظهر أو مدى تمعدن بعد 7 أيام من ثقافة (الشكل 2). لم يوجد فرق في النسبة المئوية للزيادة من خط الأساس خلال الفترة الثقافة. كما لوحظ عدم وجود فروق في إمكانية تمعدن بروتوكول قياسي من تجميع 2 الثانية 3 و 4 تشرين الأمشاط يبدو صالحا للدراسات المستقبلية.

تقليديا، واضاف المحققين βGP إلى وسائل الإعلامتستخدم لثقافة الأمشاط الجنينية لتعزيز ECM تمعدن. ومع ذلك، في دراسات ثقافة الخلية، وقد تبين أنه إذا تم إضافة TNAP الإنزيم إلى وسائل الإعلام المكونة للعظم التي تحتوي على βGP، خارج الرحم ترسب المعادن هيدروكسيباتيت لا يزال يحدث حتى في حالة عدم وجود خلايا 30. لدراسة الآثار المترتبة على مختلف ركائز تمعدن ومنبهات على قدرة مشط القدم تمعدن، ونحن مثقف الأمشاط E15 في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على مجموعة من المكملات الغذائية، وسجلت الصور وقياسات طول يوميا. وأشارت النتائج إلى أن E15 عظام المشط لا تزال تنمو ويتمعدن ECM في غياب βGP. E15 عظام المشط مثقف في حامض الاسكوربيك فقط اظهرت وسائل اعلام زيادات مماثلة في طول وتمعدن كما مثقف الأمشاط بحضور βGP (الشكل 3).

لقد أظهرنا أيضا أن الفيروسة البطيئة يمكن أن تستخدم ل transfect الحمض النووي الخارجية في metata مثقفrsals. نحن هنا transfected بنجاح عظام مشط القدم يوم 0 الثقافة (أي يوم من تشريح) مع 2 × 10 6 الخضراء بروتين فلوري (GFP) جزيئات الفيروس في مشط القدم. لتمكين التنبيغ الفيروس، وأضيف polybrene في وقت واحد على الثقافات في 1: 500. تركت الثقافات لمدة 7 أيام، مع عدم وجود تغييرات وسائل الإعلام على النحو المطلوب لE15 مشط القدم تمعدن أن يحدث، قبل أن يتم تحضين مع 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) وصمة عار لمدة 5 دقائق ثم تصور مباشرة باستخدام المجهر متحد البؤر ( الشكل 4). لدينا دليل على التجارب مفهوم تظهر بوضوح تنبيغ فعال. ومع ذلك فإنه سيكون من الحكمة لدراسة الفروع في جميع أنحاء مجمل عظم مشط القدم لتقييم ترنسفكأيشن وفعال التلاعب الجيني على.

شكل 1
الشكل 1: المنهجية المعيارية المستخدمة لقياس ركان طول ومنطقة التعدين من الجنينية الأمشاط. (A) مجموع قياسات طول الأمشاط E15 يوم 0 الثقافة (يوم تشريح) التي اتخذت من خلال مركز مشط القدم. (ب) قياسات الطول الكلي الطولي في مشط القدم بعد سبعة أيام في الثقافة. لاحظ انحناء طفيف في مشط القدم. (ج) قياس طول منطقة التمعدن بعد سبعة أيام في الثقافة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: النمو والتعدين قدرات تشريحيا متميزة E15 الأمشاط التصوير وقياس 2، 3 والأمشاط 4TH من أطرافهم هند من E15 الفئران ث.كما يؤديها. (A) وصور المسلسل من 2، 3 والأمشاط 4TH طوال الفترة الثقافة. (ب) النسبة المئوية للزيادة في طول من يوم 0 في كل يوم من أيام الثقافة. (ج) طول المعدنية من 2، 3 والأمشاط 4TH خلال الفترة الثقافة كنسبة مئوية من إجمالي طول مشط القدم. يتم تمثيل البيانات في كما يعني خطأ ± المعياري للمتوسط ​​(SEM)، (ن = 6). (D) C57BL / 6J أطوال مشط القدم في كل يوم من أيام الثقافة. يتم تمثيل البيانات في كما يعني ± الانحراف المعياري (ن = 6). أسود شريط = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): النمو والتعدين قدرات البرية من نوعE15 الأمشاط مثقف في مختلف وسائل الإعلام المكونة للعظم. (A) وصور المسلسل من الأمشاط مثقف في حامض الاسكوربيك فقط، 1 ملم βGP، phosphocholine 3 ملم، 1.5 ملم كلوريد الكالسيوم أو 3 مم كلوريد الكالسيوم التي تحتوي على وسائل الاعلام. (ب) النسبة المئوية للزيادة في طول من يوم 0 من الأمشاط مثقف مع مختلف الملاحق. (ج) طول المعدنية من الأمشاط مثقف في وسائل الإعلام المختلفة كنسبة مئوية من إجمالي طول مشط القدم. تمثل البيانات يعني كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM)، (ن = 6). أسود شريط = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: ترنسفكأيشن من E15 الأمشاط مع GFP الفيروسات Pو transfected المواد. (A) E15 عظام المشط مع جزيئات الفيروس GFP لإثبات المفهوم. كانت ملطخة (ب) العظام مع دابي لتصور الحمض النووي. (C) وصور مزدوجة أشارت ترنسفكأيشن الناجح لفيروس GFP طوال مجمل عظام مشط القدم. أشرطة بيضاء = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

ثقافة الأمشاط الجنينية في الفئران يقدم نموذجا الفسيولوجية للغاية من النمو غضروفي وتمعدن. والتحقق من صحة الدراسات المبكرة التي E15 الأمشاط الماوس الخضوع لالنمط العادي للنمو الهيكل العظمي والتمايز. الغضروف (غضروفية) والعظام (بانيات والآكلة) الخلايا والمصفوفات الكولاجينية كل منهما لا يمكن تمييزها عن تلك التي لوحظت في الجسم الحي. ومع ذلك، هناك بعض القيود المعترف بها من هذا النموذج. هو ضعف سرعة التمايز ناقضة العظم كما هو نمو العظام (ولكن ليس الغضروف التمايز). نمو العظام أبطأ ما يقرب من 50٪ من تلك التي لوحظت في الجسم الحي، وربما يرجع ذلك إلى قصور في العوامل النظامية التي تؤثر على إنتاج عوامل محلية (على سبيل المثال، IGF-1، أفضل الممارسات الإدارية، وما إلى ذلك) (31). أيضا، فمن المسلم به أيضا أن العظام هي حساسة لبيئتها الميكانيكية وهذا هو الحال بالنسبة لالأمشاط مثقف، التي تستجيب لج أيضاhanges في 32،33 تحميل الميكانيكية. لذلك، في حالات المفرغة، كما هو موضح في هذا البروتوكول، تمعدن وارتشاف المعدنية يجوز المساس بها. ومع ذلك، فإن نموذج مشط القدم يوفر القدرة على قياس مباشرة نمو العظام الطولية والتي لم يكن ممكنا عبر 2D و 3D في نظم الاستزراع المختبر.

قدمنا وصفا شاملا لبروتوكول المشاركة في تشريح وثقافة E15 الأمشاط الفئران وبالفعل، للمرة الأولى، تأكد من صحة تجميع الثانية3 و 4 تشرين الأمشاط لإجراء التجارب.

يتم استخدام الأمشاط من E17 / E18 عادة للتحقيق في آليات نمو العظام نظرا لإمكاناتها غير عادية لتنمو خارج الجسم لفترات طويلة من الزمن (أي بعد 14 أيام في الثقافة). إنها نمط راسخة للتحقيق في دور عوامل النمو على نمو العظام الطولية الجنينية.بالإضافة إلى ذلك، تشريح وثقافة الأمشاط بعد الولادة ويعملون عادة لتحديد آليات المحيطة نمو العظام بعد الولادة كما أنه من المفهوم أن نمو العظام بعد الولادة ونمو العظام الجنين وينظم بشكل مختلف 21. نمو العظام التي لوحظت في الأمشاط بعد الولادة مثقف هو إلا أقل بكثير من تلك التي لوحظت في أساسيات جنينية 25،34، مما يحد من قدرتها في دراسات على المدى الطويل وتسليط الضوء على تأثير أكثر النظامية على نمو العظام في هذه المرحلة ما بعد الولادة. في الواقع، لمدة 3 أيام بعد الولادة الأمشاط القديمة من الفئران عادة ما تكون المرحلة الأخيرة التي يمكن استخدامها للحصول على 34 نمو قابلة للقياس.

نحن هنا وصف بروتوكول لدينا لعزل عظام مشط القدم الجنينية في E15. غياب المعدنية hydroxyapaptite في عظام مشط القدم E15 يعني أنها توفر نموذجا لا مثيل لها للتحقيق ليس فقط على آليات المحيطة نمو العظام الطولية، ولكن أيضا على بدءتمعدن الهيكل العظمي. المصفوفة المعدنية في المنطقة خلية غضروفية الضخامي المحطة توفر سقالة لغزو بانيات لوضع العظام مصفوفة محددة (عظمية) وهو المتمعدنة في وقت لاحق، وعلى هذا النحو هذا تمعدن أولي أمر حيوي لتكوين ناجح وظيفية العظام 35. في الواقع لقد أكدت عدد من التقارير الأخيرة استخدام الأمشاط E15 قدرتها الفريدة للتحقيق في 28،36،37 عملية تمعدن. وبالإضافة إلى ذلك، ووصف الباحثون استخدام الأمشاط E15 كنموذج للتكوين الأوعية الدموية 38، وتسليط الضوء على إمكانات الأمشاط الجنينية كنموذج خارج وضع العظام النمو / تمعدن.

البروتوكول وصفنا يتطلب سوى معدات المختبرات القياسية بما في ذلك غطاء الصفحي التدفق، ومجهر تشريح لأداء التشريح، وحاضنة CO 2 لثقافة اساسيات رفعه. وعلاوة على ذلك، طريق مسدود أساسية جداتلح تحتوي على المتوسط αMEM، BSA، والمضادات الحيوية، antimycotics وحمض L-الاسكوربيك (لكونه عامل مساعد في تركيب هيدروكسي وهيدروكسي ليزين، اثنين من الأحماض الأمينية الأساسية لإنتاج الكولاجين 39) الابتعاد عن استخدام المواد المضافة غير محددة، مثل الأمصال الحيوانية . تقليديا، واضاف المحققين βGP إلى وسائل الإعلام المستخدمة لثقافة الأمشاط الجنينية ولكن كما كشفت في نتائجنا، لا يلزم استخدام مصدر الفوسفات إضافية لتمعدن ناجحة في هذا النظام الثقافة. هذا اكتشاف مهم في سعينا لفهم الآليات التي تقوم عليها ECM تمعدن.

سبق إصابة الأمشاط مع الفيروسات الغدية التي تحتوي على الأشكال السائدة سلبية من Smad2 لاستكشاف دور عامل النمو المحول β في تنظيم نمو العظام الطويلة 40. هنا نحن تكشف أيضا عن ترنسفكأيشن ناجحة من النوع البري عظام مشط القدم E15 مع جزيئات الفيروس GFP، مشيرا ريمكن بسهولة اعتمدت تقنيات قبعة lentiviral للتلاعب التعبير الجيني في الثقافات مشط القدم. وبالمثل، فإن نظام الثقافة الجهاز مشط القدم هو نموذج ممتاز في لمقارنة نمو العظام من الفئران المعدلة وراثيا إلى فهم أفضل لدور جين معين في عملية نمو العظام. وقد استخدمت دراساتنا السابقة للنظام الثقافة الجهاز مشط القدم لتحديد دور القامع خلوى يشير 2 (SOCS2) في نمو العظام غضروفي. استخدام عظام المشط من الفئران من نقص في SOCS2، ونحن قد أظهرت أن هرمون النمو قادرة على محاكاة مستقلة نموها الطولي للأنسولين مثل عامل النمو (IGF-1)، على عكس النوع البري عظام مشط القدم التي لا تستجيب للهرمون النمو علاج 34، 41. هذا يسلط الضوء على مدى الثقافات مشط القدم يمكن التلاعب بها لدراسة آثار جينات مختلفة و / أو عوامل خارجية على نمو العظام غضروفي.

باختصار، لدينا التفصيلقاد طريقة لاستخراج ناجحة وثقافة عظام مشط القدم الجنينية التي يمكن التلاعب بها وفحصها باستخدام مجموعة متنوعة من التحليلات. يحافظ هذا فيفو السابقين نموذج خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة، وكذلك يحتوي على غضروفية في مراحل مختلفة من الغضروف، وبالتالي توفير نموذج أكثر الفسيولوجية من الخلايا في أحادي الطبقة أو الثقافة 3D. لذا مشط القدم الثقافات الجهاز هي نموذج فريد للتحقيق في الآليات الجزيئية المسؤولة عن التحجر غضروفي، وضرورية لزيادة فهمنا للعلم وظائف الأعضاء على حد سواء العظام والفيزيولوجيا المرضية

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection scissors World Precision Instruments 14393 Autoclave sterilise before use
Dumont #5 tweezers World Precision Instruments 500342 Autoclave sterilise before use
Dumont #4 tweezers World Precision Instruments 500339 Autoclave sterilise before use
SuperFine Vannas scissors World Precision Instruments 501778
Absolute ethanol Fisher Scientific E/0650DF/17 Dilute to 70% v/v in dH2O
α-MEM without nucleosides Thermo Fischer Scientific  22561021
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A3059
Syringe filters (0.22 μm) 33 mm diameter Merck Millipore SLGP033RS
Phosphocholine chloride calcium salt tetrahydrate Sigma Aldrich P0378 Add directly to the media prior to experimentation
L-ascorbic acid-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 Make up stock soution at 5mg/ml and aliquot at -20 °C
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080 Make up stock soution at 150mM and aliquot at -20 °C
β-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma Aldrich G9422 Make up stock soution at 1mM and aliquot at -20 °C
Gentamicin Thermo Fischer Scientific  15710049
Amphotericin B Thermo Fischer Scientific  15290018
Nunc cell-culture treated 24-well plates Thermo Fischer Scientific  142475
Polybrene Sigma Aldrich H9268
DAPI Thermo Fischer Scientific  D3571

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farquharson, C., Staines, K. The skeleton: no bones about it. J. Endocrinol. 211, 107-108 (2011).
  2. Berendsen, A. D., Olsen, B. R. Bone development. Bone. 80, 14-18 (2015).
  3. Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423, 332-336 (2003).
  4. Komori, T. Regulation of bone development and extracellular matrix protein genes by RUNX2. Cell Tissue Res. 339, 189-195 (2010).
  5. de Crombrugghe, B., Lefebvre, W. Regulatory mechanisms in the pathways of cartilage and bone formation. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 721-727 (2001).
  6. Hall, B. K. Bones and Cartilage: Developmental and Evolutionary Skeletal Biology. Elsevier Academic Press. (2005).
  7. Farquharson, C., Jefferies, D. Chondrocytes and longitudinal bone growth: The development of tibial dyschondroplasia. Poult. Sci. 79, 994-1004 (2000).
  8. Cooper, K. L., et al. Multiple phases of chondrocyte enlargement underlie differences in skeletal proportions. Nature. 495, 375-378 (2013).
  9. Wuthier, R. E., Lipscomb, G. F. Matrix vesicles: structure, composition, formation and function in calcification. Front. Biosci. 16, 2812 (2011).
  10. Roberts, S., Narisawa, S., Harmey, D., Millan, J. L., Farquharson, C. Functional involvement of PHOSPHO1 in matrix vesicle-mediated skeletal. J. Bone Miner. Res. 22, 617-627 (2007).
  11. Cui, L., Houston, D. A., Farquharson, C., MacRae, V. E. Characterisation of matrix vesicles in skeletal and soft tissue mineralisation. Bone. 87, 147-158 (2016).
  12. Brighton, C. T. Structure and Function of Growth Plate. Clin. Orthop. 22-32 (1978).
  13. Shim, K. S. Pubertal growth and epiphyseal fusion. Annals of pediatric endocrinology & metabolism. 20, 8-12 (2015).
  14. Staines, K. A., Pollard, A. S., McGonnell, I. M., Farquharson, C., Pitsillides, A. A. Cartilage to bone transitions in health and disease. J. Endocrinol. 219, R1-R12 (2013).
  15. Hunziker, E. B., Schenk, R. K., Cruzorive, L. M. Quantitation of Chondrocyte Performance in Growth-Plate Cartilage During Longitudinal Bone-Growth. Journal of Bone and Joint Surgery-American. 69A, 162-173 (1987).
  16. Breur, G. J., Vanenkevort, B. A., Farnum, C. E., Wilsman, N. J. Linear Relationship Between The Volume Of Hypertrophic Chondrocytes And The Rate Of Longitudinal Bone-Growth In Growth Plates. J. Orthop. Res. 9, 348-359 (1991).
  17. Ma, B., et al. Gene expression profiling of dedifferentiated human articular chondrocytes in monolayer culture. Osteoarthritis Cartilage. 21, 599-603 (2013).
  18. Thesingh, C. W., Burger, E. H. The role of mesenchyme in embryonic long bones as early deposition site for osteoclast progenitor cells. Dev. Biol. 95, 429-438 (1983).
  19. Scheven, B. A., Hamilton, N. J. Longitudinal bone growth in vitro: effects of insulin-like growth factor I and growth hormone. Acta endocrinologica. 124, 602-607 (1991).
  20. Coxam, V., Miller, M. A., Bowman, M. B., Miller, S. C. Ontogenesis of IGF regulation of longitudinal bone growth in rat metatarsal rudiments cultured in serum-free medium. Archives of physiology and biochemistry. 104, 173-179 (1996).
  21. Andrade, A. C., Chrysis, D., Audi, L., Nilsson, O. Methods to study cartilage and bone development. Endocr Dev. 21, 52-66 (2011).
  22. Mushtaq, T., Bijman, P., Ahmed, S. F., Farquharson, C. Insulin-like growth factor-I augments chondrocyte hypertrophy and reverses glucocorticoid-mediated growth retardation in fetal mice metatarsal cultures. Endocrinology. 145, 2478-2486 (2004).
  23. Owen, H. C., Miner, J. N., Ahmed, S. F., Farquharson, C. The growth plate sparing effects of the selective glucocorticoid receptor modulator, AL-438. Mol. Cell. Endocrinol. 264, 164-170 (2007).
  24. MacRae, V. E., Farquharson, C., Ahmed, S. F. The restricted potential for recovery of growth plate chondrogenesis and longitudinal bone growth following exposure to pro-inflammatory cytokines. J. Endocrinol. 189, 319-328 (2006).
  25. Chagin, A. S., Karimian, E., Sundstrom, K., Eriksson, E., Savendahl, L. Catch-up growth after dexamethasone withdrawal occurs in cultured postnatal rat metatarsal bones. J. Endocrinol. 204, 21-29 (2010).
  26. Haaijman, A., et al. Inhibition of terminal chondrocyte differentiation by bone morphogenetic protein 7 (OP-1) in vitro depends on the periarticular region but is independent of parathyroid hormone-related peptide. Bone. 25, 397-404 (1999).
  27. Haaijman, A., Dsouza, R. N., Bronckers, A., Goei, S. W., Burger, E. H. OP-1 (BMP-7) affects mRNA expression of type 1, II, X collagen, and matrix Gla protein in ossifying long bones in vitro. J. Bone Miner. Res. 12, 1815-1823 (1997).
  28. Staines, K. A., et al. MEPE is a novel regulator of growth plate cartilage mineralization. Bone. 51, 418-430 (2012).
  29. Kaufman, M. The atlas of mouse development. 3, Academic Press. (1992).
  30. Boskey, A. L., Roy, R. Cell Culture Systems for Studies of Bone and Tooth Mineralization. Chem. Rev. 108, 4716-4733 (2008).
  31. Minkin, C., et al. Skeletal development and formation of osteoclast-like cells from in situ progenitors in fetal mouse metatarsals cultured in chemically defined. Bone Miner. 12, 141-155 (1991).
  32. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Burger, E. H. Increased calcification of growth plate cartilage as a result of compressive force in vitro. Arthritis Rheum. 29, 1002-1009 (1986).
  33. Kleinnulend, J., Veldhuijzen, J. P., Vanstrien, M. E., Dejong, M., Burger, E. H. Inhibition of osteoclastic bone-resorption by mechanical stimulation in vitro. Arthritis Rheum. 33, 66-72 (1990).
  34. Dobie, R., et al. Increased linear bone growth by GH in the absence of SOCS2 is independent of IGF-1. J. Cell. Physiol. 230, 2796-2806 (2015).
  35. Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. Insulin-like growth factor 1 receptor (IGF1R) signaling regulates osterix expression and cartilage matrix mineralization during endochondral ossification. Bone. 83, 48-57 (2016).
  36. Huesa, C., et al. The functional co-operativity of tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) and PHOSPHO1 during initiation of skeletal mineralization. Biochemistry and Biophysics Reports. 4, 196-201 (2015).
  37. Staines, K. A., et al. Endochondral Growth Defect and Deployment of Transient Chondrocyte Behaviors Underlie Osteoarthritis Onset in a Natural Murine Model. Arthritis & Rheumatology. 68, 880-891 (2016).
  38. Song, W., et al. The fetal mouse metatarsal bone explant as a model of angiogenesis. Nature Protocols. 10, 1459-1473 (2015).
  39. Libby, P., Aikawa, M. Vitamin C, collagen, and cracks in the plaque. Circulation. 105, 1396-1398 (2002).
  40. Alvarez, J., Serra, R. Unique and redundant roles of Smad3 in TGF-beta-mediated regulation of long bone development in organ culture. Dev. Dyn. 230, 685-699 (2004).
  41. Pass, C., MacRae, V. E., Huesa, C., Ahmed, S. F., Farquharson, C. SOCS2 is the critical regulator of GH action in murine growth plate chondrogenesis. J. Bone Miner. Res. 27, 1055-1066 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics