ट्यूमर के Intravital माइक्रोस्कोपी-संबद्ध Vasculature ट्रांसजेनिक फ्लोरोसेंट चूहों पर उंनत पृष्ठीय Skinfold खिड़की कक्षों का उपयोग

Medicine
 

Summary

इस प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक सेल विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त चूहों के intravital इमेजिंग का वर्णन । Intravital इमेजिंग प्रक्रियाओं के सूक्ष्म दृश्य संभव है जो प्रत्यारोपित खिड़कियों का उपयोग कर जानवरों के रहने में उच्च संकल्प टिप्पणियों के लिए एक गैर इनवेसिव विधि प्रदान करता है । इस विधि अनुदैर्ध्य प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है ।

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Seynhaeve, A. L., ten Hagen, T. L. Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice. J. Vis. Exp. (131), e55115, doi:10.3791/55115 (2018).

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Abstract

ट्यूमर और ट्यूमर पोत विकास, साथ ही चिकित्सीय चिकित्सा के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया, अत्यधिक गतिशील जैविक प्रक्रिया कर रहे हैं । प्रोटोकॉल स्थिर जानकारी प्रदान करता है और अक्सर एक सही व्याख्या के लिए पर्याप्त नहीं है । Intravital मूल्यांकन, जिसमें एक प्रक्रिया के समय में पालन किया जाता है, अतिरिक्त और अक्सर अप्रत्याशित जानकारी प्रदान करता है । सेल विशिष्ट मार्करों और लाइव सेल अनुरेखकों, इमेजिंग उपकरणों के लिए सुधार, और कई इमेजिंग मंडलों के विकास, intravital माइक्रोस्कोपी बेहतर समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गया है व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों के निर्माण के साथ जैविक प्रक्रियाओं । इस कागज ट्यूमर पोत विकास की जांच के लिए एक प्रायोगिक डिजाइन का वर्णन और उपचारात्मक प्रभाव के एक स्थानिक और लौकिक तरीके से । इस सेटअप का उपयोग करना, पोत विकास के चरण, टिप सेल और लुमेन गठन, रक्त प्रवाह, extravasation, एक की स्थापना की संवहनी बिस्तर, और संवहनी विनाश कल्पना और पीछा किया जा सकता है । इसके अलावा, चिकित्सीय प्रभाव, intratumoral भाग्य, और कीमोथेरेपी यौगिकों के स्थानीयकरण भी पीछा किया जा सकता है ।

Introduction

जबकि इन विट्रो में अध्ययन प्रक्रियाओं के उच्च संकल्प काइनेटिक इमेजिंग सक्षम करें, इन विट्रो प्रयोग उचित संदर्भ में मूल्यांकन सक्षम नहीं है । उदाहरण के लिए, एक ट्यूमर के अंदर stromal डिब्बों या दवा वितरण और वितरण के साथ ट्यूमर कोशिकाओं की बातचीत एक संस्कृति की थाली में अध्ययन नहीं किया जा सकता है । पशु मॉडल इसलिए मानव शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति की नकल करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । हालांकि, प्रक्रियाओं की अनुदैर्ध्य इमेजिंग, विशेष रूप से एक सेलुलर संकल्प पर, चुनौतीपूर्ण है । आणविक इमेजिंग तरीकों, जैसे चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई), एकल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT), और पोजीट्रान उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी), अच्छी पैठ गहराई है, लेकिन अभाव संकल्प या संरचनात्मक संरचनाओं वर्णन करने के लिए असफल । ऑप्टिकल इमेजिंग उच्च संकल्प प्रदान करता है और संरचनाओं के इमेजिंग सक्षम बनाता है, लेकिन यह ंयूनतम प्रवेश के लिए गरीब के साथ है1। इस तरह के एक पृष्ठीय skinfold या उदर खिड़की के रूप में खिड़की चैंबर प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन में intravital माइक्रोस्कोपी के आवेदन, vivo2,3,4 मेंउच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. यह तकनीक विशिष्ट लाभ है, के रूप में यह घंटे और भी दिन पर अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए अनुमति देता है, उचित संदर्भ में प्रक्रियाओं की इमेजिंग के लिए (जैसे, कक्ष-छवि ऊतक में सेल बातचीत), और प्रस्तावों के लिए ऑप्टिकल सीमा पर उंनत फोकल और multiphoton सूक्ष्मदर्शी ।

सेल के साथ ट्रांसजेनिक जानवरों की शुरूआत-या प्रोटीन विशेष फ्लोरोसेंट लेबल vivo में और पूर्व vivo प्रयोगों के लिए संभावनाओं के ढेर सारे खोलता है । उदाहरण के लिए, सेल सेल बातचीत, प्रोटीन के उत्पादन, और हेरफेर या चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया इन मॉडलों का उपयोग vivo में अध्ययन किया जा सकता है5,6,7,8। महत्वपूर्ण बात, स्थान और समय में स्थिति उचित इमेजिंग उपकरण और पद्धति के साथ निर्धारित किया जा सकता है । यहां, एक संशोधित पृष्ठीय skinfold खिड़की चैंबर में प्रत्यारोपित ट्यूमर में इंजेक्शन एजेंटों के साथ संयोजन में एक endothelial मार्कर व्यक्त पशुओं की intravital माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत की है ।

Protocol

सभी पशु प्रयोगों डच कानून के अनुसार किया गया था, और प्रोटोकॉल इरास्मस MC, रॉटरडैम, नीदरलैंड के पशु प्रयोग की समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे ।

1. प्राप्तकर्ता माउस

  1. जब ट्रांसजेनिक चूहों पैदा होते हैं, मानक प्रक्रियाओं का उपयोग कर उपयुक्त जीनोटाइप के लिए जानवरों को स्क्रीन9.
    नोट: इस पांडुलिपि में, एक eNOStag-GFP लाइन9 विकसित से घर में और एक खरीदा रोजा-mTmG (शेयर ००७६७६)10 लाइन प्रस्तुत कर रहे है से प्राप्त आंकड़ों ।
  2. उन चूहों का उपयोग करें जो १२ सप्ताह पुराने या पुराने हों और जो २० ग्राम से ऊपर हों.

2. दाता माउस

नोट: पृष्ठीय विंडो में आरोपण के लिए एक ट्यूमर टुकड़ा एक गैर ट्रांसजेनिक दाता जानवर से प्राप्त की है । ट्यूमर के प्रकार पर निर्भर करता है, सामान्य (syngeneic ट्यूमर के साथ) या immunodeficient (xenografts) चूहों का उपयोग किया जाता है.

  1. ३७ ° c और 5% सह पर संस्कृति कुप्पी में उचित पूरक के साथ एक माध्यम में ट्यूमर कोशिकाओं को विकसित2
  2. सेल कुप्पी से मध्यम निकालें, 1x पंजाबियों के साथ एक बार धो, और ०.२५% trypsin का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग ।
  3. सेल कल्चर मीडियम को जोड़कर trypsin को निष्क्रिय करें । कोशिकाओं को इकट्ठा, 5 मिनट के लिए १,२०० x g पर नीचे स्पिन, और पंजाब के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
  4. trypan नीले रंग के 20 µ एल के साथ सेल सस्पेंशन के 20 µ l को पतला करें, जो मृत कोशिकाओं को दाग लगा है । एक hemocytometer का उपयोग कर रहने वाले और मृत कोशिकाओं की संख्या गिनती; मृत कोशिकाओं की संख्या 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए ।
  5. 5 मिनट के लिए १,२०० x जी में फिर से कोशिकाओं स्पिन और बर्फ में सेल गोली reसस्पेंड-शीत पंजाब, १०० µ प्रति १,०००,००० कोशिकाओं उपज एल. ऑपरेटिंग कमरे के लिए बर्फ पर कोशिकाओं परिवहन ।
  6. isoflurane/O2का उपयोग करते हुए पशु Anesthetize । ऑक्सीजन पर बारी और ०.५ मिलीलीटर/मिनट के लिए प्रवाह समायोजित isoflurane vaporizer 3% करने के लिए समायोजित करें । कुछ ही मिनटों के बाद, संज्ञाहरण कक्ष में माउस जगह है ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कक्ष को भरना यह तनाव को कम करने के लिए उपयोग के लिए तैयार है ।
  7. जब माउस बेहोश है, ऑपरेटिंग हीटिंग तालिका के लिए पशु लाने, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा, और संज्ञाहरण नाक शंकु में थूथन जगह है ।
    1. नोट: पशु ठीक से जब एक footpad चुटकी के लिए कोई प्रतिक्रिया नोट किया है बेहोश है ।
  8. बेहतर इंजेक्शन साइट कल्पना करने के लिए माउस दाढ़ी । एक ०.५ मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज का उपयोग लगाना; कोशिकाओं के १०० µ एल सुई माउस के पार्श्व में और एक ट्यूमर को विकसित करने की अनुमति ।
  9. अपने संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के रूप में संज्ञाहरण के तहत गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा पशु Euthanize ।  माइक्रो कैंची और संदंश का प्रयोग, ट्यूमर के स्थान पर त्वचा को खोलने में कटौती और ट्यूमर टुकड़े । पंजाबियों के साथ एक पेट्री डिश में ट्यूमर रखो । माइक्रो कैंची और संदंश का उपयोग करना, ट्यूमर लगभग 1 मिमी3 (चित्र 1a-a) के टुकड़ों में काट.
    नोट: दाता माउस का ट्यूमर पर्याप्त सामग्री देने के लिए काफी बड़ा होना चाहिए, लेकिन बड़े, गल चुके ट्यूमर से बचना चाहिए । सबसे ट्यूमर के लिए, 10 मिमी पर्याप्त की एक औसत व्यास ।

3. विंडो चैंबर का आरोपण

  1. रोकनेवाला शर्तों के तहत सभी कार्यविधियों को निष्पादित करें । सर्जिकल इंस्ट्रूमेंट्स (फिगर 1a) और चेंबर सामग्री (फिगर 1b) को आटोक्लेव ।
    नोट: खिड़की कक्ष यहां इस्तेमाल किया, १.१ जी की कुल वजन के साथ, polyether ईथर कीटोंन (तिरछी नज़र), एक प्रकाश, सिंथेटिक सामग्री है कि एमआरआई संगत है से बना है । तिरछी नज़र है ३.४-टाइटेनियम, जो आमतौर पर इन खिड़कियों के लिए साहित्य में प्रयोग किया जाता है की तुलना में हल्का गुना । यह सबसे रसायनों के लिए प्रतिरोधी है, निष्क्रिय है, प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भड़काने नहीं है, और मजबूत है । इस विंडो भी डिजाइन में पहले प्रकाशित खिड़कियों की तुलना में छोटा है । इस विंडो के साथ लगे चूहों गति की पूरी क्षमता दिखाने के लिए, चढ़ाई कर सकते हैं, और एक खिड़की चैंबर के बिना चूहों को वजन तुलना. क्योंकि जानवर खिड़की पर काट सकते हैं, सिंथेटिक खिड़कियां टाइटेनियम खिड़कियों की तुलना में एक छोटे से कम पिछले सकता है; हालांकि, वे बनाने के लिए आसान कर रहे है और सस्ती कर रहे हैं । इन विशेष खिड़कियों में घर बना रहे है और अनुरोध पर प्राप्त किया जा सकता है ।
  2. प्राप्तकर्ता का उपयोग कर माउस को सांस लेना निश्चेतक (यानी, एक संज्ञाहरण कक्ष में isoflurane/ गर्म ऑपरेटिंग ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा मेज पर माउस लाओ और संज्ञाहरण नाक शंकु में थूथन जगह (२.६ कदम देखें) । सूखापन से बचने के लिए आई ऑइंटमेंट लागू करें ।
  3. बालों को शेव करके और हेयर रिमूवल जेल लगाने से पूरी पीठ से बालों को हटा दें । ध्यान रखें कि सभी जेल हाथ धोने के साथ ध्यान से जानवर को गर्म नल के पानी से निकाल दिया जाता है । पशु सूखी और ७०% इथेनॉल के साथ त्वचा साफ ।
    नोट: शेविंग प्रक्रिया भी खिड़की आरोपण से पहले दिन किया जा सकता है । क्रीम हाथ गर्म पानी के साथ अच्छी तरह से हटा दिया जाना चाहिए के रूप में इस त्वचा जलन पैदा कर सकता है ।
  4. मार्क एक मार्कर के साथ माउस रीढ़ की हड्डी पर केंद्र लाइन चैंबर के सममित स्थिति सुनिश्चित करने के लिए । माउस की स्थिति, एक तह की स्थिति के रूप में केंद्र लाइन का उपयोग कर एक प्रालंब में त्वचा खींच, और प्रालंब के बीच समझ । स्थिति खिड़की है कि इस तरह के फ्रेम के ऊपर केंद्र रेखा से नीचे 2 मिमी है और एक मार्कर के साथ त्वचा पर खिड़की दृश्य क्षेत्र सर्कल ।
  5. 15 और माइक्रो कैंची के एक स्केलपेल धारक/ब्लेड आकार का उपयोग कर, खींचा परिपत्र लाइन के साथ त्वचा को हटा दें । अंतर्निहित प्रावरणी को क्षति न हो इसके लिए सावधान रहें ।
    नोट: यह कक्ष जिसमें ट्यूमर प्रत्यारोपण है की विंडो दृश्य क्षेत्र बनाता है ।
  6. skinfold ऊपर खींचो और त्वचा के माध्यम से व्यास में छेद 1 मिमी पंच करने के लिए एक कान पंच का उपयोग, दृश्य क्षेत्र के दोनों ओर से एक (आंकड़ा 1a-बी).
    नोट: इन दो बोल्ट के लिए खिड़की के फ्रेम को एक साथ ठीक करने के लिए छेद कर रहे हैं ।
  7. बोल्ट (आंकड़े 1b-a, 1b-c) का उपयोग कर कस्टम-निर्मित फ्रंट चैंबर फ़्रेम प्लेस और बोल्ट पर वापस फ्रेम (चित्र 1b-b) स्थिति । जगह नट (चित्रा 1b-d) बोल्ट पर वापस फ्रेम में ।
    नोट: इन बोल्ट skinfold के खिलाफ एक साथ कक्षों को ठीक करने के लिए उपयोग किया जाता है और बाद में माइक्रोस्कोप के तहत मूल्यांकन के दौरान चैंबर स्थिर करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  8. त्वचा फ्रेम के ऊपर से 2-3 मिमी खींचो और सुनिश्चित करें कि प्रत्यारोपण खिड़की देखने के क्षेत्र चैंबर क्षेत्र से मेल खाता है । फ्रेम के शीर्ष पर दो छोटे टांका छेद (आंकड़ा 1b, काला तीर) के माध्यम से 23 जी सुई प्लेस. एक माइक्रो पेचकश के साथ बोल्ट पर नट कस (चित्र 1a-c) और पागल को स्थिर करने के लिए एक clamping सुई धारक ।
    नोट: त्वचा बोल्ट के आसपास नहीं बारी है, और बहुत ज्यादा कस नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानियों ले लो ।
  9. त्वचा के खिलाफ फ्रेम को ठीक करने के लिए, शीर्ष पर शुरू, टांके के साथ सुई बदलें । इस फ्रेम में टांका छेद (चित्रा 1b, सफेद तीर) के 5 जोड़े के लिए यह मत करो ।
  10. विंडो चैंबर की पीठ प्रकट करने के लिए माउस को चालू करें । 10 मिमी के व्यास के साथ भराव कांच का एक मोटा टुकड़ा प्लेस और ०.५५ mm (आंकड़ा 1b-e) की मोटाई और फिर 12 मिमी (चित्रा 1b-f) के एक मानक कवर ग्लास । पीछे चैंबर क्षेत्र में एक बनाए रखने की अंगूठी (चित्र 1b-जी) के साथ इन सुरक्षित ।
    नोट: भराव गिलास अंतरिक्ष प्रावरणी और खिड़की के बीच सामने की ओर है, जो इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है के बीच खोलने के लिए रोकता है ।
  11. विंडो देखें क्षेत्र में जो ट्यूमर बाँझ ०.९% NaCl के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरने के द्वारा डाला जाएगा हाइड्रेट । कुछ बूंदें इस दृश्य क्षेत्र पर गिर करने की अनुमति दें । एक बाँझ कपास टिप के साथ अतिरिक्त खारा निकालें ।
  12. प्रावरणी में, एक पॉकेट 1 मिमी3 ट्यूमर टुकड़ा पकड़ करने के लिए काफी बड़े (चित्र 1a-a) अपने टिप के साथ एक 25 ग्राम सुई का उपयोग कर एक ९० ° कोण (आंकड़ा 1a-d) पर आमादा है । एक सुई धारक या केली संदंश का उपयोग करना, इस जेब में प्रत्यारोपण खिड़की देखने के क्षेत्र के बीच में ट्यूमर टुकड़ा डालें ।
  13. 12 मिमी और एक बनाए रखने की अंगूठी के एक मानक कवर ग्लास के साथ विंडो दृश्य क्षेत्र को बंद करें ।
    नोट: एक हवा बुलबुला फार्म कर सकते हैं, लेकिन यह घंटे के भीतर गायब हो जाएगा ।

4. पशु की देखभाल के पूर्व और बाद में

  1. दर्द से राहत के लिए दवाओं प्रशासन (यानी, ०.०५ मिलीग्राम/buprenorphine) के रूप में अपने संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित । एक हीटिंग लैंप के तहत संज्ञाहरण से उबरने के लिए माउस की अनुमति दें ।
  2. प्लेस खिड़की-एक पिंजरे में व्यक्तिगत चूहों और एक जलवायु में ३२ डिग्री सेल्सियस और ५०% आर्द्रता से ऊपर सेट कमरे नियंत्रित । सुनिश्चित करें कि पानी की बोतलें उंहें पिंजरे पर रखने के लिए रिसाव को रोकने से पहले पर्यावरण के तापमान पर हैं । उपयोग पिंजरों और संवर्धन कि अबाधित आंदोलन और भोजन और पानी के लिए उपयोग की अनुमति ।
    नोट: इस विंडो चैंबर बहुत अच्छी तरह से सहन कर रहा है के रूप में, चूहों सामान्य व्यवहार दिखा. व्यक्तिगत आवास खिड़की अंय चूहों की वजह से चैंबर को नुकसान से बचाता है, और उच्च तापमान/आर्द्रता skinfold के ठंडा नीचे और निर्जलीकरण रोकता है ।
  3. चबाने-बंद टांके, ढीला बोल्ट/नट, या टूटे हुए कवर ग्लास के लिए नियमित रूप से माउस की जांच करें । तुरंत मरंमत और बदलें जब ऐसा होता है । एक प्रकाश सामग्री का बना कवर खिड़की की रक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

5. Intravital इमेजिंग

नोट: इस प्रक्रिया में, एक multiphoton माइक्रोस्कोप और उचित नियंत्रण सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है. यहां, सूक्ष्मदर्शी के साथ प्रदान किए गए सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग किया जाता है । प्रिंसिपल में, किसी भी सॉफ्टवेयर पैकेज है कि एक खुर्दबीन के साथ आता है और माइक्रोस्कोप नियंत्रण के लिए और छवियों का कब्जा इस प्रयोजन के लिए सूट होगा के लिए है ।

  1. सिस्टम पर स्विच करें: पीसी/माइक्रोस्कोप, पावर टू फोकल कंट्रोल यूनिट, लेजर पावर, और लेजर उत्सर्जन । उदाहरण के लिए, इस सॉफ़्टवेयर के साथ, सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और माइक्रोस्कोप तालिका (आरेख 1E-a और 1E-c) पर क्लिक करके "प्रारंभ तालिका." प्रारंभ सिस्टम पर स्विच और पीसी माइक्रोस्कोप, xy-तालिका, जेड-स्थिति, और छवि पर कब्जा को नियंत्रित करने के लिए सक्षम करने के लिए मोड सेट ।
  2. फ्लोरोसेंट लाइट (फिगर 1E-बी) पर स्विच करें ।
    नोट: यह उज्ज्वल क्षेत्र के साथ एक साथ नेत्र के माध्यम से प्रतिदीप्ति छवियों का मूल्यांकन किया जाता है ।
  3. ३७ ° c पर सेट कस्टम-निर्मित, तापमान-नियंत्रित मंच (चित्रा 1C-c; अधिक विस्तार में चर्चा में वर्णित) पर स्विच करें ।
  4. isoflurane/O2 (चित्र 1E-d) का उपयोग कर संज्ञाहरण इकाई पर स्विच । माइक्रोस्कोप स्टेज (चित्रा 1C-ई) पर संज्ञाहरण ट्यूब माउंट. xy-स्टेज पर एक दबाना स्थापित संज्ञाहरण थूथन टुकड़ा को ठीक करने के लिए ।
  5. ट्यूमर पोत विकास के चरण स्थापित करने के लिए पशु का पूर्व मूल्यांकन; यह ट्यूमर के विकास की गति पर निर्भर करता है, लेकिन यह व्यक्तिगत चूहों के बीच भिन्न हो सकते हैं.
    1. एक संज्ञाहरण चैंबर में सांस लेना निश्चेतक (isoflurane/ओ2) का उपयोग कर माउस को बेहोश (२.६ कदम देखें) ।
    2. माइक्रोस्कोप मंच पर घुड़सवार तापमान नियंत्रित मंच पर पशु प्लेस; यह anesthetized होने पर पशु के कूलिंग डाउन को रोकता है । सुनिश्चित करें कि माउस के थूथन संज्ञाहरण शंकु में स्थित है और आंख मरहम लागू अगर मूल्यांकन 5 मिनट से अधिक समय लगेगा ।
      नोट: एक मूल्यांकन के लिए 1 से अधिक लंबा h, isoflurane प्रवाह को कम करने के लिए 2%.
    3. चैंबर बोल्ट (चित्रा 1C-बी, पूर्ण तीर) एक कस्टम निर्मित चैंबर धारक (चित्रा 1C-ए) पर चैंबर को ठीक करने के लिए उपयोग करें । पेंच इस धारक (चित्रा 1C-डी, धराशायी तीर) को गरम मंच (चित्रा 1C-सी) ।
      नोट: इस संयोजन खिड़की दृश्य क्षेत्र में आंदोलन कलाकृतियों को रोकता है, जबकि अभी भी जानवर स्वतंत्र रूप से सांस लेने के लिए अनुमति देता है ।
    4. एक कपास टिप के साथ खिड़की देखने के क्षेत्र के गिलास साफ करने के लिए एक धुंधला छवि और शीशे के बाहर पर मलबे से आ रही हस्तक्षेप को रोकने के लिए पानी में डूबा सुनिश्चित करें । माइक्रोस्कोप स्टेज (चित्रा 1 d) पर मंच और माउस रखें ।
      नोट: ध्यान रखना है कि पूंछ मंच और माइक्रोस्कोप मंच के बीच अटक नहीं मिलता है ।
    5. नेत्रहीन एक 10x उद्देश्य लेंस का उपयोग कर ट्यूमर पोत विकास के चरण की जांच, उज्ज्वल क्षेत्र, और फ्लोरोसेंट रोशनी ।
      नोट: फ्लोरोसेंट वाहिकाओं ध्यान में होना चाहिए और रक्त के प्रवाह उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग कर दिखाई जानी चाहिए । जब vasculature स्पष्ट रूप से देखा है, ट्यूमर पोत विकास के चरण का मूल्यांकन । उदाहरण के लिए, निर्धारित करें कि क्या टिप कोशिकाओं या दवा वितरण के लिए एक पहले से ही स्थापित vasculature के विकास के साथ जल्दी-शुरुआत angiogenesis है । एक ही जानवर फिर से मूल्यांकन किया जा सकता है, और ट्यूमर के विकास के रूप में एक सतत प्रक्रिया है । कई चरणों में एक ही समय में एक ही ट्यूमर में देखा जा सकता है ।
      1. जब यह vasculature पर ध्यान केंद्रित करने के लिए संभव नहीं है, मंच से पशु को दूर, माउस को ठीक होने दें, और एक जलवायु नियंत्रित अंतरिक्ष में पशु वापस जगह है । बाद में इसे दोबारा जांचें । जब माउस के मूल्यांकन के लिए तैयार है, नीचे वर्णित प्रक्रिया के साथ जारी है ।
  6. "लेजर" और "Ctrl पैनल" विंयास टैब में क्लिक करके फोकल पराबैंगनीकिरण और नियंत्रण कक्ष पर स्विच
    नोट: यह लेजर शक्ति कम सेट करने के लिए सिफारिश की है, विशेष रूप से आर्गन लेजर के लिए, ब्लीच को रोकने के लिए, ऊतक के हीटिंग, और धूप. नियंत्रण कक्ष व्यक्तिगत वरीयताओं के लिए सेट किया जा सकता है । एकाधिक fluorophores का उपयोग intravital इमेजिंग के लिए यह निम्नलिखित सेटिंग्स लागू करने के लिए सिफारिश की है: "स्मार्ट लाभ, १०० वी प्रति बारी," "स्मार्ट ऑफसेट, बारी प्रति 10%," "ज़ूम, मध्यम," "एक्स स्थिति, मध्यम," "Y स्थिति, मध्यम," और "जेड स्थिति, बारी प्रति १०० µm." इमेजिंग से पहले, ऑफसेट समायोजित करने के लिए शोर को कम करने और संकेत करने वाली शोर अनुपात का अनुकूलन । फोकल ज़ूम समारोह उद्देश्य लेंस को बदलने के बिना एक उच्च आवर्धन के लिए अनुमति देता है । X, Y, और Z नियंत्रण हित के फ़ील्ड्स का पता लगाने के लिए आवश्यक है । intravital माइक्रोस्कोपी के लिए, जेड-स्थिति के बारे में १०० µm प्रति बारी के रूप में टिक ऊतक मूल्यांकन किया है होना चाहिए ।
  7. अधिग्रहण टैब में "प्राप्ति" पर क्लिक करें और सेटिंग को बदलने के लिए: "अधिग्रहण मोड XYZ या XYZT," "स्वरूप (512x512 या 1024x1024)," और "गति (४०० हर्ट्ज या २०० हर्ट्ज)." पर क्लिक करें "Pinhole" और यह सेट करने के लिए 1 हवादार इकाई. "द्वि-दिशा X" पर क्लिक करें ।
    नोट: छवियों, लेजर शक्ति, लाभ, और pinhole के बीच एक संतुलन का अनुकूलन करने के लिए मारा जाना चाहिए, जो चर्चा में उल्लेख किया है ।
  8. एकाधिक fluorophores का मूल्यांकन करते समय, चर्चा में उल्लेख किया गया है कि खून के माध्यम से रोकने के लिए "अनुक्रमिक स्कैन" और "फ्रेम के बीच" का चयन करें ।  चुनें "लाइन औसत 4" शोर का एक अच्छा कमी प्राप्त करने के लिए ।
    नोट: आंतरिक प्रतिदीप्ति ट्रांसजेनिक पशु, अंय फ्लोरोसेंट मार्करों, dextrans, Hoechst, FITC-BSA, फ्लोरोसेंट chemotherapeutics, और/या नैनोकणों में वांछित एकाग्रता को पतला की तरह NaCl में मौजूद के आधार पर किया जा सकता है प्रशासन और ट्यूमर में मूल्यांकन किया । ये पूंछ या शिश्न नस के माध्यम से इंजेक्ट कर रहे हैं ।
  9. अधिग्रहण टैब में "प्रयोग" पर क्लिक करें और नया डेटा बेस बनाने के लिए "नया" चुनें.
  10. अनुसंधान प्रश्न, 10x, 20X, या 40X उद्देश्य लेंस पर निर्भर करता है, का उपयोग कर पशु का मूल्यांकन करें । नेत्र के माध्यम से, एक स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए खोजें ।
    नोट: यह संभव के रूप में उच्च के रूप में एक ना के साथ शुष्क लेंस का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है, के रूप में शुष्क लेंस एक अपेक्षाकृत लंबी काम दूरी है और विसर्जन द्रव की जरूरत नहीं है । चर्चा में जल-विसर्जन वस्तुनिष्ठ लैंस का प्रयोग बताया गया है ।
  11. उचित लाभ और जोखिम को रोकने के लिए और संकेत करने के लिए शोर अनुपात का अनुकूलन करने के लिए ऑफसेट खोजने के लिए एक तेजी से लाइव स्कैन का प्रयोग करें । इसके अलावा, के दौरान और प्रयोगों के बीच एक ही इमेजिंग सेटिंग्स बनाए रखने यदि मात्रात्मक तुलना की जरूरत है ।
    ध्यान दें: इष्टतम इमेजिंग के लिए आगे विचार चर्चा में उल्लेख कर रहे हैं । कंट्रोल पैनल का उपयोग करते हुए लाइव स्कैन के दौरान फलाँ पोजीशन और जूम को फाइनल किया जा सकता है ।
  12. z-स्टैक बनाने के लिए, प्राप्त करें टैब में "z-स्टैक" चुनें. नियंत्रण कक्ष में z-स्थिति का उपयोग कर एक तेजी से z-स्कैन करने और "प्रारंभ µm" और "end µm." क्लिक करके स्कैन की शुरुआत और अंत सेट pinhole आकार से संबंधित Z-चरण आकार सेट करें ।
  13. "start" पर क्लिक करके छवियों पर कब्जा ।
    नोट: के रूप में intravital माइक्रोस्कोपी के बारे में सब कैनेटीक्स है और इसलिए गतिशील प्रक्रियाओं मनाया जाता है, एक छवि और जैविक प्रक्रियाओं की गति प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय के बीच एक समझौता किया जाना चाहिए । सामांय में, उच्च संकल्प, और फ्लोरोसेंट चैनल और स्कैन कर रहे है बड़ा स्कैनिंग क्षेत्र, छवि के अनुसार और अधिक पिक्सेल । मोटा Z-ढेर एक लंबा इमेजिंग समय के लिए अनुवाद । एक लंबा इमेजिंग समय आंदोलन कलाकृतियों की संभावना बढ़ जाती है और ऊतक के लिए नुकसान का कारण हो सकता है imaged । इसके अलावा, ध्यान रखें कि स्कैनिंग कुछ फ्लोरोसेंट लेबल ब्लीचिंग और विषाक्तता का कारण बनता है, जो लेजर शक्ति और संचित डाई की एकाग्रता से प्रभावित है ।
  14. Z-स्टैक स्कैनिंग के बाद जल्दी से "अधिक से अधिक प्रक्षेपण" पर क्लिक करके मूल्यांकन किया जा सकता है । Z-स्टैक स्वचालित रूप से डेटा बेस में सहेजा जाता है और उसका नाम बदला जा सकता है ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. मूल शोध प्रश्न के आधार पर, डेटा विश्लेषण के लिए कई सॉफ़्टवेयर प्रोग्रांस, जैसे ImageJ5, Matlab11, या Amira, में से किसी एक का उपयोग करें । सही विश्लेषण महत्वपूर्ण है ।

Representative Results

intravital इमेजिंग की मुख्य विशेषता आक्रामक हस्तक्षेप के बिना सेलुलर प्रक्रियाओं के अनुदैर्ध्य दृश्य है । इस के लिए, ट्रांसजेनिक एक गठन या ब्याज की कोशिकाओं में inducible फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त पशुओं का इस्तेमाल कर रहे हैं । चित्रा 2 eNOStag में फ्लोरोसेंट लेबल की अभिव्यक्ति-ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)9 और रोजा-mTmG माउस लाइनों10दिखाता है । eNOStag-GFP एक माउस लाइन है कि घर में उत्पादन किया गया था GFP के लिए एक टैग के रूप में एक छोटा एनोस जीन का उपयोग कर । महत्वपूर्ण बात, एनोस अत्यधिक endothelial कोशिकाओं में व्यक्त की है, और GFP संकेत वें eGolgi और सेलुलर झिल्ली (चित्रा 2a) में स्पष्ट रूप से देखा जाता है । रोजा-mTmG चूहों में एक झिल्ली-लक्षित दो रंग प्रतिदीप्ति Cre रिपोर्टर एलील है. यह लाइन Cre recombinase-व्यक्त कोशिकाओं में व्यापक कोशिकाओं और mGFP में mTomato प्रतिदीप्ति व्यक्त करता है और काफी वंश अनुरेखण के लिए प्रयोग किया जाता है । एक ट्यूमर टुकड़ा एक गैर ट्रांसजेनिक दाता से प्रत्यारोपित किया जाता है के रूप में, लाल प्रतिदीप्ति मुख्य रूप से ट्यूमर में stromal भागों द्वारा व्यक्त की है (जैसे, संवहनी कोशिकाओं की झिल्ली में, परिचालित कोशिकाओं, घुसपैठ रक्त कोशिकाओं, और ट्यूमर से जुड़े fibroblasts (चित्र b)) ।

पोत गठन कसकर विनियमित है, और यह अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है विकासशील रेटिना12,13. इसके अलावा, ट्यूमर पोत विकास एक काइनेटिक प्रक्रिया कि रेटिना पोत विकास के सिद्धांत में समान है । हालांकि, ट्यूमर जहाजों संगठन की कमी है और, के रूप में एक ट्यूमर लगातार remodeling है, तो ट्यूमर से जुड़े vasculature है । यह अपने फायदे हो सकता है जब एक angiogenic मॉडल के रूप में ट्यूमर का उपयोग कर, पोत विकास के सभी चरणों के रूप में अक्सर एक ही समय में एक ही ट्यूमर में पाया जा सकता है । इनमें एक endothelial अंकुरण सामने एक संयुक्त राष्ट्र में ट्यूमर के संवहनी भाग (चित्रा 2c) में बढ़ शामिल; क्षतिग्रस्त जहाजों (चित्रा 2d); और एक स्थापित संवहनी बिस्तर (चित्रा 2E-I) के साथ परिपक्व, बंटी जहाजों (चित्रा 2E-II). हालांकि इन इलाकों में angiogenic endothelial सेल भी मिल सकती है । जब angiogenic उत्तेजनाओं द्वारा उत्तेजित, एक endothelial कोशिका filopodia (चित्रा 2E-III) बहर और एक टिप सेल में अग्रिम कर सकते हैं, स्कैनिंग और दिशात्मक प्रवास (चित्रा filopodia-IV) के लिए इन 2E का उपयोग कर । यह टिप सेल ट्यूमर interstitium में विस्थापित होता है और डंठल कोशिकाओं को विभाजित करके पीछा किया जाता है । एक एकल endothelial टिप सेल कई filopodia का विस्तार, वापस लेने और किसी भी समय नवीनीकृत कर रहा है, और intravital माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2F) का उपयोग कर ट्रैक किया जा सकता है ।

दूसरे, intravital माइक्रोस्कोपी एक angiogenic मोर्चे पर लुमेन गठन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, ट्यूमर भर में रक्त का प्रवाह, और extravasation. पशु, विभिंन फ्लोरोसेंट यौगिकों में पहले से मौजूद आंतरिक फ्लोरोसेंट संकेतों पर निर्भर करता है प्रशासित किया जा सकता है । रक्त प्रवाह और extravasation Hoechst, फ्लोरोसेंट dextrans, या FITC-BSA का उपयोग कर visualized किया जा सकता है । रक्त प्रवाह और कण extravasation पर विस्तारित अध्ययन के लिए, लंबे संचलन फ्लोरोसेंट १०० एनएम के pegylated नैनोकणों लेबल इस्तेमाल किया जा सकता है । इन नैनोकणों की तैयारी के बारे में विवरण के लिए, कोई पिछला प्रकाशन5देखें । इन यौगिकों का रोजगार चित्रा 3में प्रदर्शित किया जाता है । एक रोजा-mTmG माउस में endothelial टिप कोशिकाओं स्पष्ट रूप से ट्यूमर ऊतक हमलावर देखा जा सकता है । कार्यात्मक रक्त प्रवाह संवहनी ट्यूबों के लुमेन में प्रणालीबद्ध इंजेक्शन नैनोकणों के बैंगनी प्रतिदीप्ति द्वारा प्रदर्शन किया है (चित्र 3ए). डंठल कोशिका क्षेत्र (चित्र 3-II) में लुमेन के गठन को दर्शाते हुए endothelial tip कक्षों पर नैनोकणों बारीकी से पहुंचें । प्रणालीबद्ध प्रशासित chemotherapeutics के वितरण के क्रम में ट्यूमर interstitium तक पहुंचने के लिए एक कार्यात्मक vasculature पर निर्भर करता है, और के रूप में चित्र बी में दिखाया गया है, इंजेक्शन एजेंटों, उनके आकार के स्वतंत्र, नष्ट जहाजों के साथ क्षेत्रों घुसना नहीं है, संपीड़ित वाहिकाओं, या रक्त ठहराव के साथ जहाजों ।

ज्यादातर अंगों में, endothelial अस्तर रक्त और अंतर्निहित ऊतक के बीच एक कार्यात्मक बाधा रूपों, और अणुओं के पारित होने कसकर विनियमित है । ट्यूमर से जुड़े vasculature, हालांकि, टपका हुआ जाना जाता है, और ताकना आकार कट-बंद ट्यूमर प्रकार14पर बहुत निर्भर करता है । विभिंन आकारों के साथ फ्लोरोसेंट-संयुग्मित dextrans रक्त प्रवाह, पारगम्यता, और extravasation का आकलन करने के लिए इंजेक्ट किया जा सकता है । Hoechst (६१५ Da) ट्यूमर ऊतक में तेजी से फैलाना और आसपास के कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है (चित्र 3 सी-I) । इंजेक्शन के फौरन बाद dextran में 10 केडीए (फिगर 3CII) और 2 एमडीएस (फिगर 3 सी-III) के ब्लड पाए जाते हैं. हालांकि, dextran 10 केडीए भी ट्यूमर interstitium में देखा जाता है, छोटे अणुओं के लिए endothelial अस्तर की पारगम्यता का संकेत है, जो ट्यूमर वाहिकाओं के लिए एक विशेषता जिंमेदार है. इंजेक्शन के बाद ४० मिनट (चित्रा 3 सी-IV), dextran 10 केडीए रक्त धारा (चित्रा 3 सी-वी) से मंजूरी दे दी है, और dextran 2MDa की फ्लोरोसेंट तीव्रता के रूप में अच्छी तरह से कमी आई है (आंकड़ा 3 सी-VI). हालांकि, बड़े dextrans ट्यूमर interstitium में नहीं पाए जाते हैं, इस समय सीमा के भीतर बड़े अणुओं को पारगम्यता की कमी का प्रदर्शन.

अपने अत्यधिक proliferating, गल, और संयुक्त राष्ट्र के संवहनी क्षेत्रों के साथ ट्यूमर pathophysiology, काफी जानकारीपूर्ण जब एक angiogenic मॉडल के रूप में ट्यूमर का उपयोग कर सकते हैं । हालांकि, यह प्रभावी चिकित्सा और जांच के लिए एक समस्या प्रस्तुत करता है । ट्यूमर से जुड़े vasculature के विविधता प्रशासित दवाओं के एक विषम वितरण का कारण बनता है, पूरे क्षेत्रों दवा मुक्त15छोड़ने. दवा वितरण में सुधार करने के लिए, कई रणनीतियों15,16,17लागू किया जा सकता है, और चिकित्सीय प्रगति इस intravital डिजाइन का उपयोग कर जांच की जा सकती है । ट्यूमर से जुड़े vasculature vasoactive एजेंटों का उपयोग करने के लिए दवा वितरण में सुधार17हेरफेर किया जा सकता है । ट्यूमर वाहिका हेरफेर का परिणाम Doxil के साथ संयोजन में एक vasoactive एजेंट के रूप में ट्यूमर परिगलन अल्फा (TNF) का उपयोग कर, डॉक्सोरूबिसिन के encapsulated liposomal निर्माण, एक कीमोथेरेपी एजेंट के रूप में इस पांडुलिपि में प्रस्तुत कर रहे हैं5, 18 , 19. dextrans के विपरीत, pegylated नैनोकणों कई घंटों तक प्रसारित किए जाते हैं, यदि नहीं तो दिन, रक्त परिसंचरण20में ।

जैसा कि पहले उल्लेख किया है, ट्यूमर के क्षेत्र में अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है सही ट्यूमर क्षेत्रों की पहचान करने के लिए पूर्व स्कैन हो सकता है । दवा भाग्य एक पहले से ही क्षतिग्रस्त नाड़ी बिस्तर के साथ क्षेत्रों बनाम एक कार्यात्मक vasculature के साथ क्षेत्रों में मूल्यांकन किया जा सकता है (नहीं दिखाया गया डेटा). साइटोटोक्सिक हस्तक्षेप के बिना कीमोथेरेपी एजेंटों के भाग्य की जांच करने के लिए, चिकित्सकीय एजेंट के रूप में एक ही संरचना के साथ नैनोकणों एक मॉडल दवा के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक eNOStag-GFP पशु इन नैनोकणों के साथ i.v. इलाज किया गया था और 24 के बाद एच छवि । नैनोकणों अभी भी vasculature में मौजूद थे, ट्यूमर interstitium में ंयूनतम extravasation के साथ (चित्र 4a-मैं) । हालांकि, जब नैनोकणों TNF के साथ संयोजन में प्रशासित थे, extravasation रक्त धारा से ट्यूमर interstitium (चित्रा 4a-II) में मनाया गया था, intratumoral दवा वितरण में वृद्धि. उच्च संकल्प उद्देश्य लेंस का उपयोग करके, एक यौगिक के intracellular स्थानीयकरण पहचाना जा सकता है, के रूप में हरी endothelial कोशिकाओं और ट्यूमर interstitium (चित्रा 4B) की कोशिकाओं में Hoechst के परमाणु स्थान से यहाँ दिखाया गया है । इसके अलावा, डॉक्सोरूबिसिन जैसे कई कीमोथेरेपी एजेंटों, डीएनए के साथ intercalate, इन यौगिकों के स्थानीयकरण मूल्यांकन किया जा सकता है । डॉक्सोरूबिसिन लाल फ्लोरोसेंट गुण है, और nanocarrier के साथ लेबल किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, tetramethylindotricarbocyanine perchlorate (किया) । एक eNOStag-GFP जानवर Doxil के साथ i.v. इंजेक्शन था-TNF के साथ संयोजन में किया था, और छवियों को उपचार के बाद 24 ज लिया गया था । Doxil-extravasated रक्त वाहिकाओं से बाहर किया गया था और आसपास के ट्यूमर ऊतक द्वारा लिया गया था (चित्र 4c-I) । व्यक्तिगत कोशिकाओं का एक अधिक विस्तृत मूल्यांकन (चित्र 4c-II) दिखाया है कि वाहक कोशिका में पाया जा सकता है, जबकि जारी डॉक्सोरूबिसिन सेलुलर नाभिक में मनाया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: यंत्र, पृष्ठीय skinfold चैंबर, और उपकरण की प्रक्रिया के लिए आवश्यक सेटअप. (एक) ट्यूमर के टुकड़े (एक) और प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरणों । गैर मानक उपकरणों एक कान पंच (ख), एक माइक्रो स्क्रू ड्राइवर (सी), और एक तुला सुई (डी) हैं । () पृष्ठीय skinfold विंडो चैंबर । सामने (a) और पीछे (b) विंडो (तीर: टांके के लिए छेद; ऐरोहेड: बोल्ट के लिए छेद), 2 बोल्ट (सी), 2 नट (डी), 1 भराव गिलास (ई), 2 कवर चश्मा (एफ), और 2 बनाए रखने की अंगूठी (जी) । इसके अलावा, हुक बिना छल्ले बनाए रखने (सफेद ऐरोहेड) जब आवश्यक इस्तेमाल किया जा सकता है । () कस्टम निर्मित चैंबर धारक (क), चैंबर के लिए बोल्ट-को-चैंबर धारक (ख), तापमान नियंत्रित मंच (सी), बोल्ट के लिए मंच (डी) के लिए चैंबर धारक सुरक्षित है, और संज्ञाहरण ट्यूब (ई) के साथ धारक । () प्लेटफार्म पर चेम्बर धारक में पशु चढ़कर. एक B16BL6 ट्यूमर (तीर) विंडो दृश्य क्षेत्र में दिखाई दे रहा है । () intravital मूल्यांकन के लिए आवश्यक उपकरण । इमेजिंग और माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर (एक), मानक फ्लोरोसेंट रोशनी (ख), और माइक्रोस्कोप । एक multiphoton फोकल (सी) एक संज्ञाहरण इकाई (डी) के साथ इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: ट्रांसजेनिक पशुओं के आंतरिक प्रतिदीप्ति । सभी छवियां यहां दिखाया Z-ढेर अनुमानों के बीच ५० और ७० µm मोटी हैं । () eNOSGFP-टैग लाइन में GFP endothelial कोशिकाओं के Golgi (तारांकन) और कोशिका झिल्ली (तीर) में व्यक्त की जाती है. स्केल बार = १०० µm. () रोजा-mTmG रेखा में mTomato की Intratumoral अभिव्यक्ति मुख्य रूप से संवहनी कोशिकाओं (तीर) और रक्त कोशिकाओं (तारांकन) की कोशिका झिल्ली में पाई जाती है । स्केल बार = १०० µm. (C) अन-संवहनी ट्यूमर में बढ़ते angiogenic सामने का एक प्रक्षेपण । स्केल बार = १०० µm. (D) स्थापित और क्षतिग्रस्त जहाजों (तारांकन) के साथ ट्यूमर के भाग का एक प्रक्षेपण । (ङ) परिपक्व टिक जहाजों (EII) दिखा स्थापित ट्यूमर vasculature (ेि) का एक प्रक्षेपण; angiogenic endothelial tip cells with filopodia (इइइइइइ, ऐरोहेड); और एक परिपक्व पोत, जिसमें से एक एकल endothelial कोशिका interstitium में एक filopodium (EIV, ऐरोहेड) फैली हुई है. स्केल बार = १०० µm. () filopodia का आंदोलन, 1 ज के लिए पीछा किया । हर 15 मिनट, एक Z-ढेर लिया गया था; एक अधिकतम प्रक्षेपण यहां प्रस्तुत किया है । filopodia (सफेद तीर) का विस्तार कर रहे हैं, स्थिर (=), मुकर (लाल तीर), या यहां तक कि पूरी तरह से गायब (-) । स्केल बार = 25 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: इंजेक्शन लेबल के प्रशासन extravasation और रक्त प्रवाह को समझाने के लिए । () एक रोजा mTmG माउस बैंगनी फ्लोरोसेंट नैनोकणों के साथ इंजेक्शन था, और एक Z-एक हमलावर टिप सेल सामने के ढेर 10 मिनट बाद (एअर इंडिया) लिया गया था । एक प्रक्षेपण कि सबसे endothelial अंकुरित एक कार्यात्मक लुमेन (AII, तीर) है । केवल शायद ही कभी endothelial अंकुरित प्रवाह (AII, ऐरोहेड) के बिना देखा जा सकता है । स्केल बार = २५० µm. (B) यह Z-स्टैक प्रोजेक्शन एक eNOStag-GFP जानवर के उपचार से पहले (BI) में एक नष्ट ट्यूमर पोत क्षेत्र दिखाता है । पशु नैनोकणों (बैंगनी, बीि) और Hoechst (नीला, BIII) के साथ इंजेक्ट किया गया था । नैनोकणों और Hoechst नष्ट क्षेत्रों तक पहुंच नहीं है, दानेदार सेल मलबे से संकेत अभी भी GFP व्यक्त । स्केल बार = २५० µm. (C) एक eNOStag-GFP माउस को विभिंन आकारों के दो dextrans के साथ इंजेक्ट किया गया था (लाल = Dextran 2 एमडीए; बैंगनी = Dextran 10 केडीए) और Hoechst (नीला = ६१५ Da), और एकल-विमान छवियां यहां प्रस्तुत की गई हैं । इंजेक्शन के बाद 10 मिनट, रक्त और extravasation में उपस्थिति एक ही छवि में देखा जाता है । Hoechst extravasates लगभग तुरंत रक्त वाहिकाओं से बाहर है और आसपास के कक्षों (CI) द्वारा लिया जाता है । Dextran 10 केडीए (सीआईआई) के जहाजों में और ट्यूमर interstitium में देखे जा सकते हैं । Dextran 2 एमडीए (CIII) जहाजों में पाया जा सकता है । ४० मिनट के बाद इंजेक्शन (CIV), Dextran 10 केडीए के खून से गायब हो जाता है (CV), और Dextran 2 एमडीए की फ्लोरोसेंट तीव्रता भी कम (CVI) था । स्केल बार = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कीमोथेरेपी एजेंटों के भाग्य की जांच । () एक eNOStag-GFP पशु नैनोकणों के साथ i.v. इलाज किया गया था और बाद में 24 ज छवि । नैनोकणों अभी भी जहाजों में मौजूद हैं, ट्यूमर interstitium (एअर इंडिया) में न्यूनतम extravasation के साथ. जब नैनोकणों TNF के साथ संयुक्त कर रहे हैं, extravasation ट्यूमर interstitium (AII) में रक्त धारा से मनाया जाता है । स्केल बार = २५० µm. (B) उच्च-रिज़ॉल्यूशन वाले लेंस का उपयोग करके, endothelial कोशिका (हरा) और नाभिक (नीला) किसी व्यक्ति कक्ष की पहचान की जा सकती है । स्केल बार = ५० µm. (C) एक eNOStag-GFP जानवर Doxil के साथ संयोजन में किया गया था i.v. के साथ इंजेक्शन था TNF, और छवियां लिया गया 24 बाद में एच । यहां, Doxil के extravasation-ट्यूमर interstitium में जहाजों से बाहर किया स्पष्ट (CI) है । व्यक्तिगत कोशिकाओं के एक अधिक विस्तृत मूल्यांकन (सीआईआई) से पता चलता है कि बैंगनी वाहक कोशिका (तीर) में पाया जा सकता है, जबकि जारी डॉक्सोरूबिसिन (लाल) सेलुलर नाभिक (ऐरोहेड) में मनाया जाता है । स्केल बार = ५० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Discussion

ट्यूमर और ट्यूमर पोत विकास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ट्यूमर उपचारात्मक प्रभाव, अत्यधिक गतिशील प्रक्रियाओं हैं, intravital मूल्यांकन एक समय में इन प्रक्रियाओं का सही आकलन करने के लिए एक सुरुचिपूर्ण उपकरण है और स्थानिक-निर्भर तरीके से । लाइव सेल मार्कर की बढ़ती उपलब्धता के साथ, ट्रांसजेनिक जानवरों के निर्माण, और इमेजिंग मोडलों की उन्नति, intravital इमेजिंग अधिक से अधिक लोकप्रिय होता जा रहा है । हालांकि प्रोटोकॉल अभी भी नियमित रूप से इस्तेमाल किया जाता है, और मार्करों की एक भीड़ कोशिकाओं और संरचनाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता, गतिशील प्रक्रियाओं की जांच करते समय ऊतक अनुभाग नुकसान है । ऊतक विच्छेदन की आवश्यकता है, केवल स्थिर जानकारी प्रदान; निर्धारण ऊतक की गुणवत्ता को प्रभावित करता है; और हर्जाना सेलुलर बातचीत टुकड़ा करने की क्रिया । इसके अलावा, जब गतिशील प्रक्रियाओं की जांच, अलग पर ऊतक विच्छेदन, और अक्सर माना, समय अंक जानवरों की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । intravital इमेजिंग के साथ, XYZ स्थानिक आयामों और समय के अतिरिक्त आयाम एक ही जानवर में मूल्यांकन किया जा सकता है, अंतरिक्ष और समय में संभव विभिन्न खिलाड़ियों की उचित स्थिति बना रही है । इसलिए, इष्टतम समय अंक याद नहीं हैं, और प्रयोग प्रति जानवर संख्या काफी कम है । दूसरा, intravital मूल्यांकन के साथ स्थापित समय खिड़की ऊतक निष्कर्षण का अनुकूलन करने के लिए extrapolated जा सकता है । तीसरा, पोत विकास के वांछित चरण intravitally की पहचान की जा सकती है और एक पूरे माउंट ऊतक के रूप में दाग ।

इस पांडुलिपि में वर्णित intravital डिजाइन endothelial कोशिकाओं, एक संशोधित पृष्ठीय skinfold कक्ष मॉडल, और एक समर्पित multiphoton-फोकल माइक्रोस्कोप में एक फ्लोरोसेंट लेबल व्यक्त ट्रांसजेनिक जानवरों का एक संयोजन का उपयोग करता है ।

Endothelial कोशिकाओं angiogenesis के दौरान21चरणों,22 के एक नंबर के माध्यम से जाना है, और इन चरणों अक्सर एक ट्यूमर में एक साथ देखा जा सकता है. eNOSTag-GFP माउस लाइन का प्रयोग, व्यक्तिगत endothelial कोशिकाओं का पालन किया जा सकता है, और यहां तक कि filopodia गतिशीलता का पता लगाया जा सकता है । इसलिए यह पोत विकास intravitally का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल है । पहले से मौजूद आंतरिक लेबल पर निर्भर करता है, इंजेक्शन फ्लोरोसेंट एजेंटों लुमेन गठन, रक्त प्रवाह, extravasation, और रक्त निकासी का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । माउस के लिए लगातार imaged है अप करने के लिए 5 ज । एक जानवर के दीर्घकालिक मूल्यांकन संभव है जब पशु के संज्ञाहरण के बारे में कई सावधानियों लिया जाता है, जो पहले से ही वर्णित किया गया है23। के रूप में इस शोध कैंसर पर ध्यान केंद्रित है, ट्यूमर ऊतक या कोशिकाओं प्रत्यारोपित किया गया । हालांकि, हम भी metatarsals और भ्रूण फेफड़ों के साथ प्रयोग । हालांकि, अध्ययन के तहत ऊतक की वृद्धि दर सीमित है, के रूप में कुछ हफ़्ते के बाद, त्वचा को फिर से विकसित करने के लिए शुरू होता है, जो धीमी गति से बढ़ ट्यूमर या ऊतकों के साथ एक समस्या हो सकती है.

मांयता चरण के दौरान, पृष्ठीय skinfold खिड़की चैंबर काफी शास्त्रीय मॉडल4की तुलना में संशोधित किया गया था । फ्रेम autoclavable सिंथेटिक सामग्री का निर्माण कर रहे है और प्रकाश और छोटे हैं, एक बड़ी खिड़की से देखने के क्षेत्र के साथ । बनाए रखने की अंगूठी के हुक (चित्रा 1Bg, सफेद ऐरोहेड) केवल अंगूठी के आसान हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है । हुक के बिना बनाए रखने के छल्ले इस्तेमाल किया जा सकता है जब इन इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप । त्वचा बहुत ज्यादा फैला नहीं है, ढीला इस मॉडल में नहीं होती है, और संक्रमण केवल शायद ही कभी देखा जाता है । इन संशोधनों जानवर असुविधा को कम करने और पशु प्रक्रिया काफी परिष्कृत । इसके अलावा, धातु भागों को आसानी से हटाया जा सकता है जब इमेजिंग एमआरआई24का उपयोग कर ट्यूमर ।

किसी भी खुर्दबीन intravitally छवि पृष्ठीय skinfold कक्षों को अपनाया जा सकता है । मुख्य आवश्यकता माइक्रोस्कोप स्टेज और उद्देश्य लेंस के बीच उपलब्ध जगह है । एक महत्वपूर्ण पहलू है कि इमेजिंग को प्रभावित करता है गति है । गति कलाकृतियों को रोकने के लिए, एक मंच है कि खुर्दबीन टेबल में फिट बैठता है (सभी आवेषण के हटाने के बाद) और माउस का समर्थन करता है इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह संज्ञाहरण के तहत है जब माउस को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक नहीं है, और यह माउस सांस स्वतंत्र रूप से जाने के लिए बेहतर है । हालांकि, खिड़की के मंच पर बोल्ट, देखने के क्षेत्र (यानी, ट्यूमर खिड़की चैंबर के माध्यम से दिखाई है) के इष्टतम निर्धारण दे रही है । मंच एक इलेक्ट्रॉनिक हीटिंग पैड का उपयोग कर गर्म है, के रूप में पशु हीटिंग के लिए इस्तेमाल किया । इस मंच में घर बनाया गया था, और विशेष अनुरोध पर प्राप्त किया जा सकता है । एक उच्च संकल्प उद्देश्य लेंस जब intracellular प्रक्रियाओं का मूल्यांकन और यह कोशिका और नाभिक के बीच भेदभाव करने के लिए संभव बनाता है एक आवश्यकता है । एक अच्छा ऑप्टिकल संकल्प के साथ एक पतला लेंस का उपयोग करें (उच्च एनए) लेकिन एक अपेक्षाकृत लंबे काम दूरी (अधिमानतः 2 मिमी या ऊपर) की सिफारिश की है । इमेजिंग में सीमा प्रवेश गहराई और लेबल की फ्लोरोसेंट तीव्रता है । इसके अलावा, photobleaching, phototoxicity, और संतृप्ति इमेजिंग के दौरान से बचा जाना चाहिए ।

यहां, एक एकीकृत फोकल-multiphoton और एक फोकल माइक्रोस्कोप का इस्तेमाल किया गया । multiphoton ईमानदार है, जबकि फोकल एक उल्टे माइक्रोस्कोप है । एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का लाभ पानी विसर्जन लेंस का आसान उपयोग है । ये लेंस एक उच्च एनए और एक लंबी काम की दूरी पर है, यहां तक कि एक उच्च पर (उदा, 20 या 40X) आवर्धन । विशेष रूप से, यह एक 20X NA १.० जल विसर्जन लेंस, जो कई कंपनियों द्वारा बेचा जाता है प्राप्त करने के लिए सिफारिश की है । ध्यान रखें कि, जब विसर्जन लेंस का उपयोग किया जाता है, उद्देश्य लेंस और विसर्जन द्रव ३७ ° c करने के लिए गरम किया जा करने की आवश्यकता है । सबसे अच्छा चित्र के लिए, यह इष्टतम फोकल सेटिंग्स का उपयोग करने की सिफारिश की है (यानी, 1 हवादार इकाई पर pinhole, संभव के रूप में कम के रूप में लेजर शक्ति, लाभ भी उच्च नहीं (विशेष रूप से अगर लाभ शोर का परिचय), अधिकतम लाइन गति, और स्कैन का कोई औसत). जोखिम, संतृप्ति, और अंतर में छवियों के बीच तनाव डेटा की गुणवत्ता समझौता । यह संतृप्ति और जोखिम को रोकने के लिए सिफारिश की है । यह अलग लाभ सेटिंग्स पर छवियों को प्राप्त करने से दरकिनार किया जा सकता है । लाभ बदलने छवि चमक को बदलने के लिए सबसे आसान तरीका है । अगर जरूरत पड़ी तो लेजर पावर को एडजस्ट किया जा सकता है । छवि गुणवत्ता का मानकीकरण करने के लिए, एक निश्चित प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ स्लाइड इस्तेमाल किया जा सकता है । एक ध्यान में रखना है कि जब भी सूक्ष्मदर्शी बेहतर सेट है, छवि गुणवत्ता विंडो चैंबर और ऊतक की गुणवत्ता के द्वारा एक काफी हद तक निर्धारित किया जाता है चाहिए

जब एक साथ कई फ्लोरोसेंट मार्करों स्कैनिंग, खून के माध्यम से, जिसमें एक fluorophore एक दूसरे के चैनल में पाया जाता है, से बचा जाना चाहिए । कम अतिव्यापी स्पेक्ट्रा और फ्रेम के बीच अनुक्रमिक स्कैनिंग के साथ fluorophores का एक संयोजन का उपयोग करके खून से बचें । यहां प्रस्तुत चित्र 3 अनुक्रमिक स्कैन का उपयोग कर स्कैन किया गया (1 ट्रैक: GFP, किया था या ४८८ और ६३३ लेजर के साथ fluor647; ट्रैक 2: rhodamine, Doxil, या ५४३ लेजर के साथ mTomato; और ट्रैक 3: Hoechst के साथ ४०५ लेजर) ।

ट्यूमर पोत विकास के कई चरणों के मूल्यांकन की संभावना, टिप सेल गतिशीलता, लुमेन गठन, extravasation, और संवहनी क्षति यहाँ दिखाया गया है । eNOStag-GFP लाइन, एक नष्ट संवहनी बिस्तर के साथ ट्यूमर क्षेत्रों का उपयोग आसानी से दानेदार सेलुलर अवशेष अभी भी GFP व्यक्त द्वारा पता चला रहे हैं । इन क्षेत्रों में कोई इंजेक्शन एजेंट नहीं पाया गया, जो प्रवाह की कमी को दर्शाता है । इसका मतलब यह है कि प्रशासित कीमोथेरेपी एजेंटों इन क्षेत्रों या तो नहीं पहुंच जाएगा । हालांकि, पोत विनाश भी एक चिकित्सीय परिणाम हो सकता है । ट्यूमर के पूर्व मूल्यांकन, पूर्व उपचार पोत विनाश के लिए जांच करने के लिए, सटीक चिकित्सकीय मूल्यांकन के लिए एक शर्त है और आसानी से इस प्रयोगात्मक डिजाइन का उपयोग किया जा सकता है ।

इसमें ढेर सारी संभावनाएं हैं जिनके लिए intravital माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल किया जा सकता है, और विस्तृत चर्चा इस प्रकाशन के दायरे से बाहर है । एक संक्षिप्त अंतर्दृष्टि देने के लिए, संभव अनुप्रयोगों के ट्यूमर के ऊतकों में chemotherapeutics के संचय पर अध्ययन शामिल हैं, जहाजों के विकास (जैसे, जहाजों, शाखाओं, और चौराहों की संख्या) और रक्त प्रवाह, सेल सेल बातचीत, सेल लक्ष्यीकरण, और intracellular प्रसंस्करण, और साथ ही उदाहरण के ऊपर उल्लेख किया और यहां दिखाया गया है । के रूप में विश्लेषण प्रतिदीप्ति पर आधारित है, खिड़की या ऊतक की गुणवत्ता के कारण तीव्रता उतार चढ़ाव के बारे में पता है । इसके अलावा, के रूप में ट्यूमर ऊतक अपेक्षाकृत मोटी है, ऊपर या देखने के विमान के नीचे से प्रतिदीप्ति छवि में संकेत पर एक प्रभाव है । यह उद्देश्य माप के साथ मात्रात्मक छवि विश्लेषण गठबंधन करने के लिए सबसे अच्छा है । उदाहरण के लिए, यदि दवा सांद्रता में रुचि, intravital माइक्रोस्कोपी के बाद खिड़की से ट्यूमर ऊतक निकालने के लिए और HPLC के साथ का उपयोग कर दवा सामग्री का निर्धारण करने के लिए फोकल छवियों के साथ तुलना.

ट्यूमर प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के रूप में अच्छी तरह से इस मॉडल का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन कुछ सावधानियों के साथ. एक एहसास होना चाहिए कि ट्यूमर भी आवक बढ़ती है, त्वचा में । 3 डी माप किया जा सकता है अगर प्रवेश काफी गहरा पूरे ट्यूमर को कवर है । ऐसी स्थिति में अब तक लाल रंगों का प्रयोग करना चाहिए । विंडो चैंबर के रूप में यहां वर्णित एक त्वचा के वातावरण में ट्यूमर के साथ सौदों, और यह कहना है कि खिड़की एक तापमान सामांय माउस शरीर के तापमान से थोड़ा कम रखता है महत्वपूर्ण है । इसलिए, यह सही माइक्रो पर्यावरण की स्थापना के लिए पृष्ठीय skinfold खिड़की चैंबर के साथ intravital अध्ययन की पुष्टि में ट्यूमर का अध्ययन करने के लिए सबसे अच्छा है । महत्वपूर्ण बात, पृष्ठीय skinfold चैंबर प्रक्रियाओं और तंत्र के कैनेटीक्स में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, चिकित्सा के सुधार के लिए एक वाद्य आधार प्रदान । साथ ही, अधिक वितरण और फार्माकोकाइनेटिक्स पर अतिरिक्त जानकारी प्राप्त की जा सकती है । शास्त्रीय रूप से, इन वितरण अध्ययनों ट्यूमर असर जानवरों और विदारक ट्यूमर के इलाज के द्वारा प्रदर्शन कर रहे है के लिए दवा को मापने के लिए अंगों/। इस intravital मॉडल का प्रयोग करते हुए किसी औषध का intratumoral स्थान (अर्थात, intravascular, intratumoral, intracellular या नाभिकीय),२५,२६प्रदान किया जा सकता है. न केवल दवा का स्थान पता चला है, लेकिन यह भी समय खिड़की के सबसे इष्टतम लेने के लिए अवसर ।

इस लेख में वर्णित प्रयोगात्मक डिजाइन का प्रयोग, मानकों की एक विस्तृत श्रृंखला एक लौकिक और स्थानिक सेटिंग में मूल्यांकन किया जा सकता है । विशेष रूप से, यहां हम बताते है कि intravital माइक्रोस्कोपी ट्यूमर पोत विकास और चिकित्सीय प्रतिक्रिया की गतिशीलता में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उनके विकास और eNOSTag के दान के लिए रीें वान Haperen और रिणी de Crom का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा-GFP लाइन, पशु काम के साथ उनकी तकनीकी सहायता के लिए Joost एपी Rens, और उनकी मदद के लिए पशु कार्यवाहियों । इस्तेमाल की जाने वाली माइक्रोस्कोपिक सुविधाएं इरास्मस ऑप्टिकल इमेजिंग सेंटर का हिस्सा हैं, और हम उनकी सेवा के लिए ओआईसी के कर्मचारियों को धन्यवाद देना चाहते हैं । इस अध्ययन के डच कैंसर सोसायटी से अनुदान DDHK 2000-2224 द्वारा समर्थित किया गया था, "Vereniging Trustfonds" इरास्मस विश्वविद्यालय रॉटरडैम, और "Stichting इरास्मस Heelkundig Kankeronderzoek," और हम उनके उदार दान के लिए समितियों के सदस्यों को धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma D1145 Supplemented with 10% FCS
Trypsin-versene (EDTA) Lonza BE17-161E Make a 0.1% solution in PBS, sterile
PBS
Window frames Costum made
Filler glass 10 mm, 0.55 mm Abrisia technologies
Cover glass 12mm, #1 thickness Thermo Scientific/VWR 631-0713
Hear removal gel (veet) for sensitive skin
Eye ointment
Buprenorfine hydrochloride use 0.05 mg/kg
Anesthesia unit O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green BD 324824
Needles 23G 1 1/4" Braun 4657640
Needles 25G 5/8" Braun 4657853
Sutures silkan 0.7 Braun 1134019
Nuts Jeveka 934 A2 1
Bolts Jeveka 84 A2 1 10
0.9% NaCl
Microscope + software The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal
Heated temperature controlled platform Costum made
Window holder Costum made
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran Invitrogen D7139 100 µg/mouse
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran Invitrogen D22914 100 µg/mouse
Hoechst 33342 Invitrogen H1399 25 µg/mouse
Pegulated nanoparticles ref 5
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope Leica
LAS AF Software Leica

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