Automatic Translation

This translation into Turkish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Chemistry

Unchelated Gadolinium için bir Aptamer tabanlı Sensörü (III)

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Chemistry and Biochemistry, California State University, East Bay

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    By clicking "Submit", you agree to our policies.

    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    Cite this Article

    Edogun, O., Chan, T. Y., Nguyen, N. H., Luu, A., Halim, M. An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III). J. Vis. Exp. (119), e55216, doi:10.3791/55216 (2017).

    Introduction

    Tekniğin doğal duyarlılığı ile sınırlıdır klinik tanı, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) artan önemi, yeni gadolinyum bazlı kontrast maddeler (GBKM'lerin) 1 geliştirilmesine yönelik araştırma hızlı büyüme sonuçlandı. GBKM'lerin görüntü kalitesini artırmak için tatbik edilmektedir moleküllerdir ve bunlar genellikle çok dişli bir ligand ile koordine bir üç değerli gadolinyum iyonu (Gd 3+) kimyasal yapıya sahiptir. Bu kompleksleşme toksik 3+ unchelated Gd gibi kritik öneme sahiptir; böbrek hastalığı veya yetmezliği 2 olan bazı hastalarda nefrojenik sistemik fibrozis gelişiminde rolü olduğu bilinmektedir. Sonuç olarak, sulu serbest iyon tespit GBKM'lerin güvenliğini sağlamada etkili olduğunu. GBCA Çözeltilerin unchelated Gd 3+ varlığı genellikle ligand ve iyon kompleksinin ayrışma veya displacemen arasında bir tam olmayan reaksiyon sonucudiğer biyolojik metal katyonları 3 ile t.

    Şu Gd 3+, çok yönlülük ve uygulanabilirliği 4 açısından kromatografi ve / veya spektrometre en yüksek değerli dayalı olanlar varlığını tespit etmek için kullanılan çeşitli teknikler arasında. Onların güçlü yanları arasında yüksek hassasiyet ve doğruluk, (bir liste ve çoklu Gd 3+ komplekslerin eşzamanlı ölçümü (insan serumu 5, idrar ve saç 6, atıksu 7 ve kontrast ajan formülasyonları 8 dahil) çeşitli numune matrisleri analiz yeteneği olan çalışmaların 2013 öncesinde Telgmann ve diğ.) 4 kapsamlı bir inceleme açıklanmaktadır. Tek dezavantajı bu yöntemlerden birkaç bazı laboratuvarlar erişimi olmayabilir (örneğin indüktif eşleşmiş plazma-kütle spektrometresi gibi) instrumentations 4 gerektirir olmasıdır. araştırma ve kanıt-of-concept seviyelerinde, ar de roman GBCA keşif kapsamındaelatively daha rahat, hızlı ve uygun maliyetli spektroskopik tabanlı bir yöntem (örneğin UV-Vis absorpsiyon veya floresan gibi) değerli bir alternatif olarak hizmet verebilir. Akılda bu uygulamalar sayesinde, sulu Gd 3+ için bir floresan aptamer tabanlı sensör 9 geliştirilmiştir.

    Aptamer (Gd-aptamerin) üstel zenginleştirme (SELEX) 9 tarafından ligandların sistematik evrim süreci boyunca izole edildi bazların spesifik dizisi ile bir 44 baz uzunluğunda tek iplikli bir DNA molekülüdür. Floresan sensör içine aptamer uyarlamak için, bir flüorofor, sonra 13 tamamlayıcı bazlar (Şekil 1) aracılığı ile su verme telinin (QS) ile hibridize olan telin, 5 'ucuna eklenir. QS 3 'ucunda bir karanlık söndürücü molekülü ile etiketlenir. 1 oluşan Gd 3+, sensör (Gd-sensör) yokluğunda, sırasıyla: Gd-aptamer ve QS 2 mol oranı, en az floresans emisyon nedeniyle t olacaktırquencher için fluorofordan o enerji transferi. Sulu Gd 3+ eklenmesi floresan emisyonunda bir artışa neden, Gd-aptamer gelen QS ettirilir.

    Şekil 1
    Floresein (bir fluorofor) ve DABCYL ile etiketlenmiş 13 baz uzunluğunda söndürme iplikçik (QS) ile etiketlenmiş 44 baz uzunluğunda aptamer (Gd-aptamer) (koyu söndürücü) oluşur Şekil 1. sensörü (Gd-sensör) . Unchelated Gd 3+ yokluğunda, algılayıcının flüoresan az. Gd 3+ eklenmesiyle, QS yerinden oluşur ve floresan emisyonunda bir artış gözlenmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Günümüzde vardır, yaygın bir şekilde kullanılan spektroskopik bazlı yöntem algılama içinSulu Gd 3+ ing. Bu tahlil iyonunun 10 şelasyon üzerine 433 nm 573 ila maksimum absorpsiyon dalga boyu bir kayma uğrar molekül ksilenol turuncu kullanır. Bu iki emilimi maksimum oranı unchelated Gd 3+ miktarını belirlemek için kullanılabilir. iki yöntem, hedef seçicilik, miktarının doğrusal aralıkları ve algılama yöntemlerinin (örneğin pH ve kullanılan tampon çözeltilerin bileşiminde gibi) farklı reaksiyon koşullarına sahip olarak aptamer sensörü, ksilenol turuncu tahlil alternatif (aynı zamanda tamamlayıcı olabilir) 'dir 9.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    Not: Moleküler biyoloji dereceli su Tüm tampon ve çözelti preparatlar kullanılır. Tüm atılabilir tüpleri (mikrosantrifüj ve PCR) ve pipet uçları DNase- ve RNaz-ücretsiz. Kullanmadan önce tüm kimyasalların malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) danışın. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) kullanılması önemle tavsiye edilir.

    Aptamer Stok çözeltiler hazırlanması 1.

    1. Ticari polydeoxynucleotide 2 ipliklerini satın alın. yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile saflaştırma her iki hat sipariş.
      1 (Gd-aptamer) Strand:
      5 '- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3'
      Dizin 2 (QS):
      5'-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / 3 '
    2. Gd-aptamer ve QS 100 uM bireysel hisse senedi çözümleri yapmak için su her telini eritin.
    3. -20 ° C'de bu çözümleri saklayın. çözümler şimdiye kadar, 3 yıl boyunca stabildir.
    4. Freez en aza indirmek içinE-çözülme döngüleri, 10 ul alikotları stok solüsyonları saklayın.

    2x Gd-sensör Çözüm 2. Hazırlık

    1. Deney tamponu hazırlayın (20 mM HEPES, 2 mM MgCI2, 150 mM NaCI, 5 mM KCI). NaOH ve HCl ile pH değeri için ~ 7.4 ayarlayın ve 0.2 um PES membran ile steril tek kullanımlık şişe üst filtreler aracılığıyla filtre. Steril şişelerde saklayın. filtre edilmiş ve (oda sıcaklığında) saklandığı takdirde, tampon, şimdiye kadar, 2 yıl stabildir.
    2. deney tamponu 497 uL ve (adım 1.2 dan itibaren) QS stok solüsyonu 2 uL (adım 1.2 dan itibaren) Gd-aptamer stok solüsyonu 1 mcL seyreltin. bir girdap kullanarak iyice karıştırın. 2x Gd sensör çözelti içindeki konsantrasyonu, sırasıyla, 200 nM ve 400 nM.
      NOT: - kalibrasyon eğrisi ve kontrast madde çözümleri için 3+ Gd 7 değişik konsantrasyonlarda bu adımda hazırlanan 2x Gd-sensör çözeltisinin hacmi 6 test etmek için yeterli 500 uL olduğunu(Aşama 3). Her bir numune, 384 oyuklu plaka çoğaltma kaynaklarıdır verecektir.
      1. Test edilmelidir GD 3+ çözümlerin sayısına göre 2x Gd-sensör çözümünün ses seviyesini ayarlayın.
    3. Her tüpe 50 uL ile 9 PCR tüpleri içine 2x Gd-sensör çözüm aktarın. bir termal döngü tüpler yerleştirin.
    4. 95 ° C'ye kadar tüplere çözelti ısı termal döngü programı alan 5 dakika tutun ve daha sonra yavaş yavaş oranında (15 dakika ~ boyunca 25 ° C'ye kadar soğumaya çözüm ~ 0,05-0,1 ° C / s). Isıtma ve soğutma çevrimi Gd-aptamer ve QS arasında optimal hibridizasyon sağlamaktır. eksik söndürme ve sensör daha yüksek bir eşiğe Kısmi melezleme sonuçları. Bir termal döngü cihazı kullanılabilir durumda değilse, bunun yerine sıcak su banyosu kullanılarak bu süreci yürütmek.
    5. Bir kez 25 ° C'ye kadar soğutuldu, hemen çözüm kullanmak, veya hazır olana kadar (yaklaşık 2 saat kadar) termal döngüleyici içinde tutmakKullanılmış. Bir su banyosu ısısı için kullanıldığında, su yavaş yavaş oda sıcaklığına soğurken, banyo tüpleri bırakın.

    3. Floresan Kalibrasyon eğrisi oluşturmadan ve Gd kontrast maddesi çözeltisi içinde 3+ Unchelated Gd varlığını tespit

    1. Deney tamponu içinde bir katı GdCl 3 (adım 2.1 ile aynı tamponu) içinde çözülür.
    2. Seri seyreltme yoluyla, kalibrasyon eğrisi (2x çözümleri) için nihai istenen konsantrasyonlarda iki katı 100 uL mikrosantrifüj tüpler 6 farklı Gd 3+ çözümleri her hazırlamak.
      1. Örneğin, 0 bir kalibrasyon oluşturmak için, 50, 100, 200, 400 (Resim GdCl 3 sadece tampon), ve Gd 3+ 800 nM, 0, 100, 200, 400, 800, 1600 nM içeren çözeltiler hazırlanması iyonu. Emin negatif kontrol olarak 0 nM Gd 3+ ile 'boş' her zaman dahil olun.
    3. Test için kontrast ajanı çözülürdeney tamponu içinde ed. Seri seyreltme ile kontrast maddesi çözeltilerinin 2 ya da 3 farklı konsantrasyondan hazırlayın.
      NOT: kontrast madde solüsyonu 3 farklı konsantrasyonlarda test tavsiye edilir. Bu durum, bu konsantrasyon, doğrusal aralığı içinde olduğunu sağlamaktır. doğrusal bir ilişki göstermez test örnekleri, kontrast madde konsantrasyonlarını azaltmak durumunda kullanılır.
    4. termal döngü dışına adım 2.5 den 2x Gd-sensör çözeltisi içeren PCR tüpleri atın.
    5. 2x Gd-sensör çözeltisi içeren 9 PCR tüpleri 6 içine adım 3.2 her Gd 3+ çözeltisi 50 uL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Her bir PCR tüpü artık istenen Gd 3+ konsantrasyonunu test etmek için, 100 nM Gd-aptamer ve 200 nM QS içerir.
    6. 2x Gd-sensör çözeltisi içeren Kalan PCR tüpleri için, adım 3,3 kontrast madde çözümleri 50 mcL ekleyin. yukarı pipetleme ve birkaç kez aşağı iyice karıştırın.
    7. s inkübeOda sıcaklığında yaklaşık 5 dakika için PCR tüplerine Çözeltileri. En fazla 30 dakika süreyle beklemeye bırakıldı olabilir.
    8. 384 oyuklu bir plakaya her bir tüpe 45 uL aktarın. Her bir PCR tüpü yinelenen kuyu verecektir.
    9. Bir levha okuyucu üzerinde her bir floresan kaydedin. tedarikçinin Web sitesinde listelenen Gd-sensör tasarımında kullanılan fluorofor (FAM), sırasıyla 495 ve 520 nm eksitasyon ve emisyon maxima vardır. levha okuyucu monochromator- veya filtre bazlı olmasına bağlı olarak, uygun eksitasyon ve emisyon dalga boylarını veya filtreler seçin.
    10. Gd 3+ konsantrasyonuna karşı keyfi floresan birimlerinin (AFU) floresan grafiği çizilir.
    11. Gd 3+ konsantrasyonuna karşı floresan kat değişikliği olarak grafik çizilir. (Gd 0 nM 3+) ile 'boş' çözümün AFU her konsantrasyon AFU bölerek floresan katlık değişime hesaplayın. floresan kat değişim n sağlayacaktırSonuçların ormalization, AFU ekran bazı periyodik (farklı günlerde, vb) varyasyonlar gerekir.
    12. 0 nM GdCl 3 (sadece tampon) içeren çözüm kontrast maddeyi içeren çözeltinin ve 'boş', floresan emisyonunu karşılaştırın.
      Not: GBCA çözeltisinin bir daha yüksek floresans kontrast madde, daha fazla saflandırma gerektirebilir unchelated Gd 3+ varlığını ima eder. Unchelated Gd 3+ miktarı, adımı 3.10 veya 3.11 inşa kalibrasyon eğrisi kullanılarak tahmin edilebilir.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Unchelated Gd 3+ mevcudiyetinde Gd sensör çözeltisi tipik bir floresans değişimi, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Emisyon flüoresan kat değişim (Şekil 2A) ya da rasgele birimlerde okuma ham floresans (Şekil 2B) olarak grafiğe edilebilir (SKB). Her iki araziler> 3 uM sinyalin 1 uM ve doygunluk altında Gd konsantrasyonları için doğrusal aralık 3+ ile çok benzer kalibrasyon eğrileri elde. Saptama sınırı 3 bir sinyal-gürültü oranına sahip ~ 100 nM'dir.

    Çevrede GBCA içeren solüsyonlar, unchelated Gd 3+ varlığı 'boş' çözelti ile kıyaslandığında sensörün bir floresan artışı tercüme edilecektir. Gd-DOTA kompleksi, diğerinden daha yüksek saflıkta biri 2 farklı gruplar çözümlerinde floresan değişiklikleri, gösteri vardırn Örnek sonuçlar örnek olarak (Şekil 3). Gd-DOTA (gadoteric asit) ticari bir kontrast madde bulunan bir organik bağın DOTA çevrili Gd bir gadolinyum kompleksi 3+ olduğunu. Yüksek saflıkta toplu Gd-DOTA 20 mM emisyon kadar önemli bir artış göstermez. Unchelated Gd 3+, mevcut olduğu zaman, hatta 5 mM nin altında Gd-DOTA konsantrasyonlarda belirgindir bir değişiklik gözlenmiştir. Veri noktaları sensörünün floresans kat değişiklik olarak çizilir, bu örnekte, unchelated Gd 3+ miktarının ölçümü Şekil 2A kalibrasyon eğrisi kullanılarak tahmin edilebilir.

    şekil 2
    Şekil 2. Temsilcisi Gd-sensör floresan kalibrasyon eğrisi araziler. Bütün veri noktaları, iki kopya halinde, en az gerçekleştirildi ve ortalama arsa değerlerihata çubukları olarak standart sapma ile ted. (A), bir kalibrasyon eğrisi, 100 nM Gd-aptamer ve 200 nm QS kullanılarak elde edilmiştir. grafik y ekseni olarak floresan kat değişiklikle çizilir. (B) y ekseni olarak rasgele birimi (SKB) ham floresan, (A) ile aynı kalibrasyon eğrisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3. Temsilcisi Gd-sensör floresan değişimi Gd-DOTA molekülünün örneklerinde unchelated Gd 3+ varlığını test. Gd-DOTA karmaşık çözümler İki farklı partiler bu arsa gösterilir, yüksek saflıkta (daire işaretleyici) ve diğer içeren unchelated Gd 3+ biri (mavi triangle işaretleyici). Her veri noktası, hata çubukları olarak standart sapma iki okumanın ortalamasıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Aptamer göre Gd-sensörü, gözlenen unchelated Gd 3+ konsantrasyonu ile orantılıdır flüoresan emisyonunda bir artışa kullanılması. Kullanılan örnek miktarı en aza indirmek için, deney, göz başına 45 uL toplam numune hacmi olan bir 384-çukurlu bir mikrolevhadaki çalıştırılabilir. Bu tasarımda, floresein (FAM) ve DABCYL (Dab) seçimi öncelikle reaktiflerin maliyeti dayanmaktadır; emisyon dalga boyu, floroforun farklı eşleştirme değiştirme ve söndürücü 11 kullanılabilir.

    Bu sensör ile en iyi sonucu elde etmek için dikkat etmek önemlidir, önemli adımlardan biridir Gd-aptamer ve QS arasında optimal hibridizasyon elde etmek için deney tamponunda 95 ° C ve yavaş soğutma (basamak 2.4) ısındığını şeritler. Daha önce protokolde de belirtildiği gibi, bir termal döngü cihazı mevcut değilse, 95 ° C'de kuluçka, bir su banyosu içinde gerçekleştirilebilir. kontrol etmek için bir diğer önemli parametre tO tampon çözümleri kompozisyonlar; Kontrast maddenin çözülmesi için aşama 2.1'de listelenen deney tamponu kullanılması tavsiye edilir, ya da deiyonize su da kullanılabilir. Bununla birlikte, olası interferents içeren çözeltiler kaçınılmalıdır. Böyle bir tampon maddesinin bir örneğin 3+ unchelated Gd koordinatlanabileceği çözünmeyen gadolinyum fosfat 12 oluşturmak üzere fosfat anyonları içeren biridir. Çökelti, bir yanlış negatif bir sonuç, sensör ile reaksiyona girmez.

    Deneylerde birkaç adım sonucu etkilemeden değiştirilebilir. İlk olarak, deneyi ve hesaplanmasını kolaylaştırmak Gd-sensör çözeltisi ve 2 x konsantrasyonlarda kalibrasyon eğrisi için, sulu GdCl 3 hem de hazırlanır. Eğer arzu edilirse, diğer seyreltme faktörü Gd-aptamer nihai deney konsantrasyonu ve QS sırasıyla 100 nM ve 200 nm 'de muhafaza edilir koşuluyla, (örneğin, 10 kat çözüm) kullanılabilir. İkinci olarak, deney tamponu DOES tam pH 7.4 olmak zorunda değildir. 7 arasında herhangi bir değer - 7.4 sürece aynı tampon deney boyunca kullanıldığı gibi, istenen floresan artışı üretecektir. floresan emisyon okuma elde edilir kez Üçüncüsü, veri noktaları keyfi biriminde ham floresan (AFU) veya floresan kat değişikliği olarak ya çizilir olabilir. Floresan kat değişimi hesaplamak için, her bir konsantrasyonu ham fluor ışıma değerleri negatif kontrol (0 nM Gd 3+) ve (bölünmüş) okuma normalize edilir. Şekil 2A ve B de gösterildiği gibi, her iki bölgede de floresan emisyonu eğilimleri hemen hemen aynıdır. plaka okuyucu farklı zamanlarda kaydedilen ham okumaları bazı varyasyonları görüntüler ise kat değişim verilerini analiz etmek daha uygun bir yol olabilir. laboratuvar florometre değil, bir plaka okuyucu ile donatılmış Son olarak, her bir veri noktası yerine mikroplaka, bir küvet kullanılarak ölçülebilir. boyut o bağlıMevcut küvetler f deneyde hazırlanan solüsyonların hacimleri ayarlanabilir gerekebilir.

    Burada bildirilen yöntem chromatographic- bir alternatif sunuyor ve / veya sulu Gd 3+ tespiti için spektrometresi tabanlı teknikler. ikincisi ile karşılaştırıldığında, Gd-sensör tahlil birden türlerin aynı anda tespiti için hassasiyet, doğruluk ve yeteneği bakımından daha sınırlıdır. Öte yandan, spektroskopik tabanlı sensör, muhtemelen, daha kolay elde edilebilir, daha kısa bir zaman süresi içinde gerçekleştirilebilir olabilen bir aletleri gerektirir ve numune hazırlama az. kontrast maddesi, sadece Gd sensör çözeltisi ile karıştırılır, bir tampon çözeltisi içinde eritilebilir, ve floresan emisyonu, ölçtük. Ayrıca, sensör ksilenol turuncu göstergesi (iki yöntem arasındaki büyüklük farkı yaklaşık 2 siparişleri) daha 3+ unchelated Gd çok daha düşük bir konsantrasyon tespit edebiliyor ve bir sahiptirdiğer birçok biyolojik olarak önemli ve geçiş metal iyonları üzerinden 9 Gd 3+ yüksek seçicilik.

    Bazı deneysel koşullar altında kullanımını kısıtlayabilir Bu testin iki dezavantajları vardır. Bir sınırlama sensörü 3+ Gd için spesifik değildir olmasıdır; bu 9 (örneğin Eu 3+ ve Tb 3+ gibi) diğer lantanide iyonları bir yanıt gösterir. Bununla birlikte, bu yaygın olarak kontrast ajanları bulunan iyonlar ya da biyolojik sistemler değildir ve bu nedenle, bunların parazit minimumdur. Dikkat ikinci nokta Gd 3+, Gd sensör flüoresan emisyonunda yavaş bir azalma daha yüksek konsantrasyonlarda (10 '' in yukarda uM) görülmektedir olmasıdır. Lantanid iyonları ile su verme etkisi saptanması ve 14 ölçülmesi için bir teknik olarak kullanılan bir iyi belgelenmiş bir 13'tür. Bu Gd yüksek konsantrasyonlarda ölçmek için sensör programı sınırlarken 3+

    Bu çalışmada, sulu çözelti içinde, toksik unchelated Gd 3+ tespit edilmesi için uygun bir floresans bazlı tekniğin kullanımı tarif edilmiştir. Bu deney, özellikle in vitro deneyler için sentez ve formülasyon sırasında, gadolinyum bazlı kontrast madde, saflık erken evre değerlendirilmesi için kastedilmektedir. tanısında manyetik rezonans görüntülemenin mevcut büyüme ile yeni kontrast maddelerin giderek artan sayıda, sürekli olarak tasarlanmış ve test edilmektedir. Aptamer göre Gd-sensör hızlı ortam pH değerindeki sulu solüsyon içinde reaksiyona girmemiş ya da ayrışmış Gd 3+ alt mikromolar konsantrasyonlar varlığını tespit etmek için bir vasıta sağlayarak bu geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Sensör, diğer üç değerli lantanid iyonları ile çapraz reaktivite gösterir Bundan başka, uygulama olabiliraraştırma bu alanlarda uzatıldı.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Gd-aptamer IDTDNA Input sequence and fluorophore modification in the order form A fluorophore with a different emission wavelength may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Quenching strand IDTDNA Input sequence and quencher modification in the order form A different quencher for optimal energy transfer from the fluorophore may be used. The aptamer may also be ordered from another company.
    Molecular biology grade water No specific manufacturer, both DEPC or non-DEPC treated work equally well
    Gadolinium(III) chloride anhydrous Strem 936416 Toxic
    HEPES Fisher Scientific BP310-500
    Magnesium chloride anhydrous MP Biomedicals 0520984480 - 100 g
    Sodium Chloride Acros Organics 327300025
    Potassium chloride Fisher Scientific P333-500
    Sodium hydroxide, pellets Fisher Scientific BP359 Corrosive
    Hydrochloric acid Fisher Scientific SA49 Toxic and corrosive
    384-well low flange black flat bottom polystyrene NBS plates Corning 3575 Plates which are suitable for fluorescence reading are required.
    Nalgene Rapid-Flow sterile disposable bottle top filter Thermo Scientific 5680020 The bottle top is fitted with 0.2 micron PES membrane
    Disposable sterile bottles 250 mL Corning 430281 A larger or smaller bottle may be used
    1.5 mL microcentrifuge tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    0.2 mL PCR tubes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Micropipets No specific manufacturer
    Pipet tips (non filter) of appropriate sizes No specific manufacturer, as long as they are DNAse and RNAse-free
    Equipment
    Plate reader Biotek Synergy H1 Plate readers from other manufacturers would work equally well

    References

    1. Shen, C., New, E. J. Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents. Curr. Opin. Chem. Biol. 17, (2), 158-166 (2013).
    2. Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists. Tex. Heart Inst. J. 37, (5), 508-515 (2010).
    3. Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. MRI contrast agents: basic chemistry and safety. J Magn. Reson. Imaging. 36, (5), 1060-1071 (2012).
    4. Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review. Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).
    5. Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C. Invest. Radiol. 43, (12), 817-828 (2008).
    6. Loreti, V., Bettmer, J. Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS. Anal. Bioanal. Chem. 379, (7), 1050-1054 (2004).
    7. Telgmann, L., et al. Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater. Environ. Sci. Technol. 46, (21), 11929-11936 (2012).
    8. Cleveland, D., et al. Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations. Anal. Bioanal. Chem. 398, (7), 2987-2995 (2010).
    9. Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution. Anal. Bioanal. Chem. 408, (15), 4121-4131 (2016).
    10. Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note. Contrast Med. Mol. Imaging. 1, (5), 184-188 (2006).
    11. Johansson, M. K. Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers. Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).
    12. Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. A primer on gadolinium chemistry. J. Magn. Reson. Imaging. 30, (6), 1240-1248 (2009).
    13. Shakhverdov, T. A. A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands. Opt. Spectrosc. 95, (4), 571-580 (2003).
    14. Brittain, H. G. Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence. Anal. Chem. 59, (8), 1122-1125 (1987).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter