인간 인플루엔자 바이러스 감염의 Zebrafish의 모델을 사용하여 항 바이러스 약품을 화면 및 호스트 면역 세포 반응의 특성을

Immunology and Infection

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Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

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Abstract

Introduction

세계 보건기구 (WHO)에 따르면, 인플루엔자 바이러스는 성인의 5 ~ 10 % 매년 어린이의 20 ~ 30 %를 감염 심각한 질병의 3~5,000,000가지 경우가 발생할 전세계 1 최대 50 만 명이 사망. 독감에 대한 연간 예방 접종은 질병을 예방하는 가장 좋은 옵션이 남아있다. 세계 보건기구 (WHO) 행동 계획 등의 노력은 질병률 및 계절 인플루엔자 발병 2와 연관된 사망률을 감소시키기 위해 더 강력한 백신 전략에 사용 계절 백신 백신 생산 능력 및 연구 개발이 증가하고있다. 뉴 라미니다 아제 억제제 (예 : 자 나미 비르와 오셀 타미 비르 (Oseltamivir)) 같은 항 바이러스 약물은 일부 국가에서 사용할 수 있으며, 발병 3, 4, 5의 첫 48 시간 내에 투여시, 완화 증상에 효과가 입증하고있다. 글로벌 노력에도 불구하고, 계절 인플루엔자의 봉쇄 OU인플루엔자 바이러스 항원 드리프트 종종 바이러스 (6)의 게놈 변화에 적응하기 위해 현재의 능력을 초과하는 tbreaks이 시점에서 강력한 도전 남아있다. 바이러스의 새로운 균주를 대상으로 백신 전략을 미리 개발해야하고 때로는 인해 결국 독감 시즌에 우세 균주의 종류에 예상치 못한 변화에 최적의 효과보다 렌더링됩니다. 이러한 이유로, 감염을 함유 사망률을 감소시키기위한 대안적인 치료 전략을 개발되어야 할 필요가있다. 호스트 바이러스 작용의 더 나은 이해를 달성함으로써, 신규 항 인플루엔자 의약품 및 치료 보조제 (7, 8)를 개발하는 것이 가능하다.

인간의 호스트 인플루엔자 바이러스 (IAV) 상호 작용은 복잡하다. 인간 IAV 감염의 여러 동물 모델을 포함하여, 숙주 바이러스의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻기 위해 개발되어왔다마우스, 기니아 피그, 면화, 쥐, 햄스터, 흰 족제비와 원숭이 9 보내고. 호스트 IAV 역학의 이해를 개선 한 중요한 데이터를 제공하는 한편, 각각의 모델 생물은 인간 의학에 결과를 해석 할 때 고려해야 할 중요한 결점을 가지고있다. 인간 인플루엔자 9 분리 감염 예를 들어, 가장 널리 사용되는 모델이다 생쥐는 쉽게 IAV 유도 감염 증상이 없다. 마우스는 마우스 상피 세포 대신 인간 상피 세포 (10) 상에 표현되는 α-2,6- 시알 산 결합의 α-2,3- 결합 시알 산을 발현 때문에 인간 인플루엔자에 대한 자연 친 화성 균주 부족하기 때문이다. 인간 IAV에 존재하는 헤 마글 루티 닌 단백질은 바람직하게는, 결합하여 수용체 - 매개 엔도 시토 시스 9, 11 내지 α-2,6- 시알 산 결합을 함유하는 숙주 세포를 입력 균주 12, 13>까지. 결과적으로, 이제 인간 인플루엔자 마우스 모델을 개발주의 인간 질병의 양상 요점을 되풀이 질환 표현형을 달성하기 위해 인플루엔자 적합한 균주 마우스의 적절한 변형을 짝 수행되어야 함을 허용한다. 반면, 흰 족제비의 상기도의 상피 세포가 인간 세포 (14)과 유사 α-2,6- 시알 산 결합을 갖는다. 감염된 흰 족제비는 인간과 조류 인플루엔자 바이러스 (14)의 병원성 및 전달 특성, (15)을 포함하여 인간의 질병에서 관찰되는 병리 및 임상, 많은 기능을 공유 할 수 있습니다. 또한 백신 유효성 시험에 매우 의무가 있습니다. 그럼에도 불구하고, 인간 인플루엔자의 흰 족제비 모델은 통계 signifi의 획득을 주로 크기와 사육 비용에 관한 몇 가지 단점이있다캔트 데이터 도전은. 또한, 흰 족제비 이전 테스트 효율이 어려워 약물 동력학, 생체 이용률 및 독성에 차이를 표시하고있다. 예를 들어, 흰 족제비는 M2 이온 채널 억제제 아만타딘 (16)에 독성을 나타낸다. 따라서, 인간 IAV 감염에 대한 질문을 연구하는 동물 모델을 선택하는데, 그것의 고유의 장점과 한계 및 조사하에 호스트 바이러스의 상호 작용의 측면을 고려하는 것이 중요하다 분명하다.

제브라 피쉬, 다니오 레 리오는 <면역 반응을 호스팅 미생물 감염을 조사하는 독특한 기회를 제공 동물 모델, 잠재적 약물 치료 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23이며SUP 클래스 = "외부 참조"> 24, 25, 26, 27, 28. 제브라 피쉬 세포의 표면 상에 α-2,6- 연결된 시알 산의 존재는 감염 연구에서 부담 및 IAV (19)의 형광 리포터 균주를 사용하여 생체 내에서 촬상 된 IAV에 감수성을 제시 하였다. IAV 감염 제브라에서 바이러스 ifnphi1MXA 사체의 발현 증가는 선천성 면역 반응을 자극되었다는 것을 지시하고, 부종 및 조직 파괴를 포함 IAV 감염 제브라 의해 표시되는 병리는 인간 인플루엔자 감염에서 관찰되는 것과 유사 . 또한, IAV 바이러스 뉴 라미니다 아제 억제제 자 나미 비르 제한 사망률과 제브라 피쉬 (19)의 감소 바이러스 복제.

이 보고서에서, 시스템을 시작하기위한 프로토콜제브라 피쉬 배아에서 IC IAV 감염 설명한다. 증명의 원리와 같은 임상 적 투여 량 나미 비르를 사용하여, 항 바이러스 작용에 대한 심사 화합물이 제브라 피쉬 IAV 감염 모델의 유용성이 입증된다. 또한, 상기 제브라 지역화 상피 IAV 감염을 발생시키기위한 프로토콜, 해부학 적 및 기능적으로 유사한 포유류의 폐 21, 29, 30, 31 인 것으로 간주되는 기관을 블래 수영 설명한다. 이 국부 IAV 감염 모델을 이용하여, 감염 부위에 호중구 모집 IAV 감염 및 염증 호중구 생물학의 역할에 대한 연구를 가능하게 추적 될 수있다. 이 모델은 인간 제브라 IAV 감염 기존 동물 모델을 보완 소분자 때문에 개선의 가능성의 면역 세포 반응을 시험하는데 특히 유용tatistical 전력, 높은 처리량 분석에 중등도 용량 및 능력이 빛을 현미경과 면역 세포의 행동과 기능을 추적 할 수 있습니다.

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Protocol

모든 작업은 바이오 안전성 레벨 2 (또는 BSL2) 질병 통제 (CDC) 및 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설립 지시에 따라 미국 센터에 의해 기술 표준을 사용하여 수행해야합니다. 안전 및 규정 준수를 보장하기 위하여 적절한 관리들과 협의하시기 바랍니다.

1. Zebrafish의 관리 및 유지 보수

  1. 제브라 피쉬를 생성하고 실험 배아의 필요한 번호를 수집합니다. 때 Adatto 등의 알에 의해 설명 된 것과 같이 필요한 대량 번식 탱크. 32 발달 스테이지 배아 다수를 수집하는데 이용 될 수있다.
  2. 배아는 낮은 밀도에서 깊은 배양 접시에 원하는 발달 단계 (지역화, 수영 방광 감염에 대한 전신 IAV 감염 [섹션 3] 또는 오일 후 수정에 대한 48 시간 후 - 수정 [4 장] ()까지 개발할 수 있도록 < (6)을 포함하는 살균 계란 물에 28 ° C에서 100 배아 / 요리)증류수 0 μg의 / ㎖ 바다 소금 (예를 들어, 인스턴트 오션).
    1. 플라스틱 전송 피펫과 함께 죽은 태아를 제거하고 최적의 건강과 발전을 보장하기 위해 달걀 물은 매일 변경합니다.

재료 및 시약 2. 준비

  1. 증류수와 오토 클레이브에 Tricaine-S의 4 ㎎ / ㎖ 주식 솔루션 (7.0-7.4로 산도를 조정)을 준비합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
  2. 마이크로 피펫 풀러 사용하여 필라멘트와 붕규산 유리 모세관을 당겨 (다음과 같은 설정으로 예를 들어 마이크로 피펫 풀러를 : 압력 설정 = 100, 열 = 550, 당겨 = [값 없음], 속도 = 130 시간 = 110).
    주 : 앞서 바늘을 트리밍하기 위해 바늘이 바늘의 선단에 테이퍼 시작되는 지점까지의 길이는 약 12-15mm 것이다. 이 환경 설정 및 응용 프로그램을 기반으로하지만, 다를 수 있습니다. 더 긴, 더 점진적으로 테이퍼 때문에 배아를 관통하는 증가 된 능력과 감소 된 리의 더 바람직 할 수있다바늘의 휨이나 파괴의 SK.
  3. 전자 레인지를 사용하여 100 ㎖ 달걀 물에 아가로 오스 2 g의 용융. 줄과 깊은 페트리 접시에 아가로 오스 용융이 응고 할 수 있도록 부어 배아를 주입하기에 번호판을 확인합니다.
  4. 클레아없는 물에 자 나미 비르의 10 ㎎ / ㎖의 재고를 확인하십시오. -20 ° C에서 나누어지는 및 동결.
  5. 배아는 아가로 오스 장착하기 위해 전자 레인지를 사용하여 50 ml의 달걀 물에 0.5 g 아가로 오스를 용융. 촬영하는 동안 사용할 준비가 될 때까지 50 ℃에서 물을 욕조에 유지합니다.

3. 전신 IAV 감염 (48 시간 후 수정)

주의 : 모든 연구 인력 IAV와 함께 작업을 시작하기 전에 예방 접종에 대한 자신의 상사와 의사와상의해야합니다.

  1. 수동 # 5 집게를 사용하여 실험 당일 배아 dechorionate. 제거 / ㎖ Tricaine 솔루션 200 μg의의 과정에서 부상 된 배아를 안락사주의하십시오.
  2. 준비 오미세 주입을위한 F IAV
    주 : 피쉬 태아 감염 도시 된 균주 인플루엔자 A / PR / 8 / 34 (H1N1) (APR8) 인플루엔자 X-31 A / 아이치 / 68 (H3N2) (X-31) 및 형광 리포터있다 인플루엔자 균주 NS1-GFP 33. APR8 및 X-31, 그리고 다른 균주에 대한 자세한 내용은, 인플루엔자 연구 데이터베이스에서 찾을 수 있습니다
    1. 이전 34, 35 설명한 바와 같이 발육 계란에 IAV의 NS1-GFP의 피로를 전파. 수집, 나누어지는 및 -80 ° C에서 뇨 IAV를 포함하는 유체 및 저장을 역가. APR8 사전 역가와 X-31 바이러스는 시중에서 구입할 수 있습니다.
      1. 감염 직전 빠르게 장갑을 낀 손에 IAV 나누어지는을 해동 후 빨리 역가의 손실을 줄이기 위해 얼음에 배치합니다.
    2. 바이러스 성 희석
      1. APR8 또는 X-31 바이러스를 사용하는 경우, 3.3 × 10 6 계란 감염 량 50 % (EID50)에 희석 / ㎖ 살균, 얼음처럼 차가운 PBS의 supplem에서0.25 % 페놀 레드 ented은 층류 후드 (시각화에 도움). 동시에 0.25 % 페놀 레드와 멸균 PBS가 포함 된 컨트롤을 설정합니다.
      2. NS1-GFP 스트레인 (33)를 사용하는 경우, ~ 살균, 얼음처럼 차가운 PBS가 포함 된 0.25 % 페놀 레드 NL 당 1.5 × 10 2 플라크 형성 단위 (PFU)는 층류 후드에 (시각화에 도움)에 희석. 동시에 0.25 % 페놀 레드 멸균 PBS에 바이러스처럼 희석 감염되지 않은 닭 계란의 뇨 유체를 포함하는 제어를 설정합니다.
      3. 사용할 준비가 될 때까지 얼음에 IAV을 유지한다.
    3. 사용하기 직전에 microloader 팁을 사용하여 미세 주사 바늘로 피펫 바이러스 솔루션입니다. 사출 장치 (예 MPPI -3- 압입 시스템)의 해당 홀더 미세 주사 바늘을 삽입한다.
    4. 스테레오 현미경으로 볼 때, 부드럽게 날카로운, 멸균 # 5 집게와 미세 주사 바늘 끝을 클립.
      참고 : 그것은 recommen입니다DED 마이크로 인젝션 팁이 점진적으로 잘릴 수있다.
    5. 가압 주입 시스템의 풋 페달 우울 및 교정 마이크로 미터 슬라이드 현미경 침지 기름 방울로 주입. 드롭의 직경을 측정합니다. 상기 수학 식을 이용하여 방울의 부피를 계산 V = V는 체적 NL이고 R이 μm의 반지름이다 / 3πr 3 4.
      주 : 액적 직경이 너무 작은 경우, 추가로 유리 클립핑 될 수 있거나, 압력 및 타이밍 설정을 조정할 수있다. 액적 직경이 너무 크면, 압력 및 타이밍 설정을 조정할 수있다.
    6. 압력 분사 압력 및 타이밍 설정을 조정하고 /하거나 목적하는 주입량 (일반적으로 1-3 NL)에 도달 할 때까지 바늘 끝을 reclip. 40 및 80 밀리 초 사이에 20, 30 PSI 및 펄스 지속 시간과 설정 압력의 설정은 일반적이다. 이 모세관 압력 카운터하지만 IAV (넷 제로 압력)을 누출되지 않도록 압력을 다시 조정한다.
  3. 주입을위한 배아를 맞 춥니 다
    1. 200 μg의 / ㎖ Tricaine에 dechorionated 배아를 마취.
    2. 이동이 중단되면, 플라스틱 피펫 (2.3 절에서 제조) 2 % 아가로 오스 판에 10 ~ 20 배아를 전송합니다. 초과 액체를 제거하기 위해 플라스틱 피펫을 사용합니다.
    3. 조심스럽게 화재 - 광택 및 밀봉 붕규산 유리 모세관에 미세 주입을 위해 배아를 맞 춥니 다. 퀴비에의 덕트 또는 후방 추기경 정맥은 미세 주사 바늘 (그림 1A)에 부합되도록 부드럽게 동양 배아를 스테레오 현미경을 사용.
  4. IAV 미세 주입
    1. 조심스럽게 퀴비에의 덕트 또는 후방 추기경 정맥에 미세 주사 바늘을 삽입합니다. 배아 (그림 1A)의 순환 시스템에 IAV의 원하는 볼륨을 주입하기 위해 발 페달을 우울. 필요한 경우 배아 번 이상 삽입 될 수있다.
      참고 : 주입 루스는 순환과 DISTRIB에 휩쓸한다몸 전체 uted. 주입 부피가 주사 부위에서 수집하는 경우, 실험과 안락사에서 배아를 제거합니다.
    2. 선택 바이러스의 변형에 특정 제어 솔루션을 다른 배아에 주사를 반복합니다. APR8 및 X-31의 경우, 섹션 3.2.2.1에 설명 된 컨트롤을 사용; NS1-GFP를 들어, 섹션 3.2.2.2에 설명 된 컨트롤을 사용합니다.
  5. 33 ° C에서 인큐베이터에서 살균 계란 물과 장소를 포함하는 라벨이 배양 접시로 전송 배아.
    참고 : 감염된 태아는 향상된 바이러스 복제를 지원하기 위해 33 ° C에서 성장한다. 또한 33 ° C에서 배양보다 자세히 IAV 감염이 발생 여기서, 외부 환경의 낮은 온도에 밀착하고있는 사람 상기도의 온도를 모방. 배아는 넓은 온도 범위 (34)에 적응 할 수 있습니다.

4. 지역화, Tg가에서 수영 방광 IAV 감염 (MPX : mCherry)

  1. 미세 주입을위한 IAV의 준비
    1. 3.2 절에 설명 된대로 NS1-GFP 변형 및 제어 주입 솔루션을 희석.
    2. 2.2 절에 설명 된대로 바늘을 준비합니다.
    3. Tg는 (MPX : mCherry)을 맞 춥니 다음을 제외하고 3.3 절에 설명 된대로 팽창 수영 방광을 포함하는 35 애벌레. 바늘이 부레 관통하고 이전 36 (도 2a)에 기술 된 바와 같이 바이러스, 부레의 후방에 증착 될 수있는 방식으로 정렬 유충.
  2. IAV 미세 주입
    1. 조심스럽게 부레에 미세 주사 바늘을 삽입하고 구조 (그림 2A)의 후방을 향해 원하는 볼륨 (예 : 5 NL)를 주입.
      주 : 주입 덩어리가 후방으로 수집해야하고, 부레의 공기 방울은 ㄱ한다전자는 앞으로 변위. GFP 발현은 3 시간의 주입 후 관찰되기 시작한다.
    2. 섹션 3.4.2에 설명 된대로 선택 바이러스의 변형에 특정 제어 솔루션을 반복 주사.
  3. 33 ° C에서 인큐베이터에서 살균 계란 물과 장소를 포함하는 배양 접시에 애벌레를 전송합니다.

5. 항 바이러스 약물 치료

주 : 프로토콜은 아래 이전에 가보 등에 도시 된 자 나미 비르 치료에 대해 설명합니다. 19. 이 프로토콜은, 다른 항 바이러스 약물을 스크리닝 수정 96 웰 플레이트, 고 스루풋 포맷 여러 화합물을 선별하도록 변형 될 가능성이있다 할 수있다.

  1. 3 시간 게시물 감염에서, 0, 16.7 또는 33.3 NG / ㎖ 자 나미 비르를 포함하는 살균 계란 물과 계란 NS1-GFP-의 물과 제어에 감염된 물고기를 교체합니다.
    주 : 이러한 농도는 fo를 달성 생리적 수준을 복제하도록 시도하기 위해 선택되었다인간의 명 (하루에 두 번 100, 200, 또는 600 ㎎, IV, 하루에 두 번 또는 흡입 10 ㎎,)에서 나미 비르의 llowing 관리. 인간 환자의 혈청 농도는 9.83에서 45.3 NG / ㎖ 36였다.
  2. 오일의 과정 동안, 달걀 물마다 12 시간을 변경하고 자 나미 비르의 적절한 양을 포함하는 살균 계란 물을 교체합니다.
  3. 감염의 과정을 추적 할 수 있습니다.
    1. 200 μg의 / ㎖ Tricaine에 제브라 피쉬를 마취. 시각적으로 IAV 감염 및 제어 물고기 사이의 약물의 다른 농도에 몰입 물고기 중 감염 패턴의 차이를 관찰 스테레오 형광 현미경으로 GFP 발현을 모니터링합니다.
    2. 오일의 과정을 통해 이환율과 사망률을 추적 할 수 있습니다.
      1. 혼수의 증상과 부종의 증거, 색소 침착의 차이, 안구 및 두개 안면 기형, 그리고 전만 포함하여 질병 병리학 관련 감염의 역학에 대한 기록 관찰. 질병 병리학일반적으로 주입 된 바이러스의 양에 따라 24 ~ 48 시간의 후 분사에 제어 감염된 물고기에서 분명해진다. 이미지를 24 시간 후 분사를 수집합니다.
      2. 오일 후 감염에 대한 모든 24 시간은, 죽은 병적 인, 건강한 유생의 수를 기록한다. 사망은 심장 박동 식별의 부재에 의해 정의된다. 원하는대로 데이터를 플롯. 예를 들어, 건강 병태 또는 죽은 물고기의 백분율 누적 막대 그래프로 플롯 된 데이터는, 상기 X 축, Y 축 및 처리 군에 플롯. (19)
        참고 : 사망률은 카플란 - 마이어 생존 추정에 의해 획득 할 수있다. 응용에 따라, 상기 병리학 적 관찰 기능에 따라 병적 상태의 정도를 수치화 할 수있다 스코어링 매트릭스를 포함 채점 물고기 이환율 대한 대안 적 방법을 개발하는 것이 적절할 수있다.
      3. 적절한 통계 분석을 적용 할 통계에 문의하십시오.

6. 호중구 마이그레이션

참고 :이 프로토콜은 아래의 지역화, 상피 IAV 감염 다음 부레에 호중구의 이동을 추적하는 방법을 설명합니다. 기재된 방법은 유전 적 및 화학적 조작의 효과를 테스트하기 위해 수정 될 수있다. 이 기술을 사용하여, IAV 감염 동안 호중구 동작의 기초가되는 메카니즘을 특성화하는 것이 가능할 것이다.

  1. 이미징을위한 Zebrafish의 장착
    1. 애벌레를 마취하는 200 μg의 / ㎖ Tricaine에 이미지화한다.
    2. 계란 물 (~ 50 ~ 100 μL)의 작은 방울에 잘 (24)의 웰에 NS1-GFP에 감염된 유충, 유리 바닥 판 : 개인의 Tg (mCherry MPX)을 전송합니다. 다른 IAV 감염 및 제어 물고기와 반복합니다.
    3. 천천히 큰 거품을 소개 않도록주의하면서, 각 웰 (섹션 2.5) 1 % 아가로 오스 배아 설치 미디어를 추가 할 수 있습니다.
      1. 그것의 측면 상에 장착되도록 부드럽게 유충의 위치를 ​​조정한다.케이크와 헨리 (37)는 필라멘트와 붕규산 유리 모세관에 장착 제자리에 superglued하는 곤충 핀을 사용하여이 응용 프로그램에서 잘 작동 프로브를 확인하는 방법에 대해 설명합니다.
    4. 아가로 오스가 경화되면, 부드럽게 200 μg의 / ㎖ Tricaine을 포함 달걀 물을 각각의 우물을 입력합니다.
    5. 공 초점 현미경으로 20 배 대물 렌즈를 사용하여 시야 및 형광 이미지의 스택 시리즈 아리조나 캡처 수영 방광에 초점을 맞추었다.
      1. 그들은 모든 가시적 관찰 녹색 및 적색 형광을 포착하도록 상한 및 하한을 설정한다.
      2. ≤ 4 μm의입니다 단계 2.0 마이크로 초 / 픽셀의 캡처 이미지. 픽셀 당 시간 증가 및 단계 사이의 거리 감소 (예 : 0.5-1.0 μm의 것은) 사진 해상도 및 품질이 향상됩니다.
      3. 층들을 병합하여 2 차원 화상을 생성한다.
      4. MPX-mCherry 양성 호중구 본 난의 수를 비교N IAV 감염 및 제어 주입 제브라 피쉬의 수영 방광.

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Representative Results

여기서, 피쉬 전신성 감염 IAV는 약효 (도 1A)를 테스트하는 방법을 나타내는 데이터를 제공한다. 48 시간의 후 수정에 배아는 바이러스 감염을 시작 퀴비에의 덕트를 통해 APR8 (도 1C, 1 층), X-31 (도 1D, 1G), 또는 NS1-GFP (그림 1H-1I)로 주입된다. 48 시간의 후 수정에 배아의 또 다른 집단은 바이러스 감염 (도 1B, 1E)에 대한 제어 역할을 주입 하였다. 48 시간 후 감염, IAV는 심낭 부종 (도 1C, 1D)과 심낭 (그림 1G)에 걸쳐 존재하는 적혈구와 순환 정지 (그림 1 층)의 증거를 전시 주입 제브라 피쉬으로. NS1-GFP, 빠르면 3 시간 포스트 감염이 관찰되었다로서 형광 현미경으로 GFP의 초기 표현을 사용. 이때 지브라 피쉬는 33.3 ng의 노출시켰다/를 뉴 라미니다 아제 억제제 자 나미 비르 ml의 용량. 이 용량은 인간 환자에게 주어진 200 mg의 용량과 거의 동일합니다. 자 나미 비르 (도 1H, 1H ')에 노출되지 제어 감염된 물고기는 부종 및 전신 GFP 발현의 특징을 나타내었다. 자 나미 비르에 노출 NS1-GFP에 감염된 유충에 총 병리학 및 GFP의 형광 (그림 1I, 1I ')를 감소가 관찰되었다. 아주 작은 변화가 난황 주머니에서 관찰하는 동안 GFP의 감소는, 유충의 몸에서 가장 눈에 띄는했다. 개선 수영 운동에 의해 입증하고 중심부에 부종의 수준을 감소, 생존 개선으로 자 나미 비르로 치료 물고기, 이하 사망률을 나타냈다. 이러한 발견은보다 광범위한 연구 19 보완 및 약물 스크리닝 모델의 값을 나타낸다.

지역화 된 제브라 피쉬 수영 방광 감염 모델 (31)는 IAV의 infe에 맞게되었습니다ction. 지역화, 상피 감염 (그림 2A)를 시작하는 애벌레 : NS1-GFP 바이러스는 5 D 후 수정의 Tg (mCherry MPX)의 수영 방광에 주입 하였다. PBS는 IAV 감염된 세포를 향해 호중구 모집의 특이성을 입증하기 위해 대조군으로 수영 방광에 주입 하였다. 수영 방광에 mCherry 표지 호중구의 모집 추적했다. 20 시간 게시물 감염, PBS 주입 컨트롤 IAV에 감염된 물고기 상대의 수영 방광으로 호중구의 상당한 마이그레이션 (도 2B, 2B ', 2C, 2C')에서 관찰되었다. 이러한 데이터는 인간 폐 호중구를 모집 것처럼 IAV는 부레로 호중구를 채용 할 수 있음을 입증.

그림 1
그림 1 : 항 바이러스 약물 치료는 제브라 피쉬의 IAV 감염의 심각도를 완화합니다. (A (B - I) 총 병리 및 IAV와 퀴비에의 덕트에 주입 제브라 피쉬 배아의 GFP의 형광. (BG) 물고기 IAV 감염과 바이러스 감염과 질병의 징후를 48 시간 게시물 감염에서 조사 하였다. (B - D) 제어 또는 IAV에 감염된 물고기의 단일 초점 평면 (측면 장착이 좌전, 지느러미 위, 4 배 확대, 스케일 바 = 500 μm의) 수집 하였다. (B) 제어 물고기는 PBS를 주입 정상적인 형태를 표시했다. (C - D) APR8 (C) 또는 X-31 (D)에 감염된 태아 일반적으로 전시 심낭 부종 (채워진 화살표). 배아는 (C)에서 분명 괴사 조직을 가지고 있었다. (E) 제어 물고기는 PBS를 주사하고 병리의 증거 (스케일 바 = 250 μm의)을 표시하지 않았다. APR8 감염 (F) 배아 순환 정지 (노치 화살촉, 스케일 바 = 250 μm의)를 표시합니다. (G) 배아는 X-31 독감 모두 표시 심낭 (노치 화살촉, 스케일 바 = 100 μm의)에 걸쳐 심낭 부종 (화살표) 및 풀링 적혈구 주입. (H, I) IAV 감염 제브라 피쉬 (스케일 바 = 200 μm의)에 항 바이러스 약물의 효과를 보여주는 대표 이미지. (H) 브라이트와 (H ') NS1-GFP (아무 항 바이러스 약물 치료)에 주입 된 배아를 보여주는 형광 이미지를. 특히 일반 추기경 정맥 지역 부종 및 GFP 발현을 확인할 수 있습니다. (I, I ') 치료는 항 바이러스 약물로 감염되고 감소이온, 특히 감소 된 바이러스 부담 나타내는 혈관, 신체의 흰 점선 내의 부종 감소 및 감소 된 GFP 발현을 포함한 환원 병리학 의해 입증. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 호중구가 현지화 IAV 감염의 사이트로 모집하고 있습니다. (A) 도식은 5 차원 후 수정에서 팽창 된 제브라 피쉬 부레에서 지역화 된 IAV 감염을 시작하는 데 필요한 주입 방법을 설명. NS1-GFP 감염 다음 부레에 (B, C) 호중구 모집. Z 스택 이미지 (μm의 4 단계)가 공 초점 현미경 (배율 20 배)에 의해 수집 하였다. 이미지는 평평두 차원에 달려있어 (측면 장착은 왼쪽 지느러미 상단 앞쪽). TG (MPX : mCherry) 제브라 피쉬 (5 D 포스트 - 수정)이 '(PBS과 빨간색 0.25 % 페놀 또는 C, C)로 희석 뇨 유체 (B, B)'NS1-GFP 주사 하였다 (7.2 × 10 2 PFU / 0.25 % 페놀 레드 뇨 유체 및 PBS에 희석 배아). 16 시간 게시물 감염에서, 호중구는 IAV 감염 부레의 존재 (C, C '녹색 형광 지역화 감염을 보여줍니다 C를'붉은 세포는 호중구 수 있습니다, 흰색 화살표 대표 호중구를 식별합니다). (B, B ') IAV 감염을 나타내는 GFP 발현의 증거 없음과 부레에 호중구없이 모집은 PBS의 뇨 유체를 주입 한 유충에서 관찰되었다. PLEASE이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

인간 숙주 병원체 상호 작용을 모델링하기 위해 작은 동물을 사용하여 얻은 효과를 최대화하기 위해, 상기 모델 시스템의 고유의 장점을 활용할 연구 질문 테스트 프레임 가설하는 것이 중요하다. 인간의 IAV 감염의 모델로, 제브라 피쉬는 높은 생산력, 광학 선명도, 약물 검사에 복종 할 의무 및 호중구 등의 면역 세포를 라벨 유전자 변형 라인의 가용성 등 여러 가지 장점을 가지고 있습니다. 제브라 피쉬는 염증과 선천성 면역 연구에 대한 마우스 모델 시스템에 대한 더욱 강력한 대안으로 개발되었다. 그들이 개발의 첫 번째 4-6주 동안 작동 적응 면역 반응이 부족하기 때문에, 제브라 피쉬의 부상과 감염 (37)에 대해 보호하는 선천성 면역 반응을 탑재합니다. 개발 초기 기간 동안, 분리 단독 선천성 면역 반응으로 인한 바이러스 반응의 메커니즘을 연구하는 것이 가능하다. 티빨간색 형광 단백질로 호중구 레이블 :의 작업은 Tg는 (mCherry MPX)와 같은 형질 전환 제브라 피쉬 라인의 개발에 의해 촉진되었다.

인간의 질병을 닮은 IAV 감염 제브라 피쉬 모델은 최근 19 설명했다. 그것은 제브라 피쉬는 IAV는, 결합 부착, 세포를 입력 친 화성을 바이러스 제공 자신의 세포에 α-2,6- 연결된 시알 산 잔기를 가지고 있음을 입증했다. 이 원고와 가보 등의 알입니다. 19, 그것을 도시 한 것을 IAV 두 가지 균주 (A / PR / 8 / 34 H1N1] 및 X-31 A / 아이치 / 68 [H3N2),뿐만 아니라 GFP 결과 재조합 NS1-GFP 균주 애벌레 제브라 피쉬의 순환 시스템에 주입 할 때 감염된 세포에서 번역, 감염 복제 및 사망률 수 있습니다. 침수를 통해 IAV에 노출이 안정적으로 작동하지 않는 바이러스의 주입이 감염 방법에 중요하다. 감염된 물고기는 전송해야33 ° C 배양기에 빨간색 바이러스 복제를 보장합니다. 인플루엔자 감염이 발생하는 인간의 호흡기는, 일반적으로 33 °의 C이므로주의하는 것이 중요하다. 제브라 피쉬 배양을위한 전형적인 온도 28 ° C에서 배양는 신뢰할 수있는 감염을 생산하기 위해 실패합니다. 또한, 제조자 또는 IAV의 배치로부터 수신되는 각 로트 인해 제브라에서 감염성 질병의 진행에 영향을 미치는 변화에 실험에 사용하기 전에 생산 테스트를하는 것이 필수적이다. 감염성 용량이 제대로 적정 할 때, IAV의 이러한 균주에 감염된 제브라 피쉬의 대다수가 점진적으로 악화, 빠르면 24 시간 후 감염 등, 부종으로 대표되는 총 질병 표현형을 전시한다, 48 시간 게시물 감염에 의해 두개 안면 이상, 72 시간 게시물 감염, 약 50 % 전만 5 D 포스트 감염에 의한 감염에 굴복한다. 48 시간 게시물 감염에서 조직 병리학는 아가미의 증거, 머리 신장 등을 포함한다간 괴사뿐만 아니라 심낭 유체의 징후. 제브라 피쉬의 IAV 감염의 예측 결과로서 이러한 발견을 설정에서는 화면 후보 항 인플루엔자 의약 화합물 후보 수있다. 이를 염두에두고 가버 외에 기재된 원래 결과에 기초하여 항 바이러스 약물의 스크리닝에 대한 원리 증명 프로토콜. 19 증명된다. NS1-GFP 형광에 의해 결정되는, 인간의 혈액에서 관찰되는 수준의 질병률의 지연된 발병을 모방하기 위해 예측 및 바이러스 복제 / 확산에 명백한 영향을 사망률 감소 된 용량으로는 뉴 라미니다 제 억제제 나미 비르를 사용하여 관찰 하였다. 제브라 피쉬 IAV 모델은 이상적으로 높은 처리량 소분자 화면에 중등도 적합하다. 감염 만 퀴비에 또는 후방 기수 정맥 덕트를 통해 순환으로 수동 주입 통해서만 발생할 수 있기 때문에, 스크린의 크기 기술자 맛 음료의 수에 의해 제한되고감염과 방법을 수행하는 그들의 실력을 퍼블리싱. 그럼에도 불구하고, 시간당 기술자 당 적어도 200 제브라 배아를 주입 할 수있다. 제브라 피쉬 감염 모델에서 나미 비르에 대한 항 바이러스 활성을 시연에 성공 동안, 제브라 피쉬를 포함한 모든 동물 모델에서 약물 검사는 신중하게 (38)를 제어해야 함을 인정해야합니다. 약물 흡수 및 대사의 방법은 동물을 동물 상이하며 예측하기가 어렵다. 그럼에도 불구하고, 새로운 항 인플루엔자 약물을 스크리닝하는 방법으로,이 제브라 피쉬 IAV 감염 모델은 인간에게 orthologous과 높은 보존 통합 생리학과 장기와 동물에 작은 분자의 수천을 조사 할 수있는 흥미로운 기회를 제공합니다.

IAV는 부레 (19)에 주입 될 때 전신 감염 모델 것에 더하여, 제브라 피쉬는 국소 감염 모델이 될 수있다 21, 29, 30, 31의 기능적 유사체. 제대로 적정 할 때, 5 D 포스트 수정에 NS1-GFP 균주에 감염된 제브라 피쉬는 1 차원 후 감염에 의해 수영 방광의 상피 주위에 반점 형광의 증거를 전시한다. 이 국소 감염 전략을 사용하여 감염 호중구 응답하여 동작을 추적 할 수있다. 인간 호중구처럼, 제브라 피쉬 호중구는 만성 염증 24시 조직 손상 및 감염에 중요한 역할을 수행 급성 반응하는 동안 작동, 선천성 면역의 주요 세포 매개 있습니다. 호중구 인플루엔자 감염에 대한 면역 반응에 중요한 역할을 성장 인식이있다. 실제로, 명백해질 것으로 면역 반응을 매개 "양날 칼"로 ​​호중구 기능. WHI인플루엔자 감염을 제어 할 필요가 항 바이러스 반응에 필수적인 르는 호중구는 숙주 조직에 손상 및 사망 39, 40, 41, 42, 43의 위험을 증가시킬 수있는 폐 과도한 염증 환경에 기여한다. 제브라 피쉬 인간 게놈과 유전자 synteny의 상당한 절약이있다,이 orthology와 함께, 호중구 생물학에서 중요한 기능 보존도있다. Zebrafish의 호중구 (22) 산화 효소 다형 핵, 기본 및 보조 입자의 존재 및 기능 마이 엘 로퍼 옥시 다제와 NADPH를 포함하여 인간 호중구에 많은 유사점을 부담. 또한, 제브라 피쉬 호중구는 세균을 침몰과 호중구 세포 트랩 (그물) (44)를 해제 할 수 있습니다. 여러 형질 전환 지브라 피쉬 라인 거라고되었습니다식별 호중구 생물학 27, 45, 46, 47의 기능을 해부 있도록 eveloped. 이 감염 프로토콜은 유연하며 이들 다른 도구를 사용하여 다수의 호중구의 기능을 테스트하기 위해 수정 될 수있다. 이 국부 제브라 IAV 감염 모델은 어드레싱 할 수있는 숙주의 면역 반응에 관련된 질문을 가능하게하고, 호중구 매개 특히 이들.

포유 동물 종 모델에서 수행 연구 IAV 감염 시간을 포함하는 정보는 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 귀중하지만, 몇몇 실시간 실험을 수득 한호스트에서 척추 선천성 면역 반응의 요소 간의 복잡한 상호 작용의 이해를 제한 행해진 집결지. 지난 10 년간, 제브라 피쉬 동물 모델 시스템을 사용하여 호스트 병원체 상호 작용 21, 47, 56, 57에 대한 정보의 유역을 수득하였으며, 또한 약물 발견을위한 도구로 중요한 정보를 제공하고있다. 분자 이미징 기술과 현미경의 조합은 선천성 면역 반응을 더 잘 이해할 수있는 방법이 생체17, 18, 27에 나타나있다. 제브라 피쉬의 발견은 IAV 19에 감염 될 수 있고, 그게 제브라 피쉬 주 인간을 포함한 포유 동물 시스템과 중요한 면역 학적 유사성, 연구에 문을 열었습니다중요한 인간의 바이러스 성 병원체의. 기술 된 프로토콜은 다른 응용 프로그램에 적용 할 수 있으며, 인간의 건강에 심각한 임상 영향을 미칠 수 호스트 바이러스의 상호 작용에 관한 중요한 발견을 수득 할 가능성이있다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR 89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

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References

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