Mit Zebrabärbling Modelle menschlicher Influenza-A-Virus-Infektionen Virostatika auf Bildschirm und Host-Immun-Zell-Antworten Charakterisieren

Immunology and Infection

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Sullivan, C., Jurcyzszak, D., Goody, M. F., Gabor, K. A., Longfellow, J. R., Millard, P. J., Kim, C. H. Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses. J. Vis. Exp. (119), e55235, doi:10.3791/55235 (2017).

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Abstract

Introduction

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO), infizieren Influenzaviren 5-10% der Erwachsenen und 20-30% der Kinder jährlich und verursachen 3,5 Millionen Fälle von schwerer Krankheit und bis zu 500.000 Todesfälle weltweit 1. Jährliche Impfungen gegen Influenza bleiben die beste Option, Krankheit zu verhindern. Die Bemühungen wie der WHO Global Action Plan haben saisonale Impfstoff Gebrauch Impfstoff Produktionskapazität erhöht und die Forschung und Entwicklung wirksamer Impfstoff Strategien, um die Morbidität und Mortalität im Zusammenhang mit saisonalen Influenza - Ausbrüche 2 zu reduzieren. Antivirale Medikamente wie Neuraminidase - Inhibitoren (zB Zanamivir und Oseltamivir) sind in einigen Ländern verfügbar und haben bei der Milderung Symptome wirksam erwiesen, wenn 3 innerhalb der ersten 48 Stunden nach Auftreten verabreicht, 4, 5. Trotz weltweiten Bemühungen, Eindämmung der saisonalen Grippe outbreaks bleibt eine große Herausforderung zu diesem Zeitpunkt, wie Influenzavirus Antigendrift oft Strom Fähigkeiten überschreitet 6 an den sich ändernden Genom des Virus anzupassen. Impfstrategien neue Stämme des Virus Targeting muss im Voraus entwickelt werden und sind manchmal weniger gemacht als optimal wirksam durch unvorhergesehene Änderungen in der Art der Stämme, die schließlich in einer Influenza-Saison überwiegen. Aus diesen Gründen ist ein eindeutiger Bedarf für die Aufnahme Infektionen alternative therapeutische Strategien zu entwickeln, und die Verringerung der Mortalität. Durch Erreichen Interaktion ein besseres Verständnis der Wirt-Virus kann es möglich sein , neue anti-Influenza - Medikamente zu entwickeln und adjuvante Therapien 7, 8.

Der menschliche Wirt-Influenza-A-Virus (IAV) Interaktion ist komplex. Mehrere Tiermodelle menschlicher IAV-Infektion haben, um einen Einblick in die Wirt-Virus-Interaktion, includ entwickelting Mäuse, Meerschweinchen, Baumwolle Ratten, Hamster, Frettchen und Makaken 9. Während wichtige Daten bietet, die das Verständnis der Wirt-IAV Dynamik verbessert haben, besitzt jedes Modellorganismus erhebliche Nachteile, die berücksichtigt werden müssen, wenn die Ergebnisse in der Humanmedizin zu übersetzen versucht. Zum Beispiel Mäuse, die die am weitesten verbreitete Modell sind, entwickeln sich nicht leicht-IAV induzierte Symptome der Infektion , wenn sie mit menschlichen Influenza - Isolaten 9 infiziert. Dies liegt daran , Mäuse die natürliche Tropismus für Influenza beim Menschen fehlt isoliert da Zellen Maus epithelialen α-2,3 Sialinsäure - Bindungen exprimieren , anstelle der α-2,6 Sialinsäure - Bindungen , bezogen auf die menschlichen Epithelzellen 10. Die Hämagglutinin - Proteine in menschlichen IAV - Isolate positiv binden und Wirtszellen tragen α-2,6 Sialinsäure - Bindungen durch rezeptorvermittelte Endozytose 9, 11, geben Sie 12, 13. Als Folge wird nun angenommen, dass Mausmodelle für menschliche Influenza bei der Entwicklung darauf geachtet werden, muss die entsprechende Belastung der Maus mit dem entsprechenden Influenza-Stamm, um zu paaren Krankheitsphänotypen zu erreichen, die Aspekte der menschlichen Krankheit rekapitulieren. Im Gegensatz dazu besitzen Epithelzellen in den oberen Atemwegen von Frettchen α-2,6 - Bindungen , die Sialinsäure menschlichen Zellen 14 ähneln. Infizierte Frettchen teilen viele der pathologischen und klinischen Merkmale bei der menschlichen Krankheit beobachtet, darunter die Pathogenität und Übertragbarkeit von Mensch und Vogelgrippeviren 14, 15. Sie sind auch auf die Wirksamkeit des Impfstoffes Studien sehr zugänglich. Dennoch hat das Frettchen Modell für die menschliche Influenza hauptsächlich einige Nachteile in Bezug auf ihre Größe und die Kosten der Haltung, die Akquisition von statistisch signifi machenkippe Daten herausfordernd. Darüber hinaus haben Frettchen angezeigt zuvor Unterschiede in der Arzneimittel Pharmakokinetik, Bioverfügbarkeit und Toxizität, die Prüfung der Wirksamkeit erschweren. Zum Beispiel Frettchen Toxizität für den M2 - Ionenkanal - Inhibitor Amantadin 16 aufweisen. Somit ist es klar, dass ein Tiermodell bei der Wahl Fragen über die menschliche IAV-Infektionen zu untersuchen, ist es wichtig, die besonderen Vorteile und Einschränkungen zu berücksichtigen, und den Aspekt des Wirt-Virus-Interaktion, die untersucht wird.

Der Zebrabärbling, Danio rerio, ist ein Tiermodell , das für die Untersuchung von mikrobiellen Infektion einzigartige Möglichkeiten bietet, Immunantwort Host und potentielle Arzneimitteltherapien 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, <sup class = "xref"> 24, 25, 26, 27, 28. Die Anwesenheit von α-2,6-verknüpften Sialinsäuren an der Oberfläche von Zellen in der Zebrabärbling vorgeschlagen seine Anfälligkeit für IAV, die 19 wurde in Infektionsstudien und abgebildet in vivo unter Verwendung eines Fluoreszenz - Reporter - Stamm von IAV bestätigt. In IAV-infizierten Zebrabärbling erhöhte Expression der antiviralen ifnphi1 und mxa Transkripte zeigten , dass eine angeborene Immunantwort stimuliert worden waren, und die von der IAV-infizierten Zebrabärbling angezeigt Pathologie, einschließlich Ödemen und Gewebezerstörung, war ähnlich wie in der menschlichen Influenza - Infektionen beobachtet . Darüber hinaus 19 der IAV antivirale Neuraminidasehemmer Zanamivir begrenzte Mortalität und reduziert die Virusreplikation in Zebrabärbling.

In diesem Bericht wird ein Protokoll für die System initiiertic IAV-Infektionen in Zebrafischembryonen beschrieben. Mit Zanamivir bei klinisch relevanten Dosen als Proof-of-Prinzip, die Nützlichkeit dieses Zebrabärbling Modell IAV-Infektion für Screening von Verbindungen auf antivirale Aktivität nachgewiesen wird. Darüber hinaus ist eine lokalisierte epitheliale IAV - Infektion in der Zebrabärbling Blase schwimmen ein Protokoll für die Erzeugung, ein Organ , das anatomisch zu betrachten ist und funktionell analog zu der Säugerlungen 21, 29, 30, 31, beschrieben. Mit dieser lokalisierten IAV-Infektionsmodell kann neutrophilen Rekrutierung an den Ort der Infektion verfolgt werden, so dass Untersuchungen über die Rolle der neutrophilen Biologie in der IAV-Infektion und Entzündung. Diese Modelle Zebrabärbling Ergänzung bestehender Tiermodellen von menschlichen IAV-Infektionen und sind besonders nützlich zum Testen von kleinen Molekülen und Immunzellantworten aufgrund der Möglichkeit einer verstärkten sTATISTISCHE Leistung, Kapazität für moderate- zu Assays mit hohem Durchsatz und die Fähigkeiten, um Immunzellverhalten und die Funktion mit Lichtmikroskopie verfolgen.

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Protocol

Alle Arbeiten sollten von den US Centers for Disease Control (CDC) und gemäß den Richtlinien festgelegt durch Institutional Animal Care und Verwenden Komitees (IACUC) beschrieben unter Verwendung von Biosicherheitsstufe 2 (oder BSL2) Standards durchgeführt werden. Bitte Rücksprache mit den zuständigen Beamten Sicherheit und die Einhaltung zu gewährleisten.

1. Zebrabärbling Pflege und Wartung

  1. Spawn Zebrabärbling und sammeln die erforderliche Anzahl von Embryonen für die Experimente. Bei Bedarf Massenzuchtbecken, wie die von Adatto et al. 32, können eine große Anzahl von entwicklungs inszenierten Embryonen zu sammeln eingesetzt werden.
  2. Lassen Embryonen, bis die gewünschte Entwicklungsstufe (48 Stunden nach der Befruchtung für eine systemische IAV-Infektion [Abschnitt 3] oder 5 Tage nach der Befruchtung für eine lokalisierte, schwimmen Blasenentzündung [Abschnitt 4]) in tiefen Petrischalen mit geringer Dichte zu entwickeln (< 100 Embryonen / Schale) bei 28 ° C in sterilem Wasser Ei mit 60 ug / ml Meersalz (zB Instant Ocean) in destilliertem Wasser.
    1. Entfernen Sie tote Embryonen mit Kunststoff Transferpipetten und Ei Wasser täglich ändern optimale Gesundheit und Entwicklung zu gewährleisten.

2. Herstellung von Materialien und Reagenzien

  1. Bereiten Sie eine 4 mg / ml Stammlösung von Tricaine-S (pH-Wert auf 7,0 bis 7,4) in destilliertem Wasser und Autoklaven. Lagerung bei 4 ° C.
  2. Ziehen Borosilicatglas Kapillaren mit Filamenten mit einer Mikropipette Abzieher (zB Mikropipette Abzieher mit den folgenden Einstellungen: Druckeinstellung = 100, Wärme = 550, ziehen Sie = [kein Wert], Geschwindigkeit = 130, Zeit = 110).
    HINWEIS: Vor der Nadel Trimmen, die Länge von wo die Nadel beginnt an der Spitze der Nadel zu verjüngen würde ungefähr 12-15 mm sein. Dies kann variieren, jedoch auf Basis von Vorlieben und Anwendung. Eine längere, graduelle Verjüngung kann mehr vorzuziehen sein, wegen der erhöhten Fähigkeit, den Embryo und dem reduzierten ri zu durchstechensk der Nadel Biegen oder Brechen.
  3. Melt 2 g Agarose in 100 ml Ei Wasser unter Verwendung einer Mikrowelle. Machen Sie Platten, auf denen Line-Up und injizieren die Embryonen durch Agarose in tiefe Petrischalen geschmolzen Abfüll- und ermöglicht es zu verfestigen.
  4. Machen Sie eine 10 mg / ml Stamm von Zanamivir in Nuklease-freies Wasser. Aliquotieren und Einfrieren bei -20 ° C.
  5. Melt 0,5 g Agarose in 50 ml Ei Wasser unter Verwendung einer Mikrowelle zu machen Embryo Montage Agarose. Aufrechterhaltung in einem Wasserbad bei 50 ° C bis bereit während der Bilderzeugung zu verwenden.

3. Systemische IAV-Infektion (48 Stunden nach der Befruchtung)

ACHTUNG: Alle Mitarbeiter in der Forschung mit ihren Vorgesetzten und Ärzte in Bezug auf die Impfung vor Beginn der Arbeiten mit IAV konsultieren.

  1. Manuell dechorionate Embryonen am Tag des Experiments # 5 Pinzette. Achten Sie darauf, zu entfernen und einschläfern Embryonen, die in dem Prozess in 200 ug / ml Tricaine Lösung wurden verletzt.
  2. Vorbereitung of IAV für Mikroinjektions
    HINWEIS: Stämme, die Genaktivität zu infizieren gezeigt wurden, sind Influenza A / PR / 8/34 (H1N1) (APR8), Influenza-A-X-31 A / Aichi / 68 (H3N2) (X-31) und der fluoreszierenden Reporter Influenza - Stamm NS1-GFP 33. Details zu APR8 und X-31 und andere Stämme, können an der Influenza Research Database finden
    1. Propagieren des NS1-GFP - Stamm von IAV in bebrüteten Hühnereiern , wie zuvor beschrieben 34, 35. Sammeln, aliquoten und titrieren die Allantoisflüssigkeit enthält, IAV, und bei -80 ° C. Pre-Titer bestimmt APR8 und X-31-Viren können im Handel erworben werden.
      1. Kurz vor der Infektion schnell ein IAV aliquoten in behandschuhten Händen auftauen und legen Sie dann schnell auf Eis Titerverlust zu reduzieren.
    2. Viral Verdünnung
      1. Die APR8 oder X-31 - Viren Bei Verwendung verdünnt auf 3,3 x 10 6 Ei infektiöse Dosis 50% (EID 50) / ml in sterilem, eiskaltem PBS Nachtrtierter mit Phenolrot 0,25% in einer laminaren Strömungshaube (in Visualisierung zu unterstützen). Gleichzeitig wird eine Steuerung mit steriler PBS mit 0,25% Phenolrot eingerichtet.
      2. Bei Verwendung von 33 NS1-GFP - Stamm, verdünnt auf ~ 1,5 × 10 2 Plaque - bildenden Einheiten (PFU) pro nl in sterilem, eiskaltem PBS 0,25% Phenolrot enthält (in der Visualisierung zu unterstützen) in einer Laminar - Flow - Haube. Gleichzeitig wird eine Steuerung enthält Allantoisflüssigkeit von nicht infizierten Hühnereiern verdünnt wie das Virus in sterilem PBS mit 0,25% Phenolrot eingerichtet.
      3. Pflegen Sie die IAV auf Eis bis zum Gebrauch.
    3. Pipettieren Virus-Lösung in Mikroinjektionsnadeln mit Microspitzen kurz vor der Verwendung. Einfügen Mikroinjektionsnadel in die entsprechende Halterung der Einspritzvorrichtung (zB MPPI-3 Druckeinspritzsystem).
    4. Während unter dem Stereomikroskop betrachten, vorsichtig die Mikroinjektionsnadelspitze Clip mit scharfen, sterilisiert # 5 Pinzette.
      HINWEIS: Es wird empded, dass die Mikroinjektionsspitze allmählich abgeschnitten.
    5. Fußbremse Pedals des Druckeinspritzsystem und Injizieren in einen Tropfen Mikroskop Sionsöl auf einer Kalibrierungsmikrometer Folie. Den Durchmesser des Tropfens. Berechnen des Volumens des Tropfens unter Verwendung der Gleichung V = 4 / 3πr 3, wobei V Volumen in nl ist und r der Radius in & mgr; m.
      HINWEIS: Wenn der Tropfendurchmesser zu klein ist, zusätzliche Glas abgeschnitten kann sein kann, oder Druck und Timing-Einstellungen angepasst werden. Wenn der Tropfendurchmesser zu groß ist, Druck und Zeiteinstellungen eingestellt werden.
    6. Passen Druck und Zeiteinstellungen auf dem Druck Injektor und / oder reclip die Nadelspitze, bis die gewünschte Injektionsvolumen erreicht wird (in der Regel 1-3 nl). Die Druckeinstellung zwischen 20 und 30 psi und Pulsdauer Einstellungen zwischen 40 und 80 ms sind typisch. Passen Druck zurück, so dass es Kapillardruck kontert aber nicht undicht IAV (Netto-Null-Druck).
  3. Richten Embryonen für die Injektion
    1. Anesthetize dechorionated Embryonen in 200 ug / ml Tricaine.
    2. Sobald die Bewegung aufhört, übertragen 10-20 Embryonen zu einem 2% -igen Platte (hergestellt in Abschnitt 2.3) mit einer Plastikpipette. Verwenden Sie Plastikpipette überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.
    3. Ausrichten vorsichtig Embryonen für die Mikroinjektion mit einer feuerpolierten und versiegelt Borosilicatglas Kapillare. Mit einem Stereomikroskop, sanft orientieren Embryonen , so dass der Kanal von Cuvier oder die hintere Kardinalvene im Einklang mit der Mikroinjektionsnadel ist (Abbildung 1A).
  4. IAV Mikroinjektions
    1. die Mikroinjektionsnadel in den Kanal von Cuvier oder der hinteren Kardinalvene vorsichtig einsetzen. Drücken Fußpedal das gewünschte Volumen von IAV in den Kreislauf des Embryos (1A) zu injizieren. Embryos können mehr als eine Zeit, wenn nötig injiziert werden.
      HINWEIS: Die Injektion Bolus sollte in den Kreislauf und distrib gefegt werdenim ganzen Körper ausgeschüttete. Wenn Injektionsvolumen an der Injektionsstelle sammelt, entfernen Embryo aus Experiment und Euthanize.
    2. Wiederholen Sie Injektionen an verschiedenen Embryonen mit Kontroll-Lösung speziell für den Stamm des Virus gewählt. Für APR8 und X-31, verwenden Sie die in Abschnitt 3.2.2.1 Kontrolle; für das NS1-GFP, die in Abschnitt 3.2.2.2 beschriebenen Steuerung verwenden.
  5. Transfer Embryonen markierten Petrischalen mit sterilen Ei Wasser und in Inkubatoren bei 33 ° C.
    HINWEIS: Infizierte Embryonen bei 33 ° C gezüchtet werden, verbessert die virale Replikation zu unterstützen. Zusätzlich Inkubation bei 33 ° C nachahmt näher die Temperatur des menschlichen oberen Atemwege, die mit niedrigeren Temperaturen in der äußeren Umgebung in engem Kontakt ist und in dem IAV-Infektionen auftreten. Die Embryonen können auf einen breiten Temperaturbereich 34 akklimatisieren.

4. Lokalisierte, Schwimmblase IAV - Infektion in Tg (MPX: mCherry)

  1. Herstellung von IAV für Mikroinjektions
    1. Man verdünnt das NS1-GFP-Stamm und Kontrolle Injektionslösung, wie in Abschnitt 3.2 beschrieben.
    2. Bereiten Sie Nadeln, wie in Abschnitt 2.2 beschrieben.
    3. Richten Tg (MPX: mCherry) 35 Larven enthalten , aufgeblasen Schwimmblasen , wie in Abschnitt 3.3 mit der folgenden Ausnahme beschrieben. Ausrichten Larven in der Weise , dass die Nadel die Schwimmblase durchdringen kann und das Virus kann in dem hinteren Teil des Schwimmblase abgeschieden werden, wie zuvor beschrieben 36 (2A).
  2. IAV Mikroinjektions
    1. Führen Sie vorsichtig die Mikroinjektionsnadel in die Schwimmblase und injizieren das gewünschte Volumen (zB 5 nl) zum hinteren Ende der Struktur (2A).
      HINWEIS: Die Injektion Bolus in Richtung des hinteren sammeln sollte und die Luftblase der Schwimmblase sollte be nach vorne verschoben. GFP-Expression sollte beginnen bei 3 Stunden nach der Injektion beobachtet werden.
    2. Wiederholen Sie Injektionen mit Kontroll-Lösung speziell für den Stamm des Virus gewählt, wie in Abschnitt 3.4.2 beschrieben.
  3. Übertragen Larven zu Petrischalen mit sterilen Ei Wasser und in Inkubatoren bei 33 ° C.

5. Antiviral Drug Treatment

HINWEIS: Das Protokoll unten beschreibt die Zanamivir Behandlung zuvor in Gabor gezeigt et al. 19. Dieses Protokoll kann modifiziert werden, um andere antivirale Medikamente zu screenen und hat das Potential, modifiziert werden, um mehrere Verbindungen in einer 96-Well-Platte, Hochdurchsatz-Format zu screenen.

  1. Nach 3 Stunden nach der Infektion, Ei Wasser von NS1-GFP- und Kontrolle infizierten Fische mit sterilem Wasser Ei mit 0, 16,7 oder 33,3 ng / ml Zanamivir ersetzen.
    ANMERKUNG: Diese Konzentrationen wurden gewählt, um zu versuchen, die physiologische Werte fo erreicht nachzubildenllowing Verabreichung von Zanamivir bei menschlichen Patienten (100, 200 oder 600 mg, iv, zweimal täglich oder 10 mg inhaliert, zweimal täglich). Die Serumkonzentrationen bei menschlichen Patienten reichten von 9,83 bis 45,3 ng / ml 36.
  2. Im Laufe von 5 Tagen Ei Wasser alle 12 Stunden und ersetzen mit sterilem Wasser Ei ändern Sie die entsprechende Menge an Zanamivir enthält.
  3. Verfolgen Sie Verlauf der Infektion.
    1. Anästhesieren Zebrabärbling in 200 & mgr; g / ml Tricaine. Überwachen Sie die GFP-Expression durch Stereo-Fluoreszenzmikroskopie visuell beobachten Unterschiede in der Infektionsmuster zwischen der IAV-infizierten und Kontrollfische und unter den Fischen in den verschiedenen Konzentrationen von Drogen eingetaucht.
    2. Spur Morbidität und Mortalität im Laufe der 5 Tage.
      1. Nehmen Sie Beobachtungen über Dynamik-Infektion Krankheit Pathologie im Zusammenhang, einschließlich Anzeichen von Lethargie und Beweise von Ödemen, Unterschiede in der Pigmentierung, okulare und kraniofazialen Mißbildungen und Lordose. Krankheit Pathologietypischerweise wird offensichtlich in Steuer infizierten Fischen bei 24-48 Stunden nach der Injektion in Abhängigkeit von der Menge des Virus injiziert. Sammeln Sie Bilder 24 Stunden nach der Injektion.
      2. Alle 24 Stunden für 5 Tage nach der Infektion, notieren Sie die Zahl der Toten, morbid, und gesunde Larven. Tod durch das Fehlen eines wahrnehmbaren Herzschlag definiert. Plot-Daten wie gewünscht. Zum Beispiel Plot-Daten als Stapelbalkendiagramm, mit Prozentsätzen von gesunden, morbid, oder tote Fische, aufgetragen auf der y-Achse und der Behandlungsgruppe auf der x-Achse. 19
        HINWEIS: Die Mortalitäten kann durch Kaplan-Meier-Überlebensschätzungen erzielt. Je nach Anwendung kann es zweckmäßig sein, alternative Ansätze für die Morbidität scoring Fisch zu entwickeln, einschließlich einer Scoring-Matrix, die den Grad der Morbidität auf der Grundlage der zuvor genannten pathologischen Merkmale beobachtet quantifizieren kann.
      3. Beraten Sie sich mit einem Statistiker die entsprechenden statistischen Analysen anzuwenden.

6. Neutrophilenmigration

HINWEIS: Das Protokoll unten beschreibt ein Verfahren zur Verfolgung von neutrophilen Migration in die Schwimmblase nach einer lokalisierten, epithelialen IAV-Infektion. Die beschriebenen Verfahren können die Auswirkungen von genetischen und chemischen Manipulationen zu testen, modifiziert werden. zugrundeliegenden neutrophil Verhalten während einer IAV-Infektion unter Verwendung dieser Technik ist es möglich, die Mechanismen zu charakterisieren.

  1. Montage Zebrabärbling für Imaging
    1. Anästhesieren Larven werden in 200 & mgr; g / ml Tricaine abgebildet.
    2. Übertragen Sie eine individuelle Tg (MPX: mCherry) Larve, die zu einer Vertiefung einer 24 Bodenplatte gut, Glas mit NS1-GFP infiziert wurde in einem kleinen Tropfen Ei Wasser (~ 50 bis 100 & mgr; l). Wiederholen Sie mit anderen IAV-infizierten und Kontrollfische.
    3. Langsam 1% iges Embryo Medien in jede Vertiefung (Abschnitt 2.5) Montage, dabei nicht große Blasen einzuführen.
      1. Sanft einzustellen, die Position der Larve, so dass es auf seiner Seite angebracht ist.Goody und Henry 37 beschreiben , wie Sonden zu machen , die in dieser Anwendung mit Insektenstifte gut funktionieren , die in Borosilicatglas Kapillaren mit Filamenten und superglued an Ort und Stelle montiert sind.
    4. Nachdem die Agarose erhärtet, füllen Sie vorsichtig die einzelnen Vertiefungen mit Ei Wasser, das 200 ug / ml Tricaine.
    5. Mit einem konfokalen Mikroskop, Erfassung az Stapel Reihe von Hellfeld- und Fluoreszenzbilder ein 20x-Objektiv mit konzentrierten sich auf die Schwimmblase.
      1. Stellen Sie die obere und untere Grenze, so dass sie alle sichtbar beobachtbare grüne und rote Fluoreszenz zu erfassen.
      2. Aufnehmen von Bildern bei 2,0 & mgr; s / Pixel mit Schritten, die ≤ 4 & mgr; m sind. Zeit pro Pixel erhöht und zwischen den Schritten zu reduzieren Abstand (zB 0,5 bis 1,0 & mgr; m) erhöht sich die Bildauflösung und Qualität.
      3. Generieren eines zweidimensionalen Bildes durch Schichten verschmelzen.
      4. Vergleichen Sie die Anzahl der MPX-mCherry-positive Neutrophile vorhanden in die Schwimmblasen von IAV-infizierten und Kontrolle injizierten Zebrabärbling.

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Representative Results

Hier werden Daten zeigen , wie die systemische Infektion IAV in Zebrabärbling verwendet werden kann , um die Arzneimittelwirksamkeit (1A) -Test vorgesehen sind. Embry bei 48 Stunden nach der Befruchtung sind mit APR8 (1C, 1F), X-31 (Figuren 1D, 1G) oder NS1-GFP (Abbildungen 1 H-1I) über den Kanal von Cuvier injiziert , um eine virale Infektion zu initiieren. Eine weitere Gruppe von Embryonen bei 48 Stunden nach der Befruchtung wurden als Kontrollen für die virale Infektion (1B, 1E) zu dienen injiziert. Mit dem 48 Stunden nach der Infektion, Zebrabärbling injiziert mit IAV Beweis für pericardial Ödem zeigte (1C, 1D) und Kreislaufstillstand (1F), mit Erythrozyten vorhanden während des Perikards (1G). Verwendung NS1-GFP, die anfängliche Expression von GFP durch Fluoreszenzmikroskopie bereits 3 Stunden nach der Infektion beobachtet wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurden Zebrabärbling auf 33,3 ng ausgesetzt/ Ml-Dosis des Neuraminidasehemmer Zanamivir. Diese Dosis entspricht ungefähr der 200 mg-Dosis an menschliche Patienten gegeben. Kontrolle infizierten Fische nicht ausgesetzt Zanamivir (Figuren 1H, 1H ') zeigten Merkmale von Ödemen und systemischen GFP - Expression. Reduzierte Brutto Pathologie und GFP - Fluoreszenz (Figuren 1I, 1I ') in NS1-GFP-infizierten Larven Zanamivir ausgesetzt waren , beobachtet. Die Reduktion der GFP war am deutlichsten in den Körpern der Larven, während nur sehr geringe Veränderungen in den Dottersäcke beobachtet wurde. Fisch behandelt mit Zanamivir zeigten weniger Morbidität, wie durch eine verbesserte Schwimm Beweglichkeit bewiesen und Ebenen von Ödemen im Herzen reduziert, und das Überleben verbessert. Diese Ergebnisse ergänzen , um eine umfassendere Studie 19 und zeigen den Wert dieses Modells für Wirkstoff - Screening.

Eine lokalisierte Zebrabärbling Schwimmblase Infektionsmodell 31 wurde für IAV infe angepasstction. NS1-GFP - Virus wurde in die Schwimmblasen von 5 d nach der Befruchtung Tg (MPX: mCherry) injiziert Larven eine lokalisierte, epitheliale Infektion (2A) zu initiieren. PBS wurde in die Schwimmblase als Kontrolle injiziert, um die Spezifität der Neutrophilen-Rekrutierung zu IAV-infizierten Zellen zu demonstrieren. Die Rekrutierung von mCherry-markierten Neutrophilen in die Schwimmblase verfolgt wurde. Bei 20 Stunden nach der Infektion, erhebliche Migration von Neutrophilen in die Schwimmblasen von IAV-infizierten Fische in Bezug auf PBS-injizierten Kontrollen (2B, 2B ', 2C, 2C') beobachtet. Diese Daten zeigen, dass IAV Neutrophilen an der Schwimmblase rekrutieren kann, so wie es Neutrophilen an die menschliche Lunge rekrutiert.

Abbildung 1
Abbildung 1: Die antivirale medikamentöse Behandlung mildert die Schwere der IAV - Infektion in Zebrabärbling. (A (B - I) Brutto Pathologie und GFP - Fluoreszenz von Genaktivität in den Kanal von Cuvier mit IAV injiziert. (BG) Fisch mit IAV infiziert und bei 48 Stunden nach der Infektion auf Anzeichen einer viralen Infektion und Krankheit untersucht. (B - D) Einzelbrennebenen der Kontrolle oder IAV-infizierten Fische wurden gesammelt (seitlich montierten, vorderer links, Rückenplatte, 4 - fache Vergrößerung, Maßstabsbalken = 500 & mgr; m). (B) Kontrollfische wurden mit PBS injiziert und eine normale Morphologie anzuzeigen. (C - D) Embryos mit APR8 infiziert (C) oder X-31 (D) , die gemeinsam zeigte pericardial Ödem (gefüllt Pfeil). Embry hatte auch nekrotischen Gewebes, zeigt sich in (C). (E) Kontrollfische wurden mit PBS injiziert und zeigt keine Anzeichen für Pathologie (Maßstab = 250 & mgr; m). (F) Embryonen mit APR8 infiziert zeigt Kreislaufstillstand (gekerbt Pfeilspitze, Maßstabsbalken = 250 & mgr; m). (G) Embryo mit X-31 Influenza zeigt sowohl pericardial Ödem (Pfeil) und gepoolt Erythrozyten während des Perikards (gekerbt Pfeilspitze, Maßstabsbalken = 100 & mgr; m) injiziert. (H, I) Repräsentative Bilder Effekte eines antiviralen Medikaments auf IAV-infizierten Zebrabärbling (Maßstab = 200 & mgr; m) zeigt. (H) Hellfeld- und (H ') Fluoreszenzbild zeigt einen Embryo injiziert mit NS1-GFP (keine antivirale medikamentöse Behandlung). Hinweis Ödeme und GFP-Expression vor allem in der gemeinsamen Kardinalvene Region. (I, I ') Die Behandlung mit einem antiviralen Medikament reduziert die InfektIonen, wie durch reduzierte Pathologie hervorgeht, verminderte Ödeme einschließlich und verminderte GFP-Expression innerhalb der weißen gestrichelter Umriß des Körpers, insbesondere in der Vaskulatur, die von reduzierten viralen Belastung anzeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Neutrophile rekrutiert werden auf Seiten der lokalisierten IAV - Infektion. (A) Schematische Demonstration der Injektion Ansatz erforderlich , um eine lokalisierte IAV - Infektion in einem aufgeblasenen Zebrabärbling Schwimmblase bei 5 d nach der Befruchtung zu initiieren. (B, C) Neutrophile Einstellung zum Schwimmblase folgende NS1-GFP - Infektion. Z-Stapel-Bilder (4 & mgr; m-Schritten) wurden durch konfokale Mikroskopie (20-facher Vergrößerung) gesammelt. Bilder waren flachgedrückten in zwei Dimensionen (seitlich montierten, vorderer links, oben dorsale). Tg (MPX: mCherry) Zebrabärbling (5 d nach der Befruchtung) wurden mit (B, B ') injiziert Allantoisflüssigkeit verdünnt mit PBS und 0,25% Phenolrot oder (C, C') NS1-GFP (7,2 × 10 2 PFU / Embryo), verdünnt in Allantoisflüssigkeit und PBS mit 0,25% Phenolrot. Bei 16 Stunden nach der Infektion vorhanden Neutrophilen waren in einem IAV-infizierten Schwimmblase (C, C ': grüne Fluoreszenz lokalisierte Infektion zeigt; C': rote Blutkörperchen sind Neutrophile, weißer Pfeil identifiziert Vertreter Neutrophilen). (B, B ') Kein Nachweis der GFP - Expression indikativ für IAV - Infektion und keine Rekrutierung von Neutrophilen an der Schwimmblase wurde in der Larven mit der Allantoisflüssigkeit in PBS injiziert beobachtet. please Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Um die Vorteile gewonnen aus mit einem kleinen Tier maximieren menschlichen Wirt-Pathogen-Interaktionen zu modellieren, ist es wichtig, Forschungsfragen und Testen von Hypothesen zu formulieren, dass auf die inhärenten Vorteile des Modellsystems zu nutzen. Als Modell für die menschliche IAV-Infektion hat der Zebrabärbling mehrere Stärken, einschließlich hoher Fruchtbarkeit, optische Klarheit, Zugänglichkeit für Wirkstoff-Screening, und die Verfügbarkeit von transgenen Linien, die Immunzellen wie Neutrophilen beschriften. Der Zebrabärbling wurde als immer leistungsfähigeren Alternative zur Maus-Modellsystem für die Untersuchung von Entzündungen und der angeborenen Immunität entwickelt. Weil sie eine funktionierende adaptive Immunantwort während der ersten 4-6 Wochen der Entwicklung fehlt, Zebrabärbling montieren angeborenen Immunantwort zum Schutz vor Verletzungen und Infektionen 37. Während dieser frühen Zeit in Entwicklung ist es möglich, Mechanismen der antiviralen Antwort zu isolieren und zu untersuchen aus der angeborenen Immunantwort ergeben allein. ThiArbeit wurde durch die Entwicklung von transgenen Linien Zebrabärbling wie Tg (MPX: mCherry) erleichtert worden, die Neutrophilen mit einem roten Fluoreszenzprotein - Etiketten.

Zebrabärbling Modelle für IAV - Infektion , die Krankheit beim Menschen ähneln wurden 19 kürzlich beschrieben. Es wurde gezeigt, dass Zebrabärbling auf ihren Zellen Sialinsäurereste α-2,6-verknüpften besitzen, die zur Verfügung stellen IAV den Tropismus Viren zu binden, anhängen, und die Zellen ein. In diesem Manuskript und Gabor et al. 19, es hat sich gezeigt , dass zwei verschiedene Stämme von IAV (A / PR / 8/34 [H1N1] und X-31 A / Aichi / 68 [H3N2]) sowie das rekombinante NS1-GFP - Stamm, der in GFP führt Übersetzung Zellen in infizierten könnte infizieren, replizieren und Mortalität, wenn sie in das Kreislaufsystem des Larven Zebrabärbling injiziert. Injektion des Virus ist entscheidend für diese Infektion Methode, wie der Exposition gegenüber IAV durch Eintauchen nicht zuverlässig funktioniert. Infizierte Fische sollten Transfer seinRot zu einem 33 ° C Inkubator virale Replikation zu gewährleisten. Es ist wichtig, daß der menschliche Atemwege zu beachten, in dem Influenza-Infektionen auftreten, beträgt typischerweise 33 ° C. Inkubation bei 28 ° C, die mehr typische Temperatur für die Inkubation Zebrabärbling ist, schlägt eine zuverlässige Infektion herzustellen. Des Weiteren ist es wichtig, jede Menge vom Hersteller oder Charge von IAV vor aufgrund Variabilität in einem Experiment zu verwenden produziert erhalten zu testen, die Infektiosität und Fortschreiten der Krankheit in der Zebrabärbling auswirkt. Wenn die Infektionsdosis richtig titriert wird, sollte die überwiegende Mehrheit der Zebrabärbling mit diesen Stämmen von IAV infiziert durch Ödeme typisiert zeigen grobe Krankheitsphänotypen, bereits 24 Stunden nach der Infektion, dass zunehmend verschlechtern, kraniofazialen Anomalien von 48 Stunden nach der Infektion, Lordose von 72 Stunden nach der Infektion, und etwa 50% sollten von 5 d nach der Infektion die Infektion unterliegen. Histopathologie bei 48 Stunden nach der Infektion sollten Beweise für gill, Kopf Niere umfassen, undLebernekrose sowie Indikationen von Flüssigkeit in das Perikard. Bei der Festlegung dieser Befunde als vorhersehbares Ergebnis einer IAV-Infektion in Zebrabärbling, ist es möglich, Bildschirm Kandidaten Anti-Influenza-Wirkstoff-Verbindung Kandidaten. In diesem Sinne, ein Proof-of-Principle - Protokoll für das Screening eine antivirale Arzneimittel auf Basis von Originalfunden in Gabor et al. 19 demonstriert. Verwendung des Neuraminidase-Inhibitor Zanamivir, bei einer Dosis, die vorhergesagt wird Spiegel im menschlichen Blut, verzögertes Einsetzen der Morbidität und Mortalität reduziert durch eine offensichtliche Wirkung auf die virale Replikation / Ausbreitung beobachtet nachzuahmen, wie NS1-GFP-Fluoreszenz bestimmt wurde beobachtet. Der Zebrabärbling IAV-Modell ist ideal für moderate- mit hohem Durchsatz kleinen Molekül-Bildschirme geeignet. Weil nur Infektionen kann nur durch manuelle Injektion in den Kreislauf über die Leitung Cuviers oder posterior Kardinalvene auftreten, sind die Größe der Bildschirme durch die Anzahl der Techniker beschränkt EstabGründung der Infektionen und ihre Fertigkeiten in der Technik durchgeführt wird. Dennoch ist es möglich, mindestens 200 Zebrabärbling Embryonen pro Techniker pro Stunde zu injizieren. Während erfolgreich in einem Zebrabärbling - Infektionsmodell für Zanamivir antivirale Aktivität zeigen, muss es , dass in allen Tiermodellen Wirkstoff - Screening, einschließlich Zebrabärbling anerkannt werden, müssen sorgfältig 38 gesteuert werden. Die Art und Weise ein Medikament absorbiert und metabolisiert unterscheidet sich von Tier zu Tier und ist schwer vorherzusagen. Dennoch, wie ein Verfahren zur Herstellung neuer Anti-Influenza-Medikamente Screening, das Zebrabärbling Modell IAV-Infektion stellt eine aufregende Möglichkeit, viele Tausende von kleinen Molekülen in einem Tier zu vermessen mit Organen orthologous auf den Menschen und mit hochkonservierten integrative Physiologie.

Zusätzlich zu einem Modell für eine systemische Infektion zu sein, kann der Zebrabärbling auch als Modell für lokalisierte Infektion dienen , wenn die IAV in die Schwimmblase injiziert wird 19 21, 29, 30, 31. Wenn sie richtig titriert, Zebrabärbling, die mit dem NS1-GFP-Stamm bei 5 d nach der Befruchtung infiziert sind, sollten durch 1 d nach der Infektion um den Epithelien der Schwimmblase Beweise für punctata Fluoreszenz aufweisen. Unter Verwendung dieser lokalisierten Infektionsstrategie kann neutrophil Verhalten in Reaktion auf die Infektion verfolgt werden. Wie menschliche Neutrophilen, sind Zebrabärbling Neutrophilen ein Haupt zellulären Mediator in der angeborenen Immunität, während der akuten Reaktionen auf Gewebeverletzung und Infektion funktionieren und eine entscheidende Rolle bei der chronischen Entzündung 24 zu spielen. Es gibt eine wachsende Erkenntnis, dass Neutrophile in der Immunantwort auf Influenza-Infektion eine entscheidende Rolle spielen. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass Neutrophile Funktion als "zweischneidiges Schwert" in der Immunantwort vermitteln. While wesentlich für die antivirale Antwort erforderlich Influenza - Infektionen zu kontrollieren, tragen Neutrophile auch zu einer übermäßig Entzündungs Umgebung in der Lunge , die Wirtsgewebe und erhöhen das Risiko von Mortalität 39, 40, 41, 42, 43 beschädigen können. Es gibt erhebliche Erhaltung der Gen Syntenie zwischen dem Zebrabärbling und menschlichen Genomen, und mit diesem Orthologie, gibt es auch erhebliche funktionelle Konservierung in Neutrophilen Biologie. Zebrabärbling Neutrophilen tragen viele Ähnlichkeiten mit menschlichen Neutrophilen, einschließlich einer polymorphen Kern, der Anwesenheit von primären und sekundären Körnchen und funktionelle Myeloperoxidase und NADPH - Oxidase - 22. Darüber hinaus können Zebrabärbling Neutrophilen Bakterien verschlingen und Neutrophilen extrazelluläre Fallen (NETs) 44 freigeben. Mehrere transgene Zebrabärbling Linien wurden developed zu identifizieren und zu sezieren die Funktionen der Neutrophilen biology 27, 45, 46, 47. Diese Infektion Protokoll ist flexibel und kann modifiziert werden, um mehrere neutrophile Funktionen zu testen, diese alternativen Werkzeugen. Diese lokalisierte Zebrabärbling IAV-Infektionsmodell ermöglicht, die Immunantwort des Wirts Fragen angesprochen werden, insbesondere solche, die durch Neutrophile vermittelt.

Studien in Säugetiermodell Arten durchgeführt haben wertvolle Informationen 40, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, aber nur wenige Echtzeit - Experimenten mit IAV - Infektion h ergabave durchgeführt wurde, um das Verständnis der komplexen Zusammenspiel zwischen den Komponenten des Vertebraten angeborene Immunantwort in dem Wirt zu begrenzen. Im Laufe der letzten zehn Jahre, die Verwendung des Zebrafisch Tiermodellsystem hat 21 einen Wendepunkt von Informationen über die Wirt-Pathogen - Interaktionen ergab, 47, 56, 57, und auch wichtige Informationen als Werkzeug für die Wirkstoffforschung angeboten hat. Eine Kombination von molekularen Techniken und Mikroskopie haben ein besseres Verständnis der angeborenen Immunreaktionen erlaubt und wie diese manifestieren in vivo 17, 18, 27. Die Entdeckung , dass Zebrafisch kann mit IAV 19 infiziert werden, und dass die Zebrabärbling Aktien wichtige immunologische Ähnlichkeiten mit Säugetiersystemen, einschließlich des Menschen, hat die Tür zum Arbeitszimmer geöffneteines wichtigen menschlichen viralen Erreger. Die Protokolle beschrieben sind anpassungsfähig an andere Anwendungen und haben das Potenzial, wichtige Entdeckungen zu ergeben, in Bezug auf Wirt-Virus-Interaktionen, die profunde klinische Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit haben können.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instant Ocean Spectrum Brands SS15-10
100 mm x 25 mm sterile disposable Petri dishes  VWR 89107-632
Transfer pipettes  Fisherbrand 13-711-7M
Tricaine-S (MS-222) Western Chemical
Borosilicate glass capillary with filament  Sutter Instrument  BF120-69-10
Flaming/Brown micropipette puller  Sutter Instrument P-97
Agarose Lonza 50004
Zanamivir AK Scientific G939
Dumont #5 forceps  Electron Microscopy Sciences 72700-D
Microloader tips Eppendorf 930001007
Microscope immersion oil Olympus IMMOIL-F30CC
Microscope stage calibration slide  AmScope MR095
MPPI-3 pressure injector  Applied Scientific Instrumentation
Stereo microscope Olympus SZ61
Back pressure unit Applied Scientific Instrumentation BPU
Micropipette holder kit Applied Scientific Instrumentation MPIP
Foot switch Applied Scientific Instrumentation FSW
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Magnetic base Applied Scientific Instrumentation Magnetic Base
Phenol red  Sigma-Aldrich  P-4758
Low temperature incubator VWR 2020
SteREO Discovery.V12 Zeiss
Illuminator Zeiss HXP 200C
Cold light source Zeiss  CL6000 LED
Glass-bottom multiwell plate, 24 well Mattek P24G-0-13-F
Confocal microscope Olympus IX-81 with FV-1000 laser scanning confocal system
Fluoview software Olympus
Prism v6 GraphPad
Influenza A/PR/8/34 (H1N1) virus  Charles River  490710
Influenza A X-31, A/Aichi/68 (H3N2)  Charles River  490715
Influenza NS1-GFP Referenced in Manicassamy et al. 2010
Tg(mpx:mCherry) Referenced in Lam et al. 2013

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