הפקה מהירה מחיקת פטריות דרך
1Toxicology and Mycotoxin Research Unit, NPRC, USDA-ARS, 2Hazera Seeds LTD, Brurim, 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” - Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

מוטנטים למחיקת גנים שנוצרו באמצעות רקומבינציה הומולוגית הם תקן הזהב למחקרי תפקוד גנים. OSCAR (שלב אחד בניה של Agrobacterium- רקומבינציה מוכנים פלסמידים) שיטה לדור מהיר של בונה המחיקה מתואר. Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה פטרייתית הבא. לבסוף, שיטת אישור מבוסס PCR של מחיקות גנים transformants פטרייתי מוצג.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מחיקה מדויקת של הגן (ים) של עניין, תוך השארת שאר הגנום ללא שינוי, מספקת את המוצר האידיאלי כדי לקבוע את תפקוד הגן המסוים באורגניזם החי. בפרוטוקול זה שיטת OSCAR של בנייה מדויקת ומהירה מחיקת פלסמיד מתואר. OSCAR מסתמך על מערכת שיבוט שבו תגובה רקומבינאז יחיד מתבצע המכיל את מטוהרים PCR- מוגבר 5 'ו 3' אגפים של הגן של עניין ושני פלסמידים, pA-Hyg OSCAR (וקטור הסמן) ו pOSCAR (הרכבה וֶקטוֹר). אישור של וקטור המחיקה התאספו כראוי מתבצעת על ידי מיפוי עיכול הגבלה ואחריו רצף. Agrobacterium tumefaciens משמש אז כדי לתווך המבוא של בניית המחיקה לתוך נבגים פטרייתיים (המכונה ATMT). לבסוף, assay PCR מתואר כדי לקבוע אם מבנה המחיקה משולבת על ידי רקומבינציה הומולוגיים או לא הומולוגיים, המציין מחיקת גנים אואינטגרציה ectopic, בהתאמה. גישה זו שימשה בהצלחה למחיקתם של גנים רבים ב- Verticillium dahliae וב- fusarium verticillioides בין מינים אחרים.

Introduction

דיסקציה גנטית היא מתודולוגיה רבת עוצמה לקביעת החשיבות הפונקציונלית של הפרט או שילובים של גנים. גישה סטנדרטית כדי להבין את התפקיד של גנים ספציפיים הוא ייצור של מוטציות גן יחיד ללא שינוי בכל גן אחר. הגישה החזקה ביותר והפחות מעורפלת עלולה להיות מחיקה מוחלטת ומדויקת של גן של מסגרת קריאה פתוחה (GOI ORF) ללא נזק לתפקוד גנטי אחר.

בגלל תקן קשירת גישות לדור פלסמיד המחיקה דורשים צעדים מרובים, רציונלי OSCAR 1 היה לייצר גישה מהירה יותר במבחנה . איור 1 מתאר את תהליך ההרכבה בגישת OSCAR. השיטה המתוארת כאן יש את היתרון של שילוב של בנייה מהירה של הפרט וקטורים למחיקת הגן בתגובת multipart יחיד בשילוב עם Agrobacterium tumefaciens הבאים בתיווך transfo(ATMT). OSCAR הוא מאוד מהיר ומשווה גם עם אסטרטגיות אחרות כגון שימוש הרכבה גיבסון בשמרים 2 . השיטה OSCAR שימש בהצלחה עם כמה מינים של פטריות מסוג Ascomycota. מינים אלה כוללים: fusarium verticillioides (לא פורסם), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 , ו Dothistroma septosporum 9 ו Sarocladium zeae (לא פורסם) .

פרוטוקול זה מספק צעד אחר צעד הוראה עבור השיטה כולל עיצוב פריימר, הגברה ה- PCR הגברה, התגובה OSCAR BP, מחיקה מבנה מבנה אישור, transformatיון של Agrobacterium עם המבנה ואחריו העברת מבוסס ATMT של מבנה המחיקה לתוך התאים פטרייתי, ולבסוף הבחנה מוטציות מחיקה פטריות מאלה עם מבנים מחיקת משולב ectopically.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פריימר עיצוב עבור הגברה PCR של צלעות גנים

  1. הורד לעיבוד תמלילי קובץ את האזור הגנומי של הגן של עניין (GOI) כולל מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) ולפחות 2 kb משני צדי הגן משני צדי FungiDB או משאב נתונים גנומי אחר.
  2. הדגש את ה- ORF המיועד למחיקה ולהפעלה של קודונים.
  3. זהה והדגש ORFs סמוכים בתוך הרצף שהורד.
  4. השתמש 2 KB 5 "סוף של ORI GOI ואת כלי עיצוב פריימר (ראה רשימת חומרים) לעצב PCR פריימר זוג O1 ו O2 לייצר מוצר בגודל מינימלי של 1 קילו. הקפד לא להשפיע על ORFs סמוכים.
    1. הדבק את 2 ק"ג 5 "אגף לתוך חלון" רצף כניסה ". לחץ על "הצג פרמטרים מותאמים אישית" התיבה. הזן את הפרמטרים הבאים של עיצוב מותאם אישית: פריימר TM 58 (דקות), 60 (opt) ו- 62 (מקסימום); פריימר GC 40 (דקות), 50 (opt) ו 60 (מקסימום); פריימר גודל 22 (דקות), 24 (opt) ו 26(מקסימום); Amplicon גודל 1250 (דקות), 1500 (opt) ו 2000 (מקסימום).
    2. בחר את התוצאה שממקמת את הפריימר ההפוך (O2) הקרוב ביותר ל- ORF. לכידת צילום מסך של מבחני ולהעתיק ולהדביק רצפים תחל לתוך מסמך עיבוד תמלילים.
    3. חזור על התהליך עבור 3 'אגף ליצור primers O3 ו O4, הפעם לבחור את התוצאה הצבת את תחל קדימה (O3) הקרוב ביותר ORF היעד.
  5. הוסף אתרי צירוף מתאימים לקצות 5 'של פריימרים 1 עד 4 (ראה טבלה 1 ).
  6. גם לעצב ולהזמין primers ספציפיים ORF לשמש אישור המחיקה בסעיף 4 להלן. הפרמטרים צריכים להיות זהים לזו של שלב 1.4.1 למעט שימוש בגודל Amplicon 500 (min), 750 (opt) ו- 1000 (max) עבור אורך ORF במידת הצורך. לבסוף, עבור אישור של רקומביננטים הומולוגיים, ליצור 5 'החוצה ו 3' פריימרים נמצא מחוץ לכוחות בתוך הכרומוזום. אלה "החוצה" primers ישמש עםHygR (210) ו hygF (850), בהתאמה ( איור 2 ).
  7. להזמין פריימרים.

2. הפקה של OSCAR בונה

  1. באמצעות טאי היי נאמנות , לבצע שתי תגובות, אחד עבור 5 'ו 3' אגפים, באמצעות primers (100 מיקרומטר) O1 ו O2 תגובה אחת ו primers O3 ו O4 ב השני. תערובת התגובה מכיל את הפעולות הבאות: 29.5 μL מים מזוקקים סטרילי (SDW), 5 μL 10x ל חיץ PCR, 8 μL 2.5 mM dNTP לערבב, 5 μL 25 mM MgCl 2 , 1 תבנית μL (50 ng / μL), 0.5 μL hi- נאמנות נאמנות 0.5, O 0.5 μL O2 ו 0.5 μL תחל O2 עבור אגף 5 '(או 0.5 μL תחל O3 ו 0.5 μL תחל O4 עבור 3' אגף) השימוש בתנאי התגובה הם כדלקמן: 94 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות, ואז 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ולאחר מכן השלבים הסופיים של 72 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ולאחר מכן להחזיק ללא הגבלת בשעה 10 מעלות צלזיוס.
  2. לרוץ 0.8%Agarose 1x TAE (40 מ"מ טריס אצטט pH 8.3, 1 מ"מ EDTA) ג'ל אלקטרופורזה עבור כ 125 VH במנגנון מיניגל רגיל כדי לקבוע את גודל המוצר ואת הריכוז היחסי. כתם את הג'ל עם כתם לא ethidium על פי הוראות היצרן. דמיינו על מאיר UV.
  3. אם 5 'ו 3' מוצרים האגף נמצאים בריכוז אפילו בערך, לשלב אותם בערכה זיקה טור (או משקעים PEG 90 μL בשילוב מוצרים PCR, 240 μL TE חיץ pH 7.5, 160 μL של 30% פוליאתילן גליקול PEG8000 30 מ"מ MgCl 2 ) כדי לטהר את מוצרי ה- PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן. אם הם אינם ריכוז שווה לשלב את כל מוצר ריכוז נמוך עם כמות שווה של המוצר משוער התגובה תשואה גבוהה יותר.
  4. השתמש ספקטרופוטומטר למדוד ריכוז DNA מטוהרים.
  5. לבצע התגובה BP על ידי ערבוב הבאים: 1 μL של 60 ng / μL pOSCAR, 2 μL של 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL של 60 ng / μL בשילוב אגפים, 1 μL של clonase. דגירה במשך 16 שעות ב 25 ° C. לסיים את התגובה על ידי הוספת 0.5 μase μL K ו דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. המרה גבוהה יכולת E. תאי coli . שני תאים מתאימים זמינים מסחרית תוצרת ביתית DH5α CaCl 2 תאים מתאימים שימשו בהצלחה כמו נמענים כפי שתואר על ידי הוראות היצרן. צלחת על נתרן נמוכה (0.5 גרם / L NaCl) LB המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​spectinomycin (Spec).
  7. זהה את המבנה הנכון על ידי ביצוע minipreps DNA 10 מושבות שנוצר לעיל. לבצע עיכול כפול עם HII dIII ו Kpn אני כדלקמן: פיפטה 5 DNA μL, 2 U של כל אנזים, 2 חיץ 10X μL המתאים עם SDW ל נפח הכולל 20 μL. זה משחרר את הכנס (כ 4.5 קילו עם 1.5 kb גנים האגפים) מן וקטור ( כ 7 קילו) ו חותך כל האתריםטבעות אשר יכול לתת גדלים הלהקה צפוי.
  8. רצף 11 שיבוטים נבחרים המציגים תבנית הולכה מתאימה.

3. Agrobacterium tumefaciens מתווך טרנספורמציה (ATMT) של פטריות

  1. לשנות את AGL1 זן עם מחיקת OSCAR לבנות 12 .
  2. שינוי פטרייה עם AGL1 המכיל את GOI OSCAR מחיקת פלסמיד. לשם כך, בצע את השלבים הבאים:
    1. הכן ההשעיה נבג פטרייתי עם מים סטריליים ב 2 x 10 6 נבגים / מ"ל. לכמת נבגים על hemocytometer או מונה תא אוטומטי. מקום 500 μL זה צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. הגדרה זו היא עבור 4 לוחות שינוי.
    2. השתמש בלולאה חד פעמית סטרילי כחול להוסיף גוב גלוי בקלות (צריך לכסות על 20% של קוטר הלולאה) של פלסמיד המחיקה המכיל AGL1 מ 2-3 יום LB-Spec 100 בינוני בינוני (ראה MAterials רשימת הרכב) המכיל צלחות ומערבבים לתוך ההשעיה נבג. וורטקס עד תאים חיידקים מפוזרים היטב ( כ 5 דקות בינונית מהירות).
    3. פיפטה 100 μL ההשעיה conidia-Agro אל מרכז מסנן קרום תאית ממוקם על כל אחד מארבעה 6 צלחות פטרי ס"מ המכיל שיתוף טיפוח בינוני 12 .
    4. מורחים את ההשעיה עם חרוזי זכוכית סטרילית (כ 4) כדי לכסות את כל השטח של המסנן קרום. לחלופין להפיץ את ההשעיה באמצעות כלי מפזר מסורתי. אפשר מסנן קרום להתייבש מכסה מנוע במשך כ 10 דקות, לעטוף עם סרט פרפין. חזור על שלבים 3.2.2 ו 3.2.3 כדי להגדיר מספר טרנספורמציות.
    5. דגירה את הצלחת במשך 2 ימים בטמפרטורת החדר, הפוך.
    6. מעבירים את מסנן קרום על 6 ס"מ בינוני הבחירה Aspergillus 12 צלחות המכילות hygromycin B (Hyg) 150 מיקרוגרם / מ"ל, cefotaxime מ"מ 200 ו 100 מיקרוגרם / מ"לMoxalactam. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5-7 ימים לפני הבידוד היג מושבות עמיד.
    7. עם קיסמים קיסריים, העברת transformative putative על גבי 6 ס"מ צלחות Dactrose אגר (PDA) תפוחי אדמה המכילים 150 מיקרוגרם / מ"ל ​​Hyg, 100 מיקרוגרם / קנמיצין מ"ל.

4. מחיקת זיהוי מוטציה על ידי PCR

  1. חלץ DNA עבור PCR מן טרנספורמנטים על ידי תרמופוליזה 13 .
    1. לאחר טרנספורמציות טופס מושבות על מחשב כף יד משלב 3.2.7, להשתמש קיסם קיסרי להעביר כמות קטנה (2 מ"מ x 2 מ"מ) של mycelium או תאים שמרים מהמושבה לתוך 100 μL של תמיסה פתרון (50 מ"מ זרחתי פוספט, pH 7.4, 1 מ"מ EDTA, 5% גליצרול) בצינור microcentrifuge.
    2. לדגור את התערובת על 85-90 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. חנות תמצית גס המכיל DNA גנומי ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש בשלב 4.2.
  2. לבצע 4 תגובות PCR לכל המרה, אחד כל דEtcom recombination הומולוגיים של 5 'ו 3' אגפים, בהתאמה, אחד עבור סמן לבחירה (hygromycin phosphotransferase במקרה זה) ואחד עבור ה- GOI ORF.
    הערה: בדרך כלל אנו משתמשים Taq נמוך נאמנות נמוכה עבור תגובות אלה. תנאי התגובה הם כמתואר בשלב 2.1 לעיל מכילים SDW 20 μL, חיץ 10x Taq 2.5 μL, dNTPS (10 מ"מ) 0.5 μL, תוצרת בית 14 , 0.5 μL, פריימר (100 מיקרומטר) 0.5 μL, Primer B (100 מיקרומטר ) 0.5 μL, תבנית 0.5 μL. מניות ריכוז נמוך ריכוז (10 מיקרומטר) ניתן להשתמש באותה מידה.
  3. הפעל ג'ל agarose ( למשל 0.8%) של מוצרי ה- PCR. מוטציות מחיקה יפיקו את הלהקה Hyg אבל לא מוצר ORF. Ectopic integrants יראה שתי להקות. סוג בר יפיק רק את הלהקה ORF.
  4. שמור לצמיתות מחיקות מוטציות (ו ectopic transformant או שניים עבור בקרות) לשימוש עתידי.
    הערה: גליצרול 15% משמש sקרע שלנו זנים לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה OSCAR, בתגובה אחת, מייצר פלסמיד המכיל את הצלעות של הגן היעד להימחק סביב קלטת סמן לבחירה. הייצור של מבנים בונה באמצעות OSCAR הוא מאוד יעיל. המערכת יכולה, עם זאת, לייצר מבנים חלקיים המכילים כמה אבל לא כל שלושת השברים (שני האגפים גן סמן לבחירה). בדרך כלל, רוב E. transi coli מכילים את המבנה הנכון OSCAR. לדוגמה, איור 2 מתאר את מבנה המחיקה של OSCAR עבור הגן Verticillium dahliae VDAG_06812. במקרה זה את הצלעות של VDAG_06812 חוסר HII dIII או אתרים KpnI ולכן יש להוסיף פלסמיד של 4,247 BP צריך להיות משוחרר. איור 3 מראה HII dIII- Kpn אני הגבלה אנזים אישור עיכול כפול של מבנה פלסמיד נכון למעט נתיבים 5 ו 11 המייצג construc חריגהTs. איור 4 מראה אישור סופי של שני מחיקות גנטיות שונות על ידי כתם דרום. איור 5 מראה גישה PCR סופי כחלופה כתם דרום.

איור 2
איור 1: OSCAR מחיקת תגובה הבנייה. OSCAR את תהליך הבנייה מחיקת כולל הגברה נפרדת PCR של 5 'ו 3' אגפים גן, ואחריו תגובה clonase BP עם משולבת מוצרים האגף מטוהרים ואת הבחירה פלסמידים סמן בינארי. B1R, B2, B3, B4, P1R, P2R, P3, P4, R1, R2, L3 ו- L4 מייצגים אתרי רקומבינציה למבדה. הדפס מחדש באישור מהתייחסות 1 .

איור 2
איור 2: בניית מחיקת OSCAR עבור < Em> גן ורטיציליום דליהי VDAG_06812. עמדות של זיהוי אנזים הגבלה ואת אתרי חישול תחל כדי לאמת מבנה מבנה למחוק נכונה מוצגים. הדפס מחדש באישור מהתייחסות 1 .

איור 3
איור 3: אישור עיכול הגבלה של מבנה מבנה המחיקה של VDAG_06812 עם Kpn I ו- HII dIII. פלסמידים היו מעוכלים פעמיים ונותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה על 0.8% agarose ג'ל. המבנה הנכון מייצר שתי להקות, של כ 6.9 קילו ו 4.2 kb, המייצג את עמוד השדרה וקטור בינארי ואת סמן HygR התמזגו האגפים גן היעד, בהתאמה. הדפס מחדש באישור מהתייחסות 1 .

Ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> איור 4
איור 4: הכלאה כתם דרום המאשר מחיקת VDAG_02161 ו VDAG_09930 ב V. dahliae באמצעות אוסקר מחיקות בונה. הדנ"א הגנומי התעכל עם Bcl I. הם נחקרו לאחר מכן עם VDAG_02161 ו VDAG_09930 בדיקות ORF. להקות הכלאה הן 2,757 bp ו 1,426 bp עבור אללים סוג בר של VDAG_02161 ו VDAG_09930, בהתאמה. דוגמאות הן כדלקמן: נתיב 1: סוג בר זן VdLs.17; נתיב 2: מחיקת זן מוטציה 02161.1; נתיב 3: מחיקה זן מוטציה 02161.3; נתיב 4: זן transctant ectopic Ect 02161.2; נתיב 5: מחיקה זן מוטציה 09930.3; נתיב 6: מחיקה זן מוטציה 09930.10; נתיב 7: זן transctant ectopic Ect 09930.4. הדפס מחדש באישור מ הפניה 1 .

Gether.within-page = "1"> איור 5
איור 5: אישור מוטציה מחיקה על ידי PCR. ניתוח של טרנספורמציות fusarium fusarium verticillioides ectopic עבור הגן FVEG_13253. מסלולים 1 למעלה ולמטה, סמן; נתיבים 2-6 למעלה ג 'ל טרנספורמנטי PCR 5' מתוך הגברה קטע; נתיבים 7-11 למעלה הג 'ל ORF הגברה; נתיבים 2-6 ג'ל תחתון Hyg הגברה הגברה; נתיבים 7-11 ג'ל תחתון 3 'מתוך הגברה קטע. הדגימות הן זני מחיקה 11/31 (נתיבים 2 ו -7), 11/32 (נתיבים 3 ו -8), 11/33 (נתיבים 4 ו -9), וטרנספורמנטים ectopic 11/34 (נתיבים 5 ו -10) ו -11 / 35 (נתיבים 6 ו -11).

תֶחֶל להשתמש סדר פעולות
פריימר O1- (ATB2r) הגברה של 5'האגף,פריימר קדימה 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA
פריימר O2- (ATB1r) הגברה של 5'אגף, הפוך תחל 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT
פריימר O3- (ATB4) הגברה של 3 'אגף, פריימר קדימה 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTTTTT
פריימר O4- (ATB3) הגברה של 3 'אגף, פריימר הפוכה 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT

טבלה 1: תוספות ספציפיות של OSCAR פריימר 5 'נוספו לרצפי פריימר ספציפיים לגנים.

תֶחֶל להשתמש סדר פעולות
OSC-F 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT
OSC-R OSCAR הפוך רצף תחל, רצפים נגד החושים גדיל של 5 'האגף 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT
HygR (210) הפוך פריימר רצף, רצפים נגד גדיל חוט של 5 'האגף 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA
HygF (850) קדימה פריימר רצף, רצפים תחושה חוט של 3 'האגף 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG
ניו הייג מרקר קדימה כדי להגביר את הגן ההתנגדות hygromycin כבקרה (יחד עם חדש Hyg Marker Reverse תחל) 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA
חדש היג סמן הפוך כדי להגביר את הגן התנגדות hygromycin כבקרה (יחד עם חדש Hyg סמן סמן קדימה) 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG

טבלה 2: Primers לניתוח של אוסקר מחיקת מבנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלב אחד בניה של Agrobacterium -Recombination מוכן פלסמידים (OSCAR) הועסק בהצלחה עם מספר הולך וגדל של פטריות Ascomycota. השיטה צריכה גם להיות מיושם בקלות על Basidiomycota ו מינים אחרים phyla פטרייתי (עם היזמים המתאימים נהיגה לבחירה סמן גנים), בהנחה Agrobacterium בתיווך טרנספורמציה הומולוגיים רקומבינציה אפשריים. סמנים סמן נוספים נוצרו כדי לגוון את הבחירות של תרכובת אנטי פטרייתיים כמו גם לאפשר ייצור של מוטציות סדר כפול ומעלה. אלה כוללים התנגדות G418, nourseothricin, ולאחרונה את קוטלי עשבים glufosinate אמוניום ואתור כלורמורון 4 .

השיטה עובדה לשימוש עם Verticillium dahliae שממנו התמונות המוצגות כאן נגזרים בעיקר 1 . לאחרונה OSCAR כבר בשימוש נרחב למחיקה של גנים בפטרייה המוטוקסיגנית פוסיאריום ורטיצילואידים. מעל 60 מבניות מחיקה נעשו ומחיקות מוטציות עבור יותר מ -30 גנים שנוצר (לא פורסם).

ב iteration הנוכחי התהליך דורש כ 4-6 שבועות יש קבוצה של מוטציות המחיקה אישר ביד. להלן רשימה קצרה של מדרגות OSCAR הגדולות ואת הזמן המשוער הדרוש כדי להשיג אותם: 1) עיצוב ורכישה של primers OSCAR מבוסס על נתוני הגנום (5 ימים), 2) הגברה אגף שיבוט, (2 ימים), 3) לשכפל אישור על ידי miniprep ו רצף (1 שבוע), 4) הקדמה של פלסמיד לתוך Agrobacterium עבור ATMT (4 ימים), 5) ייצור של טרנספורמנטים על ידי ATMT ב fusarium verticillioides ולצמוח (2 שבועות, שים לב שזה תלוי בקצב הצמיחה של הפטרייה תחת מחקר), תרמופוליזה וקביעת PCR של גנוטיפים המרה (2 ימים), 6) בודדת, גנוטיפ אישור ואחסון (1-2 שבועות).

התחת = "jove_content"> ההתאמה של OSCAR לתפוקה גבוהה אמיתית לא ננסה לידיעתנו, אבל צריך להיות מעשי. התגובות הן חזקות מספיק כדי לאפשר יישום מוצלח בפורמט רב. השימוש ברובוטיקה בהחלט מקדם גישה זו. השיטה OSCAR יש את היתרון זמן החיסכון של דרישה תגובה רקומבינציה אחת המכילה את האגפים מוגבר ושתי פלסמידים pOSCAR ו- pA-Hyg OSCAR. גישות דומות דורשות הדור של שיבוט כניסה שיש לאשר ולאחר מכן משמש תגובה שנייה כדי ליצור את מבנה עניין. פלסמידים pOSCAR ו- pA-Hyg OSCAR המוזכרים זמינים באמצעות Addgene או פטריית גנטיקה Stock Center 15 . אחרים OSCAR סמן פלסמידים כגון pA-Bar-OSCAR ו pA-sur-OSCAR עשוי להיות זמין מחברים 5 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לסטודנטים הבאים לתואר ראשון ולתלמידי תיכון על עבודתם על מנת ליצור מוטציות של אוסקר ב Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodbry, Chelsea Patterson, קתלין רוברטסון, קריסטינה ברדלי, אשטון רוג'רס, אלקסיס מקנזי, מני הרננדז , ג 'ף דלונג, כריסטיאן קינג, ג' י ג 'ונג, מריה בלדינג, כריסטי בור, דניאל O'Meara, לורן (ויקטוריה) קוק, ג' ייק גודמן, Sampriti דה, Oge Okoye, אליסה Beckstead, גארט היבס, ניק גולדשטיין, קרוליין Twum , כריס בנסון, לואיס סטוקס, האנה אייל, ג'יין הולסה, ג'סים מוחמד, ג'יימס לוגינס, קלי ראסל, גרינישה ג'ונס, קריסטין שאפר, מריאם חמאדי, אווה וילסון, קטרינה בזמור, טוני הארפר, קרלין מקגי, מוחמד מומין, רימה מומין , Thi Ngoc לה אנג'ל פאם.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxime TCI America C2224
Kanamycin 11815032
Moxalactam Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48, (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7, (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103, (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9, (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65, (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10, (5), e0125960 (2015).
  9. Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
  10. Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8, (2), 172 (1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51, (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Springer International Publishing. 361-384 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics