Producción de eliminación rápida en hongos vía
1Toxicology and Mycotoxin Research Unit, NPRC, USDA-ARS, 2Hazera Seeds LTD, Brurim, 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” - Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”

Genetics

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Summary

Los mutantes de deleción genética generados a través de la recombinación homóloga son el patrón oro para estudios de la función génica. Se describe el método OSCAR (construcción de un solo paso de Agrobacterium-recombinación-listo-plásmidos) para la generación rápida de construcciones de deleción. Sigue la transformación de hongos mediada por Agrobacterium. Finalmente, se presenta un método de confirmación basado en PCR de deleciones de genes en transformantes fúngicos.

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Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

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Abstract

La deleción precisa de los genes de interés, dejando el resto del genoma sin cambios, proporciona el producto ideal para determinar la función de ese gen particular en el organismo vivo. En este protocolo se describe el método OSCAR de construcción de plásmidos de deleción precisa y rápida. OSCAR se basa en el sistema de clonación en el que se lleva a cabo una única reacción de recombinasa que contiene los flancos 5 'y 3' amplificados por PCR purificados del gen de interés y dos plásmidos, pA-Hyg OSCAR (el vector marcador) y pOSCAR vector). La confirmación del vector de deleción correctamente ensamblado se lleva a cabo por mapeo de digestión de restricción seguido por secuenciación. Agrobacterium tumefaciens se utiliza entonces para mediar la introducción de la construcción de deleción en esporas de hongos (denominado ATMT). Por último, se describe un ensayo de PCR para determinar si la construcción de deleción se integra mediante recombinación homóloga o no homóloga, indicando deleción de gen oEctópica, respectivamente. Este enfoque se ha utilizado con éxito para la deleción de numerosos genes en Verticillium dahliae y en Fusarium verticillioides entre otras especies.

Introduction

La disección genética es una poderosa metodología para determinar la importancia funcional de individuos o combinaciones de genes. Un enfoque estándar para comprender el papel de genes específicos es la producción de mutantes de un solo gen inalterados en cualquier otro gen. El enfoque más potente y menos potencialmente confuso es la supresión completa y precisa del marco de lectura abierto de un gen de interés (GOI ORF) sin dañar ninguna otra función génica.

Debido a que los enfoques de ligación estándar para la generación de plásmidos de deleción requieren múltiples etapas, el racional para OSCAR 1 era producir un enfoque in vitro más rápido. La figura 1 representa el proceso de montaje en el enfoque de OSCAR. El método descrito aquí tiene la ventaja de combinar la construcción rápida de vectores individuales de deleción de genes en una única reacción de múltiples partes en combinación con el posterior transfo mediado por Agrobacterium tumefaciensRencia (ATMT). OSCAR es muy rápido y se compara bien con otras estrategias como el uso del ensamblaje Gibson en levadura 2 . El método OSCAR se ha utilizado con éxito con varias especies de hongos Ascomycota. Estas especies incluyen: Fusarium verticillioides (inédito), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 y Dothistroma septosporum 9 y Sarocladium zeae (inédito) .

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para el método que incluye diseño de cebador, amplificación por PCR de flanco, reacción de OSCAR BP, confirmación de estructura de construcción de deleción, transformaciónDe Agrobacterium con el constructo seguido de la transferencia basada en ATMT de la construcción de deleción en las células fúngicas y finalmente diferenciando mutantes de deleción de hongos de aquellos con construcciones de deleción ectopicamente integradas.

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Protocol

1. Diseño del cebador para la amplificación por PCR de los flancos génicos

  1. Descargar a un archivo de procesamiento de texto la región genómica del gen de interés (GOI) incluyendo el marco de lectura abierto (ORF) y al menos 2 kb que flanquean el gen en cada lado de FungiDB u otro recurso de datos genómicos.
  2. Resalte el ORF destinado a la deleción y los codones de inicio y fin de la etiqueta.
  3. Identificar y resaltar ORFs adyacentes dentro de la secuencia descargada.
  4. Utilice el extremo 5 'de 2 kb del ORF de GOI y la herramienta de diseño de cebadores (ver Lista de Materiales) para diseñar el par de cebadores de PCR O1 y O2 para generar un producto de tamaño mínimo de 1 kb. Tenga cuidado de no impactar los ORF adyacentes.
    1. Pegue el flanco de 2 kb 5 'en la ventana "Sequence Entry". Haga clic en "Mostrar parámetros personalizados" cuadro. Introduzca los siguientes parámetros de diseño personalizados: primer TM 58 (min), 60 (opt) y 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) y 60 (máximo); Tamaño del cebador 22 (min), 24 (opt) y 26(Máx.); Amplicón Tamaño 1250 (min), 1500 (opt) y 2000 (máximo).
    2. Elija el resultado que coloca el cebador inverso (O2) más cercano al ORF. Capture una captura de pantalla de los ensayos y copie y pegue las secuencias de primer en el documento de procesamiento de texto.
    3. Repita el proceso para el flanco 3 'para generar los cebadores O3 y O4, esta vez elija el resultado colocando el cebador directo (O3) más cercano al ORF objetivo.
  5. Añadir sitios de unión apropiados a los extremos 5 'de los cebadores 1 a 4 (véase la Tabla 1 ).
  6. También diseñe y ordene cebadores específicos de ORF que se utilizarán para confirmar la eliminación en la sección 4 a continuación. Los parámetros deben ser los mismos que en el paso 1.4.1, excepto el uso de Amplicon tamaño 500 (min), 750 (opt) y 1000 (máximo) de ajuste de la longitud de ORF si es necesario. Finalmente, para la confirmación de recombinantes homólogos, genere cebadores 5 'hacia fuera y 3' hacia fuera descubiertos fuera de los flancos dentro del cromosoma. Estos cebadores "fuera" se utilizarán conHigR (210) e hygF (850), respectivamente ( Fig. 2 ).
  7. Primeros de pedido.

2. Producción de OSCAR Constructs

  1. Utilizando una Taq de alta fidelidad, se realizan dos reacciones, una para los flancos 5 'y 3', usando cebadores (100 μM) O1 y O2 en una reacción y los cebadores O3 y O4 en la segunda. La mezcla de reacción contiene lo siguiente: 29,5 mu l de agua destilada estéril (SDW), 5 mu l de tampón de PCR 10x LA, 8 mu l de mezcla de dNTP 2,5 mM, 5 mu L de MgCl _ { 2 } 25 mM, 1 mu l de plantilla (50 ng / (0,5 μl de Primer O3 y 0,5 μL de Primer O4 para el flanco 3 '). Las condiciones de reacción de uso son las siguientes: 94ºC durante 1 min, luego 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 2 min, luego pasos finales de 72 ° C durante 5 min y luego se mantienen indefinidamente a 10 ° C.
  2. Ejecutar 0,8%Agarosa 1x electroforesis en gel TAE (40 mM Tris acetato pH 8,3, EDTA 1 mM) durante aproximadamente 125 Vh en un aparato de minigel estándar para determinar el tamaño del producto y la concentración relativa. Post mancha el gel con mancha de non-ethidium de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Visualice en un iluminador UV.
  3. Si los productos de los flancos 5 'y 3' están en una concentración aproximadamente igual, combinarlos y utilizar un kit de columna de afinidad (o precipitación con PEG 90 μL de productos de PCR combinados, 240 μl de tampón TE pH 7,5, 160 μL de 30% de polietilenglicol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) para co-purificar los productos de PCR de acuerdo con el protocolo del fabricante. Si no son de igual concentración, combinar todo el producto de baja concentración con una cantidad estimada igual de producto de la reacción de rendimiento más alto.
  4. Utilice un espectrofotómetro para medir la concentración de ADN purificado.
  5. Realizar la reacción de BP mezclando lo siguiente: 1 μl de 60 ng / μL de pOSCAR, 2 μl de 60 ng /ΜL de pA-Hyg-OSCAR, 1 μl de flancos combinados de 60 ng / μl, 1 μl de clonasa. Incubar durante 16 h a 25 ° C. Terminar la reacción añadiendo 0,5 μL de proteinasa K e incubar durante 10 minutos a 37 ° C.
  6. Transformar alta competencia E. Coli . Tanto las células competentes comercialmente disponibles como las células competentes de DH5α CaCl2 hechas en casa se usaron satisfactoriamente como receptores como se describe en las instrucciones del fabricante. Placa de bajo contenido de sodio (0,5 g / L de NaCl) LB que contiene 100 μg / ml de espectinomicina (Spec).
  7. Identificar la construcción correcta mediante la realización de minipreps de ADN 10 de las colonias generadas anteriormente. Realizar una doble digestión con Hin dIII y Kpn I de la siguiente manera: pipetear 5 μL de ADN, 2 U de cada enzima, 2 μl de tampón 10x apropiado con SDW hasta un volumen total de 20 μL. Esto libera el inserto (aproximadamente 4,5 kb con los flancos del gen de 1,5 kb) del vector (aproximadamente 7 kb) y corta cualquier sitio enFlancos que pueden dar tamaños de banda predecibles.
  8. Secuencia 11 seleccionan clones que muestran un patrón de bandas apropiado.

3. Agrobacterium tumefaciens Transformación mediada (ATMT) de los hongos

  1. Transformar Agrobacterium tumefaciens cepa AGL1 con OSCAR deleción construir 12 .
  2. Transformar el hongo con AGL1 que contiene el plásmido de deleción GOI OSCAR. Para ello, realice los siguientes pasos:
    1. Preparar una suspensión de esporas fúngicas con agua estéril a 2 x 10 6 esporas / mL. Cuantificar las esporas en un hemocitómetro o en un contador automático de células. Coloque 500 μl de esto en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Esta configuración es para 4 placas de transformación.
    2. Utilizar un bucle desechable estéril azul para añadir una gota fácilmente visible (debe cubrir aproximadamente el 20% del diámetro del bucle) del plásmido de deleción que contiene AGL1 a partir del medio LB-Spec 100 de 2-3 días de edad (véase MPara la composición) que contienen las placas y mezclar en la suspensión de la espora. Vórtice hasta que las células bacterianas estén bien dispersas (aproximadamente 5 min de velocidad media).
    3. Pipetear 100 μl de la suspensión de conidia-Agro sobre el centro de un filtro de membrana de celulosa colocado en cada una de las cuatro placas de Petri de 6 cm que contienen el medio de co-cultivo 12 .
    4. Separe la suspensión con perlas de vidrio estériles (aproximadamente 4) para cubrir toda la superficie del filtro de membrana. Alternativamente, esparcir la suspensión con una herramienta de esparcido tradicional. Deje que el filtro de membrana se seque en una campana durante aproximadamente 10 min, envuelva con una película de parafina. Repita los pasos 3.2.2 y 3.2.3 para configurar múltiples transformaciones.
    5. Incubar la placa durante 2 días a temperatura ambiente, invertida.
    6. Transferir el filtro de membrana a un medio de selección de Aspergillus de 6 cm que contiene higromicina B (Hyg) 150 μg / ml, cefotaxima 200 mM y 100 μg / mlMoxalactama. Incubar a temperatura ambiente durante 5-7 días antes de aislar Hyg colonias resistentes.
    7. Con palillos de dientes estériles, transfiera los transformantes putativos a placas de 6 cm de Agar de Dextrosa de Patata (PDA) que contienen 150 μg / mL de Hyg, 100 μg / mL de kanamicina.

4. Identificación de mutantes por PCR

  1. Extraer el ADN para la PCR de transformantes por termólisis [ 13] .
    1. Una vez que los transformantes forman colonias en el PDA de la etapa 3.2.7, utilice un palillo estéril para transferir una pequeña cantidad (2 mm x 2 mm) de micelio o células de levadura de la colonia a 100 μl de solución de lisis (fosfato sódico 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, glicerol al 5%) en un tubo de microcentrífuga.
    2. Incubar la mezcla a 85-90 ° C durante 20-30 min. Almacenar el extracto crudo que contiene ADN genómico a -20 ° C hasta su uso en el paso 4.2.
  2. Llevar a cabo 4 reacciones de PCR por transformante, una cada dEtect recombinación homóloga de los flancos 5 'y 3', respectivamente, uno para el marcador seleccionable (higromicina fosfotransferasa en este caso) y uno para el GOI ORF.
    NOTA: En general, utilizamos Taq de baja fidelidad de bajo costo para estas reacciones. Las condiciones de reacción son las descritas en el paso 2.1 anterior y contienen SDW 20 μl, tampón Taq 10x 2,5 μl, dNTPS (10 mM) 0,5 μl, Taq 14 casero, 0,5 μL, Primer A (100 μM) ) 0,5 mu L, Plantilla 0,5 mu l. Pueden utilizarse igualmente cantidades de cebadores de concentración más baja (10 μM).
  3. Ejecutar un gel de agarosa ( por ejemplo, 0,8%) de los productos de PCR. Los mutantes de eliminación producirán la banda Hyg pero no un producto ORF. Los integrantes ectópicos mostrarán ambas bandas. El tipo salvaje producirá solamente la banda ORF.
  4. Almacenar permanentemente mutantes de deleción (y un transformante ectópico o dos para los controles) para uso futuro.
    NOTA: El 15% de glicerol se utiliza para sRasgó nuestras cepas a largo plazo a -80 ° C.

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Representative Results

El método OSCAR, en una única reacción, genera un plásmido que contiene los flancos del gen diana que se ha de deletar rodeando el casete marcador seleccionable. La producción de construcciones de deleción usando OSCAR es muy eficiente. Sin embargo, el sistema puede producir construcciones parciales que contienen algunos pero no todos los tres fragmentos (los dos flancos del gen y el marcador seleccionable). Generalmente, la mayoría de los transformantes de E. coli contienen la construcción OSCAR correcta. Por ejemplo, la Figura 2 representa la construcción de deleción de OSCAR para el gen Verticillium dahliae VDAG_06812. En este caso, los flancos de VDAG_06812 carecen de sitios Hin dIII o KpnI y por lo tanto se debe liberar un inserto plasmídico de 4,247 pb. La Figura 3 muestra la confirmación de doble digestión de la enzima de restricción Hin dIII- Kpn I de la estructura de plásmido correcta excepto para los carriles 5 y 11 que representan la construcción anómalaTs La Figura 4 muestra la confirmación final de dos supresiones de genes diferentes mediante transferencia de Southern. La Figura 5 muestra un enfoque de PCR definitivo como una alternativa a la transferencia de Southern.

Figura 2
Figura 1: Reacción de construcción de supresión de OSCAR. El proceso de construcción de deleción de OSCAR incluye amplificación por PCR separada de los flancos del gen 5 'y 3', seguido de una reacción de clonasa de BP con los productos de flanco purificados combinados y los plásmidos binarios y marcadores de selección. B1r, B2r, B3, B4, P1r, P2r, P3, P4, R1, R2, L3 y L4 representan sitios de recombinación lambda. Reimprimir con permiso de referencia 1 .

Figura 2
Figura 2: construcción de eliminación de OSCAR para < Em> Verticillium dahliae gen VDAG_06812. Se muestran posiciones de reconocimiento de enzimas de restricción y sitios de recocido de cebadores para verificar la estructura de construcción de deleción correcta. Reimprimir con permiso de referencia 1 .

figura 3
Figura 3: Confirmación de la digestión de restricción de la estructura de construcción de deleción de VDAG_06812 con Kpn I y Hin dIII. Los plásmidos se digirieron dos veces y se analizaron por electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8%. La construcción correcta genera dos bandas, de aproximadamente 6,9 ​​kb y 4,2 kb, que representan el esqueleto del vector binario y el marcador HygR fusionado con los flancos de los genes diana, respectivamente. Reimprimir con permiso de referencia 1 .

Ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: hibridación Southern blot que confirma la deleción de VDAG_02161 y VDAG_09930 en V. dahliae usando construcciones de deleción de OSCAR. Los ADN genómicos se digirieron con Bcl I. Luego se probaron simultáneamente con las sondas VDAG_02161 y VDAG_09930 ORF. Las bandas de hibridación son 2,757 pb y 1,426 pb para los alelos de tipo salvaje de VDAG_02161 y VDAG_09930, respectivamente. Las muestras son las siguientes: carril 1: cepa de tipo salvaje VdLs17; Carril 2: cepa mutante de deleción 02161.1; Carril 3: cepa mutante de deleción 02161.3; Carril 4: cepa transformante ectópica Ect 02161.2; Carril 5: cepa mutante de deleción 09930.3; Carril 6: cepa mutante de deleción 09930.10; Carril 7: cepa transformante ectópica Ect 09930.4. Reimprimir con permiso de Referencia 1 .


Figura 5: Confirmación del mutante de deleción por PCR. Análisis de la deleción y transformantes ectópicos de Fusarium verticillioides para el gen FVEG_13253. Carriles 1 arriba y abajo, marcador; Carriles 2 - 6 transformador de gel superior PCR 5 'amplificación de fragmentos; Carriles 7-11 amplificación de ORF de gel superior; Carriles 2-6 gel inferior Hyg gen amplificación; Carriles 7-11 gel de fondo 3 'amplificación de fragmentos. Las muestras son cepas de deleción 11/31 (carriles 2 y 7), 11/32 (carriles 3 y 8), 11/33 (carriles 4 y 9) y transformantes ectópicos 11/34 (carriles 5 y 10) y 11 / 35 (carriles 6 y 11).

Cebador Utilizar Secuencia
Primer O1- (attB2r) La amplificación del flanco 5 'Adelante 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA
Primer O2- (attB1r) Amplificación del flanco 5 ' 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT
Primer O3- (attB4) Amplificación del flanco 3 ', adelante del cebador 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT
Primer O4- (attB3) Amplificación del flanco 3 ', reverso del cebador 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT

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Cebador Utilizar Secuencia
OSC-F 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT
OSC-R OSCAR iniciador de secuenciación inversa, secuencias antisentido de 5 'de flanco 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT
HygR (210) Injerto de secuenciación inversa, secuencias antisentido de 5 'flanco 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA
HygF (850) Secuencia de secuenciación directa, Secuencia de secuencia de sentido de flanco 3 ' 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG
New Hyg Marker Delantero Para amplificar el gen de resistencia a la higromicina como control (junto con el cebador New Hyg Marker Reverse a continuación) 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA
New Hyg Marker Reverse Para amplificar el gen de resistencia a la higromicina como control (junto con el cebador New Hyg Marker Forward anterior) 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG

Tabla 2: Primers para el análisis de las construcciones de deleción de OSCAR.

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Discussion

La construcción en un solo paso de los plásmidos preparados con recombinación de Agrobacterium (OSCAR) se ha empleado con éxito con un número cada vez mayor de hongos Ascomycota. El método también debe ser fácilmente aplicable a Basidiomycota y especies de otros phylas de hongos (con promotores apropiados que conducen genes marcadores seleccionables), suponiendo que la transformación mediada por Agrobacterium y la recombinación homóloga son posibles. Se han generado vectores marcadores adicionales para diversificar las elecciones de compuestos antifúngicos, así como para permitir la producción de mutantes de orden doble y superior. Estos incluyen la resistencia a G418, nourseothricin, y recientemente los herbicidas glufosinato amonio y clorimurón etilo 4 .

El método fue elaborado para su uso con Verticillium dahliae de la que las imágenes presentadas aquí se derivan principalmente 1 . Más recientemente OSCAR se ha utilizado ampliamente para la eliminaciónDe los genes en el hongo micotoxigénico Fusarium verticillioides. Se han hecho más de 60 construcciones de deleción y supresiones mutantes para más de 30 genes generados (inéditos).

En su iteración actual, el proceso requiere unas 4-6 semanas para tener un conjunto de mutantes confirmados de deleción en la mano. A continuación se presenta una breve lista de los principales pasos de OSCAR y el tiempo aproximado necesario para lograrlos: 1) Diseño y obtención de cebadores OSCAR basados ​​en datos genómicos (5 días), 2) amplificación y clonación de flancos (2 días), 3) (4 semanas), 5) producción de transformantes por ATMT en Fusarium verticillioides y crecimiento (2 semanas, tenga en cuenta que esto depende de la tasa de crecimiento Del hongo en estudio), termólisis y PCR de genotipos transformantes (2 días), 6) solo sporing, confirmación del genotipo y almacenamiento (1-2 semanas).

15 . Otros plásmidos marcadores OSCAR tales como pA-Bar-OSCAR y pA-Sur-OSCAR pueden estar disponibles de autores 5 .

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores agradecen a los siguientes estudiantes de pregrado y secundaria su trabajo para generar mutantes OSCAR en Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie y Manny Hernández Ashly Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, María Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le y Angel Pham.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxime TCI America C2224
Kanamycin 11815032
Moxalactam Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR

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References

  1. Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48, (7), 677-684 (2011).
  2. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  3. Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7, (7), (2011).
  4. Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103, (6), 641-647 (2013).
  5. Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9, (9), (2014).
  6. Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
  7. Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65, (4), 2151-2160 (2015).
  8. Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10, (5), e0125960 (2015).
  9. Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
  10. Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y. Mini-prep in ten minutes. Biotechniques. 8, (2), 172 (1990).
  11. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74, (12), 5463-5467 (1977).
  12. Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
  13. Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51, (1), 114-118 (2010).
  14. Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21, (20), 4850-4851 (1993).
  15. McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. Springer International Publishing. 361-384 (2016).

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