Produção de Deleção Rápida em Fungi via
1Toxicology and Mycotoxin Research Unit, NPRC, USDA-ARS, 2Hazera Seeds LTD, Brurim, 3Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea “La Mayora” - Universidad de Málaga - Consejo Superior de Investigaciones Científicas (IHSM-UMA-CSIC), Estación Experimental “La Mayora”

Genetics

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Summary

Os mutantes de deleção de genes gerados através da recombinação homóloga são o padrão-ouro para estudos de função gênica. O método OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) para a geração rápida de construções de exclusão é descrito. A transformação fúngica mediada por Agrobacterium segue. Finalmente, é apresentado um método de confirmação baseado em PCR de deleções genéticas em transformantes fúngicos.

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Gold, S. E., Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Glenn, A. E. Rapid Deletion Production in Fungi via Agrobacterium Mediated Transformation of OSCAR Deletion Constructs. J. Vis. Exp. (124), e55239, doi:10.3791/55239 (2017).

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Abstract

Eliminação precisa de gene (s) de interesse, deixando o resto do genoma inalterado, fornece o produto ideal para determinar a função desse gene específico no organismo vivo. Neste protocolo, descreve-se o método OSCAR de construção de plasmídeos de deleção precisa e rápida. OSCAR depende do sistema de clonagem no qual uma única reação de recombinase é realizada contendo os flancos 5 'e 3' amplificados de PCR amplificados do gene de interesse e dois plasmídeos, pA-Hyg OSCAR (o vetor marcador) e pOSCAR (a assembléia vetor). A confirmação do vetor de deleção corretamente montado é realizada por mapeamento de digestão de restrição seguido de seqüenciamento. Agrobacterium tumefaciens é então usado para mediar a introdução da construção de deleção em esporos de fungos (referido como ATMT). Finalmente, um ensaio de PCR é descrito para determinar se a construção de deleção integrada por recombinação homóloga ou não homóloga, indicando deleção de gene ouIntegração ectopica, respectivamente. Esta abordagem foi utilizada com sucesso para a eliminação de numerosos genes em Verticillium dahliae e em Fusarium verticillioides entre outras espécies.

Introduction

A dissecção genética é uma metodologia poderosa para determinar a importância funcional de indivíduos ou combinações de genes. Uma abordagem padrão para entender o papel de genes específicos é a produção de mutantes de genes únicos inalterados em qualquer outro gene. A abordagem mais poderosa e menos potencialmente confusa é a deleção completa e precisa de um quadro de leitura aberto do gene de interesse (GOF ORF) sem danos a qualquer outra função genética.

Como as abordagens de ligadura padrão para a produção de plasmídeos de deleção requerem etapas múltiplas, o racional para OSCAR 1 era produzir uma abordagem in vitro mais rápida. A Figura 1 mostra o processo de montagem na abordagem OSCAR. O método descrito aqui tem a vantagem de combinar a construção rápida de vetores de deleção de genes individuais em uma única reação multipart em combinação com transfo mediado subseqüente Agrobacterium tumefaciens(ATMT). O OSCAR é muito rápido e compara-se bem com outras estratégias, como o uso da montagem de Gibson em leveduras 2 . O método OSCAR foi utilizado com sucesso com diversas espécies de fungos de Ascomycota. Essas espécies incluem: Fusarium verticillioides (não publicado), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. Sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 e Dothistroma septosporum 9 e Sarocladium zeae (não publicado) .

Este protocolo fornece instruções passo-a-passo para o método, incluindo design de iniciadores, amplificação de PCR de flanco, reação de OSCAR BP, confirmação de estrutura de construção de exclusão, transformaçãoIão de Agrobacterium com a construção seguida pela transferência baseada na ATMT da construção de deleção nas células de fungos e, finalmente, diferencia os mutantes de deleção de fungos daqueles com construções de exclusão ectopicamente integradas.

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Protocol

1. Projeto de iniciador para amplificação por PCR de flancos de genes

  1. Faça o download para um arquivo de processamento de texto da região genômica do gene de interesse (GOI) incluindo o quadro de leitura aberto (ORF) e pelo menos 2 kb flanqueando o gene em cada lado do FungiDB ou outro recurso de dados genômicos.
  2. Destaque o ORF destinado a eliminação e rotina de arranque e paragem de codificações.
  3. Identificar e destacar ORFs adjacentes dentro da seqüência de download.
  4. Use o final de 5 kb do ORF GOI e a ferramenta de design do primer (consulte Lista de materiais) para projetar o par de iniciadores de PCR O1 e O2 para gerar um produto de tamanho mínimo de 1 kb. Tenha cuidado para não afetar ORFs adjacentes.
    1. Cole o flanco de 5 kb de 5 'na janela "Sequence Entry". Clique na caixa "Mostrar parâmetros personalizados". Digite os seguintes parâmetros de design personalizados: primer TM 58 (min), 60 (opt) e 62 (máximo); Primer GC 40 (min), 50 (opt) e 60 (máximo); Primer Tamanho 22 (min), 24 (opt) e 26(Máximo); Amplicon Tamanho 1250 (min), 1500 (opt) e 2000 (máximo).
    2. Escolha o resultado que coloca o primário reverso (O2) mais próximo do ORF. Capture uma captura de tela dos ensaios e copie e cole as sequências de iniciadores no documento de processamento de texto.
    3. Repita o processo para o flanco de 3 'para gerar primers O3 e O4, desta vez escolha o resultado colocando o iniciador direto (O3) mais próximo do ORF de destino.
  5. Adicione locais de ligação apropriados às extremidades 5 'dos ​​iniciadores 1 a 4 (ver Tabela 1 ).
  6. Também crie e ordene primers ORF específicos para serem usados ​​para confirmação de exclusão na seção 4 abaixo. Os parâmetros devem ser os mesmos que na etapa 1.4.1, exceto usar Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) e 1000 (máximo) ajustando o comprimento do ORF, se necessário. Finalmente, para a confirmação de recombinantes homólogos, gerar 5 'out e 3' out primers encontrados apenas fora dos flancos dentro do cromossomo. Esses iniciadores "fora" serão usados ​​comHygR (210) e hygF (850), respectivamente ( Fig. 2 ).
  7. Primários de pedidos.

2. Produção de Construções OSCAR

  1. Usando uma Taq de alta fidelidade , realizar duas reações, uma para cada 5 'e 3' flancos, usando primers (100 μM) O1 e O2 em uma reação e primers O3 e O4 no segundo. A mistura de reacção contém o seguinte: 29,5 μL de água destilada estéril (SDW), 5 μL de tampão de PCR de 10x LA, 8 μL de mistura de dNTP 2,5 mM, 5 μL de MgCl2 25 mM, molde de 1 μL (50 ng / μL), 0,5 μL de hi- Taq de fidelidade , 0,5 μL de Primer O1 e 0,5 μL de Primer O2 para flanco de 5 '(ou 0,5 μL de Primer O3 e 0,5 μL de Primer O4 para flanco de 3'). As condições de reacção de utilização são as seguintes: 94 ° C durante 1 min, depois 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C durante 2 min, depois etapas finais de 72 ° C durante 5 min e depois segure indefinidamente a 10 ° C.
  2. Execute 0,8%Agarose 1x TAE (acetato de Tris 40 mM pH 8,3, EDTA 1 mM) eletroforese em gel para aproximadamente 125 Vh em um aparelho minigel padrão para determinar o tamanho do produto e a concentração relativa. Posicione o gel com mancha não-etídica de acordo com as instruções do fabricante. Visualize em um iluminador UV.
  3. Se os produtos de flanco de 5 'e 3' estiverem em uma concentração aproximadamente igual, combine-os e use um kit de coluna de afinidade (ou precipitação de PEG, 90 μL de produtos de PCR combinados, 240 μL de tampão TE pH 7,5, 160 μL de polietileno glicol a 30% PEG8000 MgCl 30 mM 2 ) para co-purificar os produtos de PCR de acordo com o protocolo do fabricante. Se eles não são de igual concentração combinam todo o produto de baixa concentração com uma quantidade equivalente estimada de produto da reação de maior rendimento.
  4. Use um espectrofotômetro para medir a concentração de DNA purificada.
  5. Realize a reação da PA, misturando o seguinte: 1 μL de 60 ng / μL de pOSCAR, 2 μL de 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μL de flancos combinados de 60 ng / μL, 1 μL de clonase. Incubar durante 16 h a 25 ° C. Terminar a reação adicionando 0,5 μL de proteinase K e incubar durante 10 min a 37 ° C.
  6. Transforme alta competência E. Células de coli . Ambas as células competentes comercialmente disponíveis e as células competentes DH5α CaCl 2 caseiras foram usadas com sucesso como destinatários conforme descrito pelas instruções do fabricante. Placa com baixo teor de sódio (0,5 g / L de NaCl) contendo 100 μg / mL de espectinomicina (Spec).
  7. Identifique a construção correta através da realização de minipretes de DNA 10 das colônias geradas acima. Faça uma digestão dupla com Hin dIII e Kpn I da seguinte maneira: pipeteie 5 μL de DNA, 2 U de cada enzima, 2 μL de tampão 10x apropriado com SDW para um volume total de 20 μL. Isso liberta a inserção (aproximadamente 4,5 kb com flancos de genes de 1,5 kb) do vetor ( aproximadamente 7 kb) e corta todos os sites emFlancos que podem dar tamanhos de banda previsíveis.
  8. Sequência 11 clones selecionados que mostram um padrão de bandas apropriado.

3. Agrobacterium tumefaciens Transformação Mediada (ATMT) de Fungos

  1. Transforme a Estirpe AGL1 de Agrobacterium tumefaciens com a construção de deleção de OSCAR 12 .
  2. Transforme o fungo com AGL1 contendo o plasmídeo de deleção GOI OSCAR. Para fazer isso, execute as seguintes etapas:
    1. Prepare uma suspensão de esporos fúngicos com água estéril a 2 x 10 6 esporos / mL. Quantificar esporos em um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Coloque 500 μL deste em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Esta configuração é para 4 placas de transformação.
    2. Use um laço descartable estéril azul para adicionar uma gota facilmente visível (deve cobrir cerca de 20% do diâmetro do laço) do plasmídeo de deleção contendo AGL1 a partir do meio LB-Spec 100 de 2 a 3 dias de idade (ver MLista de composição para composição) contendo placas e misture na suspensão de esporos. Vortex até células bacterianas estão bem dispersas (aproximadamente 5 min de velocidade média).
    3. Pipetar 100 μL da suspensão conidia-Agro no centro de um filtro de membrana de celulose colocado em cada um dos quatro pratos de Petri de 6 cm contendo meio de co-cultivo 12 .
    4. Espalhe a suspensão com contas de vidro esterilizadas (cerca de 4) para cobrir toda a superfície do filtro de membrana. Alternativamente, espalhe a suspensão usando uma ferramenta de espalhamento tradicional. Deixe o filtro de membrana secar em um capuz por aproximadamente 10 minutos, envolva com filme de parafina. Repita as etapas 3.2.2 e 3.2.3 para configurar múltiplas transformações.
    5. Incubar a placa durante 2 dias à temperatura ambiente, invertida.
    6. Transfira o filtro de membrana para meio de seleção de Aspergillus de 6 cm 12 placas contendo higromicina B (Hyg) 150 μg / mL, cefotaxima 200 mM e 100 μg / mLMoxalactam. Incubar à temperatura ambiente durante 5-7 dias antes de isolar as colônias resistentes a Hyg.
    7. Com palitos de dentes estéreis, transfira transformantes putativos em placas de 6 cm de Agar Dextrose de Batata (PDA) contendo 150 μg / mL de Hyg, 100 μg / mL de kanamicina.

4. Eliminar Identificação de Mutantes por PCR

  1. Extrair DNA para PCR de transformantes por termólise 13 .
    1. Uma vez que os transformantes formam colônias no PDA do passo 3.2.7, use um palito de dente estéril para transferir uma pequena quantidade (2 mm x 2 mm) de células de micélio ou de fermento da colônia para 100 μL de solução de lise (pH de fosfato de 50 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, 5% de glicerol) num tubo de microcentrífuga.
    2. Incubar a mistura a 85-90 ° C durante 20 a 30 minutos. Armazene o extrato bruto contendo DNA genômico a -20 ° C até o uso no passo 4.2.
  2. Realizar 4 reações de PCR por transformante, uma a cada dEtect recombinação homóloga dos flancos 5 'e 3', respectivamente, um para o marcador selecionável (higromicina fosfotransferase neste caso) e um para ORF GOI.
    NOTA: Geralmente, usamos Taq de baixa fidelidade barato para essas reações. As condições de reacção são como descrito no passo 2.1 acima e contêm SDW 20 μL, tampão Taq 10x 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μL, Taq 14 caseiro, 0,5 μL, Primer A (100 μM) 0,5 μL, iniciador B (100 μM ) 0,5 μL, modelo 0,5 μL. Os estoques de iniciadores de menor concentração (10 μM) podem ser utilizados igualmente bem.
  3. Execute um gel de agarose ( eg 0,8%) dos produtos de PCR. Os mutantes de exclusão produzirão a banda Hyg, mas não um produto ORF. Os integrantes ectopicos mostrarão as duas bandas. O tipo selvagem produzirá apenas a banda ORF.
  4. Permanentemente armazene mutantes de deleção (e um transformante ectópico ou dois para controles) para uso futuro.
    NOTA: 15% de glicerol é usado para sRasgou nossas tensões a longo prazo a -80 ° C.

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Representative Results

O método OSCAR, em uma única reação, gera um plasmídeo contendo os flancos do gene alvo a ser excluído em torno da cassete marcador selecionável. A produção de construções de exclusão usando o OSCAR é muito eficiente. O sistema pode, no entanto, produzir construções parciais que contenham alguns, mas não todos os três fragmentos (os dois flancos de genes e o marcador selecionável). Geralmente, a maioria dos transformantes de E. coli contém a construção OSCAR correta. Por exemplo, a Figura 2 mostra a construção de exclusão de OSCAR para o gene Verdicllium dahliae VDAG_06812. Nesse caso, os flancos de VDAG_06812 carecem de sites Hin dIII ou KpnI e, portanto, deve ser liberada uma inserção de plasmídeo de 4.247 pb. A Figura 3 mostra a confirmação de dupla digestão de enzima de restrição de Hin dIII- Kpn I da estrutura de plasmídeo correta, exceto para pistas 5 e 11 que representam uma construção anômalaTs. A Figura 4 mostra a confirmação final de duas deleções de genes diferentes por Southern Blot. A Figura 5 mostra uma abordagem de PCR definitiva como alternativa ao Southern Blot.

Figura 2
Figura 1: reação de construção de exclusão de OSCAR. O processo de construção de deleção de OSCAR inclui amplificação por PCR separada dos flancos de genes de 5 'e 3', seguido de uma reação de clonase de BP com os produtos de flanco purificados combinados e os plasmídeos marcadores de seleção e binário. B1r, B2r, B3, B4, P1r, P2r, P3, P4, R1, R2, L3 e L4 representam sítios de recombinação de lambda. Reimprimir com permissão da referência 1 .

Figura 2
Figura 2: construção de exclusão OSCAR para < Em> Verticillium dahliae gene VDAG_06812. As posições de reconhecimento de enzimas de restrição e os locais de recozimento de iniciadores para verificar a estrutura correta de construção de exclusão são mostradas. Reimprimir com permissão da referência 1 .

Figura 3
Figura 3: Confirmação de digestão de restrição da estrutura de construção de deleção de VDAG_06812 com Kpn I e Hin dIII. Os plasmídeos foram digeridos duas vezes e analisados ​​por electroforese em gel em um gel de agarose a 0,8%. A construção correta gera duas bandas, de cerca de 6,9 ​​kb e 4,2 kb, representando o esqueleto do vetor binário e o marcador HygR fundido aos flancos dos genes alvo, respectivamente. Reimprimir com permissão da referência 1 .

Aient "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 4
Figura 4: hibridação Southern blot confirmando a eliminação de VDAG_02161 e VDAG_09930 em V. dahliae usando construções de exclusão OSCAR. Os DNAs genômicos foram digeridos com Bcl I. Eles foram então sondados simultaneamente com as sondas ORD VDAG_02161 e VDAG_09930. As bandas de hibridação são de 2,757 pb e 1,426 pb para os alelos de tipo selvagem de VDAG_02161 e VDAG_09930, respectivamente. As amostras são as seguintes: pista 1: estirpe de tipo selvagem VdLs.17; Pista 2: estirpe mutante de deleção 02161.1; Pista 3: estirpe mutante de deleção 02161.3; Pista 4: estirpe transformante ectópica Ect 02161.2; Pista 5: estirpe mutante de deleção 09930.3; Pista 6: estirpe mutante de deleção 09930,10; Pista 7: estirpe transformante ectópica Ect 09930.4. Reimprimir com permissão de Referência 1 .


Figura 5: Excluir a confirmação do mutante por PCR. Análise de deleção e transformantes ectópicos de Fusarium verticillioides para o gene FVEG_13253. Lanes 1 top e bottom, marcador; Pistas 2 a 6 superiores transformante de gel PCR 5 'out amplificação de fragmento; Pistas 7-11 amplificação superior de ORF de gel; Pistas 2-6 amplificação do gene Hyg de fundo; Pistas 7-11 amplificação do fragmento 3 'do fundo do fragmento. As amostras são estirpes de deleção 11/31 (pistas 2 e 7), 11/32 (pistas 3 e 8), 11/33 (pistas 4 e 9) e transformantes ectópicos 11/34 (pistas 5 e 10) e 11 / 35 (pistas 6 e 11).

Primer Usar Seqüência
Primer O1- (attB2r) Amplificação do flanco 5,5Preliminar para a frente 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA
Primer O2- (attB1r) Amplificação do flanco 5,5, reverso do iniciador 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT
Primer O3- (attB4) Amplificação do flanco 3 ', iniciador para frente 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT
Primer O4- (attB3) Amplificação do flanco 3 ', reverso do iniciador 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT

Tabela 1: Extensões específicas do iniciador OSCAR 5 'adicionadas às sequências de iniciadores específicas do gene.

Primer Usar Seqüência
OSC-F 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT
OSC-R Primário de sequenciação inversa OSCAR, corda anti-sentido de sequências de flanco de 5 ' 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT
HygR (210) Primário de sequenciação inversa, corda anti-sentido de sequências de flanco de 5 ' 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA
HygF (850) Primário de seqüência direta, seqüência de seqüências do flanco de 3 ' 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG
New Hyg Marker Forward Para amplificar o gene de resistência à higromicina como um controle (em conjunto com o iniciador New Hyg Marker Reverse abaixo) 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA
New Hyg Marker Reverse Para amplificar o gene de resistência à higromicina como um controle (juntamente com o iniciador New Hyg Marker Forward acima) 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG

Tabela 2: Primers para análise de construções de exclusão de OSCAR.

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Discussion

One Step Construction of Agrobacterium - Os plasmídeos prontos para reconstrução (OSCAR) foram empregados com sucesso com um número cada vez maior de fungos de Ascomycota. O método também pode ser facilmente aplicável à Basidiomycota e a espécies de outros filamentos fúngicos (com promotores apropriados que geram genes marcadores selecionáveis), assumindo que a transformação mediada por Agrobacterium e a recombinação homóloga são possíveis. Foram gerados vetores marcadores adicionais para diversificar as escolhas de compostos anti-fúngicos, bem como permitir a produção de mutantes de ordem superior e superior. Estes incluem resistência a G418, a nutseotricina e, recentemente, os herbicidas glufosinato amônio e clorimurão etil 4 .

O método foi elaborado para uso com Verticillium dahliae, das quais as imagens apresentadas aqui são derivadas 1 . Mais recentemente, o OSCAR foi amplamente usado para exclusãoDe genes no fungo micotoxigênico Fusarium verticillioides. Mais de 60 construções de deleção foram feitas e deleções mutantes para mais de 30 genes gerados (não publicados).

Na sua iteração atual, o processo requer cerca de 4-6 semanas para ter um conjunto de mutantes de deleção confirmados em mãos. O seguinte é uma breve lista das principais etapas do OSCAR e o tempo aproximado necessário para realizá-los: 1) Concepção e aquisição de iniciadores OSCAR com base nos dados do genoma (5 dias), 2) amplificação e clonagem do flanco (2 dias), 3) Confirmação do clone por miniprep e seqüenciamento (1 semana), 4) introdução de plasmídeo em Agrobacterium para ATMT (4 dias), 5) produção de transformantes por ATMT em Fusarium verticillioides e crescimento (2 semanas, observe que isso depende da taxa de crescimento Do fungo em estudo), termólise e determinação por PCR de genótipos de transformantes (2 dias), 6) esportivo único, confirmação e armazenamento de genótipos (1-2 semanas).

15 . Outros plasmídeos marcador OSCAR como pA-Bar-OSCAR e pA-Sur-OSCAR podem estar disponíveis nos autores 5 .

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Os autores agradecem aos seguintes estudantes de graduação e ensino médio por seu trabalho para gerar mutantes OSCAR em falsos verticillioiodes de Fusarium : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez Ashli ​​Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin Thi Ngoc Le e Angel Pham.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FungiDB Database/ http://fungidb.org/fungidb/
IDT PrimerQuest IDT Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
Microsoft Word Sequence file manipulation
Low Na LB Spec 100 medium E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium
Co-cultivation medium ATMT transformation induction (Reference 12)
Aspergillus minimal medium with Hygromycin Fungal transformant selection
PDA medium Acumedia 7149A Single spore slant tubes
PDA-Hyg-Kan medium Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin
Glass beads Genlantis C400100 Plate spreading
Nitrocellulose filters (47 mm) Fisher 09-719-555 Co-culturing for ATMT
Various centifuge tubes multiple preps
Petri plates (various) Culturing of bacteria and Fungi
pA-Hyg OSCAR Addgene 29640 Selectable marker vector
pOSCAR Addgene 29639 Assembly vector
DH5α One Shot Competent E. coli cells Life Technologies  12297-016 BP reaction transformation
ccdB survival E. coli cells Life Technologies  A10460 Maintenance of pOSCAR
Wooden transfer sticks Colony streaking
Toothpicks Colony picking
Microcentrifuge Pelleting Bacteria, etc.
Preparative centrifuge Fungal spore collection
Dissecting microscope Single spore isolation
Automated Cell Counter Spore suspension calculation
Compound microscope Hemocytometer cell counting
QIAquick PCR Purification Kit  Qiagen 28104 PCR gene flank produict purification
TaKaRa LA Taq  Takara Bio USA RR002A Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation
Hygromycin B InvivoGen ant-hg-5
Spectinomycin Sigma 22189-32-8
Cefotaxime TCI America C2224
Kanamycin 11815032
Moxalactam Sigma-Aldrich 43963
GelRed  Phenix Research Products RGB-4103 Post staining agarose gels
Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) 
(OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen)  Thermo Fisher Scientific C862003
Gateway BP Clonase II Enzyme mix Thermo Fisher Scientific 11789020 Used to assemble deletion construct in pOSAR

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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