Använda mikroflödessystem enheter för att mäta livslängd och Cellular fenotyper i Single Budding jästceller

Published 3/30/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

You must be subscribed to JoVE to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit," you agree to our policies.

 

Summary

I denna artikel presenteras ett protokoll optimerad för produktion av mikrofluidchips och installationen av mikrofluid experiment för att mäta livslängden och cellulära fenotyper av enstaka jästceller.

Cite this Article

Copy Citation

Zou, K., Ren, D. S., Ou-yang, Q., Li, H., Zheng, J. Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells. J. Vis. Exp. (121), e55412, doi:10.3791/55412 (2017).

Please note that all translations are automatically generated through Google Translate.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Spirande jäst är en kraftfull modellorganism i äldreforskning. Emellertid en konventionell livslängd analys i jäst är beroende av microdissection, som inte bara är arbetsintensiv utan också låg genomströmning 1, 2. Dessutom behöver den traditionella microdissection tillvägagångssätt inte ger en detaljerad vy av olika cellulära och molekylära funktioner i de samlade moderceller som de gamla. Utvecklingen av mikrofluidanordningar har möjliggjort en automatiserad procedur för att mäta jäst livslängd såväl som att följa molekylära markörer och olika cellulära fenotyper under hela livet av modercellerna 3, 4, 5, 6, 7, 8. Efter jästceller laddas i en mikrofluidanordning kan de spåras under ett mikroskop med användning av automatiska tids varve avbildning. Med hjälp av avbildning bearbetningsverktyg kan olika cellulära och molekylära fenotyper extraheras tre, sex, åtta, inklusive livslängd, storlek, fluorescerande reporter, cellmorfologi, cellcykeldynamik, etc, av vilka många är svåra eller omöjliga att erhålla med användning av den traditionella microdissection metoden. Mikrofluidikanordningar har fått en framträdande plats i jäst åldrande forskning eftersom deras framgångsrik utveckling för några år sedan 3, 4, 6, 7. Flera grupper har därefter publicerat på varianter av de tidigare konstruktioner 5 och många jäst labs har använt mikroflödessystem enheter för sina studier.

I en cellkultur som undergår exponentiell tillväxt, antalet åldrade moderceller som är tillgängliga för observation är miniscule. Därför är den allmänna principen om mikroflödessystem enheten design för livslängdsmätningar att behålla moderceller och för att avlägsna dotterceller. En sådana konstruktioner utnyttjar det faktum att jäst genomgår asymmetrisk celldelning. Strukturerna i den enheten kommer fällan större moderceller och möjliggör mindre dotterceller som skall tvättas bort. Mikroflödeschipet som beskrivs i denna artikel använder ett mjukt polydimetylsiloxan (PDMS) dyna (vertikala Pensile kolumner) för att fånga moderceller (Figur 1). Anordningar av liknande utformning har tidigare 3, 4, 6, 7 rapporterats. Detta protokoll använder ett enklare förfarande för att tillverka mikrofluidanordningar och en enkel cellladdningsmetod som är optimerad för de tidsförlopp imaging experiment. En av de viktigaste parametrarna i mikrofluidanordningen är bredden av de PDMS dynor som används för att fälla moderceller. vår dEvice använder bredare kuddar som kan hålla fler moderceller under varje pad, inklusive en betydande del av färska moderceller som kan spåras under hela deras livslängd. Förutom livslängdsmätningar, är detta protokoll användbar för enkelcelltidsförlopp imaging experiment när cellerna måste spåras i många generationer, eller när en observation genom hela livslängd är nödvändigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kiselskiva Mold Fabrication

OBS: Fotomasken är utformad med AutoCAD och tillverkas av ett kommersiellt företag. Denna design innehåller tre skikt av olika mönster ( Kompletterande File 1 ). Höjderna av de första, andra, och tredje skikten är ungefär 4 pm, 10 pm och 50 pm, respektive. Den kiselskiva formen skapades från fotomasken med hjälp mjuk litografi 9, 10.

  1. Baka en kiselskiva vid 200 ° C under 10 min för att förånga vattenånga. Spin coat negativ fotoresist SU-8 på kiselskivan.
    OBS: Spinn coat SU-8 3005 vid 5000 rpm under 30 s för att generera det första skiktet, SU-8 2010 vid 3000 rpm under 30 s för att generera det andra skiktet, och SU-8 3025 vid 2000 rpm under 30 s för att generera den tredje skiktet.
  2. Soft-baka det belagda skivan innan than mönsteröverföring. Rikta och exponera skivan i "direktkontakt" läge med en mask Aligner.
    OBS: Soft-baka skivan i 2 min vid 95 ° C för det första skiktet, 3 min vid 95 ° C för det andra skiktet, och 15 min vid 95 ° C i det tredje skiktet. Använda exponeringsdosen vid 100 mJ / cm 2 för det första skiktet, 130 mJ / cm 2 för det andra skiktet, och 200 mJ / cm 2 för det tredje skiktet.
  3. Efter exponering, post-baka skivan och utveckla den med SU-8 utvecklare. Torka skivan med användning av en N 2 pistol och hård-baka skivan vid 200 ° C under 30 min.
    OBS: kiselskiva formen är fäst vid en 15 plast cm diameter Petri-skål med användning av tejp, med mönstersidan uppåt. Vanligtvis sätter vi flera identiska chip strukturer på samma form, vilket gör att flera mikroflödeschip som skall tillverkas vid samma tidpunkt. Varje form kan återanvändas många gånger för att tillverka mikroflödessystem chips.

2. Mikrofluidchip Fabrication

  1. Placera en ren väger båt på en balans och tarera balansen. Pour 50 g av PDMS bas till den väger båten.
  2. Lägga 5 g av PDMS härdare till väga båt (vikt / vikt-förhållande av 1:10 till PDMS bas).
    OBS: Denna volym är baserad på en 15 cm diameter Petri-skål med formen. Justera mängden reagens om med användning av en petriskål av en annan storlek.
  3. Rör om PDMS basen och härdaren med en engångspipett. Börja från kanten av vägnings båten och sakta röra sig inåt. Rör om ordentligt under flera minuter tills små bubblor bildar hela blandningen; noggrann blandning är väsentlig för PDMS polymerisation.
  4. Häll blandningen långsamt i petriskålen; blandningen måste helt täcka kiselskivan formen.
  5. Placera petriskål i ett vakuum under 10 minuter för att avlägsna alla luftbubblor från PDMS blandningen. Om bubblor kvar på ytan av blandningen, använd en pipett för att blåsa ut dem.
  6. Inkubera kiselwafer formen med PDMS i en ugn vid 75 ° C under ca 2 h.
  7. Dra försiktigt skiktet av polymeriserade PDMS utanför kiselbrickan mögel, undvika eventuella skador på konstruktionen av skivan formen. Alternativt skär PDMS direkt från kiselskivan formen med ett minimum 5-mm marginal runt mönstret med användning av en enkel-kant industriell rakblad; försiktigt skala PDMS skiktet utanför skivan formen.
  8. Placera PDMS skiktet på bänken med mönstersidan uppåt. Skär försiktigt ur den individuella chip med en enkel-kant industriell rakblad, behålla en tillräcklig marginal från kanten av varje enda chip för att undvika byggskador.
  9. Med mönstret sidan uppåt, använder en stanspenna (0,75-mm ID) för att slå hål rakt ner genom inlopps- och utlopps cirklar på vardera sidan av kanalerna.
    OBS: Dessa hål skapa vägen för flödet av mediet. Därför är det viktigt att gå igenom cirklar och slå hela vägen genom PDMS lagret. Se till attavlägsna PDMS kolumner från hålet.
  10. Kontrollera varje stansade hål genom att sätta stämpeln kanylen åter i hålet. Kontrollera att nålen kan komma ut från den andra sidan, vilket indikerar att det inte finns någon blockering. Applicera tejp mönstret ytan, sedan försiktigt dra av tejpen för att rengöra dammpartiklar. Upprepa detta steg minst tre gånger. Lämna en ren bit tejp på PDMS för att upprätthålla sterilisering.
  11. Upprepa denna procedur på den motsatta sidan av PDMS och lämna den sista bit tejp på samt.
  12. Bered en 24 mm x 30 mm täckglas med en tjocklek av 0.13-0.17 mm. Spraya 70% etanol på glaset och torka med dammborttagnings att sterilisera ytan; dessutom kan glaset tvättas med autoklaverat vatten och torkades med damm remover.
  13. Överför täckglaset och PDMS till en plastplatta. Ta bort tejp från PDMS och placera mönstersidan uppåt. Undvik kontakt med mönsterytan under överföringen.
  14. Placera försiktigt PDMS på täckglaset, som förbinder både hydrofila ytorna (de ytor som möter upp under plasmabehandlingen). Se till att det inte finns några luftbubblor mellan PDMS och täckglaset.
  15. Inkubera PDMS-chip i en ugn vid 75 ° C i minst 2 timmar.
    OBS: Bristande mikrofluidik kan orsaka vätskeläckage på mikroskop under experimentet. Därför är det viktigt att kontrollera bindningen mellan PDMS och täckglaset med något lyfter PDMS från kanterna med pincett. Försiktigt lyfta PDMS bör inte skilja den från täckglaset, vilket indikerar en lyckad obligation.

3. Förberedelser för experimentet

  1. Dränka ingångs- och utgångsrören i 70% etanollösning separat en dag innan PDMS-chip beredning.
  2. Fyll en 5-ml spruta med autoklaverat vatten för att tvätta rören. Tvätta varje rör genom att ansluta röret på sprutan och spolning av röret med vatten.
  3. Upprepa tvättsteget minst 3 gånger för att rengöra etanol återstod.
  • Undersöka PDMS kanaler under ett optiskt mikroskop med en 10X objektiv för att säkerställa att strukturen är konsekvent och intakt. Stabilisera PDMS-chip på mikroskop plattform med hjälp av tejp.
    OBS: Se flera chips på en gång i steg 2 för att säkerställa att det finns backup chips, särskilt om att enheten för första gången.
  • Fyll en 5-ml spruta med autoklaverat vatten. Fäst sprutan en sprutpump och sätt motsvarande ingångs- och utgångsrören. Ställa tvätthastigheten till 750 mikroliter / h för att skölja chip för ca 10 min. Luftbubblorna på grenkanalernabör tvättas bort under denna period; om det finns kvarvarande bubblor, manuellt justera hastigheten för att eliminera bubblorna.
  • beredning jästprov.
    1. Överföring 1 ml av beredd jäst prov (OD 600 0,6-0,8) i två 1,5-ml mikrocentrifugrör och centrifugera i 5 min vid 3000 x g.
    2. Avlägsna huvuddelen av supernatanten från varje rör och kombinera återstoden för bildning av en 0,5-ml prov.
  • Paus sprutpumpen och ta bort ingångsrören från PDMS-chip.
  • omvänd manuellt sprutpumpen att suga en liten luftbubbla (1 till 2 cm i längd) in i varje ingångsröret. Flytta på att suga i jästen provet; luftbubblan kommer att visa prov gränsen och ange hur mycket prov har tagits.
    OBS: Undvik att suga provet i sprutan.
  • Infoga inmatningsröret tillbaka in i PDMS-chip och starta pumpen för att ladda cellerna med en hastighet av 750 pl / h.
  • Lämna sprutpumpen på under 10 minn och undersöka cellbelastning progression under mikroskop; en framgångsrik lastning kommer att fälla celler under mer än 60% av suspendera pelaren.
  • Växla till näringslösning och justera hastigheten till 400 mikroliter / h för cellodling.
  • Välj positioner observation i mikroskop.
    OBS: För livslängdsmätningar har bilder tas en gång var 15: e minut genom ett optiskt mikroskop med en 40x objektiv. För fluorescerande reporteranalys har bilder tas en gång var 15: e min genom ett fluorescensmikroskop med en 60X olja mål.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Efter experimenten kan livslängder av cellerna och många cellulära och molekylära fenotyper extraheras från de inspelade time-lapse bilder. Eftersom det finns ett antal olika funktioner som kan extraheras från varje cell, är det första steget av analysen för att kommentera cellerna och händelser, inklusive positionerna och gränserna för cellerna och timingen av olika händelser som håller på att spåras, såsom som spirande händelser. Dessa anteckningar kommer att göra det lättare att återvända till samma uppsättning av celler och analysera olika funktioner i framtiden. Med användning av mjukvara för bildanalys, såsom ImageJ 11 och de tillhörande insticksprogram, kan en lista med fenotyper då extraheras från bilddata med hjälp av de registrerade annoteringar i cellerna.

    Följande är några exempel på fenotyper uppmätta med mikrofluidanordningen. Livslängden fenotypen av jästkan erhållas genom att räkna antalet knoppar som produceras av varje instängd modercellen och uppskattning med Kaplan-Meier-estimatorn. Cellerna från början fångade i mikroflödessystem enheter är okända åldrar. Att minimera förspänningen av livslängdsmätningar som härrör från dessa okända åldrar, använde tidigare metoder det genomsnittliga antalet knopp ärr på de uppfångade cellerna att kalibrera livslängden 4, 7. Emellertid, knopp ärr mätningar kräver den ytterligare färgning av celler och ger endast en indirekt uppskattning av förspänningen. Med hjälp av detta protokoll, enheten fångar ofta färska dotterceller som knoppande ut från redan instängda celler. Dessa celler sväng till moderceller. Sådana celler kan identifieras med hjälp av vår nedströms bildanalysmjukvara (film 1). Dessa nya moderceller ger en mer exakt livslängd mätning. Såsom visas i fig 2, Livslängden kurvorna för färska moderceller var comparött med de celler av okänd ålder. I detta experiment, den genomsnittliga livslängden för de färska moderceller var något längre (ca två generationer av skillnaden i median livslängd).

    Förutom antalet knoppar, andra intressanta fenotyper, såsom tidsintervallet mellan två på varandra följande spirande händelser, såsom visas i fig 3, kan extraheras från de bilddata 3, 7, 8. Celler in i en period av snabb spirande efter några långsammare initiala buddings. Spirande avtog dramatiskt mot slutet av deras livslängd, indikerar ohälsosamt tillstånd hos dessa åldern celler. Cellcykeln dynamik innehåller mycket användbar information om den cellulära tillstånd av de unga och gamla celler och har använts, till exempel för att karakterisera telomeras mutanter 12. Viktigt kan enheten varaanvänds för att mäta fluorescenssignaler i hela livslängd (figur 4), vilket möjliggör spårning av molekylära markörer som kan vara föraren av åldrandet.

    Figur 1
    Figur 1: En schematisk bild av utformningen av den mikrofluidiska anordningen. Anordningen består av 6 oberoende funktionella moduler som kan arbeta parallellt. Varje modul är gjord av en huvudkanal ansluten till två sidokanaler. Varje sidokanal har 113 Pensile kolumner. En ytterligare brygga tillsätts i mitten för att ansluta huvudkanalen med de två sidokanalerna. Moderceller fångas nedanför Pensile kolumner, medan de mindre dotterceller tvättas bort av flödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.


    Figur 2: Färska moderceller lever längre än celler med okänd historia. Den replikativa livslängden av färska moderceller kontra celler av okänd historia (celler fångade från början av experimentet) i SD media, 30 grader. I genomsnitt, friska moderceller bor ca 2 generationer längre. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 3
    Figur 3: Längden på spirande intervall förändringar som cell åldern. Spirande intervall mätt som tidsramar mellan buddings var färgkodade cellerna beställts av deras replikering livslängd och friska moderceller var septemberarated från celler av okänd historia. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4: Mätning av aktiviteten för värmechockfaktor 1 (HSF1) med användning av en mikrofluidanordning. Den HSF1-aktiviteten reporter konstrueras genom ett grönt fluorescerande protein (GFP) fuserad till en handikappad CYC1 promotor med HSE uppströms 13. Fluorescensbilder togs var 30 min. GFP Intensiteten var kvantifieras sedan med användning av en anpassad MATLAB code 14. poäng för varje enskild cell-data är anslutna och indikeras med en färgad linje. I detta experiment, var stammen odlades i SD-medium med 2% glukos (vikt / volym) vid 30 ° C över natt; Den späddes sedan med samma medium för återvinning. efteråt,SD-medium med 0,05% glukos (vikt / volym) användes för att odla celler i mikroflödeschipet under fluorescensmätning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Film 1: Ett exempel på färska moderceller bli instängd inuti anordningen för hela livslängd. Filmen visar en ny modercell föddes ur en instängd cell. Den röda pilen i början av filmen markerar positionen för den friska modercellen och dess första spirande. Denna modercell fångades i mikroflödessystem enheten för hela dess livslängd. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    PDMS-enhet måste nybakade. Annars kommer luftbubblorna som orsakas genom införing rören i anordningen vara svåra att avlägsna. Steg 3,4 är viktigt för att förbättra cellbelastning effektiviteten genom att koncentrera cellerna. Att öka genomströmningen av experimentet, 4 till 6 moduler på samma PDMS-chip anslutna till oberoende arbetande pumpar används typiskt för att utföra fyra till sex olika experiment (olika stammar eller medie kompositioner) samtidigt.

    Jämfört med den konventionella jästreplikativa åldrandet analys (som använder microdissection), är den mikrofluid metod som presenteras här mindre arbetskrävande och tidskrävande. Dessutom tillåter den mikrofluidiska anordningen för den detaljerade kvantifiering av olika cellulära eller molekylära parametrar, inkluderande cellstorlek, cellcykeldynamik, cellmorfologi, och olika molekylära markörer. Denna mikroflödes metod uppnår långtidscellspårning med högupplösande mikroskopi genom att kvarhållamor celler under PDMS mikrodynor som dotterceller spolas automatiskt.

    Denna anordning använder mjuka PDMS mikrodynor för att fånga moderceller 4, med den grundläggande struktur liknande, som Huberts et al. beskrivs i sitt arbete 7. Det finns ett antal skillnader i enheten design och experimentella protokoll. Den bredare PDMS dynan i denna anordning tillåter vissa nyfödda dotterceller som skall fångas och analyseras (figurerna 2 och 3, film 1). För att identifiera sådana celler, kommenterad vi dottercellerna knoppande från redan instängda moderceller och strunta i dotterceller som spolas bort utan spirande. I genomsnitt fick vi cirka två färska moderceller per PDMS pad. Förhållandet mellan dessa färska moderceller till cellerna med okänd historia var ca 1: 2, bland vilka ca tredjedel hölls i anordningen för hela livslängd. Dessa celler möjliggöra en mer noggrann livslängd mätning end gör det möjligt att analysera samband mellan mor och dotterceller. I denna anordning är en djupare huvudkanal ansluten till två grundare sidokanaler där observationerna görs; denna design hjälper till att minska risken för sidokanalerna blockeras av stora luftbubblor. För mikroflödeschipet produktion, detta protokoll använder också en enkel metod för att binda PDMS och täckglaset, bara med hjälp av plasmaexponeringen och ugn bakning, vilket ökar chansen att lyckas.

    Med detta protokoll, är mikrofluidanordningen kunna robust fälla åtminstone en cell (3-5 celler i genomsnitt) per PDMS dynan vid början av experimentet för vildtyp haploid jäststammar (dvs BY4741 eller BY4742). Omkring 30% av cellerna kan bibehållas under hela deras livslängd. Det är värt att notera att utförandet av PDMS anordningen beror på gapstorleken mellan Pensile kolumner och glaset och storleken av jästcellerna. För vildtyp haploida jäststammar, denlämplig storlek för gapet är 3,5-4,5 um. Utanför detta område, laddningseffektivitet och cellavdragssatsen nedgång kraftigt. Sålunda måste nya anordningar för jäststammar med mycket större eller mindre cellstorlekar 7 tillverkas genom att modifiera höjden av det första skiktet i steg 1.

    Sammanfattningsvis anordningen och protokoll som beskrivs i denna artikel är inte bara lämpliga för jäståldringsstudier men är också tillämpbar på andra experiment som kräver spårning av moderceller och för kontroll av molekylmarkörer i många generationer eller under hela livet.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    3'' <111> silicon wafer Addison Engineering
    SU-8 2000 and 3000 Series MicroChem
    Sylgard® 184 Silicone Elastomer Kit ellsworth 2065622 Include Sylgard® silicone elastomer base and curing agent
    Petri dishes VWR 391-1502
    Harris Uni-core™ punch (I.D. 0.75 mm) Sigma-Aldrich 29002513
    24 mm x 40 mm SLIP-RITE® cover glass Thermo Fisher Scientific 102440
    3M Scotch Tape ULINE S-10223
    VWR® Razor Blades VWR 55411-050
    Pure Ethanol, Koptec VWR 64-17-5
    Whoosh-Duster™ VWR 16650-027
    5 mL BD Syringe (Luer-Lock™ Tip) Becton, Dickinson and Company 309646
    PTFE Standard Wall Tubing (100 ft, AWG Size: 22, Nominal ID: 0.028) Component Supply Company SWTT-22
    Needle Assortment Component Supply Company NEKIT-1
    Desiccator HACH 2238300
    Lab Oven Fisher Scientific 13246516GAQ
    Nikon TE2000 microscope with 40X and 60X objective Nikon
    Zeiss Axio Observer Z1 with 40X and 60X objective Zeiss
    Syringe Pump Longerpump TS-1B

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183, (4677), 1751-1752 (1959).
    2. Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486, (7401), 37-38 (2012).
    3. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11, (4), 599-606 (2012).
    4. Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7, (11), e48275 (2012).
    5. Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. (2016).
    6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (13), 4916-4920 (2012).
    7. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143 (2013).
    8. Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (30), 9364-9369 (2015).
    9. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16, (2), 276-284 (2006).
    10. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37, (5), 550-575 (1998).
    11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
    12. Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160, (5), 928-939 (2015).
    13. Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33, (2), 274-283 (1999).
    14. Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11, (10), e1001673 (2013).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Video Stats