마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

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Summary

안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.

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Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

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Abstract

망막 및 맥락막 혈류 역학은 녹내장, 당뇨병 성 망막증, 연령 관련 황반변 성 (AMD) 및 기타 안구 염증성 질환과 같은 다양한 안구 질환의 병태 생리 및 후유증에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한 눈의 치료 반응을 모니터하는 데 도움이 될 수 있습니다. 표지 세포의 살아있는 세포 이미징과 결합 혈액 세포의 적절한 라벨링, 망막과 맥락 순환에 흐름 역학의 조사 수 있습니다. 여기에서 마우스 적혈구 및 백혈구의 1.5 % indocyanine green (ICG) 및 1 % sodium fluorescein 표지의 표준화 된 프로토콜을 각각 설명합니다. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO)는 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 표지 된 세포를 시각화하기 위해 적용되었습니다. 두 방법 모두 생쥐 망막 순환에서 특이 적으로 형광 표지 된 세포를 보였다. 이러한 표지 방법은 다양한 안구 질환에서 더 넓은 적용 범위를 가질 수 있습니다모델.

Introduction

망막 및 맥락막 순환에서 혈구의 유동 역학을 연구하면 잠재적으로 시력이 위협되는 안구 질환 및 기타 안구 염증성 질환의 병인을 이해하는 것이 필수적입니다. 그러나 혈장 단백질에 형광 염료를 결합시키는 기존의 혈관 조영술은 적혈구 또는 백혈구의 동력학에 관한 정보를 제공하지 않습니다 1 . 적혈구 망막 혈류 역학은 망막에서의 대사 적으로 효율적인 순환과 다양한 염증 조건에서 세포 이동, 인식, 부착 및 파괴를 이해하기위한 백혈구 유동 역학을 연구하는데 중요합니다 2 . 다양한 세포 유형 3 의 동정과 특성 규명에 사용되는 몇 가지 형광 분자가 있습니다. 혈액 세포의 혈류 역학은 적절한 형광으로 염색하여 측정 할 수 있습니다염료 및 적절한 이미징 기술 적용 4 .

연령 관련 황반변 성 (AMD)과 당뇨 망막 병증 (DR)과 같은 안구 질환에서 염증 반응의 존재는 병변에 림프구가 축적되는 것을 의미합니다 5 , 6 . 조직에서 면역 세포를 추적하면 질병 발병 기전과 관련된 복잡한 사건을 이해하는 데 도움이됩니다. 51 Cr과 125 I와 같은 방사성 동위 원소는 초기 연구에서 세포 추적자로 사용되었다. 이 염료는 독성이 있고 세포 생존 능력에 영향을줍니다. 방사성 마커 3 H와 14 C는 낮은 방출 에너지로 인해 세포에 덜 독성이 있지만 시스템 7,8 에서 신호를 검출하기가 어렵습니다. 여러 가지 형광 염료가 잠재적 인 문제를 극복하기 위해 도입되었습니다.i 방사능 마커 및 형광 현미경 및 유동 세포 계측법을 사용하여 체외에서 림프구 이동 추적 9,10 . Hoechst 33342와 thiazole orange는 DNA 결합 형광 염료이며, 생체 내에서 림프구를 추적하는데 사용됩니다 . Hoechst 33342는 DNA의 AT가 풍부한 영역에 결합하고, 막 투과성이며, 2 ~ 4 일 동안 형광 시그널을 유지하며 9 , 10 소실에 내성입니다. Hoechst 33342와 thiazole orange의 단점은 림프구 증식의 억제 11 과 짧은 반감기 9 입니다.

(FDA), 2 ', 7'- 비스 - (2- 카르복시 에틸) -5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신, 아세 톡시 메틸 에스테르 (BCECF-AM), 5- (및 -6) (CFDA) 및 5- (및 -6) - 카르복시 플루 오레 신 디 아세테이트 아세 톡시 메틸 에스테르 (CFDA-AM)림프구 이동 연구에 사용되는 세포질 형광 염료입니다. 그러나 FDA, CFDA 및 CFDA-AM은 세포 내 보유력이 낮습니다 9 . BCECF-AM은 증식 반응을 감소시키고 주 화성 및 과산화물 생산에 영향을 미친다. Calcein-AM은 형광 염료이며 단기 생체 내 림프구 이동 연구 유용합니다. 그것은 강한 형광 신호를 방출하고 대부분의 세포 기능을 방해하지 않으며 최대 3 일 동안 형광 신호를 유지합니다 12 , 13 . Fluorescein isothiocyanate (FITC)와 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE)는 공유 결합 형광 염료이며 림프구 이동 연구에 사용됩니다. FITC는 세포 생존 능력에 영향을 미치지 않으며 T 림프구보다 B 림프구에 더 강한 친 화성을 갖는다 14 , 15 9 , 16 시간 동안 생체 내에서 추적 할 수 있습니다. C18 DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 및 PKH26은 막 - 백혈구 및 적혈구를 표지하기 위해 사용되는 형광 친 지성 카보시 아닌 염료를 삽입한다. C18 Dil과 DiO는 세포막에 결합 될 때 더 높은 신호를 나타내며 상대적으로 독성이 없습니다 12 , 17 . PKH2, PKH3 및 PKH26로 표지 된 세포는 독성이 적은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 의 형광 신호를 잘 유지합니다. 그러나, PKH2는 CD62L 발현을 감소시키고 ly를 감소시킨다 림프구 생존율 23 .

상기 언급 된 대부분의 연구는 림프계에서 림프구 이동 및 증식을 추적하고 비 안과 순환에서 표지 된 적혈구를 연구하기 위해 수행되었다. 안과 순환에서 혈액 세포를 연구하기위한 표지 기술을 적용한 연구는 거의 없습니다. 주사 레이저 안검 내시경 (SLO)의 적용은 안저 혈관 조영술 24에 의한 생체 내 망막 및 맥락막 순환 에서 표지 된 세포를 연구하는데 큰 이점이 있습니다. SLG 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 30에 의해 망막 순환에서 백혈구를 연구하는데 사용되는 ICG, 아 크리 딘 오렌지, FITC, 나트륨 플루오 레세 인 및 CFDA와 같은 여러 가지 형광 염료가있다 .class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . acridine 오렌지의 광 독성과 발암 성 26 , 27 , 세포 활동과 FITC의 간섭, 망막과 맥락막 혈관의 해상도를위한 혈관 내 조영제의 요구 사항은 생체 내 동물 실험 29 그들의 응용 프로그램을 제한합니다. Sodium fluorescein 및 ICG는 식품 의약품 안전청 (Food and Drug Administration)의 승인을 얻은 무독성이며 인체 검사시 안전합니다 32 , 35 . 유동 역학 연구의 대부분은 백혈구 또는 적혈구의 표지 및 망막 및 맥락막 혈관에서의 시각화와 관련이있다 36 , 37 , 38 , 39

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Protocol

이 연구에 사용 된 동물 프로토콜은 싱가포르 싱가포르 SingHealth의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻었으며 안과 / 안과 분야에서의 동물 사용을위한 안과 / 안과 연구 협회 (ARVO)의 성명서 연구.

1. 형광 염료를 이용한 적혈구 및 백혈구의 표지

  1. 시약 준비
    1. 멸균 된 증류수 1800 μL에 ICG 3 mg을 녹여 ICG (1.5 mg / mL)를 준비하십시오. 10x 인산 완충 식염수 (PBS) 200 μL를 추가합니다.
    2. 멸균 증류수 6 ML에 1X PBS 4 ML을 추가하여 40 % 1X PBS를 준비합니다. 1x PBS 10 ML에 BSA 100 MG를 추가하여 PBS에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 준비합니다. BSA가 녹을 때까지 잘 섞는다.
  2. 밀도 구배 원심 분리를 이용한 적혈구 및 백혈구 분리
    1. 생쥐 마취 (야생 타이(ARVO 지침에 따라 스케쥴 1에 따라) 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)의 조합을 사용하여 투여 하였다 (C57BL / 6). 페달 철수 반사 ( , 발가락 핀치)로 마취를 확인하십시오.
    2. 29 게이지 바늘 (1 mL 주사기에 부착 됨)을 천천히 심장쪽으로 향하게하여 삽입하십시오. 바늘이 심장 안에 있는지 확인하려면 플런저를 약간 빼내고 혈액이 주사기 안으로 빠지는지 확인하십시오. 심장에서 0.8 - 1 mL의 피를 직접 뽑아냅니다.
    3. 즉시 혈액 수집 튜브가 들어있는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (혈액 1.8 mL / mL)에 혈액을 옮기고 혈액 응고를 방지하기 위해 부드럽게 혼합하십시오.
    4. pentobarbital (80mg / kg)을 복강 내 주사하여 마우스를 안락사하십시오.
    5. 2 ML의 microcentrifuge 튜브와 centri에서 polysucrose과 나트륨 diatrizoate 솔루션 (1 : 1 비율, 밀도 1.077 g / ML)의 상단에 전혈을 계층화fuge (450 xg, 30 min)를 사용하여 혈장에서 백혈구와 적혈구를 분리시킵니다.
    6. 피펫을 사용하여 상등액 (플라스마)을 제거하고 버립니다. 조심스럽게 피펫을 사용하여 버피 코트 (백혈구)와 적혈구 (적혈구 층)를 새롭고 분리 된 튜브로 옮깁니다.
  3. 적혈구의 ICG (1.5 %) 표지
    1. 오염 물질을 제거하기 위해 1x PBS로 적혈구를 씻으십시오. 1x PBS (1 : 1)에 적혈구를 재 침투하여 50 % 헤마토크리트를 만듭니다. 50 % 헤마토크리트 0.5 mL (~ 250 μL 포장 된 적혈구)를 미세 원심 분리 튜브에 넣으십시오. 적혈구를 원심 분리하고 (750 xg, 5 분) 상등액을 버립니다.
    2. pelleted erythrocytes에 40 % 1x PBS 200 μL를 추가 잘 혼합하고 5 분 동안 실온에서 품어. 적혈구 현탁액에 ICG (1.5 MG / ML)의 100 μL를 추가 튜브 부드럽게 혼합하여 5 분 실온에서 품어. 1x PBS 300 μL를 첨가하고쉐이커 배양기에서 37 ℃로 60 분간 방치 하였다.
    3. 담체 적혈구 (750 xg, 3 분)를 원심 분리하고 1 ML 1X PBS에 resuspend.
    4. 상청액이 맑아 때까지 1x PBS로 세포 ~ 3 ~ 5 번 씻으십시오 (1.3.3 단계). 마지막 세척 후 상층 액을 버리고 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트 (1.25 x 10 8 세포 / mL)를 얻기 위해 1 % BSA PBS (1 : 1)를 표지 된 미리 부풀린 적혈구에 첨가한다.
  4. 백혈구의 나트륨 fluorescein (1 %) 표시
    1. 밀도 그라디언트 원심 분리 (단계 1.2.6에서)를 사용하여 혈액에서 버피 코트를 분리 후, 어떤 오염 물질을 제거하기 위해 10 분 동안 450xg에서 원심 분리하여 1x PBS 10 ML로 세포를 한 번 씻으십시오. 1x PBS 900 μL에 펠렛을 Resuspend.
    2. 백혈구 현탁액의 900 μL에 10 % 나트륨 fluorescein의 100 μL를 추가하고 2 분 동안 실온에서 품어. centrifugi하여 10 ML 1X PBS로 세 번 레이블 세포를 씻으십시오ng (450 xg, 10 분). 100 μL 1X PBS에 세포를 Resuspend.

2. 형광 라벨이 붙은 세포의 라이브 영상

  1. ICG 표지 된 적혈구의 라이브 셀 이미징
    1. 꼬리 정맥 또는 역 궤도 경로 를 통한 주사 용 세포를 준비하려면 ICG 표지 된 적혈구의 50 % 헤마토크리트를 1x PBS로 10 배 및 50 배 희석하여 각각 5 % 및 1 % 헤마토크리트 세포를 만듭니다.
    2. 꼬리 정맥이 팽창하도록 5 분 동안 적외선 (250W 강도) 아래에 마우스를 놓습니다. 마우스를 케타민 하이드로 클로라이드 (50mg / kg)와 크 실라 진 하이드로 클로라이드 (0.5mg / kg)로 복강 내 주사 (여기서는 스케줄 1에 따라 ARVO 지침에 따라)로 마취시킨다.
    3. 눈의 각 동공을 0.5 % 트로피 아미드와 2.5 % 페닐에 프린 하이드로 클로라이드 한 방울로 증량하십시오.
    4. 이미징을 위해 콘택트 렌즈를 한쪽 눈 위에 올려 놓습니다. 이미징을위한 매체로 안과 용 젤을 사용하고 건조를 방지하십시오.s의 각막. 마우스 눈의 굴절을 보상하기 위해 + 25 디옵터 렌즈가있는 공 촛점 레이저 스캐닝 검안경 (SLO) 카메라를 수정하십시오.
    5. 마우스를 SLO 이미징 플랫폼 위에 놓습니다. 마우스의 각막이 SLO 기계의 광학 헤드를 향해 직면하는지 확인하십시오.
    6. 이미징 모듈을 켭니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 "New Patient"버튼을 클릭하고 마우스 귀 태그 번호, 생년월일, 형광 염료의 백분율 및 분류 된 세포 유형과 같은 동물 식별 정보를 추가하십시오.
      1. 이미징 모듈을 조작하여 동물의 시신경을 이미징 스크린의 중앙에 배치합니다. 관련 이미징 모듈 소프트웨어를 사용하여 "Acquire"버튼을 클릭하여 30 ° 또는 15 ° 앵글 뷰 설정으로 적외선 (IR) 안저 이미지를 가져옵니다. 망막의 중심, 동공 및 레이저의 광학 경로가 최상의 품질의 이미지를 얻기 위해 정렬되어 있는지 확인하십시오.
    7. ICG 안저 영상을 가져 가라.
      1. ICG 필터 (790 nm)를 켜고 30 ° 또는 15 ° 각도로 카메라를 고속 모드로 설정하고 표준화를위한 모든 판독 값에 대해 ICG 밝기를 85로 설정하십시오. 제어판에서 "Acquire"버튼을 클릭하여 1 분 동안 8.8 / 15 프레임 / 초로 비디오 (기본 제어)를 촬영하십시오.
    8. 30 게이지 바늘에 부착 된 인슐린 주사기에 ICG로 표지 된 적혈구 100 μL를 넣으십시오.
      1. 꼬리 정맥 경로 를 통한 주사의 경우, 바늘 베벨을 꼬리 정맥에 삽입하십시오. 혈액이 주사기로 역류되었는지 확인하여 정맥 내 접근을 확인하고 혈액 순환 세포에 표식 세포를 주입하십시오.
      2. retro-orbital 경로를 통한 주입의 경우, 눈에 인접한 바늘을 retro-orbital spac이자형. 주사기에 혈액의 역류를 확인하여 retro - orbital 액세스를 확인하고 순환에 라벨 세포를 주입.
    9. 주입 후 마우스를 재배치하고 IR 안저 영상 (단계 2.1.6.1 참조) 및 비디오를 ICG 필터 (단계 2.1.7.1 참조)로 가져옵니다. 망막 순환에서 라벨 세포는 세포 주입 직후 시각 수 있습니다.
    10. 비디오 프레임을 획득 한 후 SLO보기 모듈 소프트웨어를 사용하여 비디오를 내보낼 때 .tiff 형식을 선택하여 비디오 시퀀스의 .tiff 이미지를 추출하십시오. 원하는 폴더에 파일을 저장하십시오.
    11. 콘택트 렌즈를 꺼내 다른 눈 위에 올려 놓고 2.1.4 - 2.1.7 단계에 설명 된대로 이미징을 완료하십시오.
    12. 이미징 후 마취에서 회복 될 때까지 체온을 유지하기 위해 마취 동물을 적외선 (250W) 아래에 두십시오. 동물이 완전히 회복되면 마우스를 다시 새장에 넣으십시오.
  2. 1 % sodium fluorescein으로 표지 된 백혈구의 라이브 셀 이미징
    1. 마우스를 준비하고 2.1 절의 설명에 따라 장비를 설정하십시오.
    2. 단계 2.1.4 - 2.1.6에서 설명한대로 마우스를 위치시키고 IR 안저 사진을 찍습니다.
      1. 표준화를 위해 모든 판독 값에 대해 30 ° 또는 15 ° 각도보기 및 85에서의 형광 강도를 갖는 고속 카메라 모드의 형광 물질 필터 (488 nm)를 사용하여 마우스의 형광 안저 혈관 조영상을 얻습니다. 8.8 / 15 프레임 / 초 (기준 2.1.7.1 참조)에 비디오 (기준선 제어)를 기록하십시오.
        참고 : 여기서 여러 비디오 트랙 (1 분 비디오)이 서로 다른 시간 간격으로 획득되었습니다.
    3. 2.1.8 절에서 설명한대로 꼬리 정맥 또는 역 궤도 주사를 통해 마우스에 100 μL 표지 백혈구를 주사하십시오.
    4. 주사 직후에 마우스를 위치시키고 IR 안저 영상 (단계 2.1.5 및 2.1.6 참조)과 fluo마우스의 혈관 조영술 재개 (2.2.2 절 참조).
    5. 이미징 모듈의 초점 노브를 돌려 스캐닝 레이저의 초점을 조정하여 망막 또는 맥락막 혈관의 표시된 세포를 관찰합니다.
    6. SLO보기 모듈 소프트웨어 (단계 2.1.10 참조)를 사용하여 비디오 프레임과 이미지를 가져 와서 원하는 폴더에 저장하십시오.
    7. 절차가 끝나면 동물 관리를 위해 2.1.12 단계를 수행하십시오.
  3. MtrackJ 소프트웨어로 이미지 분석
    1. "파일"을 클릭하여 ImageJ에서 이미지 시퀀스를 엽니 다. "가져 오기"를 선택하고 "이미지 시퀀스"를 선택하고 원하는 이미지 폴더를 선택한 다음 "열기"를 클릭하십시오. "시퀀스 옵션"팝업 창이 화면에 나타납니다. "확인"을 클릭하십시오; 이미지 시퀀스가 ​​열립니다.
    2. "이미지"를 클릭하고 속도 측정을 위해 "속성"을 선택하여 이미지 비디오의 프레임 간격을 설정하십시오. 여기, 8.8 프레임es / s.
    3. "Plugins"을 선택하여 MTrackJ 플러그인을여십시오. "Tracking"을 선택하고 "MtrackJ"를 선택하십시오. 메뉴가 나타납니다.
    4. 추적 설정을 조정하려면 메뉴 아래의 "추적"을 선택하고 "점 추가 후 다음 시간 프레임 색인으로 이동"확인란을 선택하십시오.
    5. 첫 번째 셀을 추적하십시오.
      1. 하나의 셀을 찾고 후속 프레임에서 동일한 셀을 추적하십시오. 메뉴에서 "추가"를 클릭하여 새 트랙을 추가하십시오.
      2. 이미지 위에 커서를 놓고 (+ 기호) 적절한 셀을 클릭하십시오.
        참고 : MTrackJ는 자동으로 다음 시간 프레임으로 이동하고 궤도의 첫 번째 점의 위치를 ​​표시하는 작은 원을 추가합니다.
      3. 이미지 시퀀스의 프레임을 이동하면서 셀의 현재 위치를 계속 클릭합니다.
        참고 : 때때로 궤도의 이전 점을 표시하는 원이 현재 위치를 보는 기능을 방해합니다. 이 경우,단계 2.3.5.3.1로 진행하십시오.
        1. 메뉴에서 "표시"를 클릭하고 "현재 트랙 포인트 만 표시"옵션을 선택하여 궤적의 표시 옵션을 변경하십시오. 모든 궤도를 보려면이 옵션의 선택을 취소하십시오.
      4. 첫 번째 셀의 궤도가 보일 때까지 계속 클릭하십시오. 그런 다음 "저장"을 클릭하여 트랙을 저장하십시오.
    6. 두 번째 셀을 추적하십시오.
      1. 메뉴에서 "추가"를 클릭하여 새 트랙을 시작하십시오. 새 셀을 추적하려면 2.3.5.1 - 2.3.5.4 단계를 반복하십시오. 두 번째 트랙을 저장하려면 "저장"을 클릭하십시오.
      2. 관찰 된 모든 추적 가능한 셀에 대해이 단계를 계속하십시오. 셀을 추적 한 후 메뉴 탭에서 "측정"및 "확인"을 클릭하여 결과를 가져옵니다.
        참고 : 결과 창은 자동으로 열리 며 추후 분석을 위해 스프레드 시트에 저장하고 열 수 있습니다.

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Representative Results

1.5 % ICG로 표지 된 적혈구를 C57BL / 6J 마우스 (야생형)의 망막 순환에서 시각화 하였다. 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 및 5 % 헤마토크릿 모두 망막 순환에서 구별 할 수 있었다. 그러나 개별 표식 된 세포는 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 헤마토크리트로 더 명확하게 시각화되었습니다 ( 그림 1 ). 5 % 헤마토크리트에서 망막 혈관의 많은 수의 표식 세포로 인해 개별 세포를 표시 할 수 없었습니다. 두 조건 모두에서 약간의 erythrostasis가 peripapillary region에서 관찰되었지만, 표지 된 적혈구의 5 % 적혈구 용적률에서 더 두드러졌다 ( 그림 2 ).

백혈구는 상기 프로토콜에 따라 1 % 나트륨 플루오 레세 인으로 성공적으로 표지되고 형광 현미경을 사용하여 녹색 표지화 된 세포로서 시각화된다 ( class = "xfig"> 그림 3). 세포의 작은 덩어리 (4 - 5 세포 함께)는 또한 표본 샘플에서 관찰되었다. 세포가 마우스 순환에 주입되었을 때, 표식 된 백혈구가 망막 순환에서 시각화되었다 ( 그림 4 ). 표지 후 적혈구와 백혈구를 즉시 마우스에 주입하고 30 분 및 60 분 간격으로 시각화 하였다. 형광 표지 된 세포는 주사 직후에 관찰되었지만, 형광 세기는 30 분 및 60 분 간격으로 점차적으로 감소 하였다. 우리는 또한 적혈구에 1 % sodium fluorescein (백혈구 염색 프로토콜)을 사용하여 적혈구의 표지를 관찰하지 않았습니다. 이미지 J 퍼블릭 도메인 소프트웨어에서 Mtrack J 플러그인을 사용하여 망막 순환에서 세포를 추적합니다 ( 그림 5 ).

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그림 1 : 망막 순환에서 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 1 % 헤마토크릿. ICG는 망막 혈관에 밝은 신호를 나타내는 개별 적혈구를 표시했다. 일부 적혈구 증이 유두 주위 부위에서 관찰되었습니다. 스케일 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2 : 망막 순환에서 1.5 % ICG 표지 된 적혈구의 5 % 적혈구 용적. 망막 혈관에 밝은 신호를 나타내는 많은 ICG 표지 된 적혈구; 유두 주위 영역에서 많은 양의 적혈구 증이 관찰되었다. 스케일 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 1 % 나트륨 Fluorescein 표지 백혈구의 형광 현미경 이미지. 작은 덩어리 (20X 배율, 크기 = 50 μm)가있는 녹색 형광 신호를 나타내는 나트륨 플루오르세틴 표지 백혈구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 망막 순환에서 1 % 나트륨 플루 오레 신 라벨 백혈구. 망막 혈관에 밝은 신호를 나타내는 나트륨 fluorescein 백혈구 (화살표). 스케일 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5 : 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 망막 순환에서 라벨이있는 개별 세포의 추적. 망막 순환에서 표지 된 세포의 평균 속도를 계산하기 위해 다른 트랙 (이미지 상에 표시된 것과 같은 색의 원 및 선)을 측정 하였다.

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Discussion

망막 및 맥락막 순환에서 혈류 역학을 연구하는 것은 많은 안구 질환의 병리 생리학을 이해하는 데 중요합니다. 망막 순환에서의 혈류 역학은 Fourier-domain optical coherence tomography (FD-OCT), laser speckle flowgraphy (LSFG) 및 망막 산소 측정법에 의해 연구 될 수있다. 이 방법은 망막 순환에서 총 혈류를 연구하기 위해 다른 접근법을 사용하지만 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 개별 세포 유형의 유동 역학을 연구 할 수 없다는 한계가 있습니다. 망막과 맥락막 조직에 영양분과 산소 공급뿐만 아니라 안구 염증성 질환에서 면역 세포의 이동과 질병 발병 기전에서의 역할은 연구팀의 흐름 역학을 조사함으로써 연구 할 수있다망막 및 맥락막 순환에서의 적혈구 및 백혈구 이미징 방법과 결합 된 표지 기술은 혈액 순환에서 표지 된 세포를 추적하고 표지 된 세포의 유동 역학을 연구하는 데 도움이 될 것입니다. 백혈구 및 적혈구에 3 , 17 , 18 , 19 순환계의 유동 역학 조사를 위해 여러 가지 형광 염료가 성공적으로 적용되었습니다.

여기서는 식품 의약품 안전청에서 승인 한 무독성 형광 염료 인 indocyanine green과 sodium fluorescein을 망막 순환에서의 적혈구 및 백혈구의 표시 및 시각화에 대해보고합니다. 나트륨 fluorescein은 백혈구를 추적하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 염료입니다 31 , 32 , 33

SLO에서 우수한 이미지를 얻기 위해서는 눈꺼풀이 완전히 팽창되어야하고 콘택트 렌즈가 안과 용 젤과 함께 사용되어 축축한 각막을 유지하고 백내장 형성을 예방해야합니다. 안구의 위치와 카메라의 광학 경로는 고화질의 안저 및 혈관 조영상을 얻기 위해 직선이어야합니다. 이미징하는 동안 움직임을 최소화하기 위해 동물을 깊이 진정시켜야합니다. 1.5 % ICG의 1 % 및 5 % 헤마토크리트 모두표지 된 적혈구는 망막 순환에서 형광으로 표지 된 세포의 시각화를 보여 주었으며, 1 % 헤마토크리트는 개별 세포를 모니터링하는 데 더 적합했다. 주입 된 백혈구의 수가 너무 적 으면 형광으로 표지 된 세포를 시각화 할 수 없습니다. 따라서 망막 순환계에서 표식 세포를 모니터링하는 데 더 나은 결과를 얻으려면 적어도 4 마리의 마우스에서 백혈구를 수집하고 1 % 나트륨 플루 오레 신으로 라벨을 붙이고 단일 마우스에 주사하는 것이 좋습니다. 나트륨 플루오 레세 인 (칼레 신, FITC, DIO, FDA 및 FDA 및 CFDA는 나트륨 플루오 레세 인과 유사하거나 그 근소치와 유사 함)에 대한 염료 유지율 및 안구 조직에 대한 독성은 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .

보고 된 기술의 한계는60 분 후에 순환하는 형광 신호의 페이딩 따라서, 라벨 세포의 흐름 역학은 60 분 이내에 분석해야합니다. 여기에서 백혈구를 표지하기 위해 한 마우스에서 혈액을 빼내고 세포를 분리하고 라벨을 붙이고 다른 마우스에 주입 한 다음 SLO에서 시각화했습니다. 그러나 SLO에서는 망막 혈관에서 1 프레임 당 0-1 세포 만 관찰되었습니다. 이것은 백혈구 세포 수가 불충분하여 발생할 수 있으므로 적어도 3 ~ 4 마리의 마우스에게서 혈액을 채취하여 프레임 당 더 높은 세포 수를 시각화하는 것이 좋습니다. 이 연구에서는 8.8 프레임 / 초의 카메라 속도가 사용되었지만이 방법을 사용하여 레이블이있는 셀의 연속적인 이미지와 비디오를 더 많이 얻을 수있었습니다.

이전 연구들은 DR의 다른 단계를 가진 당뇨병 환자의 망막 순환에서 혈류 속도의 변화를보고했다. Clermont et al. DR 47 의 초기 단계의 환자에서 망막 혈류가 33 % 감소했다고보고하고 Nguyen et.al. 증식 성 DR 48을 가진 당뇨병 환자에서 망막 혈류의 증가를보고했다. 감소 된 혈류 속도는 또한 진행성 녹내장 49 과 관련이 있다고보고되었다. 앞에서의 연구에서 저자들은 망막 순환에서 전체 혈류 속도를 조사했다. 각 세포 유형의 유속을 연구하면 여러 질병 및 질병의 여러 단계에서 세포 상호 작용에 대한 정보를 제공 할 수 있으며 예후를 도울 수 있습니다. 여기 적혈구 및 백혈구에 ICG 및 나트륨 플루오 레세 인을 라벨링하고 망막 순환에서 이들의 시각화 방법을보고한다. 이 방법은 생체 내 연구에 대한 모든 질병 모델에 적용 할 수 있습니다.

미래의 연구는 SLO를 사용하여 우리의 표지 기술을 활용하여 다른 약물 치료 조건 하에서 표지 된 적혈구 및 백혈구의 유동 역학 변화를 연구 할 수 있습니다이 질병의 여러 단계에서. 또한, 우리의 방법은 질병 표현형에서 적혈구 및 백혈구의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다. 재정적 또는 이해 상충은 없습니다.

Acknowledgements

이 연구 프로젝트는 싱가포르 국립 의료 연구 협의회 (National Medical Research Council, NMRC)의 New Investigator 기금으로 지원되었습니다. 연구팀은 2012 년 11 월부터 2012 년 10 월까지 National Medical Research Council (NMRC) 해외 연구 연수 펠로우 십을 통해 University University of London (UCL)의 안과 연구소 (IoO)에서 Agrawal 박사에게 제공 한 연구 훈련에 대해 감사를 표합니다. David Shima. Agrawal 박사는 시마 박사의 실험실에서 세포에 라벨을 붙이고 영상을 찍기위한 개념과 기술을 습득했습니다. 따라서 팀은 David Shima 교수, Kenith Meissner 박사, Peter Lundh 박사 및 Daiju Iwata 교수의 훈련 펠로우쉽 중 감독과지도를 인정하고자합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

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