Fluoreszenzfarbstoff-Markierung von Erythrozyten und Leukozyten zum Studieren der Flußdynamik bei der Maus-Retinal-Zirkulation

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Summary

Die Live-Zell-Bildgebung der markierten Blutzellen im Augenkreis kann Informationen über Entzündungen und Ischämie bei diabetischer Retinopathie und altersbedingter Makuladegeneration liefern. Ein Protokoll zur Etikettierung von Blutzellen und Bild der markierten Zellen in der Netzhautzirkulation ist beschrieben.

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Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

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Abstract

Die retinale und choroidale Blutflussdynamik kann einen Einblick in die Pathophysiologie und Folgeerscheinungen verschiedener Augenkrankheiten wie Glaukom, diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und andere okuläre Entzündungszustände geben. Es kann auch helfen, die therapeutischen Reaktionen im Auge zu überwachen. Die korrekte Markierung der Blutzellen, gepaart mit der lebenden Zellenabbildung der markierten Zellen, ermöglicht die Untersuchung der Strömungsdynamik im Netzhaut- und Aderhautkreislauf. Hier beschreiben wir die standardisierten Protokolle von 1,5% Indocyaningrün (ICG) und 1% Natriumfluorescein-Markierung von Mäusen-Erythrozyten bzw. Leukozyten. Die Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) wurde angewendet, um die markierten Zellen in der Retinalzirkulation von C57BL / 6J-Mäusen (Wildtyp) zu visualisieren. Beide Methoden zeigten deutliche fluoreszenzmarkierte Zellen in der Maus-Retinalzirkulation. Diese Etikettierungsmethoden können breitere Anwendungen bei verschiedenen Augenerkrankungen habenModelle.

Introduction

Das Studium der Strömungsdynamik der Blutzellen im Netzhaut- und Aderhautkreislauf ist für das Verständnis der Pathogenese potenziell visionsbedrohender Augenkrankheiten und anderer okulärer entzündlicher Zustände unerlässlich. Die herkömmlichen Angiographietechniken, die die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen an Plasmaproteine ​​beinhalten, liefern jedoch keine Information über die Dynamik der Erythrozyten oder Leukozyten 1 . Die Erythrozyten-Retinalströmungsdynamik ist wichtig für das Studium der metabolisch wirksamen Zirkulation in der Netzhaut und die Leukozytenströmungsdynamik zum Verständnis der Zellmigration, der Erkennung, der Adhäsion und der Zerstörung bei verschiedenen entzündlichen Zuständen. Es gibt mehrere fluoreszierende Moleküle, die bei der Identifizierung und Charakterisierung verschiedener Zelltypen verwendet werden 3 . Die Hämodynamik der Blutzellen kann durch Färbung mit den entsprechenden Fluoren gemessen werdenCent-Farbstoffe und Anwendung der richtigen bildgebenden Techniken 4 .

Die Anwesenheit von entzündlichen Reaktionen bei intraokularen Erkrankungen wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) und diabetische Retinopathie (DR) beinhaltet die Akkumulation von Lymphozyten im kranken Bereich 5 , 6 . Die Verfolgung der Immunzellen in den Geweben kann dazu beitragen, die komplexen Ereignisse in den Mechanismus der Krankheit Pathogenese beteiligt zu verstehen. Radioaktive Isotope wie 51 Cr und 125 wurden als Zelltracer in frühen Studien verwendet. Diese Farbstoffe sind giftig und beeinflussen die Lebensfähigkeit der Zellen. Obwohl die radioaktiven Marker 3H und 14C aufgrund ihrer geringeren Emissionsenergien weniger toxisch für die Zellen sind, ist es schwierig, ihre Signale im System 7 , 8 zu detektieren. Eine Anzahl von Fluorochrom-Farbstoffen wurden eingeführt, um die potentiellen Probleme zu überwindenIth radioaktive Marker und Track-Lymphozyten-Migration in vitro mit Fluoreszenz-Mikroskopie und Durchflusszytometrie 9 , 10 . Hoechst 33342 und Thiazolorange sind DNA-bindende Fluoreszenzfarbstoffe, die zur Verfolgung von Lymphozyten in vivo verwendet werden. Hoechst 33342 bindet an AT-reiche Regionen in der DNA, ist membranpermeabel, behält Fluoreszenzsignale für 2 - 4 Tage und ist resistent gegen Abschrecken 9 , 10 . Die Nachteile von Hoechst 33342 und Thiazolorange sind die Hemmung der Lymphozytenproliferation 11 und die kurze Halbwertszeit bzw. 9 .

Calcein-AM, Fluoresceindiacetat (FDA), 2 ', 7'-Bis- (2-carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein, Acetoxymethylester (BCECF-AM), 5- (und-6) Carboxyfluoresceindiacetat (CFDA) und 5- (und-6) -Carboxyfluoresceindiacetat-Acetoxymethylester (CFDA-AM)Sind die zytoplasmatischen Fluoreszenzfarbstoffe, die für Lymphozytenmigrationsstudien verwendet werden. Allerdings haben FDA, CFDA und CFDA-AM eine niedrigere Retention in den Zellen 9 . BCECF-AM reduziert die proliferative Reaktion und beeinflusst die Chemotaxis- und Superoxidproduktion 9 , 12 . Calcein-AM ist ein fluoreszierender Farbstoff und nützlich für kurzfristige in vivo- Lymphozyten-Migrationsstudien. Es strahlt starke Fluoreszenzsignale aus, stört nicht die meisten zellulären Funktionen und behält fluoreszierende Signale für bis zu 3 Tage 12 , 13 bei . Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFDA-SE) sind kovalente Kopplungs-Fluoreszenzfarbstoffe, die für Lymphozytenmigrationsstudien verwendet werden. FITC zeigt keine Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit und hat eine stärkere Affinität zu B-Lymphozyten als die T-Lymphozyten 14 , 15 in vivo für mehr als 8 Wochen und bis zu 8 Zellteilungen 9 , 16 verfolgt werden . C18 DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat), DiO (3,3'-dioctadecyloxacarbocyaninperchlorat), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 und PKH26 sind Membran- Einfügen von fluoreszierenden lipophilen Carbocyaninfarbstoffen, die zur Markierung von Leukozyten und Erythrozyten verwendet werden. C18 Dil und DiO zeigen höhere Signale, wenn sie in die Zellmembran eingebaut werden und sind relativ ungiftig 12 , 17 . PKH2-, PKH3- und PKH26-markierte Zellen zeigen eine gute Retention der Fluoreszenzsignale mit weniger Toxizität 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Allerdings reguliert PKH2 down die CD62L-Expression und reduziert die ly Mphozytenlebensfähigkeit 23 .

Die meisten der oben erwähnten Studien wurden durchgeführt, um die Lymphozytenmigration und -proliferation in den Lymphgefäßen zu verfolgen und die markierten Erythrozyten in der nicht-okulären Zirkulation zu untersuchen. Es gibt sehr wenige Studien, die die Etikettierungstechniken anwenden, um die Blutzellen in der Augenzirkulation zu untersuchen. Die Anwendung der Scanning-Laser-Ophthalmoskopie (SLO) hat einen großen Vorteil beim Studium der markierten Zellen in der Netzhaut- und Aderhautzirkulation in vivo durch Fundusangiographie 24 . Es gibt mehrere Fluoreszenzfarbstoffe wie ICG, Acridinorange, FITC, Natriumfluorescein und CFDA, die verwendet werden, um die Leukozyten in der Retinalzirkulation durch SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . Die Phototoxizität und Karzinogenität von Acridinorange 26 , 27 , die Interferenz von FITC mit der zellulären Aktivität und die Anforderung eines intravaskulären Kontrastmittels für die Auflösung der retinalen und choroidalen Blutgefäße beschränken ihre Anwendung in in vivo Tierversuchen 29 . Natriumfluorescein und ICG sind ungiftig, von der Food and Drug Administration genehmigt und sicher für die Prüfung auf Menschen 32 , 35 . Die meisten der dynamischen Strömungsstudien beziehen sich auf die Markierung der Leukozyten oder Erythrozyten und deren Visualisierung in den Netzhaut- und Aderhautblutgefäßen 36 , 37 , 38 , 39

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Protocol

Die Tierprotokolle, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von SingHealth, Singapur, genehmigt und entsprechen den Richtlinien der Vereinigung für Forschung in der Vision und Ophthalmologie (ARVO) Erklärung zur Verwendung von Tieren in Ophthalmologie und Vision Forschung.

1. Markierung von Erythrozyten und Leukozyten mit Fluoreszenzfarbstoffen

  1. Vorbereitung der Reagenzien
    1. Bereiten Sie ICG (1,5 mg / ml) vor, indem Sie 3 mg ICG in 1800 & mgr; l sterilisiertem destilliertem Wasser auflösen. Zugabe von 200 μl 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    2. 40% 1x PBS durch Zugabe von 4 ml 1x PBS zu 6 ml sterilisiertem destilliertem Wasser zubereiten. 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS durch Zugabe von 100 mg BSA zu 10 ml 1x PBS zubereiten. Mischen Sie gut, bis das BSA aufgelöst ist.
  2. Isolierung von Erythrozyten und Leukozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation
    1. Anästhesieren Sie die Mäuse (wild tyPe C57BL / 6) unter Verwendung einer Kombination von Ketaminhydrochlorid (50 mg / kg) und Xylazinhydrochlorid (0,5 mg / kg) (nach Plan 1 unter ARVO-Richtlinien). Bestätigen Sie die Anästhesie durch Pedal-Entzugsreflex ( dh Zehensperre).
    2. Langsam die 29-Gauge-Nadel (an einer 1-ml-Spritze befestigt) in einem auf das Herz gerichteten Kameradwinkel einsetzen. Um zu bestätigen, dass die Nadel im Inneren des Herzens ist, ziehen Sie den Kolben leicht zurück und prüfen Sie, ob Blut in die Spritze zurückgezogen wird. Exsanguinate 0,8 - 1 mL Blut direkt aus dem Herzen.
    3. Sofort das Blut in ein Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (1,8 mg / ml Blut) mit Blutentnahmeröhrchen überführen und vorsichtig vermischen, um eine Koagulation des Blutes zu verhindern.
    4. Euthanisieren der Mäuse durch Verabreichung von Pentobarbital (80 mg / kg) durch intraperitoneale Injektion.
    5. Schicht das Vollblut auf eine Polysucrose- und Natriumdiatrizoatlösung (Verhältnis 1: 1, Dichte 1,077 g / ml) in einem 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Centri(450 xg, 30 min), um die Trennung der Leukozyten und Erythrozyten aus dem Plasma zu ermöglichen.
    6. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand (Plasma) mit einer Pipette. Sorgfältig den Buffy Coat (Leukozyten) und Erythrozyten (rote Blutkörperchen) in neue und separate Röhrchen mit Pipetten übertragen.
  3. ICG (1,5%) Kennzeichnung von Erythrozyten
    1. Waschen Sie die Erythrozyten mit 1x PBS, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen. Resuspendieren Sie die Erythrozyten in 1x PBS (1: 1), um 50% Hämatokrit zu machen. Aliquot 0,5 ml 50% Hämatokrit (~ 250 μl gepackte Erythrozyten) in Mikrozentrifugenröhrchen. Die Erythrozyten (750 xg, 5 min) zentrifugieren und den Überstand verwerfen.
    2. Fügen Sie 200 μl 40% 1x PBS zu den pelletierten Erythrozyten hinzu, mischen Sie gut und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. 100 μl ICG (1,5 mg / ml) der Erythrozytensuspension zugeben, vorsichtig durch Umkehren des Röhrchens mischen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zugabe von 300 μl 1x PBS und Inkubieren bei37 ° C in einem Shaker-Inkubator für 60 min.
    3. Die Träger-Erythrozyten (750 xg, 3 min) zentrifugieren und in 1 ml 1x PBS resuspendieren.
    4. Waschen Sie die Zellen ~ 3 - 5 mal mit 1x PBS, bis der Überstand klar ist (Schritt 1.3.3). Nach dem letzten Waschen dekantieren Sie den Überstand und fügen 1% BSA PBS (1: 1) zu den markierten vorgequollenen Erythrozyten hinzu, um einen 50% igen Hämatokrit (1,25 x 10 & sup8; Zellen / ml) von ICG-markierten Erythrozyten zu erhalten.
  4. Natriumfluorescein (1%) Markierung von Leukozyten
    1. Nach dem Trennen der Buffy Coat vom Blut mit Dichtegradientenzentrifugation (ab Schritt 1.2.6), die Zellen einmal mit 10 ml 1x PBS durch Zentrifugieren bei 450 xg für 10 min waschen, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen. Das Pellet wird in 900 μl 1x PBS resuspendiert.
    2. 100 μl 10% iges Natriumfluorescein werden zu 900 μl der Leukozytensuspension gegeben und bei Raumtemperatur für 2 min inkubiert. Die markierten Zellen dreimal mit 10 ml 1X PBS durch Zentrifugi waschenNg (450 xg, 10 min). Resuspendieren der Zellen in 100 μl 1x PBS.

2. Live-Bildgebung von fluoreszenzbeschrifteten Zellen

  1. Live-Zell-Bildgebung von ICG-markierten Erythrozyten
    1. Um Zellen zur Injektion über die Schwanzvene oder den retro-orbitalen Weg vorzubereiten, verdünnen Sie den 50% Hämatokrit von ICG-markierten Erythrozyten um 10-fach und 50-fach mit 1x PBS, um jeweils 5% bzw. 1% Hämatokrit-Zellen herzustellen.
    2. Legen Sie die Maus unter das Infrarotlicht (250W Intensität) für 5 min, um die Schwanzvene zu erweitern. Anästhesieren Sie die Maus mit Ketaminhydrochlorid (50 mg / kg) und Xylazinhydrochlorid (0,5 mg / kg) durch intraperitoneale Injektion (hier nach Plan 1 unter ARVO-Richtlinien).
    3. Duplizieren Sie jeden Schüler der Augen mit einem Tropfen von 0,5% Tropicamid und 2,5% Phenylephrin-Hydrochlorid.
    4. Legen Sie die Kontaktlinse über ein Auge für die Bildgebung. Verwenden Sie ophthalmisches Gel als Medium für die Bildgebung und um Trockene zu verhindernS der Hornhaut. Fixieren Sie die konfokale Laserscanning-Ophthalmoskopie (SLO) Kamera mit +25 Dioptrienobjektiv, um die Brechung des Mausauges zu kompensieren.
    5. Legen Sie die Maus auf die SLO-Imaging-Plattform. Stellen Sie sicher, dass die Hornhaut der Maus gerade in Richtung des optischen Kopfes der SLO-Maschine liegt.
    6. Schalten Sie das Bildmodul ein. Verwenden Sie die zugehörige Imaging-Modul-Software, klicken Sie auf die Schaltfläche "Neuer Patient" und fügen Sie Tieridentifikationsdetails wie Maus-Ohr-Tag-Nummer, Geburtsdatum, Prozentsatz des Fluoreszenzfarbstoffs und markierten Zelltyps hinzu.
      1. Positionieren Sie den Sehnerv des Tieres in der Mitte des Bildgebungsbildschirms, indem Sie das Bildgebungsmodul manövrieren. Mit der dazugehörigen Imaging-Modul-Software klicken Sie auf die Schaltfläche "Acquire", um die Infrarot- (IR-) Fundus-Bilder mit der 30 ° oder 15 ° Winkelansicht zu nehmen. Stellen Sie sicher, dass die Mitte der Netzhaut, die Pupille und der optische Pfad des Lasers ausgerichtet sind, um ein bestes Bild zu erhalten.
    7. Nehmen Sie das ICG Fundus Video.
      1. Schalten Sie den ICG-Filter (790 nm) ein, stellen Sie die Kamera in den Hochgeschwindigkeitsmodus mit der 30 ° - oder 15 ° -Winkelansicht ein und stellen Sie die ICG-Intensität bei 85 für alle Messwerte für die Standardisierung ein. Klicken Sie auf dem Bedienfeld auf die Schaltfläche "Acquire", um das Video (Baseline Control) bei 8.8 / 15 Frames / s für 1 Minute zu nehmen.
    8. Laden Sie 100 μl ICG-markierte Erythrozyten in eine Insulinspritze, die an einer 30-Gauge-Nadel befestigt ist.
      1. Für die Injektion über die Schwanzvenenroute die Nadel in die Schwanzvene aufsetzen. Bestätigen Sie den intravenösen Zugang, indem Sie den Rückfluss des Blutes in die Spritze überprüfen und die markierten Zellen in den Kreislauf injizieren.
      2. Für die Injektion über den Retro-Orbital-Weg die Nadel neben dem Auge in den retro-orbitalen Raum einführenE. Bestätigen Sie den retro-orbitalen Zugang, indem Sie den Rückfluss des Blutes in die Spritze überprüfen und die markierten Zellen in den Kreislauf injizieren.
    9. Nach der Injektion die Maus repositionieren und die IR-Fundusbilder (siehe Schritt 2.1.6.1) und Video mit dem ICG-Filter aufnehmen (siehe Schritt 2.1.7.1). Die markierten Zellen in der Netzhautzirkulation können unmittelbar nach der Injektion der Zellen sichtbar gemacht werden.
    10. Nach dem Erfassen der Videoframes extrahieren Sie .tiff Bilder der Videosequenzen, indem Sie das .tiff-Format beim Exportieren des Videos mit der SLO-Viewing-Modul-Software auswählen. Speichern Sie die Dateien in einem gewünschten Ordner.
    11. Entfernen Sie die Kontaktlinse, legen Sie sie über das andere Auge und vervollständigen Sie die Bildgebung wie in den Schritten 2.1.4 - 2.1.7 beschrieben.
    12. Nach der Bildgebung legen Sie das betäubte Tier unter das Infrarotlicht (250W), um die Körpertemperatur zu erhalten, bis es sich von der Anästhesie erholt. Wenn das Tier vollständig erholt ist, legen Sie die Maus wieder in den Haltekäfig.
  2. Live-Zell-Bildgebung von 1% Natriumfluorescein-markierten Leukozyten
    1. Bereiten Sie die Maus vor und richten Sie das Gerät wie in Abschnitt 2.1 beschrieben ein.
    2. Positionieren Sie die Maus und nehmen Sie die IR-Fundus-Bilder wie in den Schritten 2.1.4 - 2.1.6 beschrieben.
      1. Erhalten Sie das Fluorescein-Angiogramm der Maus mit dem Fluorescein-Filter (488 nm) mit dem High-Speed-Kameramodus mit der 30 ° - oder 15 ° -Winkelansicht und Fluoreszenzintensität bei 85 für alle Messwerte für die Standardisierung. Aufnehmen des Videos (Baseline-Steuerung) bei 8.8 / 15 Frames / s (siehe Schritt 2.1.7.1).
        HINWEIS: Hier wurden mehrere Tracks von Videos (1 Min. Videos) in verschiedenen Zeitintervallen erworben.
    3. 100 μl markierte Leukozyten in die Maus durch die Schwanzvene oder retro-orbitale Injektion injizieren, wie in Abschnitt 2.1.8 beschrieben.
    4. Unmittelbar nach der Injektion positionieren Sie die Maus und nehmen die IR-Fundus-Bilder (siehe Schritte 2.1.5 und 2.1.6) und die FluoResignieren das Angiogramm der Maus (siehe Abschnitt 2.2.2).
    5. Beobachten Sie die markierten Zellen in den Netzhaut- oder Aderhaut-Blutgefäßen, indem Sie den Brennpunkt des Scanning-Lasers einstellen, indem Sie den Fokussierknopf auf das Imaging-Modul drehen.
    6. Erfassen Sie die Videoframes und Bilder mit der SLO-Anzeigemodul-Software (siehe Schritt 2.1.10) und speichern Sie sie in einem gewünschten Ordner.
    7. Nach dem Eingriff folgen Sie Schritt 2.1.12 für die Tierpflege.
  3. Bildanalyse von MtrackJ Software
    1. Öffnen Sie die Bildsequenz in ImageJ, indem Sie auf "Datei" klicken. Wählen Sie "Importieren" und wählen Sie "Bildsequenz", wählen Sie den gewünschten Bildordner aus und klicken Sie auf "Öffnen". Ein Pop-up-Fenster mit dem Namen "Sequence options" erscheint auf dem Bildschirm. OK klicken"; Die Bildsequenz wird geöffnet.
    2. Legen Sie das Bildintervall des Bildvideos fest, indem Sie auf "Bild" klicken und "Eigenschaften" für Geschwindigkeitsmessungen auswählen. Hier ist es 8.8 FramEs / s.
    3. Öffnen Sie das MTrackJ Plugin, indem Sie "Plugins" auswählen. Wählen Sie "Tracking" und wählen Sie dann "MtrackJ". Es sollte ein Menü erscheinen.
    4. Um die Tracking-Einstellungen anzupassen, wählen Sie "Tracking" (unter Menü) und markieren Sie das Kontrollkästchen "Nach dem Hinzufügen von Punkt" zum nächsten Frame-Index.
    5. Verfolge die erste Zelle.
      1. Suchen Sie eine Zelle und verfolgen Sie die gleiche Zelle in nachfolgenden Frames. Klicken Sie im Menü auf "Hinzufügen", um eine neue Spur hinzuzufügen.
      2. Bewege den Cursor über das Bild (+ Zeichen) und klicke auf die entsprechende Zelle.
        HINWEIS: MTrackJ springt automatisch zum nächsten Zeitrahmen und fügt einen kleinen Kreis hinzu, der die Position des ersten Punktes in der Trajektorie markiert.
      3. Klicken Sie auf die aktuelle Position der Zelle, während Sie sich durch die Bilder der Bildsequenz bewegen.
        HINWEIS: Gelegentlich stören die Kreise, die die vorherigen Punkte in der Trajektorie markieren, die Möglichkeit, den aktuellen Standort anzuzeigen. Wenn dies geschieht,Fahren Sie mit Schritt 2.3.5.3.1 fort.
        1. Ändern Sie die Anzeigeoption für die Trajektorie, indem Sie im Menü auf "Anzeigen" klicken und die Option "Nur Trackpunkte zur aktuellen Zeit anzeigen" auswählen. Um alle Trajektorien zu sehen, wählen Sie diese Option aus.
      4. Fahren Sie weiter, bis die Trajektorie der ersten Zelle sichtbar ist. Dann speichern Sie die Spur, indem Sie auf "Speichern" klicken.
    6. Verfolge die zweite Zelle.
      1. Klicken Sie im Menü auf "Hinzufügen", um eine neue Spur zu starten. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.5.1 - 2.3.5.4 für die Verfolgung der neuen Zelle. Klicken Sie auf "Speichern", um den zweiten Track zu speichern.
      2. Fortsetzen Sie diese Schritte für alle verfolgten Zellen beobachtet. Nach dem Verfolgen der Zellen, klicken Sie auf "Messen" und "OK" in der Menü-Registerkarte, um die Ergebnisse zu erhalten.
        HINWEIS: Es öffnet sich automatisch ein Ergebnisfenster, das für eine weitere Analyse gespeichert und in einer Tabellenkalkulation geöffnet werden kann.

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Representative Results

Erythrozyten, markiert mit 1,5% ICG, wurden in der Netzhautzirkulation von C57BL / 6J-Mäusen (Wildtyp) sichtbar gemacht. Sowohl 1% als auch 5% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten waren im Retinalkreislauf zu unterscheiden. Allerdings wurden die einzelnen markierten Zellen mit 1% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten deutlicher sichtbar gemacht ( Abbildung 1 ). In 5% Hämatokrit war es aufgrund der großen Anzahl markierter Zellen in den Netzhautgefäßen nicht möglich, die einzelne Zelle zu markieren. Einige Erythrostasen wurden in der peripapillaren Region unter beiden Bedingungen beobachtet, aber sie war im 5% Hämatokrit der markierten Erythrozyten stärker ausgeprägt ( Abbildung 2 ).

Leukozyten wurden erfolgreich mit 1% Natriumfluorescein nach dem obigen Protokoll markiert und wurden als grün markierte Zellen unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie ( Class = "xfig"> Abbildung 3). Kleine Klumpen von Zellen (4 - 5 Zellen zusammen) wurden auch in markierten Proben beobachtet. Als die Zellen in die Mauszirkulation injiziert wurden, wurden markierte Leukozyten in der Retinalzirkulation sichtbar gemacht ( Abbildung 4 ). Nach der Markierung wurden sowohl die Erythrozyten als auch die Leukozyten sofort in die Mäuse injiziert und in 30 und 60 min Zeitintervallen sichtbar gemacht. Fluoreszenzmarkierte Zellen wurden unmittelbar nach der Injektion beobachtet, aber die Fluoreszenzintensitäten gingen allmählich in 30 und 60 min Zeitintervallen ab. Wir verwendeten auch das Leukozyten-Färbeprotokoll (1% Natriumfluorescein) auf den Erythrozyten und beobachteten keine Markierung der Erythrozyten. Mit dem Mtrack-J-Plugin auf der Public-Media-Software von Image J wurden die Zellen in der Retinalzirkulation verfolgt ( Abbildung 5 ).

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Abbildung 1 : 1% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten im Retinalkreislauf. Das ICG beschriftete einzelne Erythrozyten, die helle Signale in den Netzhautgefäßen zeigen. In der peripapillaren Region wurde eine Erythrostase beobachtet. Maßstab = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2 : 5% Hämatokrit von 1,5% ICG-markierten Erythrozyten in der Retinalzirkulation. Viele ICG-markierte Erythrozyten zeigen helle Signale in den Netzhautgefäßen; Eine große Menge an Erythrostase wurde in der peripapillaren Region beobachtet. Maßstab = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3 : Fluoreszenzmikroskopie Bild von 1% Natriumfluorescein markierten Leukozyten. Natriumfluorescein-markierte Leukozyten mit grünen Fluoreszenzsignalen mit kleinen Klumpen (20fache Vergrößerung, Skala = 50 μm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4 : 1% Natriumfluorescein-markierte Leukozyten in der Retinalzirkulation. Natriumfluorescein markierte Leukozyten (Pfeil) mit hellem Signal in den Netzhautgefäßen. Maßstab = 200 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5 : Verfolgung von markierten Einzelzellen im Retinalkreislauf mittels Bildanalyse-Software. Verschiedene Spuren (farbige Kreise und Linien, wie auf dem Bild dargestellt) wurden gemessen, um die durchschnittliche Geschwindigkeit der markierten Zellen in der Netzhautzirkulation zu berechnen.

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Discussion

Das Studium der Hämodynamik im Netzhaut- und Aderhautkreislauf ist für das Verständnis der Pathophysiologie vieler Augenerkrankungen unerlässlich. Die Blutflussdynamik in der Netzhautzirkulation kann durch Fourier-Domänen-optische Kohärenztomographie (FD-OCT), Laser-Speckle-Flowgraphie (LSFG) und Netzhautoximetrie untersucht werden. Obwohl diese Methoden unterschiedliche Ansätze zur Untersuchung des Gesamtblutflusses in der Netzhautzirkulation 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 verwenden , teilen sie die Beschränkung der Unfähigkeit, die Strömungsdynamik einzelner Zelltypen zu untersuchen. Die Nährstoffe und die Sauerstoffversorgung der Netzhaut- und Aderhautgewebe sowie die Migration von Immunzellen bei Augenentzündungserkrankungen und ihre Rolle bei der Krankheitspathogenese können durch die Untersuchung der Strömungsdynamik von er untersucht werdenYthrozyten und leukozyten in der retinalen und choroidalen zirkulation. Etikettiertechniken, die mit bildgebenden Verfahren gekoppelt sind, helfen, die markierten Zellen in der Zirkulation zu verfolgen und die Strömungsdynamik der markierten Zellen zu untersuchen. Mehrere Fluoreszenzfarbstoffe wurden erfolgreich angewendet, um die Leukozyten und Erythrozyten zur Untersuchung ihrer Strömungsdynamik im Kreislauf 3 , 17 , 18 , 19 zu etikettieren .

Hier berichten wir über die Anwendung von Food and Drug Administration, die nicht toxische Fluoreszenzfarbstoffe, Indocyaningrün und Natriumfluorescein für die Markierung und Visualisierung der Erythrozyten und Leukozyten im Retinalkreislauf zugelassen sind. Obwohl Natriumfluorescein der am häufigsten verwendete Farbstoff für die Verfolgung der Leukozyten 31 , 32 , 33 ist 34 , der Vorteil der gleichzeitigen Markierung von Erythrozyten und Leukozyten mit ICG und Natriumfluorescein ist eine effiziente Visualisierung von markierten Zellen gleichzeitig im Tierauge durch Veränderung der Filter im SLO. SLO ist eine nicht-invasive Methode der Netzhaut-Bildgebung, die weitgehend in der Untersuchung von pathologischen Veränderungen bei verschiedenen Netzhauterkrankungen bei Menschen und Tieren verwendet wird. Es kann auch beim Vergleich von Netzhautveränderungen in Reaktion auf eine gegebene Behandlung helfen.

Um qualitativ hochwertige Bilder im SLO zu erzielen, müssen die Pupillen vollständig erweitert werden und die Kontaktlinse muss mit ophthalmischem Gel verwendet werden, um eine feuchte Hornhaut aufrechtzuerhalten und eine Kataraktbildung zu verhindern. Die Position der Augen und der optische Pfad der Kamera müssen gerade sein, um Qualität Fundus und Angiogramm Bilder zu erreichen. Das Tier sollte tief sediert sein, um die Bewegung während der Bildgebung zu minimieren. Obwohl sowohl 1% als auch 5% Hämatokrit von 1,5% ICGMarkierten Erythrozyten zeigten die Visualisierung von fluoreszenzmarkierten Zellen in der Netzhautzirkulation, 1% Hämatokrit war besser geeignet für die Überwachung der einzelnen Zellen. Fluoreszenzmarkierte Zellen können nicht sichtbar gemacht werden, wenn die Anzahl der injizierten Leukozyten zu niedrig ist. Um daher bessere Ergebnisse bei der Überwachung der markierten Zellen in der Retinalzirkulation zu erzielen, empfiehlt es sich, Leukozyten aus mindestens 4 Mäusen zu sammeln, mit 1% Natriumfluorescein zu markieren und in eine einzelne Maus zu injizieren. Obwohl es einige alternative Farbstoffe für Natriumfluorescein (Calcein, FITC, DIO, FDA und CFDA mit Absorptions- / Emissionsmaxima ähnlich oder nahe Natriumfluorescein gibt), müssen die Farbstoff-Retentionsrate und die Toxizität für Augengewebe 9 , 12 , 13 , 14 , 17

Die Begrenzung der gemeldeten Technik ist dieAusbleichen des fluoreszierenden Signals im Umlauf nach 60 min. Daher muss die Strömungsdynamik der markierten Zellen innerhalb von 60 min analysiert werden. Hier wurde, um Leukozyten zu etikettieren, Blut aus einer Maus entnommen, die Zellen wurden isoliert, markiert, in eine andere Maus injiziert und durch SLO sichtbar gemacht. Bei SLO wurde jedoch nur 0 - 1 Zelle pro Rahmen in retinalen Blutgefäßen beobachtet. Dies könnte auf eine unzureichende Leukozytenzellzahl zurückzuführen sein, und so empfehlen wir, Blut von mindestens 3 - 4 Mäusen zu sammeln, um eine höhere Zellzahl pro Rahmen zu visualisieren. Die Kamerageschwindigkeit von 8,8 Frames / s wurde in der Studie verwendet, aber dies könnte erhöht werden, um mehr sequentielle Bilder und Videos der markierten Zellen zu erzielen.

Frühere Studien berichteten über Veränderungen der Blutströmungsgeschwindigkeit bei der Netzhautzirkulation von Diabetikern mit verschiedenen Stadien von DR. Clermont et al. Berichteten über eine 33% ige Abnahme des Netzhautblutflusses bei Patienten mit dem frühen Stadium von DR 47 und Nguyen etAl. Berichteten über eine Erhöhung des Netzhautblutflusses bei Diabetikern mit proliferativem DR 48 . Eine verminderte Blutströmungsgeschwindigkeit wurde auch mit dem progressiven Glaukom 49 assoziiert. In den vorgenannten Studien untersuchten die Autoren die gesamten Blutströmungsgeschwindigkeiten im Netzhautkreislauf. Das Studium der Strömungsgeschwindigkeiten jedes Zelltyps kann Informationen über die zellulären Wechselwirkungen bei verschiedenen Krankheiten und in verschiedenen Stadien der Erkrankung liefern und kann bei der Prognose helfen. Hier berichten wir über eine Methode zur Etikettierung der Erythrozyten und Leukozyten mit ICG und Natriumfluorescein bzw. deren Visualisierung im Retinalkreislauf; Diese Methode kann auf jedes Krankheitsmodell für in vivo Studien angewendet werden .

Die zukünftige Forschung kann unsere Markierungstechniken unter Verwendung von SLO nutzen, um die Variation der Strömungsdynamik der markierten Erythrozyten und Leukozyten unter verschiedenen Arzneimittelbehandlungen zu untersuchenBei verschiedenen Stadien der Erkrankung. Darüber hinaus können unsere Methoden helfen, die Rolle der Erythrozyten und Leukozyten bei Krankheits-Phänotypen zu verstehen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren. Kein finanzieller oder interessenkonflikt

Acknowledgements

Das Forschungsprojekt wurde unter dem New Investigator-Stipendium des National Medical Research Council (NMRC), Singapur, finanziert. Das Team wird gern die von Dr. Agrawal am Institut für Ophthalmologie (IoO), University College London (UCL) unter National Medical Research Council (NMRC) ausländische Forschungsausbildungsstipendien von November 2012 bis Oktober 2014 unter Mentoren von Prof. David Shima Dr. Agrawal erwarb das Konzept und die Fähigkeiten für die Etikettierung der Zellen und die Live-Bildgebung in Dr. Shimas Labor. Das Team wird daher während der Trainingsstiftung von Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh und Dr. Daiju Iwata, die Betreuung und Führung anerkennen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

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