Étiquetage des colorants fluorescents des érythrocytes et des leucocytes pour étudier la dynamique du flux dans la circulation de la rétine de la souris

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Summary

L'imagerie à cellules vivantes des cellules sanguines marquées dans la circulation oculaire peut fournir des informations sur l'inflammation et l'ischémie dans la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Un protocole pour étiqueter les cellules sanguines et l'image des cellules marquées dans la circulation de la rétine est décrit.

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Agrawal, R., Balne, P. K., Tun, S. B., Sia Wey, Y., Khandelwal, N., Barathi, V. A. Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation. J. Vis. Exp. (125), e55495, doi:10.3791/55495 (2017).

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Abstract

La dynamique du flux sanguin rétinien et choroidal peut donner un aperçu de la pathophysiologie et des séquelles de diverses maladies oculaires telles que le glaucome, la rétinopathie diabétique, la dégénérescence maculaire liée à l'âge (AMD) et d'autres affections inflammatoires oculaires. Il peut également aider à surveiller les réponses thérapeutiques dans l'œil. L'étiquetage correct des cellules sanguines, couplé à l'imagerie des cellules vivantes des cellules marquées, permet d'étudier la dynamique de l'écoulement dans la circulation rétinienne et choroïde. Ici, nous décrivons les protocoles normalisés de 1,5% d'indocyanine vert (ICG) et de 1% de fluorescéine de sodium sur l'étiquetage des souris érythrocytes et les leucocytes, respectivement. On a appliqué une ophtalmoscopie laser à balayage (SLO) pour visualiser les cellules marquées dans la circulation rétinienne des souris C57BL / 6J (type sauvage). Les deux méthodes ont démontré des cellules séparées fluorescentes dans la circulation de la rétine de la souris. Ces méthodes d'étiquetage peuvent avoir des applications plus larges dans diverses maladies oculairesdes modèles.

Introduction

L'étude de la dynamique de l'écoulement des cellules sanguines dans la circulation rétinienne et choroïdienne est impératif pour comprendre la pathogenèse des maladies oculaires potentiellement visibles pour la vision et d'autres affections inflammatoires oculaires. Cependant, les techniques d'angiographie conventionnelles, qui impliquent la liaison de colorants fluorescents aux protéines plasmatiques, ne fournissent aucune information concernant la dynamique des érythrocytes ou des leucocytes 1 . La dynamique des flux rétiniens des érythrocytes est importante pour étudier la circulation métaboliquement efficace dans la rétine et la dynamique des flux de leucocytes, pour comprendre la migration cellulaire, la reconnaissance, l'adhésion et la destruction dans diverses conditions inflammatoires 2 . Il existe plusieurs molécules fluorescentes utilisées dans l'identification et la caractérisation de différents types de cellules 3 . L'hémodynamique des cellules sanguines peut être mesurée en les colorant avec les fluorescences appropriéesCent et appliquant les techniques d'imagerie appropriées 4 .

La présence de réponses inflammatoires dans les maladies intraoculaires comme la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) et la rétinopathie diabétique (DR) impliquent l'accumulation de lymphocytes dans la zone malade 5 , 6 . Le suivi des cellules immunitaires dans les tissus peut aider à comprendre les événements complexes impliqués dans le mécanisme de la pathogenèse de la maladie. Les isotopes radioactifs comme 51 Cr et 125 I ont été utilisés comme traceurs cellulaires lors d'études précoces. Ces colorants sont toxiques et affectent la viabilité cellulaire. Bien que les marqueurs radioactifs 3 H et 14 C soient moins toxiques pour les cellules, en raison de leurs énergies d'émission plus faibles, il est difficile de détecter leurs signaux dans le système 7 , 8 . Un certain nombre de colorants fluorochrome ont été introduits pour surmonter les problèmes potentiels associés wIth marqueurs radioactifs et suivi de la migration des lymphocytes à l' aide de microscopie fluorescente et de cytométrie en flux 9 , 10 . Hoechst 33342 et l'orange thiazole sont des colorants fluorescents liés à l'ADN, qui sont utilisés pour suivre les lymphocytes in vivo. Hoechst 33342 se lie aux régions riches en AT dans l'ADN, est perméable à la membrane, conserve les signaux fluorescents pendant 2 à 4 jours et résiste à la trempe 9 , 10 . Les inconvénients de Hoechst 33342 et de l'orange thiazole sont l'inhibition de la prolifération lymphocytaire 11 et la demi-vie courte, respectivement 9 .

Calcein-AM, diacétate de fluorescéine (FDA), 2 ', 7'-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et -6) -carboxyfluorescéine, acétoxyméthyl ester (BCECF-AM), 5- (et -6) Le diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA) et l'ester acétoxyméthylique de diacétate de 5 (et -6) -carboxyfluorescéine (CFDA-AM)Sont les colorants fluorescents cytoplasmiques utilisés pour les études sur les migrations de lymphocytes. Cependant, la FDA, la CFDA et la CFDA-AM ont une rétention plus faible dans les cellules 9 . BCECF-AM réduit la réponse proliférative et influence la chimiotaxis et la production de superoxyde 9 , 12 . Calcein-AM est un colorant fluorescent et utile pour des études de migration de lymphocytes à vivo court terme. Il émet de solides signaux fluorescents, n'interfère pas avec la plupart des fonctions cellulaires et conserve des signaux fluorescents jusqu'à 3 jours 12 , 13 . L'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et l'ester succinimidylique de diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA-SE) sont des colorants fluorescents à couplage covalent, qui sont utilisés pour des études de migration de lymphocytes. FITC ne présente aucun effet sur la viabilité cellulaire et a une affinité plus forte avec les lymphocytes B que les lymphocytes T 14 , 15 in vivo pendant plus de 8 semaines et jusqu'à 8 divisions cellulaires 9 , 16 . C18 DiI (1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'-tétraméthylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3'-dioctadécyloxacarbocyanine perchlorate), Paul Karl Horan (PKH) 2, PKH3 et PKH26 sont membranaires- L'insertion de colorants fluorescents de carbocyanine lipophiles utilisés pour étiqueter les leucocytes et les érythrocytes. C18 Dil et DiO présentent des signaux plus élevés lorsqu'ils sont incorporés dans la membrane cellulaire et sont relativement non toxiques 12 , 17 . Les cellules marquées PKH2, PKH3 et PKH26 présentent une bonne conservation des signaux fluorescents avec moins de toxicité 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . Cependant, PKH2 down régule l'expression CD62L et réduit considérablement Viabilité des radiopathies 23 .

La plupart des études mentionnées ci-dessus ont été réalisées pour suivre la migration et la prolifération des lymphocytes dans les lymphatiques et étudier les érythrocytes marqués dans la circulation non-oculaire. Il existe très peu d'études appliquant les techniques d'étiquetage pour étudier les cellules sanguines dans la circulation oculaire. L'application de l'ophtalmoscopie laser à balayage (SLO) a un grand avantage dans l'étude des cellules marquées dans la circulation rétinienne et choroïde in vivo par angio-graphie du fondus 24 . Il existe plusieurs colorants fluorescents, tels que l'ICG, l'orange d'acridine, la FITC, la fluorescéine de sodium et les CFDA qui sont utilisés pour étudier les leucocytes dans la circulation de la rétine par SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = "xref"> 31 , 32 , 33 , 34 . La phototoxicité et la cancérogénicité de l'orange de l'acridine 26 , 27 , l'interférence de la FITC avec l'activité cellulaire et l'exigence d'un agent de contraste intravasculaire pour la résolution des vaisseaux sanguins rétiniens et choroïdiens limitent leur application dans des expériences animales in vivo 29 . La fluorescéine au sodium et la GIC sont non toxiques, approuvées par la Food and Drug Administration, et sont sûres pour les tests sur les humains 32 , 35 . La plupart des études dynamiques de flux sont liées à l'étiquetage des leucocytes ou des érythrocytes et à leur visualisation dans les vaisseaux sanguins rétiniens et choroïdaux 36 , 37 , 38 , 39

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Protocol

Les protocoles animaux utilisés dans cette étude ont été approuvés par le comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de SingHealth, à Singapour et sont conformes aux directives de l'Association pour la recherche en vision et ophtalmologie (ARVO) Déclaration pour l'utilisation d'animaux en ophtalmologie et en vision Recherche.

1. Étiquetage des érythrocytes et des leucocytes avec des colorants fluorescents

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparer ICG (1,5 mg / mL) en dissolvant 3 mg d'ICG dans 1800 μL d'eau distillée stérilisée. Ajouter 200 μL de solution salée tamponnée au phosphate 10x (PBS).
    2. Préparer 40% 1x PBS en ajoutant 4 mL de 1x PBS à 6 mL d'eau distillée stérilisée. Préparer 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS en ajoutant 100 mg de BSA à 10 ml de 1x PBS. Bien mélanger jusqu'à ce que la BSA soit dissoute.
  2. Isolation des érythrocytes et des leucocytes en utilisant une centrifugation à gradient de densité
    1. Anesthésier les souris (type sauvagePe C57BL / 6) en utilisant une combinaison de chlorhydrate de kétamine (50 mg / kg) et de chlorhydrate de xylazine (0,5 mg / kg) (selon le schéma 1, selon les directives ARVO). Confirmer l'anesthésie par réflexe de retrait de la pédale ( c. -à- d . Pincement du pied).
    2. Insérer lentement l'aiguille à calibre 29 (attaché à une seringue de 1 mL) à un angle coûteux dirigé vers le coeur. Pour confirmer que l'aiguille se trouve dans le cœur, retirer légèrement le piston et vérifier si le sang est retiré dans la seringue. Exsanguinate 0,8 - 1 mL de sang directement du coeur.
    3. Transférer immédiatement le sang dans un tube d'éthylène diamine tétraacétique (EDTA) (1,8 mg / ml de sang) contenant du sang et mélanger doucement pour prévenir la coagulation du sang.
    4. Éuthaniser les souris en administrant du pentobarbital (80 mg / kg) par injection intrapéritonéale.
    5. Couler le sang entier sur une solution de polysucrose et de diatrizoate de sodium (rapport 1: 1, densité 1,077 g / mL) dans un tube à microcentrifugeuse de 2 mL et centri(450 xg, 30 min) pour permettre la séparation des leucocytes et des érythrocytes du plasma.
    6. Retirer et jeter le surnageant (plasma) à l'aide d'une pipette. Transférer soigneusement le manteau buffy (leucocytes) et les érythrocytes (couche de globules rouges) dans des tubes nouveaux et séparés à l'aide de pipettes.
  3. ICG (1,5%) étiquetage des érythrocytes
    1. Laver les érythrocytes avec 1x PBS pour éliminer tout contaminant. Ressusciter les érythrocytes dans 1x PBS (1: 1) pour former 50% d'hématocrite. Aliquote 0,5 ml d'hématocrite à 50% (~ 250 μL d'érythrocytes emballés) dans des tubes à microcentrifugeuse. Centrifuger les érythrocytes (750 xg, 5 min) et jeter le surnageant.
    2. Ajouter 200 μL de 40% 1x PBS aux érythrocytes granulés, bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 100 μL d'ICG (1,5 mg / mL) à la suspension érythrocytaire, mélanger doucement en inversant le tube et incuber à température ambiante pendant 5 min. Ajouter 300 μL de 1x PBS et incuber à37 ° C dans un incubateur agitateur pendant 60 min.
    3. Centrifuger les érythrocytes porteurs (750 xg, 3 min) et remettre en suspension dans 1 mL 1x PBS.
    4. Lavez les cellules ~ 3 à 5 fois avec 1x PBS jusqu'à ce que le surnageant soit dégagé (étape 1.3.3). Après le dernier lavage, décanter le surnageant et ajouter 1% de BSA PBS (1: 1) aux érythrocytes pré-gonflés marqués pour obtenir un hématocrite à 50% (1,25 x 10 8 cellules / mL) d'érythrocytes marqués ICG.
  4. Étiquetage des leucocytes par la fluorescéine au sodium (1%)
    1. Après avoir séparé la couche buffy du sang en utilisant une centrifugation à gradient de densité (à partir de l'étape 1.2.6), laver les cellules une fois avec 10 mL de 1x PBS en centrifugant à 450 xg pendant 10 minutes pour éliminer tout contaminant. Remettre en suspension la pastille dans 900 μl de 1x PBS.
    2. Ajouter 100 μl de 10% de fluorescéine de sodium à 900 μl de suspension de leucocytes et incuber à température ambiante pendant 2 min. Laver les cellules étiquetées trois fois avec 10 mL de PBS 1X par centrifugerNg (450 xg, 10 min). Remettre en suspension les cellules dans 100 μL de 1x PBS.

2. Imagerie en direct des cellules étiquetées fluorescentes

  1. Imagerie en cellules vivantes d'érythrocytes marqués ICG
    1. Pour préparer les cellules à injecter via la veine de la queue ou la voie rétro-orbitaire, diluer l'hématocrite à 50% des érythrocytes marqués par ICG de 10 fois et 50 fois avec 1x PBS pour former des cellules d'hématocrite à 5% et 1%, respectivement.
    2. Placez la souris sous la lumière infrarouge (intensité de 250W) pendant 5 minutes pour que la veine de la queue se dilate. Anesthésier la souris avec du chlorhydrate de kétamine (50 mg / kg) et du chlorhydrate de xylazine (0,5 mg / kg) par injection intrapéritonéale (ici, selon le calendrier 1, selon les directives ARVO).
    3. Dilatent chaque pupille des yeux avec une goutte de 0,5% de tropicamide et 2,5% de chlorhydrate de phényléphrine.
    4. Placez les lentilles de contact sur un oeil pour l'imagerie. Utiliser le gel ophtalmique comme moyen d'imagerie et prévenir les séchésS de la cornée. Réparez la caméra d'ophtalmoscopie à balayage laser confocal (SLO) avec +25 lentilles dioptriques pour compenser la réfraction de l'œil de la souris.
    5. Placez la souris sur la plate-forme d'imagerie SLO. Assurez-vous que la cornée de la souris est tournée vers la tête optique de la machine SLO.
    6. Allumez le module d'imagerie. À l'aide du logiciel du module d'imagerie associé, cliquez sur le bouton «Nouveau patient» et ajoutez des détails d'identification des animaux tels que le numéro d'étiquette de l'oreille de la souris, la date de naissance, le pourcentage de colorant fluorescent et le type de cellule marquée.
      1. Positionner le nerf optique de l'animal au centre de l'écran d'imagerie en manoeuvrant le module d'imagerie. À l'aide du logiciel du module d'imagerie associé, cliquez sur le bouton "Acquérir" pour prendre les images de fond de l'infrarouge (IR) avec le réglage de l'angle 30 ° ou 15 °. Assurez-vous que le centre de la rétine, la pupille et le chemin optique du laser sont alignés pour obtenir une image de meilleure qualité.
    7. Prenez la vidéo ICG Fundus.
      1. Activez le filtre ICG (790 nm), réglez l'appareil photo en mode haute vitesse avec l'angle 30 ° ou 15 ° et définissez l'intensité ICG à 85 pour toutes les lectures pour la normalisation. Sur le panneau de commande, cliquez sur le bouton "Acquérir" pour prendre la vidéo (contrôle de ligne de base) à 8,8 / 15 images / s pendant 1 min.
    8. Chargez 100 μL d'érythrocytes marqués ICG dans une seringue d'insuline attachée à une aiguille à calibre 30.
      1. Pour l'injection via la voie de la veine de la queue, insérez le biseau de l'aiguille dans la veine de la queue. Confirmer l'accès intraveineux en vérifiant le reflux du sang dans la seringue et injecter les cellules étiquetées dans la circulation.
      2. Pour l'injection via la voie rétro-orbitale, insérez l'aiguille adjacente à l'œil dans l'espace rétro-orbitaireE. Confirmez l'accès rétro-orbitaire en vérifiant le reflux du sang dans la seringue et injectez les cellules étiquetées dans la circulation.
    9. Après l'injection, repositionnez la souris et prenez les images du fond de l'infrarouge (voir l'étape 2.1.6.1) et la vidéo en utilisant le filtre ICG (voir l'étape 2.1.7.1). Les cellules marquées dans la circulation de la rétine peuvent être visualisées immédiatement après l'injection des cellules.
    10. Après avoir acquis les images vidéo, extraire les images .tiff des séquences vidéo en choisissant le format .tiff lors de l'exportation de la vidéo à l'aide du logiciel du module de visualisation SLO. Enregistrez les fichiers dans un dossier souhaité.
    11. Retirez la lentille de contact, placez-la sur l'autre œil et complétez l'image comme décrit aux étapes 2.1.4 - 2.1.7.
    12. Après l'imagerie, placez l'animal anesthésié sous la lumière infrarouge (250W) pour maintenir la température du corps jusqu'à ce qu'il récupère de l'anesthésie. Lorsque l'animal est complètement récupéré, placez la souris dans la cage de retenue.
  2. Imagerie en cellules vivantes de 1% de leucocytes marqués au sodium fluorescéine
    1. Préparez la souris et configurez l'instrument comme décrit dans la section 2.1.
    2. Placez la souris et prenez les images du fond de rayon infrarouge comme décrit aux étapes 2.1.4 - 2.1.6.
      1. Obtenez l'angiographie fluorescéine de la souris en utilisant le filtre à fluorescéine (488 nm) avec le mode caméra haute vitesse avec une vue d'angle de 30 ° ou 15 ° et une intensité de fluorescéine à 85 pour toutes les lectures pour la standardisation. Enregistrez la vidéo (contrôle de base) à 8,8 / 15 images / s (voir l'étape 2.1.7.1).
        REMARQUE: ici, plusieurs pistes de vidéos (vidéos de 1 min) ont été acquises à différents intervalles de temps.
    3. Injecter 100 ul de leucocytes marqués dans la souris à travers la veine de queue ou l'injection rétro-orbitale comme décrit dans la section 2.1.8.
    4. Immédiatement après l'injection, positionnez la souris et prenez les images IR du fond (voir les étapes 2.1.5 et 2.1.6) et le fluoAngine de résine de la souris (voir la section 2.2.2).
    5. Observez les cellules étiquetées dans les vaisseaux sanguins de la rétine ou du choroïde en ajustant le point focal du laser de balayage en tournant le bouton de mise au point sur le module d'imagerie.
    6. Acquérir les images vidéo et les images à l'aide du logiciel du module de visualisation SLO (voir l'étape 2.1.10) et l'enregistrer dans un dossier souhaité.
    7. Après la procédure, suivre l'étape 2.1.12 pour les soins des animaux.
  3. Analyse d'image par logiciel MtrackJ
    1. Ouvrez la séquence d'image dans ImageJ en cliquant sur "Fichier". Sélectionnez "Importer" et choisissez "Séquence d'image", sélectionnez le dossier d'image souhaité, puis cliquez sur "Ouvrir". Une fenêtre pop-up appelée "Options de séquence" apparaît à l'écran. Cliquez sur "OK"; La séquence d'images s'ouvrira.
    2. Définissez l'intervalle de trame de la vidéo d'image en cliquant sur "Image" et sélectionnez "Propriétés" pour les mesures de vitesse. Ici, il est 8.8 framEs / s.
    3. Ouvrez le plugin MTrackJ en sélectionnant "Plugins". Sélectionnez "Suivi", puis sélectionnez "MtrackJ". Un menu devrait apparaître.
    4. Pour ajuster les paramètres de suivi, sélectionnez "Suivi" (sous le menu) et cochez la case "Déplacer vers l'index de la prochaine période après ajout du point".
    5. Suivre la première cellule.
      1. Localisez une cellule et tracez la même cellule dans les images suivantes. Dans le menu, cliquez sur "Ajouter" pour ajouter une nouvelle piste.
      2. Passez le curseur sur l'image (signe +) et cliquez sur la cellule appropriée.
        REMARQUE: MTrackJ passe automatiquement au prochain intervalle et ajoute un petit cercle, marquant la position du premier point de la trajectoire.
      3. Continuez à cliquer sur la position actuelle de la cellule tout en parcourant les images de la séquence de l'image.
        REMARQUE: de temps en temps, les cercles qui marquent les points précédents de la trajectoire interfèrent avec la capacité de visualiser l'emplacement actuel. Si cela se produit,Passez à l'étape 2.3.5.3.1.
        1. Changez l'option d'affichage pour la trajectoire en cliquant sur "Afficher" dans le menu et en sélectionnant l'option "afficher uniquement les points de suivi à l'heure actuelle". Pour voir toutes les trajectoires, désélectionnez cette option.
      4. Continuez à cliquer jusqu'à ce que la trajectoire de la première cellule soit visible. Ensuite, enregistrez la piste en cliquant sur "Enregistrer".
    6. Suivre la deuxième cellule.
      1. Dans le menu, cliquez sur "Ajouter" pour lancer une nouvelle piste. Répétez les étapes 2.3.5.1 - 2.3.5.4 pour suivre la nouvelle cellule. Cliquez sur "Enregistrer" pour enregistrer la deuxième piste.
      2. Continuez ces étapes pour toutes les cellules à traquer observées. Après avoir suivi les cellules, cliquez sur "Mesurer" et "OK" dans l'onglet du menu pour obtenir les résultats.
        REMARQUE: Une fenêtre de résultats s'ouvre automatiquement, qui peut être sauvegardée et ouverte dans une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie.

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Representative Results

Les érythrocytes marqués avec ICG à 1,5% ont été visualisés dans la circulation rétinienne de souris C57BL / 6J (type sauvage). L'hématocrite à 1% et à 5% des érythrocytes marqués au ICG à 1,5% se distingue par la circulation de la rétine. Cependant, les cellules étiquetées individuelles ont été visualisées plus clairement avec 1% d'hématocrite d'érythrocytes marqués ICG à 1,5% ( figure 1 ). Dans 5% d'hématocrite, en raison du grand nombre de cellules marquées dans les vaisseaux rétiniens, il n'était pas possible de marquer la cellule individuelle. Une certaine érythrothase a été observée dans la région peripapillaire dans les deux conditions, mais elle était plus importante dans l'hématocrite de 5% des érythrocytes marqués ( figure 2 ).

Les leucocytes ont été étiquetés avec succès avec 1% de fluorescéine de sodium suivant le protocole ci-dessus et ont été visualisés sous forme de cellules marquées au vert en utilisant la microscopie fluorescente ( Class = "xfig"> Figure 3). De petits groupes de cellules (4 à 5 cellules ensemble) ont également été observés dans des échantillons marqués. Lorsque les cellules ont été injectées dans la circulation de la souris, les leucocytes marqués ont été visualisés dans la circulation de la rétine ( Figure 4 ). Après l'étiquetage, les érythrocytes et les leucocytes ont été immédiatement injectés dans les souris et ont été visualisés à des intervalles de temps de 30 et 60 minutes. Les cellules marquées par fluorescence ont été observées immédiatement après l'injection, mais les intensités de fluorescence ont progressivement diminué à des intervalles de temps de 30 et 60 minutes. Nous avons également utilisé le protocole de coloration des leucocytes (1% de fluorescéine de sodium) sur les érythrocytes et nous n'avons observé aucun étiquetage des érythrocytes. En utilisant le plugin Mtrack J sur le logiciel de domaine public Image J, les cellules ont été suivies dans la circulation de la rétine ( figure 5 ).

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Figure 1 : 1% d'hématocrite d'érythrocytes étiquetés ICG à 1,5% dans la circulation rétinienne. L'ICG a identifié des érythrocytes individuels affichant des signaux lumineux dans les vaisseaux rétiniens. Une certaine érythrostase a été observée dans la région peripapillaire. Echelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : 5% d'hématocrite d'érythrocytes étiquetés ICG à 1,5% dans la circulation rétinienne. Beaucoup d'érythrocytes marqués par ICG affichant des signaux lumineux dans les vaisseaux rétiniens; Une grande quantité d'érythrostasie a été observée dans la région peripapillaire. Échelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3 : Microscopie à fluorescence Image de 1% de leucocytes labellés à la fluorescéine de sodium. Les leucocytes marqués par la fluorescéine au sodium montrant des signaux fluorescents verts avec de petites grappes (grossissement 20X, échelle = 50 μm). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : 1% de leucocytes étiquetés à la fluorescéine de sodium dans la circulation rétinienne. Leucocyte marqué par la fluorescéine au sodium (flèche) montrant un signal lumineux dans les vaisseaux rétiniens. Echelle = 200 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Suivi des cellules individuelles étiquetées dans la circulation de la rétine à l'aide du logiciel d'analyse d'image. Des pistes différentes (cercles colorés et lignes représentés sur l'image) ont été mesurées pour calculer la vitesse moyenne des cellules marquées dans la circulation de la rétine.

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Discussion

L'étude de l'hémodynamique dans la circulation rétinienne et choroïdienne est essentielle pour comprendre la pathophysiologie de nombreuses maladies oculaires. La dynamique du flux sanguin dans la circulation de la rétine peut être étudiée par tomographie par cohérence optique à Fourier (FD-OCT), par laser speckle flowgraphy (LSFG) et par oxymétrie rétinienne. Bien que ces méthodes utilisent différentes approches pour étudier le flux sanguin total dans la circulation de la rétine 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45 , elles partagent la limitation de l'incapacité d'étudier la dynamique de l'écoulement des types de cellules individuelles. Les nutriments et l'apport d'oxygène aux tissus rétiniens et choroïdaux, ainsi que la migration des cellules immunitaires dans les maladies inflammatoires oculaires et leur rôle dans la pathogénèse de la maladie, peuvent être étudiés en étudiant la dynamique des flux d'erYthrocytes et leucocytes dans la circulation rétinienne et choroïde, respectivement. Les techniques d'étiquetage associées aux méthodes d'imagerie aideront à suivre les cellules marquées dans la circulation et à étudier la dynamique des cellules étiquetées. Plusieurs colorants fluorescents ont été appliqués avec succès pour étiqueter les leucocytes et les érythrocytes pour l'étude de leur dynamique d'écoulement dans la circulation 3 , 17 , 18 , 19 .

Ici, nous signalons l'application de colorants fluorescents non toxiques approuvés par l'Administration des aliments et drogues, de l'indocyanine verte et de la fluorescéine de sodium, pour l'étiquetage et la visualisation des érythrocytes et des leucocytes dans la circulation de la rétine, respectivement. Bien que la fluorescéine sodique soit le colorant le plus couramment utilisé pour le suivi des leucocytes 31 , 32 , 33 34 , l'avantage de marquer simultanément les érythrocytes et les leucocytes avec ICG et la fluorescéine de sodium, respectivement, est une visualisation efficace des cellules marquées simultanément dans l'œil de l'animal en changeant les filtres dans le SLO. SLO est une méthode non invasive d'imagerie rétinienne qui est largement utilisée dans l'étude de changements pathologiques dans diverses maladies de la rétine chez les humains et les animaux. Il peut également aider à comparer les changements de la rétine en réponse à un traitement donné 46 .

Pour obtenir des images de qualité dans le SLO, les pupilles doivent être complètement dilatées et les lentilles de contact doivent être utilisées avec du gel ophtalmique pour maintenir une cornée humide et prévenir la formation de la cataracte. La position des yeux et le chemin optique de la caméra doivent être directement pour obtenir des images de fondus et des angiogrammes de qualité. L'animal doit être profondément sédatif pour minimiser les mouvements pendant l'imagerie. Bien que 1% et 5% d'hématocrite de 1,5% ICGLes érythrocytes marqués ont démontré la visualisation de cellules marquées par fluorescence dans la circulation de la rétine, 1% d'hématocrite était mieux adapté pour surveiller les cellules individuelles. Les cellules marquées par fluorescence ne peuvent être visualisées si le nombre de leucocytes injectés est trop faible. Par conséquent, pour obtenir de meilleurs résultats dans la surveillance des cellules marquées dans la circulation de la rétine, il est recommandé de collecter des leucocytes d'au moins 4 souris, d'étiqueter avec 1% de fluorescéine de sodium et d'injecter dans une seule souris. Bien qu'il existe des colorants alternatifs pour la fluorescéine de sodium (Calcein, FITC, DIO, FDA et CFDA avec maximum d'absorption / émission semblable ou proche de la fluorescéine de sodium), le taux de rétention des colorants et la toxicité des tissus oculaires doivent être évalués 9 , 12 , 13 , 14 , 17 .

La limitation de la technique rapportée est laDécoloration du signal fluorescent en circulation après 60 min. Par conséquent, la dynamique d'écoulement des cellules marquées doit être analysée dans les 60 minutes. Ici, pour étiqueter les leucocytes, le sang a été retiré d'une souris, les cellules ont été isolées, étiquetées, injectées dans une autre souris et visualisées par SLO. Cependant, dans SLO, seulement 0 à 1 cellule par cadre a été observée dans les vaisseaux sanguins rétiniens. Cela pourrait être dû à un nombre insuffisant de cellules de leucocytes et nous recommandons donc de recueillir du sang d'au moins 3 à 4 souris pour visualiser un nombre de cellules plus élevé par trame. La vitesse de la caméra de 8,8 images / s a ​​été utilisée dans l'étude, mais cela pourrait être augmenté pour obtenir plus d'images et de vidéos séquentielles des cellules marquées.

Des études antérieures ont rapporté des changements dans la vitesse du flux sanguin dans la circulation rétinienne des patients diabétiques avec différents stades de DR. Clermont et al. Ont rapporté une diminution de 33% du débit sanguin de la rétine chez les patients ayant un stade précoce de la DR 47 et Nguyen etAl. Ont signalé une augmentation du flux sanguin de la rétine chez les patients diabétiques atteints de prolifération DR 48 . Une diminution de la vitesse d'écoulement sanguin était également associée au glaucome progressif 49 . Dans les études susmentionnées, les auteurs ont étudié l'ensemble des vitesses sanguines dans la circulation de la rétine. L'étude des vitesses d'écoulement de chaque type de cellule peut fournir des informations sur les interactions cellulaires dans différentes maladies et à différents stades de la maladie et peuvent contribuer au pronostic. Ici, nous rapportons une méthode pour étiqueter les érythrocytes et les leucocytes avec ICG et la fluorescéine de sodium, respectivement, et leur visualisation dans la circulation de la rétine; Cette méthode peut être appliquée sur tout modèle de maladie pour les études in vivo .

Les recherches futures peuvent utiliser nos techniques d'étiquetage en utilisant SLO pour étudier la variation de la dynamique des écosystèmes et des leucocytes marqués sous différentes conditions de traitement médicamenteuxÀ différents stades de la maladie. En outre, nos méthodes peuvent aider à comprendre le rôle des érythrocytes et des leucocytes dans les phénotypes de la maladie.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler. Aucun conflit financier ou financier.

Acknowledgements

Le projet de recherche a été financé dans le cadre de la subvention du nouveau chercheur du National Medical Research Council (NMRC), à Singapour. L'équipe souhaitera reconnaître la formation de recherche fournie au docteur Agrawal à l'Institut d'ophtalmologie (IOO), au collège universitaire de Londres (UCL) au titre de la bourse de formation en recherche outre-mer du Conseil national de recherches médicales (NMRC) de novembre 2012 à octobre 2014 sous mentorat du Prof. David Shima. Le Dr Agrawal a acquis le concept et les compétences pour l'étiquetage des cellules et l'imagerie en direct dans le laboratoire du Dr Shima. L'équipe souhaitera donc reconnaître la supervision et l'orientation lors de la bourse de formation du Prof. David Shima, Pro.f Kenith Meissner, Dr. Peter Lundh et Dr. Daiju Iwata.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cardiogreen polymethine dye (Indocyanine green) Sigma Aldrich 12633-50MG
Fluorescein 100 mg/mL Novartis U1705A/H-1330292
10x Phosphate-buffered saline (PBS) Ultra Pure Grade 1st BASE BUF-2040-10X1L
Bovine serum albumin Sigma Aldrich A7906-100G
Microtainer tubes with K2E (K2EDTA) - EDTA concentration - 1.8 mg/mL of blood BD, USA REF 365974
Histopaque 1077 solution Sigma Aldrich 10771
Centrifuge 5810 R Eppendorf 05-413-401
Microcentrifuge tubes 2 mL Axygen MCT-200-C-S
Vortex mixer Insta BioAnalytik pte. ltd FINE VORTEX
Shaker incubator Lab Tech
Ceva Ketamine injection (Ketamine hydrochloride 100 mg/mL) Ceva KETALAB03
ILIUM XYLAZIL-20 (Xylazine hydrochloride 20 mg/Ml) Troy Laboratories PTY. Limited LI0605
1% Mydriacyl 15 mL (Tropicamide 1%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0355-15
2.5% Mydfrin 5 mL (Phenylephrine hydrochloride 2.5%) Alcon Laboratories, Inc. USA NDC 0998-0342-05
Terumo syringe with needle 1 cc/mL Tuberculin Terumo (Philippenes) Corporation, Philippines SS-01T2613
Vidisic Gel 10 G Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, Berlin, Germany
Alcohol swabs Assure medical disposables 7M-004-L-01
Confocal laser scanning angiography system (Heidelberg Retina Angiograph 2) Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Hiedelberg Spectralis Viewing Module software, v4.0 Heidelberg Engineering, GmbH, Heidelberg, Germany
Fluorescent microscope ZEISS Model: axio imager z1

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