Estrazione e purificazione di polifenoli da polvere di bacche congelata per il trattamento di cellule muscolari lisce vascolari

Chemistry

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Summary

Questo lavoro descrive un metodo passo-passo per preparare estratti ricchi di polifenoli dalla polvere di bacche congelata. Inoltre, fornisce una descrizione approfondita di come utilizzare questi estratti ricchi di polifenoli nella coltura cellulare in presenza dell'ormone peptidico angiotensino II (Ang II) utilizzando cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs).

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Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

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Abstract

Gli studi epidemiologici indicano che l'aumento dell'assunzione di flavonoidi è correlato alla diminuzione della mortalità dovuta a malattie cardiovascolari (CVD) negli Stati Uniti (Stati Uniti) e in Europa. Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno un elevato contenuto polifenolico. I polifenoli hanno dimostrato di interagire con molti obiettivi molecolari e di esercitare numerose funzioni biologiche positive, inclusi gli effetti antiossidanti, antinfiammatori e cardioprotettivi. I polifenoli isolati dalla mora (BL), dal lampone (RB) e dal lampone nero (BRB) riducono lo stress ossidativo e la senescenza cellulare in risposta all'angiotensina II (Ang II). Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata del protocollo utilizzato per preparare gli estratti di polifenoli da bacche congelate. Le estrazioni di polifenoli dalla polvere di bacche congelata sono state eseguite utilizzando l'etanolo acquoso al 80% ed un metodo di estrazione ad ultrasuoni. L'estratto grezzo è stato ulteriormente purificato e frazionato utilizzando cloroformio e acetato di etile,rispettivamente. Gli effetti di entrambi gli estratti grezzi e purificati sono stati testati su cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) in coltura.

Introduction

I polifenoli sono composti che contengono almeno un anello fenolico nella loro struttura e sono abbondantemente presenti nel regno vegetale 1 . Gli esseri umani hanno consumato piante per millenni per scopi medicinali senza essere consapevoli dell'esistenza di tali composti 2 . Molti frutti e verdure hanno alcuni composti polifenolici condivisi, anche se con quantità diverse, tra cui flavonoidi, stilbene e acidi fenolici 3 . Anche se i polifenoli sono spesso associati a frutta e verdura colorati, questo non è strettamente vero. Ad esempio, zeaxantina e xantina sono presenti nelle verdure che non sono molto colorate, come le cipolle e l'aglio, provenienti dalla famiglia di scalloni e sono associati a numerosi benefici per la salute 4 . Oltre ad essere associati a numerosi vantaggi sanitari 5 , i polifenoli servono anche le piante proteggendole dagli insettiD radiazione ultravioletta 2 . I polifenoli si trovano comunemente nella dieta umana e sono considerati potenti antiossidanti, in quanto possono scavare le specie reattive di ossigeno (ROS) 6 , 7 , 8 . Hanno anche antinfiammatori 9 , antimicrobici 10 , antipertensivi 11 e 12 , 13 proprietà anti-cancerogene.

Gli studi epidemiologici dimostrano un'associazione inversa tra il consumo di flavonoidi e la malattia cardiovascolare (CVD) 16 , 17 e la mortalità 14 , 15 . Le bacche sono ampiamente consumate negli Stati Uniti e hanno elevate quantità di polifenoli, compresi i flavonoidi. Ad esempio, il consumo di succo di mora (BL) (300 Ml / d) per otto settimane ha significativamente ridotto la pressione sistolica nei pazienti dislipidemici 18 . Jeong et al. 19 riportarono che gli uomini e le donne pre-ipertensivi che consumavano 2,5 g di estratto di lampone nero (BRB) al giorno avevano una pressione arteriosa più bassa di 24 ore e di notte rispetto a quelle che consumavano un placebo. Raspberries (RB) ha ridotto la pressione sanguigna mentre aumenta l'espressione di superossido dismutasi (SOD) in ratti spontaneamente ipertensivi 20 . Recentemente è stato dimostrato che BL, RB e BRB riducono i livelli di ROS e senescenza indotti da angiotensina II (Ang II) in cellule muscolari lisce vascolari (VSMCs) 21 . Inoltre, la frazione di antocianina dall'estratto BL ha ridotto l'espressione di sintesi dell'ossido nitrico induttivo (iNOS) e ha inibito l'attività del fattore nucleare kappa B (NF-κB) e della chinasi extracellulare-regolata (ERK) nel lipopolisaccaride (LPS) stimolata J774 celluleAss = "xref"> 22. Gli estratti BRB hanno ridotto l'attivazione di NF-κB e l'espressione cicloossigenasi 2 (COX-2) in vitro 23 , ha migliorato il profilo lipidico e ha impedito la formazione di lesioni aterosclerosi nei topi alimentati ad una dieta ad alto contenuto di grassi 24 . Le antocianine, considerate i flavonoidi più abbondanti nelle bacche, modulano la risposta infiammatoria nei macrofagi RAW 264.7 stimolati da LPS diminuendo la produzione di alfa TNF-α 25 e diminuendo la proliferazione e la migrazione di VSMCs 26 .

Dal momento che è cresciuto interesse a capire il ruolo dei polifenoli nella salute umana e nelle malattie, è importante ottimizzare il metodo di estrazione. L'estrazione del solvente è ampiamente utilizzata per questo scopo, in quanto è conveniente e facilmente riproducibile. In questo studio, è stata utilizzata un'estrazione di solvente con l'etanolo, insieme ad un estratto ad ultrasuoniN, che è stato adattato da Kim e Lee 27 . La purificazione e la frazionamento di estratti grezzi (CE) utilizzando cloroformio e acetato di etile sono state eseguite per ottenere la frazione di estratto purificato (PE) che è stato adattato da Queires et al 28 . Inoltre, sono stati confrontati l'efficacia degli estratti di polifenoli grezzi e purificati da BL alla riduzione della fosforilazione basale di ERK1 / 2 e sono stati forniti esempi rappresentativi dell'effetto inibitorio dell'estratto policifenolo BL purificato sulle riduzioni di segnalazione induciate da Ang II in VSMCs.

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Protocol

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparare l'etanolo 80% (100 mL) mescolando 80 mL di etanolo assoluto (grado di biologia molecolare) e 20 mL di acqua sterile a coltura cellulare.
  2. Per preparare l'estratto di polifenolo (10 mg / ml), pesare 10 mg di CE o PE. Aggiungere 1 ml di pianta Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sotto un cofano di cultura cellulare. Vortice la soluzione. Aliquota in porzioni da 200 μl e conservare a -20 ° C.
  3. Preparare il buffer di lisi.
    1. Aggiungere 5 ml di soluzione 1 M di base di HEPES (pH 7,4, 50 mM finale), 1 ml di soluzione a base di 5 M NaCl (finale di 50 mM), 1 ml di 0,5 M soluzione EDTA (5 mM finale), 2 ml di 0,5 Soluzione finale di M NaF (10 mM finale), 286 μL di 700 mM soluzione a base di Na 3 VO 4 (finale di 2 mM), 5 ml di soluzione a base di 200 mM Na 4 P 2 O 7 (10 mM finale) e 5 ml di Soluzione di stock di 20% Triton-X-100 preparata in acqua (finale 1%). Aggiungere acqua per raggiungere un volume di 100 mL. Tenere a 4 ° C.
  4. Preparare il buffer di campionamento Laemmli (4x).
    1. Aggiungere 31,25 ml di soluzione a base di 2 M Tris (pH 6,8), 100 ml di glicerolo, 50 ml di una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) al 20% preparata in acqua e 50 ml di β-mercaptoetanolo. Aggiungere acqua fino a 250 ml. Tenere a 4 ° C.
  5. Per preparare il tampone Tris-Buffered Saline (TBS), pesare 3 g di Tris (25 mM finale), 0,18 g di KCl (2,5 mM finale) e 8,76 g di NaCl (150 mM finale). Regolare il pH a 7,4 e aggiungere acqua fino a 1 L. Tenere a RT.
  6. Per preparare TBS-T, aggiungere 997,5 ml di TBS e 2,5 ml di una soluzione al 20% di Triton-X-100 preparata in acqua. Tenere a RT.

2. Preparazione degli estratti di Blackerry

  1. Preparazione di estratto grezzo dalla polvere di bacche congelata.
    1. Pesare 10 g di polvere di mirtillo congelato (o 5 g di polvere fresca). Se viene utilizzato frutto congelato, tagliarlo iIn pezzi molto piccoli prima di iniziare l'estrazione.
    2. Mescolare la polvere di frutta con 100 ml di etanolo acquoso 80% in un pallone Erlenmeyer da 1 litro rotondo.
    3. Sonicare la miscela per 20 minuti a 42 kHz, 135 W utilizzando un bagno a ultrasuoni a 25 ° C, senza intervallo di tempo tra. Effettuare la sonicazione con continuo azoto azionato in luce sottomessa. Per la frutta congelata, aumentare il tempo di incubazione a 4 ore.
    4. Filtrare la miscela attraverso una carta filtrante # 2 utilizzando un imbuto raffreddato Buchner con aspirazione a vuoto.
      NOTA: Alla fine di questo passaggio, i residui del campione appaiono sulla carta del filtro; Questo è chiamato torta di filtro.
    5. Sciacquare la torta filtrante con 50 ml di etanolo al 100%. Salvare il filtrato e aggiungere la torta filtrante a una tazza da 1 L contenente 100 mL di etanolo acquoso 80%.
    6. Ripetere il processo di estrazione del residuo (punti 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Combinare i due filtrati in un pallone a tondo con un ulteriore 50 mLDel 80% di etanolo acquoso.
      NOTA: Il volume finale deve essere di circa 300 ml.
    8. Utilizzare un evaporatore rotativo a 62 ° C e 50 giri / min per evaporare il solvente. Continuare questo processo fino a quando l'etanolo non si evapora più.
      NOTA: Questo processo dura circa 45 minuti.
    9. Trasferire il campione in un tubo conico da 50 ml. Evaporare l'etanolo iniettando gas azoto nella parte superiore del tubo per 10 min.
      NOTA: Questo passaggio è necessario per garantire l'evaporazione completa dell'etanolo. Il volume del campione a questo punto è di circa 20 ml.
    10. Freeze il campione a -80 ° C per almeno 24 h.
      NOTA: questo passaggio è necessario per consentire un più efficiente processo di essiccazione a congelamento.
    11. Asciugare il campione a -50 ° C per circa 8 ore. Conservare i campioni a -20 ° C.
      NOTA: L'essiccatore a congelatore crea un vuoto potente a -50 ° C all'interno della camera per asciugare i campioni ma conserva la maggior parte dei composti, come il polipheNOLS.
  2. Preparazione di estratti polifenolici purificati da estratti grezzi.
    1. Pesare i campioni estratti congelati.
      NOTA: Il volume dell'estratto a questo punto è di circa 10 ml.
    2. Aggiungere due volumi (~ 20 mL) di cloroformio all'estratto grezzo e agitare la soluzione per 5 minuti in una mescola.
    3. Versare la miscela in un imbuto separatore. Lasciare decantare l'estratto grezzo per 1 h in RT per ottenere la frazione purificata.
      NOTA: A questo passo si forma una miscela a due fasi.
    4. Scartare lo strato inferiore (fase di cloroformio) dall'imbuto di separazione e raccogliere lo strato acquoso in un bicchiere pulito.
    5. Aggiungere due volumi di acetato di etile alla frazione acquosa e utilizzare una barra magnetica per mescolare la miscela per 5 minuti a RT.
    6. Filtrare la miscela con carta filtrante # 2 usando un imbuto raffreddato Buchner con aspirazione sotto vuoto.
    7. Raccogliere il campione filtrato e trasferirlo in un pallone a tondina per essere noiCon l'evaporatore rotativo.
    8. Impostare l'evaporatore rotativo a 62 ° C e 50 rpm ed evaporare l'acetato di etile per circa 30 minuti.
    9. Asciugare il campione a -50 ° C per circa 8 ore. Trasferire il campione in un tubo conico da 50 ml e conservarlo a -20 ° C.

3. Trattamento di VSMC con estratti di Berry

  1. VSMCs cultura.
    1. Isolare VSMC dalle aortas toraciche dei ratti di Sprague-Dawley eseguendo una digestione enzimatica, come descritto in precedenza 29 . Coltivare i VSMC come descritto 29 .
    2. Preparare un mezzo completo per la coltura di VSMC usando DMEM contenente 1 g / L di glucosio e completato con 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 100 U / mL penicillina, 100 mg / mL streptomicina e 2 mM L-glutamina. Conservare il supporto completo a 4 ° C.
  2. Incubazione di VSMC con estratti di polifenoli.
    1. Per dividere i VSMC, scartare il cultuRe e lavare le cellule due volte con soluzione salina fosfatizzata (PBS). Aggiungere 4 mL di PBS e 2 mL di EDP 0,25% di tripsina. Incubare le cellule per 5 min a 37 ° C in un incubatore di CO 2 .
      1. Raccogliere le cellule, mescolarle con 2 ml di mezzo completo in un tubo centrifugo da 15 ml e centrifugare a 1100 g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare con 1 ml di PBS. Conta le cellule usando un emocitometro.
      2. Sezionare 50.000 VSMCs per pozzetto in piastre di coltura a 6 pozzetti e svilupparle in un mezzo completo contenente il 10% di FBS fino a raggiungere il 90% di confluenza (circa 3 d). Mantenere i VSMC a 37 ° C in un incubatore di umidità del 5% CO 2 .
    2. Preparare il mezzo per il trattamento utilizzando un mezzo di DMEM contenente 1 g / L di glucosio, 100 U / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina, 2 mM di L-glutammina e 0,5% di FBS. Conservare il supporto di trattamento a 4 ° C.
      NOTA: Estratti di polifenoli e Ang II vengono aggiunti direttamente alle cellule utilizzando questo medium.
    3. Preparare una soluzione di base di 10 mg / ml di estratto grezzo (CE) o di estratto purificato (PE) di polifenoli sciogliendo 10 mg di estratto in 1 ml di mezzo DMEM normale. Conservare le azione in aliquote da 200 μL a -20 ° C.
    4. Incubare i VSMC con 2 ml di terreno di trattamento contenente 0,5% di FBS e aggiungere estratti CE o PE per ottenere una concentrazione di 50-500 μg / ml. Cambiare il supporto ogni 24 h aggiungendo estratti di polifenoli freschi. Trattare le cellule per 3 d.
    5. Per il trattamento con Ang II o altri ormoni e fattori di crescita, affamati le cellule per almeno 24 ore incubando le cellule con terreno di trattamento contenente 0,5% di FBS prima dell'aggiunta di Ang II (100 nM).
      NOTA: Si raccomanda l'incubazione con e senza CE e PE nel mezzo di trattamento FBS di 0,5% prima dell'aggiunta di Ang II.
      1. Dopo 24 ore di fame, aggiungere 100 nM Ang II. Sostituire il terreno di trattamento con fresco CE, PE o Ang II ogni 24 ore per 3 d.
  3. Preparazione di campioni di cellule.
    1. Lavare le cellule trattate due volte in PBS freddo e lipezzare con 200 μl di tampone di lisi sul ghiaccio.
    2. Raccogli i lisati delle cellule usando i raschiatori di cellule e trasferendo i lisati in tubi di microcentrifuga da 1,5 mL. Incubare i lisati cellulari totali per 20 minuti su ghiaccio e vortex ogni 5 min.
    3. Sonicare l'estratto delle cellule con tre bursts a 125 W per 10 s ciascuno, con una pausa di 2 s in mezzo. Tenere i campioni in ghiaccio per tutta la sonicazione.
    4. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un reagente di analisi proteica a 595 nm.
    5. Conservare i campioni a -20 ° C per l'analisi mediante blot western.
  4. Western blot.
    1. Mescolare uguali quantità di proteine ​​(circa 50 μg) dai campioni trattati non trattati e trattati con polifenoli o trattati con Ang II con tampone di lisi per ottenere un volume totale massimo di 50 μL. Aggiungere 16 μl di un tampone di campione 4x Laemmli. Riscaldare i campioni per 5 minuti a 75 ° C.
    2. Separare il campioneIn 10% di gel SDS-PAGE e trasferirli a membrane PDVF a 10 V per 75 minuti in un sistema di trasferimento semi-secco per analisi Western blot con anticorpi specifici.
    3. Bloccare la membrana con 2% di latte in TBS 0.05% Triton-X100 buffer (TBS-T) per 20 minuti.
    4. Rimuovere il latte lavando la membrana almeno tre volte con TBS (5 min ciascuno) e incubare con anticorpi primari per 1 h a RT o O / N a 4 ° C.
    5. Lavare la membrana tre volte, 10 minuti ciascuno, con TBS-T e incubare con un anticorpo secondario collegato HRP per 45 min.
    6. Lavare la membrana tre volte, 10 minuti ciascuno, con TBS-T e sviluppare mediante chemiluminescenza aumentata (ECL).

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Representative Results

È stato dimostrato in precedenza che gli estratti di polifenoli isolati da BL, RB e BRB hanno ridotto la senescenza dei VSMC in risposta a Ang II 21 . È stato dimostrato che questi estratti polifenolici purificati modulano la segnalazione di Ang II riducendo la fosforilazione di Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) e ERK1 / 2. BL impedisce la senescenza riducendo l'espressione della NADPH ossidasi (Nox) 1, un enzima che produce anioni superossidiche e fortemente regolato da Ang II. Al contrario, RB e BRB prevengono la senescenza da un meccanismo indipendente da Nox1, aumentando l'espressione degli enzimi antiossidanti SOD1, SOD2 e glutatione perossidasi 1 (GPx-1). BL non aumenta l'espressione di SOD2, mentre nessuno degli estratti attenua la downregulation della catalasi da Ang II 21 . BL è stato concentrato per determinare se la mancanza di effetto di BL su SOD2 e l'espressione catalasi potrebbeSi spiega con una perdita di composti polifenolici durante il processo di purificazione o da una concentrazione insufficiente di un certo composto polifenolico nell'estratto. VSMCs sono stati incubati con 50-500 μg / mL CE ( Figura 1A ) o PE ( Figura 1B ) in mezzo contenente 0,5% FBS per tre giorni. Né CE né PE hanno aumentato i livelli di SOD2 o catalasi a nessuna delle concentrazioni testate. Come controllo positivo, è stata misurata la fosforilazione di ERK1 / 2 e si è scoperto che CE ha ridotto la fosforilazione di questa chinasi a concentrazioni superiori a 300 μg / mL. Al contrario, PE era efficace a circa 100 μg / mL ( Figura 1B ). Sono stati osservati bassi livelli di fosforilazione a concentrazioni di 200-500 μg / mL. Questi dati supportano l'osservazione precedente che dimostra che 200 μg / mL BL PE è sufficiente a ridurre la segnalazione Ang II 21 . Questi risultati suggeriscono che concentrazioni superiori di polifenolo cOmpounds in PE, rispetto a CE, potrebbe spiegare la maggiore efficienza di questo estratto a ridurre la fosforilazione ERK1 / 2. Per testare questa idea, sono state confrontate le composizioni polifenoliche di entrambi gli estratti. L'identificazione e la quantificazione dei composti polifenolici in CE sono stati eseguiti mediante HPLC, come descritto in precedenza 21 ( Tabella 1 ). L'acido 3- O- caffeochinico e il quercetina erano presenti a livelli più alti in PE rispetto a CE, mentre l'acido ferulico e il rutin erano stati trovati solo in CE. Successivamente, VSMCs sono stati trattati con 200 μg / mL BL PE per 24 ore prima dell'aggiunta di 100 nM Ang II ( Figura 1C ). Come riportato in precedenza 21 , l'estratto di polifenolo BL ha ridotto la fosforilazione ERK1 / 2 indotta da Ang II, ma non ha dimostrato alcun effetto sulla espressione catalasi e SOD2.

Figura 1
B ) o 200 μg / mL PE ( C ) % FEM DMEM medium per 3 d. C ) Dopo 24 ore di incubazione con BL PE, è stato aggiunto Ang II (100 nM) e le cellule sono state incubate per 3 d. Il mezzo, con estratti freschi e Ang II, è stato cambiato ogni giorno. Le cellule sono state quindi lavate e lisate e gli estratti cellulari totali sono stati separati in 10% di PAGE-SDS gel. Le macchie Western sono state testate con anticorpi coniglio contro ERK1 / 2 (Thr 202 / Tyr 204) fosforilato, ERK1 / 2, catalasi e SOD2 e topo anticorpo contro β-actina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analitici (ppm) PE CE
Acidi fenolici
acido gallico 243.5 321,9
P-coumarico 32.9 46.5
Acido ferulico - 236,5
Acidi clorogenici
3-O-caffeoilchinico 235.3 170.5
4-O-caffeoilchinico 13 76.9
5-O-caffeoilchinico 14.1 49,9
FLAVONOIDI
flavonoli
La quercetina 95 24.5
flavanoni
Rutina - 37.8

Tabella 1: Analisi della composizione polifenolica di Blackberry in estratto crudo e polifenolo-purificato. Gli acidi fenolici ei flavonoidi in Estratto Crudo (CE) e Estratto Purificato (PE) sono stati analizzati utilizzando High Performance Chromatography Liquid (HPLC). La concentrazione di analiti è espressa in ppm. La composizione dei polifenoli in BL PE è stata recentemente pubblicata 21 e aggiunta alla tabella da confrontare con CE.

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Discussion

I polifenoli isolati dalle bacche contengono composizioni distinte. Il protocollo di estrazione a base di etanolo qui descritto ha permesso di identificare diversi livelli di acidi fenolici e flavonoidi presenti nei grezzi e purificati estratti polifenolici di BL ( Tabella 1 ). CE è stata arricchita in acido gallico, acido ferulico, acido 4-O-caffeoilchinico e acido 5-O-caffeoilchinico. Il processo di purificazione non alterava significativamente i livelli di acido gallico e acido p-cumarico. Tuttavia, ha aumentato i livelli di acido 3- O- caffeoilchinico da 170,5-235,3 ppm e da quercetina da 24,5 a 95 ppm. Al contrario, l'acido ferulico e il routine sono stati persi durante la purificazione del CE.

Il trattamento di VSMC con 50-500 μg / mL di CE e PE ha mostrato che entrambi gli estratti erano efficaci nella riduzione della fosforilazione basale di ERK1 / 2. Tuttavia, PE ha mostrato una più forte riduzione della regolazione nell'attività di questa chinasi a una concentrazione inferiore:181; g / mL per PE rispetto a 400-500 μg / mL per CE. Questi risultati possono riflettere la concentrazione più elevata di acido 3- O- caffeochinico o quercetina presente in PE. L'uso di composti fenolici individuali nelle cellule in coltura è necessario per identificare i composti specifici responsabili della riduzione della fecoliazione ERK1 / 2.

La diminuzione dell'attività delle chinasi di segnalazione, inclusi Akt, ERK1 / 2 e p38MAPK, causati da polifenoli purificati isolati da BL, RB e BRB 21 e ERK1 / 2 causati da BL CE, qui illustrati, è d'accordo con Rapporti precedenti. Per esempio, gli estratti di polifenoli isolati dal mirtillo riducono la crescita tumorale delle cellule tumorali mammarie, in parte riducendo l'attività di Akt e ERK1 / 2 30 . Come detto in precedenza, queste chinasi sono coinvolte anche nell'induzione della senescenza cellulare da Ang II 21 , suggerendo che i polifenoli da BL, RB e BRB shoulD ridurre l'invecchiamento vascolare e la disfunzione associata a CVD.

Come abbiamo riportato in precedenza 21 , la catalasi e l'espressione SOD2 non sono state regolate da PE, anche a concentrazioni fino a 500 μg / mL. Poiché CE era anche inefficace per aumentare la catalasi e l'espressione di SOD2, questi dati suggeriscono che i composti fenolici persi durante il protocollo di purificazione non sono coinvolti nella regolazione di questi enzimi antiossidanti. Questi dati suggeriscono inoltre che il protocollo di purificazione mostrato qui effettivamente composti fenolici concentrati pertinenti alla regolazione del segnale Ang II, dello stress ossidativo e della senescenza cellulare. Ad esempio, i risultati rappresentativi mostrano che la PE ha fortemente ridotto la fosforilazione ERK1 / 2 indotta da Ang II. La valutazione della fosforilazione di questa chinasi è rilevante in quanto l'inibizione dell'attività ERK1 / 2 ha impedito la senescenza cellulare indotta da Ang II.

In tErms di modifiche ai protocolli precedenti, qui è stata aggiunta una sonicazione per aumentare la resa di estrazione per CE. Inoltre, per la purificazione di polifenoli, invece di utilizzare una cartuccia C18, come descritto da Kim e Lee 27 , un metodo più tradizionale di Queires et al . 28 è stata adottata qui. Una fase di filtrazione, utilizzando carta filtrante per rimuovere le impurità, è stata aggiunta alla purificazione della sezione polifenolica. In termini di limitazioni, i passaggi di sonicazione e di evaporazione devono essere attentamente monitorati in base al tipo di strumento utilizzato, poiché la durata e la temperatura della sonicazione e dell'evaporazione sono i passi critici di questo protocollo. Le modifiche aggiunte a questo metodo hanno determinato la resa massima dei polifenoli rispetto ai metodi precedenti 27 , 28 utilizzati nel nostro laboratorio (dati non mostrati), probabilmente a causa dell'aggiunta di una fase di sonicazione. Come mentiNella sezione protocollo, questo protocollo può essere utilizzato per la polvere liofilizzata da varie frutti di bosco, nonché per frutta congelata. Questo metodo è stato utilizzato con successo per estrarre e purificare i polifenoli dai lamponi e dai lamponi neri 21 , nonché dai mirtilli e dalle fragole (dati non mostrati). Quindi, questo metodo potrebbe essere utilizzato anche per estrarre i polifenoli da altri tipi di alimenti, comprese le verdure.

In conclusione, questo lavoro illustra un metodo veloce, conveniente e facilmente riproducibile per isolare i polifenoli dalle bacche, che consente la conservazione e la concentrazione di composti che proteggono lo stress ossidativo nei VSMC.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato finanziato dall'American Heart Association (14GRNT20180028) e dal Florida State University Council sulla ricerca e la creatività (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

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References

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