Extracción y purificación de polifenoles de polvo de baya liofilizado para el tratamiento de células musculares lisas vasculares

Chemistry

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Summary

Este trabajo detalla un método paso a paso para preparar extractos ricos en polifenoles de polvo de bayas liofilizadas. Además, proporciona una descripción completa de cómo usar estos extractos ricos en polifenoles en cultivo celular en presencia de la hormona peptídica angiotensina II (Ang II) usando células vasculares de músculo liso (VSMCs).

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Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

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Abstract

Los estudios epidemiológicos indican que el aumento de la ingesta de flavonoides se correlaciona con la disminución de la mortalidad por enfermedades cardiovasculares (ECV) en los Estados Unidos y Europa. Las bayas son ampliamente consumidas en los EE.UU. y tienen un alto contenido polifenólico. Se ha demostrado que los polifenoles interactúan con muchos objetivos moleculares y ejercen numerosas funciones biológicas positivas, incluyendo efectos antioxidantes, antiinflamatorios y cardioprotectores. Los polifenoles aislados de mora (BL), frambuesa (RB) y frambuesa negra (BRB) reducen el estrés oxidativo y la senescencia celular en respuesta a angiotensina II (Ang II). Este trabajo proporciona una descripción detallada del protocolo utilizado para preparar los extractos de polifenoles de las bayas liofilizadas. Las extracciones de polifenoles de polvo de bayas liofilizadas se realizaron utilizando etanol acuoso al 80% y un método de extracción asistido por ultrasonidos. El extracto bruto se purificó adicionalmente y se fraccionó usando cloroformo y acetato de etilo,respectivamente. Los efectos de los extractos crudos y purificados se ensayaron en células musculares lisas vasculares (VSMC) en cultivo.

Introduction

Los polifenoles son compuestos que contienen al menos un anillo fenólico en su estructura y están abundantemente presentes en el reino vegetal 1 . Los seres humanos han estado consumiendo plantas durante milenios con fines medicinales sin ser conscientes de la existencia de tales compuestos 2 . Muchas frutas y verduras tienen algunos compuestos polifenólicos compartidos, aunque con diferentes cantidades, incluyendo flavonoides, estilbenos y ácidos fenólicos 3 . Aunque los polifenoles a menudo se asocian con frutas y verduras de colores, esto no es estrictamente cierto. Por ejemplo, la zeaxantina y la xantina están presentes en vegetales que no son muy coloridos, como la cebolla y el ajo, que provienen de la familia de los cebolletas y que están asociados con numerosos beneficios para la salud 4 . Aparte de estar asociado con varios beneficios para la salud [ 5] , polifenoles también sirven a las plantas mediante la protección de los insectos yD radiación ultravioleta 2 . Los polifenoles se encuentran comúnmente en la dieta humana y se consideran poderosos antioxidantes, ya que pueden eliminar especies reactivas de oxígeno (ROS) 6 , 7 , 8 . También tienen propiedades antiinflamatorias 9 , antimicrobianas 10 , antihipertensivas 11 y anti-carcinógenas 12 , 13 .

Los estudios epidemiológicos demuestran una asociación inversa entre el consumo de flavonoides y la incidencia de enfermedades cardiovasculares (ECV) 16 , 17 y mortalidad 14 , 15 . Las bayas son ampliamente consumidas en los EE.UU. y tienen altas cantidades de polifenoles, incluyendo flavonoides. Por ejemplo, el consumo de jugo de zarzamora (BL) (300 Ml / d) durante ocho semanas disminuyó significativamente la presión arterial sistólica en pacientes dislipidémicos 18 . Jeong et al. 19 informaron que los hombres y mujeres pre-hipertensos que consumían 2,5 g de extracto de frambuesa negra (BRB) por día tenían una presión sanguínea más baja de 24 h y de noche que los que consumían un placebo. Las frambuesas (RB) disminuyeron la presión arterial mientras aumentaban la expresión de superóxido dismutasa (SOD) en ratas espontáneamente hipertensas 20 . Recientemente se ha demostrado que BL, RB y BRB reducen los niveles de ROS y senescencia inducida por la angiotensina II (Ang II) en las células musculares lisas vasculares (VSMCs) [ 21] . Además, la fracción de antocianina del extracto BL redujo la expresión de la sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) e inhibió la actividad de Factor Nuclear kappa B (NF-κB) y de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) en estimulaciones de lipopolisacárido (LPS) Células J774Ass = "xref"> 22. Los extractos de BRB disminuyeron la expresión de la activación de NF-κB y la ciclooxigenasa 2 (COX-2) in vitro 23 , mejoraron el perfil lipídico y evitaron la formación de lesiones de aterosclerosis en ratones alimentados con una dieta rica en grasas 24 . Las antocianinas, que se consideran los flavonoides más abundantes en las bayas, modulan la respuesta inflamatoria en los macrófagos RAW 264.7 estimulados con LPS, disminuyendo la producción de factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) 25 y disminuyendo la proliferación y migración de los VSMC 26 .

Dado que ha habido un creciente interés en la comprensión del papel de los polifenoles en la salud humana y la enfermedad, es importante optimizar el método de extracción. La extracción con disolvente es ampliamente utilizada para este propósito, ya que es rentable y fácilmente reproducible. En este estudio, se utilizó una extracción con disolvente con etanol, junto con una extracción asistida por ultrasonidoN, que fue adaptado de Kim y Lee [ 27] . La purificación y fraccionamiento de extractos brutos (CE) con cloroformo y acetato de etilo se realizaron para obtener la fracción de extracto purificado (PE) que fue adaptada de Queires et al . Además, se comparó la eficacia de los extractos de polifenoles crudos versus purificados de BL en la reducción de la fosforilación basal de ERK1 / 2, y se proporcionaron ejemplos representativos del efecto inhibidor del extracto de polifenol BL purificado en las reducciones de señalización inducidas por Ang II en VSMC.

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Protocol

1. Preparación de reactivos

  1. Preparar 80% de etanol (100 ml) mezclando 80 ml de etanol absoluto (grado de biología molecular) y 20 ml de agua estéril de grado de cultivo celular.
  2. Para preparar el extracto de polifenol (10 mg / ml), pese 10 mg de CE o PE. Añadir 1 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco simple (DMEM) bajo una campana de cultivo celular. Vórtice la solución. Alícuota en porciones de 200 μl y guarde a -20 ° C.
  3. Preparar buffer de lisis.
    1. Se añaden 5 ml de solución madre de HEPES 1 M (pH 7,4, final 50 mM), 1 ml de solución madre de NaCl 5 M (final 50 mM), 1 ml de solución madre EDTA 0,5 M (final 5 mM), 2 ml de solución madre 0,5 Solución madre NaF (final 10 mM), 286 μl de solución madre Na3VO4 700 mM (final 2 mM), 5 ml de solución madre Na 4 P 2 O 7 200 mM (final 10 mM) y 5 ml de solución madre Solución madre Triton-X-100 al 20% preparada en agua (1% final). Añadir agua para alcanzar un volumen de 100 ml. Mantener a 4 ° C.
  4. Preparar el tampón de muestra Laemmli (4x).
    1. Se a~naden 31,25 ml de solución madre de Tris 2 M (pH 6,8), 100 ml de glicerol, 50 ml de una solución de sulfato sódico al 20% (SDS) preparada en agua y 50 ml de β-mercaptoetanol. Añada agua hasta 250 ml. Mantener a 4 ° C.
  5. Para preparar un tampón de solución salina tamponada con Tris (TBS), se pesan 3 g de Tris (25 mM final), 0,18 g de KCl (final 2,5 mM) y 8,76 g de NaCl (150 mM final). Ajustar el pH a 7,4 y agregar agua hasta 1 L. Mantener a temperatura ambiente.
  6. Para preparar TBS-T, añadir 997,5 ml de TBS y 2,5 ml de una solución de Triton-X-100 al 20% preparada en agua. Mantenga a temperatura ambiente.

2. Preparación de extractos de Blackerry

  1. Preparación de extracto bruto de polvo de bayas liofilizadas.
    1. Pesar 10 g de polvo de zarzamora liofilizado (o 5 g de polvo fresco). Si se usa fruta congelada, corteEn piezas muy pequeñas antes de comenzar la extracción.
    2. Mezclar el polvo de fruta con 100 ml de etanol acuoso al 80% en un matraz Erlenmeyer de fondo redondo de 1 L.
    3. Sonicar la mezcla durante 20 minutos a 42 kHz, 135 W usando un baño ultrasónico a 25 ° C, sin ningún intervalo de tiempo intermedio. Realizar la sonicación con purga continua de nitrógeno en luz tenue. Para frutas congeladas, aumente el tiempo de incubación a 4 h.
    4. Filtrar la mezcla a través de un papel de filtro # 2 usando un embudo de Buchner enfriado con succión al vacío.
      NOTA: Al final de este paso, los residuos de la muestra aparecen en el papel de filtro; Esto se llama pastel de filtro.
    5. Enjuague la torta del filtro con 50 ml de etanol al 100%. Se conserva el filtrado y se añade la torta de filtración a un matraz de fondo redondo de 1 L que contiene 100 ml de etanol acuoso al 80%.
    6. Repita el proceso de extracción del residuo (pasos 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Se combinan los dos filtrados en un matraz de fondo redondo con 50 ml adicionalesDe etanol acuoso al 80%.
      NOTA: El volumen final debe ser de aproximadamente 300 mL.
    8. Utilizar un evaporador rotatorio a 62 ° C y 50 rpm para evaporar el disolvente. Continúe este proceso hasta que el etanol no se evapore más.
      NOTA: Este proceso dura aproximadamente 45 min.
    9. Transferir la muestra a un tubo cónico de 50 ml. Evaporar el etanol inyectando gas nitrógeno en la parte superior del tubo durante 10 min.
      NOTA: Este paso es necesario para asegurar la completa evaporación del etanol. El volumen de la muestra en este paso es de aproximadamente 20 ml.
    10. Congelar la muestra a -80 ° C durante al menos 24 h.
      NOTA: Este paso es necesario para permitir un proceso de liofilización más eficiente.
    11. Se liofiliza la muestra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Almacenar las muestras a -20 ° C.
      NOTA: El secador por congelación crea un vacío potente a -50 ° C dentro de la cámara para secar las muestras pero conserva la mayoría de los compuestos, tales como polipheNols.
  2. Preparación de extractos purificados de polifenoles a partir de extractos crudos.
    1. Pesar las muestras extraídas liofilizadas.
      NOTA: El volumen del extracto en este paso es de aproximadamente 10 ml.
    2. Añadir dos volúmenes (~ 20 ml) de cloroformo al extracto bruto y agitar la solución durante 5 min en una placa de agitación.
    3. Vierta la mezcla en un embudo de separación. Dejar decantar el extracto en bruto durante 1 h a RT para obtener la fracción purificada.
      NOTA: En este paso, se formará una mezcla de dos fases.
    4. Deseche la capa inferior (fase de cloroformo) del embudo de separación y recoja la capa acuosa en un vaso de precipitados limpio.
    5. Añadir dos volúmenes de acetato de etilo a la fracción acuosa y utilizar una barra de agitación magnética para agitar la mezcla durante 5 minutos a TA.
    6. Filtrar la mezcla a través de papel de filtro # 2 usando un embudo Buchner enfriado con succión al vacío.
    7. Recoger la muestra filtrada y transferirla a un matraz de fondo redondo para ser nosotrosCon el evaporador rotatorio.
    8. Ajustar el evaporador rotatorio a 62 ° C y 50 rpm y evaporar el acetato de etilo durante aproximadamente 30 min.
    9. Se liofiliza la muestra a -50 ° C durante aproximadamente 8 h. Transferir la muestra a un tubo cónico de 50 ml y almacenarla a -20 ° C.

3. Tratamiento de VSMC con extractos de Berry

  1. Cultura de VSMCs.
    1. Aislar VSMCs de las aortas torácicas de ratas Sprague-Dawley mediante la realización de una digestión enzimática, como se describe anteriormente [ 29] . Cultivo de los VSMCs como se describe 29 .
    2. Preparar el medio completo para el cultivo de VSMC utilizando DMEM que contenga 1 g / l de glucosa y suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 2 mM de L-glutamina. Almacene el medio completo a 4 ° C.
  2. Incubación de VSMC con extractos de polifenoles.
    1. Para dividir el VSMCs, descarte el cultuRe medio y lavar las células dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Añadir 4 ml de PBS y 2 ml de tripsina EDTA 0,25%. Incubar las células durante 5 min a 37 ° C en una incubadora de CO 2 .
      1. Recoger las células, mezclarlas con 2 ml de medio completo en un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 1.100 × g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular con 1 mL de PBS. Cuente las células usando un hemocitómetro.
      2. Sembrar 50.000 VSMC por pocillo en placas de cultivo de 6 pocillos y cultivarlas en medio completo que contenga FBS al 10% hasta que alcancen una confluencia del 90% (aproximadamente 3 días). Mantener los VSMCs a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% humidificada.
    2. Preparar el medio para el tratamiento utilizando medio DMEM que contenga 1 g / l de glucosa, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 0,5% de FBS. Almacene el medio de tratamiento a 4 ° C.
      NOTA: Los extractos de polifenoles y Ang II se añaden directamente a las células usando este meDium
    3. Preparar una solución madre de 10 mg / ml de Extracto Crudo (CE) o Extracto Purificado (PE) de polifenoles disolviendo 10 mg de extracto en 1 ml de medio DMEM simple. Conservar el stock en alícuotas de 200 μL a -20 ° C.
    4. Incubar los VSMCs con 2 mL de medio de tratamiento que contiene 0,5% de FBS y agregar extractos de CE o PE para lograr una concentración de 50-500 μg / mL. Cambiar el medio cada 24 h añadiendo extractos frescos de polifenoles. Tratar las células durante 3 d.
    5. Para el tratamiento con Ang II u otras hormonas y factores de crecimiento, mueren de hambre las células durante al menos 24 h incubando las células con medio de tratamiento que contiene 0,5% de FBS antes de la adición de Ang II (100 nM).
      NOTA: Incubación con y sin CE y PE en medio de tratamiento con FBS al 0,5% antes de que se recomiende la adición de Ang II.
      1. Después de 24 h de inanición, añadir 100 nM Ang II. Reemplace el medio de tratamiento con CE, PE, o Ang II fresco cada 24 h durante 3 d.
  3. Preparación de muestras de células.
    1. Lavar las células tratadas dos veces en PBS frío y lisarlas con 200 μl de tampón de lisis sobre hielo.
    2. Recoger lisados ​​celulares utilizando raspadores de células y transferir los lisados ​​a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar los lisados ​​celulares totales durante 20 min en hielo y vórtice cada 5 min.
    3. Sonicar los extractos celulares con tres ráfagas a 125 W durante 10 s cada uno, con una pausa de 2 s entre. Mantenga las muestras en hielo durante la sonicación.
    4. Mida la concentración de proteína usando un reactivo de ensayo de proteína a 595 nm.
    5. Almacenar las muestras a -20 ° C para su análisis por Western blot.
  4. Western blot.
    1. Se mezclan cantidades iguales de proteína (aproximadamente 50 μg) de las muestras tratadas no tratadas y tratadas con polifenoles o Ang II con tampón de lisis para obtener un volumen total máximo de 50 μl. Añadir 16 μl de un tampón de muestra Laemmli 4x. Calentar las muestras durante 5 min a 75 ° C.
    2. Separar la muestraEn geles de SDS-PAGE al 10% y transferirlos a membranas de PDVF a 10 V durante 75 min en un sistema de transferencia semi-seco para análisis Western blot con anticuerpos específicos.
    3. Bloquear la membrana con 2% de leche en TBS 0,05% de tampón Triton-X100 (TBS-T) durante 20 min.
    4. Eliminar la leche lavando la membrana al menos tres veces con TBS (5 min cada uno) e incubar con anticuerpos primarios durante 1 h a RT o O / N a 4 ° C.
    5. Lavar la membrana tres veces, 10 min cada una, con TBS-T e incubar con un anticuerpo secundario ligado a HRP durante 45 min.
    6. Lavar la membrana tres veces, 10 min cada una, con TBS-T y desarrollar mediante quimioluminiscencia mejorada (ECL).

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Representative Results

Se ha demostrado previamente que los extractos de polifenoles aislados de BL, RB y BRB reducían la senescencia de VSMCs en respuesta a Ang II 21 . Se ha demostrado que estos extractos de polifenoles purificados modulan la señalización de Ang II mediante la reducción de la fosforilación de Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK), y ERK1 / 2. BL previene la senescencia al reducir la expresión de la NADPH oxidasa (Nox) 1, una enzima que produce aniones superóxido y está fuertemente regulada por Ang II. En contraste, RB y BRB previenen la senescencia mediante un mecanismo independiente de Nox1, ya que aumentan la expresión de las enzimas antioxidantes SOD1, SOD2 y glutatión peroxidasa 1 (GPx-1). BL no incrementa la expresión de SOD2, mientras que ninguno de los extractos atenúa la regulación negativa de la catalasa por Ang II 21 . BL se centró en determinar si la falta de efecto de BL en SOD2 y catalasa expresión podríaSe explica por una pérdida de compuestos de polifenoles durante el proceso de purificación o por una concentración inadecuada de un cierto compuesto polifenólico en el extracto. VSMCs fueron incubadas con 50-500 μ g / mL CE ( Figura 1A ] o PE ( Figura 1B ] en medio que contiene 0,5% de FBS durante tres días. Ni CE ni PE incrementaron los niveles de SOD2 o catalasa en ninguna de las concentraciones ensayadas. Como control positivo, se midió la fosforilación de ERK1 / 2, y se encontró que CE redujo la fosforilación de esta quinasa a concentraciones superiores a 300 μg / mL. En contraste, el PE era eficaz a aproximadamente 100 μg / ml ( Figura 1B ). Se observaron bajos niveles de fosforilación en concentraciones de 200-500 μg / mL. Estos datos apoyan la observación anterior que muestra que 200 μ g / mL BL PE es suficiente para reducir Ang II señalización [ 21] . Estos resultados sugieren que las mayores concentraciones de polifenol cOmpounds en PE, en comparación con CE, podría explicar la mayor eficiencia de este extracto en la reducción de ERK1 / 2 fosforilación. Para probar esta idea, las composiciones de polifenoles de ambos extractos se compararon. La identificación y cuantificación de los compuestos de polifenoles en CE se realizó por HPLC, como se describió anteriormente 21 ( Tabla 1 ). El ácido 3- O- cafeoylquínico y la quercetina estuvieron presentes en niveles más altos en PE en comparación con CE, mientras que el ácido ferúlico y la rutina se encontraron sólo en CE. A continuación, VSMCs fueron tratados con 200 μ g / mL BL PE durante 24 h antes de la adición de 100 nM Ang II ( Figura 1C ]. Como se informó anteriormente 21 , el extracto de polifenol BL redujo la fosforilación de ERK1 / 2 inducida por Ang II pero no demostró ningún efecto sobre la expresión de catalasa y SOD2.

Figura 1
B ) o 200 μg / mL de PE ( C ) en 0,5 % De medio FBS DMEM durante 3 d. C ) Después de 24 h de incubación con BL PE, se añadió Ang II (100 nM) y las células se incubaron durante 3 d. El medio, con extractos frescos y Ang II, se cambiaba cada día. Las células se lavaron entonces y se lisaron, y los extractos celulares totales se separaron en geles PAGE-SDS al 10%. Las transferencias de Western se ensayaron con anticuerpos de conejo contra ERK1 / 2 fosforilado (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, catalasa y SOD2 y anticuerpo de ratón contra β-actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis (ppm) EDUCACIÓN FÍSICA CE
Ácidos fenólicos
Ácido gálico 243,5 321,9
Ácido p-cumárico 32,9 46,5
Ácido ferúlico - 236,5
Ácidos clorogénicos
Ácido 3-O-cafeoilquínico 235,3 170,5
Ácido 4-O-cafeoilquínico 13 76,9
Ácido 5-O-cafeoilquínico 14.1 49,9
FLAVONOIDES
Flavonoles
Quercetina 95 24,5
Flavanones
Rutina - 37,8

Tabla 1: Análisis de la composición de polifenoles de mora en extractos puros y purificados con polifenoles. Los ácidos fenólicos y flavonoides en Extracto Crudo (CE) y Extracto Purificado (PE) se analizaron usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). La concentración de analitos se expresa en ppm. La composición de polifenoles en BL PE se publicó recientemente 21 y se añadió a la tabla para ser comparada con CE.

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Discussion

Los polifenoles aislados de bayas contienen composiciones distintas. El protocolo de extracción a base de etanol descrito aquí permitió la identificación de diferentes niveles de ácidos fenólicos y flavonoides presentes en los extractos de polifenoles crudos y purificados de BL ( Tabla 1 ). CE se enriqueció en ácido gálico, ácido ferúlico, ácido 4-O-cafeoilquínico y ácido 5-O-cafeoilquínico. El proceso de purificación no alteró significativamente los niveles de ácido gálico y ácido p-cumárico. Sin embargo, aumentó los niveles de ácido 3- O -cafeoylquínico de 170,5 - 235,3 ppm y de quercetina de 24,5 - 95 ppm. En contraste, el ácido ferúlico y la rutina se perdieron durante la purificación de CE.

El tratamiento de VSMC con 50 - 500 μg / mL de CE y PE mostró que ambos extractos fueron eficaces en la reducción de la fosforilación basal de ERK1 / 2. Sin embargo, el PE mostró un downregulation más fuerte en la actividad de esta quinasa en una concentración más baja: 100 & #181; g / mL para PE comparado con 400 - 500 μg / mL para CE. Estos resultados pueden reflejar la mayor concentración de ácido 3- O -cafeoylquínico o quercetina que se encuentra en el PE. El uso de compuestos fenólicos individuales en células en cultivo es necesario para identificar el compuesto o compuestos específicos responsables de la reducción de la fosforilación de ERK1 / 2.

La actividad disminuida de quinasas de señalización, incluyendo Akt, ERK1 / 2 y p38MAPK, causada por polifenoles purificados aislados de BL, RB y BRB 21 , así como de ERK1 / 2 causada por BL CE, mostrada aquí, está de acuerdo con Informes anteriores. Por ejemplo, los extractos de polifenoles aislados del arándano disminuyeron el crecimiento tumoral de las células cancerosas mamarias, en parte reduciendo la actividad de Akt y ERK1 / 2 30 . Como se mencionó anteriormente, estas quinasas también están implicadas en la inducción de senescencia celular por Ang II 21 , lo que sugiere que los polifenoles de BL, RB y BRB shoulD reducir el envejecimiento vascular y la disfunción asociada con ECV.

Como se informó anteriormente 21 , la catalasa y SOD2 expresión no fueron upregulated por PE, incluso a concentraciones tan altas como 500 μ g / mL. Dado que la CE era también ineficaz para aumentar la expresión de catalasa y SOD2, estos datos sugieren que los compuestos fenólicos perdidos durante el protocolo de purificación no están implicados en la regulación de estas enzimas antioxidantes. Estos datos también sugieren que el protocolo de purificación mostrado aquí efectivamente concentra compuestos fenólicos relevantes para la regulación de la señalización de Ang II, el estrés oxidativo y la senescencia celular. Por ejemplo, los resultados representativos muestran que el PE regulaba fuertemente la fosforilación ERK1 / 2 inducida por Ang II. La evaluación de la fosforilación de esta quinasa es relevante porque la inhibición de la actividad ERK1 / 2 previno Ang II inducida por senescencia celular [ 21] .

En tErms de modificaciones a protocolos anteriores, se añadió una sonicación para aumentar el rendimiento de extracción para CE. Adicionalmente, para la purificación de polifenoles, en lugar de usar un cartucho C18, como se describe por Kim y Lee 27 , un método más tradicional de Queires et al . 28 fue adoptado aquí. Se añadió una etapa de filtración, usando papel de filtro para eliminar impurezas, a la purificación de la sección de polifenoles. En cuanto a las limitaciones, los pasos de sonicación y evaporación deben monitorearse cuidadosamente según el tipo de instrumento utilizado, ya que la duración y la temperatura de la sonicación y la evaporación son los pasos críticos en este protocolo. Las modificaciones añadidas a este método dieron como resultado el mayor rendimiento de polifenoles cuando se compararon con los métodos anteriores 27 , 28 utilizados en nuestro laboratorio (datos no mostrados), muy probablemente debido a la adición de una etapa de sonicación. Como mentiEste protocolo se puede utilizar para el polvo liofilizado de diversas bayas, así como para frutas congeladas. Este método se ha utilizado con éxito para extraer y purificar polifenoles de frambuesas y frambuesas negras 21 , así como de arándanos y fresas (datos no presentados). Por lo tanto, este método podría ser también utilizado para extraer polifenoles de otros tipos de alimentos, incluyendo verduras.

En conclusión, este trabajo detalla un método rápido, rentable y fácilmente reproducible para aislar los polifenoles de las bayas, lo que permite la retención y concentración de compuestos que protegen contra el estrés oxidativo en los VSMC.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Asociación Americana del Corazón (14GRNT20180028) y el Consejo de Investigación y Creatividad de la Universidad Estatal de Florida (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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