Extraktion och rening av polyfenoler från frystorkat bärpulver för behandling av vaskulära glatta muskelceller

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Detta arbete beskriver en steg-för-steg-metod för att förbereda polyphenolrika extrakt från frystorkat bärpulver. Dessutom ger den en grundlig beskrivning av hur man använder dessa polyphenolrika extrakt i cellkultur i närvaro av peptidhormon angiotensin II (Ang II) med hjälp av vaskulära smala muskelceller (VSMC).

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Epidemiologiska studier indikerar att ökat flavonoidintag korrelerar med minskad dödlighet på grund av hjärt-kärlsjukdomar (CVD) i Förenta staterna (USA) och Europa. Bär konsumeras ofta i USA och har ett högt polyphenoliskt innehåll. Polyfenoler har visat sig interagera med många molekylära mål och utöva många positiva biologiska funktioner, inklusive antioxidant, antiinflammatoriska och hjärtskyddande effekter. Polyfenoler isolerade från brombär (BL), hallon (RB) och svart hallon (BRB) reducerar oxidativ stress och cellulär senescens som svar på angiotensin II (Ang II). Detta arbete ger en detaljerad beskrivning av protokollet som används för att framställa polyphenol-extrakten från frystorkade bär. Polyfenol extraktioner från frystorkat bärpulver utfördes med användning av 80% vattenhaltig etanol och en ultraljudassisterad extraktionsmetod. Råtextraktet renades ytterligare och fraktionerades med användning av kloroform och etylacetat,respektive. Effekterna av både råa och renade extrakt testades på vaskulära smala muskelceller (VSMCs) i odling.

Introduction

Polyfenoler är föreningar som innehåller minst en fenolisk ring i sin struktur och är rikligt närvarande i växtriket 1 . Människor har konsumerat växter i årtusenden för medicinska ändamål utan att vara medvetna om förekomsten av sådana föreningar 2 . Många frukter och grönsaker har vissa delade polyphenoliska föreningar, om än med olika kvantiteter, inklusive flavonoider, stilbener och fenolsyra 3 . Trots att polyfenoler ofta är förknippade med färgglada frukter och grönsaker, är detta inte helt sant. Till exempel finns zeaxanthin och xantin närvarande i grönsaker som inte är mycket färgglada, såsom lök och vitlök, som är från familjen av scallions och är förknippade med många hälsofördelar 4 . Bortsett från att de är förknippade med flera hälsofördelar 5 , tjänar polyfenoler också växter genom att skydda dem från insekter enD ultraviolett strålning 2 . Polyfenoler är vanligen förekommande i den mänskliga kosten och anses vara kraftfulla antioxidanter, eftersom de kan scavenge Reactive Oxygen Species (ROS) 6 , 7 , 8 . De har också antiinflammatoriska 9 , antimikrobiella 10 , antihypertensiva 11 och anti-cancerogena 12 , 13 egenskaper.

Epidemiologiska studier visar en invers association mellan konsumtionen av flavonoider och kardiovaskulär sjukdom (CVD) förekomst 16 , 17 och mortalitet 14 , 15 . Bär konsumeras mycket i USA och har stora mängder polyfenoler, inklusive flavonoider. Till exempel konsumtion av blackberry (BL) juice (300 ML / d) i åtta veckor signifikant minskat systoliskt blodtryck hos dyslipidemiska patienter 18 . Jeong et al. 19 rapporterade att prehypertensiva män och kvinnor som konsumerar 2,5 g svart hallon (BRB) extrakt per dag hade lägre 24 h och natt blodtryck jämfört med de som konsumerar en placebo. Hallon (RB) minskade blodtrycket samtidigt som uttrycket av superoxiddismutas (SOD) ökade i spontant hypertensiva råttor 20 . Det har nyligen visats att BL, RB och BRB minskar nivåerna av ROS och senescence inducerad av angiotensin II (Ang II) i vaskulära smala muskelceller (VSMCs) 21 . Dessutom reducerade anthocyaninfraktionen från BL-extrakten uttrycket av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS) och inhiberade aktiviteten av kärnfaktor kappa B (NF-KB) och extracellulär signalreglerad kinas (ERK) i lipopolysackarid (LPS) -stimulerade J774-cellerRöv = "xref"> 22. BRB-extrakt minskade NF-KB-aktiveringen och cyklooxygenas 2 (COX-2) -expressionen in vitro 23 , förbättrade lipidprofilen och förhindrade ateroskleroslesionsbildning hos möss matade en fetthaltig diet 24 . Anthocyaniner, som anses vara de mest rikliga flavonoiderna i bär, modulerar det inflammatoriska svaret i LPS-stimulerade RAW 264.7-makrofager genom att minska Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-a) -produktionen 25 och minska proliferationen och migreringen av VSMCs 26 .

Eftersom det har blivit ett växande intresse för att förstå polyphenols roll för människors hälsa och sjukdom är det viktigt att optimera extraktionsmetoden. Lösningsmedelsutvinning används allmänt för detta ändamål, eftersom det är kostnadseffektivt och enkelt reproducerbart. I denna studie användes en lösningsmedelsextraktion med etanol tillsammans med en ultraljudassisterad extraktionN-metod, som anpassades från Kim och Lee 27 . Rening och fraktionering av råa extrakt (CE) med användning av kloroform och etylacetat utfördes för erhållande av renad extrakt (PE) fraktion som anpassades från Queires et al., 28 . Vidare jämfördes effektiviteten av råa mot renade polyfenol-extrakt från BL vid reducering av basal fosforylering av ERK1 / 2, och representativa exempel på den inhiberande effekten av renat BL-polyfenol-extrakt på Ang II-inducerade signalreduktioner i VSMCs tillhandahölls.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Framställning av reagens

  1. Förbered 80% etanol (100 ml) genom att blanda 80 ml absolut etanol (molekylärbiologi-grad) och 20 ml sterilt vatten från cellodlingskvalitet.
  2. För att förbereda polyfenol extrakt (10 mg / ml) väger 10 mg CE eller PE. Tillsätt 1 ml vanligt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) under en cellodlingshuvud. Virvel lösningen. Alikvot i 200 | il portioner och lagra vid -20 ° C.
  3. Förbered lysisbuffert.
    1. Tillsätt 5 ml 1 M HEPES stamlösning (pH 7,4; 50 mM slutlig), 1 ml 5 M NaCl stamlösning (50 mM slutlig), 1 ml 0,5 M EDTA stamlösning (5 mM slutlig), 2 ml 0,5 M NaF stamlösning (10 mM slutlig), 286 pi 700 mM Na3 VO4 stamlösning (2 mM slutlig), 5 ml 200 mM Na4P207 stamlösning (10 mM slutlig) och 5 ml 20% Triton-X-100 stamlösning beredd i vatten (1% slutlig). Tillsätt vatten för att nå en volym på 100 ml. Förvara vid 4 ° C.
  4. Förbered Laemmli provbuffert (4x).
    1. Tillsätt 31,25 ml 2 M Tris stamlösning (pH 6,8), 100 ml glycerol, 50 ml av en 20% natriumdodecylsulfatlösning (SDS) framställd i vatten och 50 ml p-merkaptoetanol. Tillsätt vatten upp till 250 ml. Förvara vid 4 ° C.
  5. För att bereda Tris-buffrad saltlösning (TBS) buffert väger 3 g Tris (25 mM slutlig), 0,18 g KCl (2,5 mM slutlig) och 8,76 g NaCl (150 mM slutlig). Justera pH till 7,4 och tillsätt vatten upp till 1 L. Förvara vid RT.
  6. För att framställa TBS-T tillsättes 997,5 ml TBS och 2,5 ml av en 20% Triton-X-100-lösning framställd i vatten. Förvara vid RT.

2. Framställning av Blackberry Extracts

  1. Framställning av rå extrakt från frystorkat bärpulver.
    1. Väg 10 g frystorkad blackberrypulver (eller 5 g färskt pulver). Om frusen frukt används, skära den iNtill mycket små bitar innan extraktionen startas.
    2. Blanda fruktpulvret med 100 ml 80% vattenhaltig etanol i en 1 liter rundkolv Erlenmeyer-kolv.
    3. Sonikera blandningen i 20 minuter vid 42 kHz, 135 W med användning av ett ultraljudsbad vid 25 ° C, utan något tidsintervall däremellan. Utför sonication med kontinuerlig kvävgasrening i dämpat ljus. För frusen frukt, öka inkubationstiden till 4 timmar.
    4. Filtrera blandningen genom ett filterfilter nr 2 med en kyld Buchner-trakt med vakuumsugning.
      OBS! I slutet av detta steg visas rester av provet på filterpapperet; Detta kallas filterkaka.
    5. Skölj filterkakan med 50 ml 100% etanol. Spara filtratet och sätt i filterkakan till en 1 liter rundkolv innehållande 100 ml 80% vattenhaltig etanol.
    6. Upprepa extraktionsprocessen för återstoden (steg 2.1.2 - 2.1.4).
    7. Kombinera de två filtraten i en rundkolv med ytterligare 50 mlAv 80% vattenhaltig etanol.
      OBS: Slutvolymen ska vara ca 300 ml.
    8. Använd en rotationsindunstare vid 62 ° C och 50 rpm för att indunsta lösningsmedlet. Fortsätt denna process tills etanolen inte avdunstar längre.
      OBS: Denna process tar cirka 45 min.
    9. Överför provet till ett 50 ml koniskt rör. Evaporera etanolen genom att injicera kvävgas i toppen av röret i 10 minuter.
      OBS! Detta steg är nödvändigt för att säkerställa fullständig avdunstning av etanolen. Volymen av provet vid detta steg är ungefär 20 ml.
    10. Frysta provet vid -80 ° C under minst 24 timmar.
      OBS! Detta steg är nödvändigt för att möjliggöra en effektivare frystorkningsprocess.
    11. Frys-torka provet vid -50 ° C under ca 8 h. Förvara proverna vid -20 ° C.
      OBS: Frystorken skapar ett kraftfullt vakuum vid -50 ° C inuti kammaren för att torka proverna, men bevarar de flesta av föreningarna, såsom polypheNOLS.
  2. Framställning av renade polyfenol-extrakt från råa extrakt.
    1. Väg de frystorkade extraherade proven.
      OBS: Volymen av extraktet vid detta steg är ca 10 ml.
    2. Tillsätt två volymer (~ 20 ml) kloroform till det råa extraktet och skaka lösningen under 5 minuter i en omrörningsplatta.
    3. Häll blandningen i en separeringstratt. Låt det råa extraktet dekantera i 1 h vid RT för erhållande av den renade fraktionen.
      OBS: Vid detta steg kommer en tvåfasblandning att bildas.
    4. Kassera bottenskiktet (kloroformfasen) från separeringstrattet och samla det vattenhaltiga skiktet i en ren bägare.
    5. Tillsätt två volymer etylacetat till den vattenhaltiga fraktionen och använd en magnetisk omrörningsstång för att omröra blandningen i 5 min vid RT.
    6. Filtrera blandningen genom filterpapper nr 2 med en kyld Buchner-trakt med vakuumsugning.
    7. Samla det filtrerade provet och överför det till en rundkolv för att vara ossEd med rotationsindunstaren.
    8. Ställ in rotationsindunstaren till 62 ° C och 50 rpm och indunsta etylacetatet i ca 30 min.
    9. Frys-torka provet vid -50 ° C under ca 8 h. Överför provet till ett 50 ml koniskt rör och förvara det vid -20 ° C.

3. Behandling av VSMC med Berry Extracts

  1. VSMCs kultur.
    1. Isolera VSMCs från thoraxaortor av Sprague-Dawley-råttor genom att utföra en enzymatisk digestion, såsom tidigare beskrivits 29 . Kultur de VSMCs som beskrivs 29 .
    2. Förbered fullständigt medium för odlingen av VSMCs med användning av DMEM innehållande 1 g / 1 glukos och kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin och 2 mM L-glutamin. Förvara hela mediet vid 4 ° C.
  2. Inkubation av VSMCs med polyfenol-extrakt.
    1. För att dela upp VSMC: erna, kassera cultuRe medium och tvätta cellerna två gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 4 ml PBS och 2 ml trypsin EDTA 0,25%. Inkubera cellerna i 5 minuter vid 37 ° C i en CO2-inkubator.
      1. Samla cellerna, blanda dem med 2 ml komplett medium i ett 15 ml centrifugrör och centrifugera vid 1 100 × g i 5 min. Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten med 1 ml PBS. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
      2. Seed 50.000 VSMCs per brunn i 6-brunns odlingsplattor och odla dem i komplett medium innehållande 10% FBS tills de når 90% konfluens (ca 3 d). Underhålla VSMC: er vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2-inkubator.
    2. Förbered mediet för behandling med DMEM-medium innehållande 1 g / 1 glukos, 100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin, 2 mM L-glutamin och 0,5% FBS. Förvara behandlingsmediet vid 4 ° C.
      OBS: Polyfenol extrakt och Ang II läggs direkt till celler som använder denna migDIUM.
    3. Förbered en stamlösning av 10 mg / ml rå extrakt (CE) eller renat extrakt (PE) av polyfenoler genom upplösning av 10 mg extrakt i 1 ml vanligt DMEM-medium. Förvara beståndet i 200 μl alikvoter vid -20 ° C.
    4. Inkubera VSMC: erna med 2 ml behandlingsmedium innehållande 0,5% FBS och tillsätt antingen CE- eller PE-extrakt för att uppnå en koncentration på 50-500 μg / ml. Byt mediet var 24: e timme genom att tillsätta färska polyphenol-extrakt. Behandla cellerna i 3 d.
    5. För behandling med Ang II eller andra hormoner och tillväxtfaktorer, svälta cellerna i minst 24 timmar genom att inkubera cellerna med behandlingsmedium innehållande 0,5% FBS före tillsatsen av Ang II (100 nM).
      OBS: Inkubation med och utan CE och PE i 0,5% FBS behandlingsmedium före tillsats av Ang II rekommenderas.
      1. Efter 24 timmars svält, tillsätt 100 nM Ang II. Byt behandlingsmediet med färskt CE, PE eller Ang II var 24: e timme under 3 d.
  3. Framställning av cellprover.
    1. Tvätta de behandlade cellerna två gånger i kallt PBS och lyse dem med 200 pl lysisbuffert på is.
    2. Samla celllysat med cellskrapor och överför lysaten till 1,5 ml mikrocentrifugrör. Inkubera de totala celllysaten i 20 minuter på is och virvel varje 5 min.
    3. Sonikera cellextrakten med tre sprickor vid 125 W i 10 s vardera, med en 2 s paus däremellan. Håll proven på is under hela sonication.
    4. Mät proteinkoncentrationen med ett proteinanalysreagens vid 595 nm.
    5. Förvara proverna vid -20 ° C för analys av Western blot.
  4. Western blot.
    1. Blanda lika stora mängder protein (ca 50 μg) från kontroll-icke-behandlade och polyfenolbehandlade eller Ang II-behandlade prover med lysbuffert för att erhålla en maximal totalvolym av 50 | il. Tillsätt 16 μl av en 4x Laemmli provbuffert. Värm proven i 5 minuter vid 75 ° C.
    2. Separera sampletS i 10% SDS-PAGE-geler och överföra dem till PDVF-membran vid 10 V i 75 min i ett halvt torrt överföringssystem för Western blot-analys med specifika antikroppar.
    3. Blockera membranet med 2% mjölk i TBS 0,05% Triton-X100 buffert (TBS-T) i 20 min.
    4. Ta bort mjölken genom att tvätta membranet minst tre gånger med TBS (5 min vardera) och inkubera med primära antikroppar i 1 h vid RT eller O / N vid 4 ° C.
    5. Tvätta membranet tre gånger, 10 min vardera, med TBS-T och inkubera med en HRP-länkad sekundär antikropp i 45 min.
    6. Tvätta membranet tre gånger, 10 min vardera, med TBS-T och utvecklas med ökad kemiluminescens (ECL).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det har tidigare visats att polyfenol extrakt isolerade från BL, RB och BRB reducerade senescensen av VSMCs som svar på Ang II 21 . Det har visats att dessa renade polyfenolekstrakter modulerar Ang II-signaleringen genom att reducera fosforyleringen av Akt, p38-mitogenaktiverad proteinkinas (MAPK) och ERK1 / 2. BL förhindrar senescens genom att reducera uttrycket av NADPH-oxidaset (Nox) 1, ett enzym som producerar superoxidanjoner och är starkt uppreglerat av Ang II. I motsats till detta förhindrar RB och BRB senescens med en Nox1-oberoende mekanism, eftersom de ökar uttrycket av antioxidant-enzymerna SOD1, SOD2 och glutationperoxidas 1 (GPx-1). BL misslyckas med att öka SOD2-uttrycket, medan inget av extrakten dämpar nedreglering av katalas av Ang II 21 . BL fokuserade på att bestämma huruvida bristen på effekt av BL på SOD2 och katalasuttryck kundeFörklaras av en förlust av polyfenolföreningar under reningsprocessen eller genom en otillräcklig koncentration av en viss polyfenolförening i extraktet. VSMC: er inkuberades med 50-500 | ig / ml CE ( Figur 1A ) eller PE ( Figur IB ) i medium innehållande 0,5% FBS i tre dagar. Varken CE eller PE ökade SOD2 eller katalasnivåer vid någon av de testade koncentrationerna. Som en positiv kontroll uppmättes ERK1 / 2-fosforylering och det visade sig att CE reducerade fosforyleringen av denna kinas vid koncentrationer högre än 300 | ig / ml. I motsats till detta var PE effektiv vid ca 100 | ig / ml ( Figur IB ). Låga fosforyleringsnivåer observerades vid koncentrationer av 200-500 | ig / ml. Dessa data stöder den föregående observationen som visar att 200 μg / mL BL PE är tillräcklig för att reducera Ang II-signalering 21 . Dessa resultat tyder på att högre koncentrationer av polyfenol cOmpounds i PE, jämfört med CE, kunde förklara det högre effektiviteten hos detta extrakt vid minskning av ERK1 / 2-fosforylering. För att testa denna ide jämfördes polyfenolkompositionerna av båda extrakten. Identifieringen och kvantifieringen av polyfenolföreningar i CE utfördes genom HPLC, såsom tidigare beskrivits 21 ( Tabell 1 ). 3-0- koeoylkinsyra och quercetin var närvarande vid högre nivåer i PE jämfört med CE, medan ferulsyra och rutin hittades endast i CE. Därefter behandlades VSMCs med 200 | ig / ml BL PE i 24 timmar innan tillsatsen av 100 nM Ang II ( Figur 1C ). Som tidigare rapporterats 21 reducerade BL-polyfenol-extraktet Ang II-inducerat ERKl / 2-fosforylering men visade ingen effekt på katalas och SOD2-uttryck.

Figur 1
B ) eller 200 | ig / ml PE ( C ) i 0,5 % FBS DMEM-medium för 3 d. C ) Efter 24 h inkubation med BL PE tillsattes Ang II (100 nM) och cellerna inkuberades i 3 d. Mediet, med färska extrakt och Ang II, byttes varje dag. Cellerna tvättades sedan och lyserades och de totala cellextrakten separerades i 10% PAGE-SDS-geler. Western blottar testades med kaninantikroppar mot fosforylerat ERK1 / 2 (Thr 202 / Tyr 204), ERK1 / 2, katalas och SOD2 och musantikropp mot p-aktin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Analyser (ppm) PE CE
Fenolsyra
gallussyra 243,5 321,9
P-kumarinsyra 32,9 46,5
Ferulsyra - 236,5
Klorogena syror
3-0-koffeoylkinsyra 235,3 170,5
4-0-koffeoyl-kiniksyra 13 76,9
5-0-koffeoylkvinsyra 14,1 49,9
flavonoider
flavonoler
quercetin 95 24,5
flavanones
rutin - 37,8

Tabell 1: Analys av polyfenolsammensättningen av Blackberry i råa och polyfenolrenade extrakt. Fenolsyra och flavonoider i rå extrakt (CE) och renat extrakt (PE) analyserades med användning av High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Koncentrationen av analyter uttrycks som ppm. Sammansättningen av polyfenoler i BL PE publicerades nyligen 21 och tillsattes till bordet för att jämföras med CE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Polyfenoler isolerade från bär innehåller distinkta kompositioner. Det etanolbaserade extraktionsprotokollet som beskrivs här tillåts för identifiering av olika nivåer av fenolsyra och flavonoider närvarande i råa och renade polyfenol-extrakt av BL ( tabell 1 ). CE berikades i gallinsyra, ferulsyra, 4-0-koffeoylkinsyra och 5-0-koffeoylkinsyra. Reningsprocessen förändrade inte signifikant nivåerna av gallinsyra och p-kumarsyra. Det ökade emellertid nivåerna av 3-0- koffeoylkinsyra från 170,5-235,3 ppm och av quercetin från 24,5 till 95 ppm. Däremot förlorades ferulsyra och rutin under rening av CE.

Behandlingen av VSMC med 50 - 500 μg / mL CE och PE visade att båda extrakten var effektiva för att reducera basal fosforylering av ERK1 / 2. Emellertid visade PE en starkare nedreglering i aktiviteten hos denna kinas vid en lägre koncentration: 100 & #181; g / ml för PE jämfört med 400-500 μg / ml för CE. Dessa resultat kan återspegla den högre koncentrationen av 3-0- koffeoylkinsyra eller quercetin som finns i PE. Användningen av enskilda fenolföreningar i celler i kultur behövs för att identifiera den specifika förening (er) som är ansvariga för nedreglering av ERK1 / 2-fosforylering.

Den minskade aktiviteten hos signalkinaser, inklusive Akt, ERK1 / 2 och p38MAPK, orsakad av renade polyfenoler isolerade från BL, RB och BRB 21 , liksom av ERK1 / 2 orsakad av BL CE, som visas här, är överens med Tidigare rapporter. Exempelvis minskade polyphenolekstrakter isolerade från blåbär tumörtillväxten av bröstcancerceller, delvis genom att reducera aktiviteten hos Akt och ERK1 / 2 30 . Som tidigare nämnts är dessa kinaser också involverade i induktionen av cellulär senescens av Ang II 21 , vilket tyder på att polyfenoler från BL, RB och BRB shoulD minska vaskulär åldrande och dysfunktion i samband med CVD.

Som vi rapporterade tidigare 21 , uppskattades katalas och SOD2 uttryck inte av PE, även vid koncentrationer så höga som 500 μg / ml. Eftersom CE också var ineffektivt vid ökande katalas och SOD2-uttryck, tyder dessa data på att de fenolföreningar som förloras under reningsprotokollet inte är involverade i reglering av dessa antioxidant-enzymer. Dessa data föreslår också att det reningsprotokoll som visas här effektivt koncentrerar fenoliska föreningar som är relevanta för reglering av Ang II-signalering, oxidativ stress och cellulär senescens. De representativa resultaten visar till exempel att PE starkt nedreglerade Ang II-inducerad ERK1 / 2-fosforylering. Bedömningen av fosforyleringen av detta kinas är relevant eftersom inhiberingen av ERKl / 2-aktivitet förhindrade Ang II-inducerad cellulär senescens 21 .

I tErmar av modifikationer till tidigare protokoll, en sonication tillsattes här för att öka extraktionsutbytet för CE. Dessutom, för rening av polyfenoler, istället för att använda en C18-patron, såsom beskrivs av Kim och Lee 27 , en mer traditionell metod från Queires et al . 28 antogs här. Ett filtreringssteg med användning av filterpapper för avlägsnande av föroreningar tillsattes till reningen av polyfenolsektionen. När det gäller begränsningar bör sonikations- och evaporationsstegen övervakas noggrant beroende på vilken typ av instrument som används, eftersom varaktigheten och temperaturen för sonikering och avdunstning är de kritiska stegen i detta protokoll. Modifieringarna som tillsattes till denna metod resulterade i det högsta utbytet av polyfenoler jämfört med tidigare metoder 27 , 28 som användes i vårt laboratorium (data ej visade), troligen på grund av tillsatsen av ett sonikeringstrin. Som mentiDetta protokoll kan användas i frystorkat pulver från olika bär, såväl som frysta frukter. Denna metod har framgångsrikt använts för att extrahera och rena polyfenoler från hallon och svarta hallon 21 , samt från blåbär och jordgubbar (data ej visade). Således kan denna metod också användas för att extrahera polyfenoler från andra typer av livsmedel, inklusive grönsaker.

Sammanfattningsvis beskriver detta arbete en snabb, kostnadseffektiv och lätt reproducerbar metod för att isolera polyfenoler från bär, vilket möjliggör retention och koncentration av föreningar som skyddar mot oxidativ stress i VSMC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av American Heart Association (14GRNT20180028) och Florida State University Council on Research and Creativity (COFRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000
Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27, (3), 152-159 (2000).
  2. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90, (3), 859-904 (2010).
  3. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79, (5), 727-747 (2004).
  4. Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16, (7), 603-615 (2002).
  5. Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96, (2), 365-371 (2016).
  6. Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48, (11), 5677-5684 (2000).
  7. Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53, (2), 1214-1221 (2016).
  8. Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
  9. Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
  10. Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23, (2), 174-181 (2012).
  11. Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23, (2), 220-231 (2016).
  12. Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8, (9), E552 (2016).
  13. Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6, (2), 251-261 (2016).
  14. Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155, (4), 381-386 (1995).
  15. Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70, (9), 491-508 (2012).
  16. Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127, (2), 188-196 (2013).
  17. Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114, (9), 1496-1503 (2015).
  18. Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20, (7), 684-691 (2015).
  19. Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32, (4), 461-467 (2016).
  20. Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7, (25), 19-24 (2011).
  21. Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7, (10), 4175-4187 (2016).
  22. Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15, (1), 30-39 (2006).
  23. Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54, (1), 69-78 (2006).
  24. Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146, (2), 515-524 (2013).
  25. Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50, (15), 4183-4189 (2002).
  26. Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11, (4), 1679-1703 (2010).
  27. Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
  28. Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26, (1A), 379-387 (2006).
  29. Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266, (23), 15498-15504 (1991).
  30. Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics