En all-on-chip metode til hurtig neutrofile kemotaxis analyse direkte fra en bloddråbe

* These authors contributed equally
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikel tilvejebringer den detaljerede fremgangsmåde til at udføre en hurtig neutrofile kemotaxis-analyse ved at integrere on-chip-neutrofilisoleringen fra helblod og kemotaxis-testen på en enkelt mikrofluidisk chip.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yang, K., Wu, J., Zhu, L., Liu, Y., Zhang, M., Lin, F. An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood. J. Vis. Exp. (124), e55615, doi:10.3791/55615 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neutrofile migration og kemotaks er afgørende for vores krops immunsystem. Mikrofluidiske enheder anvendes i stigende grad til undersøgelse af neutrofilmigration og kemotaxis på grund af deres fordele ved real-time visualisering, præcis styring af kemisk koncentrationsgradientgenerering og reduceret reagens- og prøveforbrug. For nylig er der gjort en stigende indsats fra de mikrofluidiske forskere mod udvikling af integrerede og let betjente mikrofluidiske kemotaxisanalysesystemer direkte fra helblod. I denne retning blev den første all-on-chip-metode udviklet til integration af den magnetiske negative oprensning af neutrofiler og kemotaxisassayet fra små blodvolumenprøver. Denne nye metode tillader en hurtig prøve-til-resultat-neutrofile kemotaxis-test i 25 minutter. I dette papir leverer vi detaljeret konstruktion, drift og dataanalysemetode til denne all-on-chip chemotaxis-analyse med en diskussion om fejlfindingsstrategier, limiTationer og fremtidige retninger. Repræsentative resultater af den neutrofil-kemotaxis-analyse, der tester en defineret kemoattraktant, N- formyl-Met-Leu-Phe (fMLP) og sputum fra en patient med kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), under anvendelse af denne all-on-chip-metode, er vist. Denne metode er anvendelig til mange celle migrationsrelaterede undersøgelser og kliniske anvendelser.

Introduction

Chemotaxis, en proces med rettet cellemigration til opløselig kemisk koncentrationsgradient, er kritisk involveret i mange biologiske processer, herunder immunrespons 1 , 2 , 3 , vævsudvikling 4 og cancermetastase 5 . Neutrofiler er den mest almindelige hvide blodlegemsundergruppe og spiller afgørende roller for at muliggøre kroppens medfødte værtsforsvarsfunktioner samt til formidling af adaptive immunresponser 6 , 7 . Neutrofiler er udstyret med højtregulerede kemotaktiske maskiner, der gør det muligt for disse bevægelige immunceller at reagere på begge patogenafledte kemoattraktanter (fMLP) og værtsafledte kemoattraktanter ( f.eks . Interleukin-8) gennemkemotaks 8 . Neutrofile migration og kemotaksis medierer forskellige fysiologiske problemerOg sygdomme som inflammation og cancer 1 , 9 . Således tilvejebringer den nøjagtige vurdering af neutrofil kemotaxis en vigtig funktionel aflæsning til undersøgelse af neutrofile biologien og de associerede sygdomme.

Sammenlignet med de almindeligt anvendte konventionelle kemotaxis-analyser ( fx transwell-assay 10 ) viser de mikrofluidiske indretninger et stort løfte om kvantitativ evaluering af celle-migration og kemotaxis på grund af den præcist styrede kemiske gradientgenerering og miniaturisering 11 , 12 , 13 . I løbet af de sidste to årtier har der været udviklet forskellige mikrofluidiske enheder til at studere kemotaksen af ​​forskellige biologiske celletyper, især neutrofiler 11 . En betydelig indsats var afsat til at karakterisere neutrofilmigration i spatiotemporalt kompleks che Mical gradienter, der blev konfigureret i de mikrofluide indretninger 14 , 15 . Interessante strategier blev også udviklet til at studere retningsbestemt beslutningstagning ved hjælp af neutrofiler ved anvendelse af mikrofluidiske indretninger 16. Udover biologisk orienteret forskning er anvendelserne af mikrofluidiske indretninger blevet udvidet til testkliniske prøver til sygdomsevaluering 17 , 18 , 19 . Imidlertid er brugen af ​​mange mikrofluidiske indretninger begrænset til specialiserede forskningslaboratorier og kræver langvarig neutrofile isolation fra store mængder blodprøver. Derfor har der været en stigende tendens til at udvikle integrerede mikrofluidiske enheder til hurtig neutrofile kemotaksanalyser direkte fra en dråbe fuldblod 20 , 21 , 22 ,Ef "> 23 , 24 .

Mod denne retning blev der udviklet en all-on-chip-metode, der integrerer den magnetiske negative neutrofile rensning og den efterfølgende kemotaxisanalyse på en enkelt mikrofluidisk indretning 25 . Denne all-on-chip-metode har følgende nye egenskaber: 1) I modsætning til tidligere on-chip-strategier, der isolerer neutrofile fra blodet ved adhæsionsbaseret celleindfangning eller cellestørrelsesbaseret filtrering 20 , 22 , tillader denne nye metode høj Renhed, on-chip magnetisk adskillelse af neutrofiler fra små volumener af fuldblod samt kemotaxismåling ved kemoattraktantstimulering; 2) celledockingsstrukturen hjælper med at justere de indledende positioner af neutrofiler tæt på den kemiske gradientkanal og tillader enkel kemotaxisanalyse uden single cell tracking; 3) integrationen af ​​neutrofile isolationen og kemotAkse-analysen på en enkelt mikrofluidisk anordning tillader hurtig analyse af kemotaxis i kemikalier i løbet af 25 minutter, når der ikke er nogen afbrydelse mellem eksperimentelle trin.

Dette papir indeholder en detaljeret protokol til konstruktion, drift og dataanalysemetode i denne all-on-chip chemotaxis-analyse. Papiret demonstrerer den effektive anvendelse af den udviklede metode til at udføre neutrofil kemotaks ved at teste en kendt rekombinant kemoattraktant og komplekse kemotaktiske prøver fra patienter efterfulgt af en diskussion om fejlsøgningsstrategier, begrænsninger og fremtidige retninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle humane prøveindsamlingsprotokoller blev godkendt af Det Etiske Fakultet for Forskningsetik ved University of Manitoba, Winnipeg.

1. Fremstilling af mikrofluidiske enheder ( figur 1A )

  1. Design og udskrifts gennemsigtighedsmaske.
    1. Design enheden som beskrevet tidligere 25 . Se figur 1A .
      BEMÆRK: Enheden indeholder to lag. Det første lag (4 μm høje) definerer celle docking barrierekanalen for at fælde cellerne ved siden af ​​gradientkanalen. Det andet lag (60 μm høje) definerer gradientgenereringskanalen, porten og kanalen til cellebelastning, kemikalieindløbsreservoirerne og affaldsstikket. Justeringsmærkerne er designet til de to lag. For det andet lag er længden og bredden af ​​den opstrøms serpentin-indgangskanal henholdsvis 60 mm og 200 μm; Længden og bredden af ​​nedstrømsSerpentin indgangskanal er henholdsvis 6 mm og 280 μm.
    2. Udskriv de første og andet lagsfunktioner til en gennemsigtighedsmaske ved hjælp af en højopløsningsprinter.
      BEMÆRK: Udskriftsopløsningen afhænger af de mindste funktioner i designet. I det nuværende design blev 32.000 dpi valgt til 10 μm minimumsfunktion.
  2. Rengør siliciumpladen.
    1. Placer en 3 i siliciumskive i plasmarenseren. Påfør vakuum i 3 minutter.
    2. Tænd for plasmakraften og indstil niveauet til HØJ. Brug iltplasmaet til at behandle siliciumskiven i 30 minutter.
    3. Sluk for plasmarenseren og tag siliciumskiven ud; Siliciumskiven er klar til fremstilling af anordningens form.
  3. Fremstil det første lag ved fotolithografi i en cleanroom facilitet.
    BEMÆRK: De nøjagtige fabrikationsparametre kan variere afhængigt af fabrikationsanlægget.
    1. Fortynd 10 ml SU-8 2025 med 10 ml SU-8 2000 i en glasbryder for at forberede den designede fotoresist. Lad blandingen stå i røgen i 10 minutter, indtil boblerne forsvinder.
    2. Anbring forsigtigt den rensede siliciumskive på spinderen med den passende chuck og påfør vakuumet for at immobilisere siliciumskiven.
    3. Hæld forsigtigt 3 ml af fotoresistblandingen på midten af ​​siliciumpladen. Spin ved 500 rpm i 5 s. Derefter drejes ved 3000 rpm i 30 s for at opnå en endelig 4 μm tykkelse fotoresist belægning på silicium wafer.
    4. Fjern forsigtigt siliciumwaferen fra spinneren og bage siliciumwaferen på en kogeplade i 4 minutter ved 95 ° C.
    5. Placér siliciumwaferen forsigtigt på en maskindstilling og indstil UV-eksponeringstiden til 6 s. Tilslut forsigtigt gennemsigtighedsmasken af ​​det første lag på en gennemsigtig glasplade ved hjælp af tape.
    6. Sæt forsigtigt den gennemsigtige glasplade med den vedhæftede maske til justeringsapparatet og juster masken med siliciumskiven. Udsætte siLignonskive til UV til mønster celle docking struktur.
    7. Fjern forsigtigt glaspladen og tag den udskilte siliciumplader ud. Bages siliciumwaferen på en kogeplade i 4 minutter ved 95 ° C.
    8. Overfør siliciumpladen til en dampplade og læg den i en glasplade, der indeholder SU-8-udvikleren. Ryst det forsigtigt i 30 s.
    9. Rengør siliciumskiven ved brug af frisk SU-8-udvikler efterfulgt af isopropylalkohol (IPA) inde i dampdækslet. Tør siliciumskiven tørret med nitrogengas inde i dampkoglen; Det første lag er klar.
  4. Fremstil det andet lag på det første lag.
    1. Brug tape til at dække justeringsmærkerne på det første lag. Sæt forsigtigt siliciumwaferen med det første lag på spinnerens vakuumchuck og påfør vakuum for at immobilisere siliciumskiven.
    2. Hæld 3 ml SU-8 2025 fotoresist på siliciumpladen. Spinde siliciumwaferen ved 500 omdr./min. I 5 s. Spol derefter ved 2000 omdr./min. For 30S for at opnå en endelig 60 μm tykkelse fotoresistbelægning på siliciumskiven.
    3. Fjern forsigtigt siliciumwaferen fra spinneren og overfør den til en kogeplade; Bage ved 65 ° C i 2 minutter.
    4. Fjern forsigtigt klæbebåndet for at afsløre justeringsmærkerne på det første lag. Placer siliciumskiven på en kogeplade og bages ved 95 ° C i 6 minutter.
    5. Sæt forsigtigt siliciumwaferen på en maskindstilling og indstil UV-eksponeringstiden til 18 s.
    6. Monter forsigtighedsmasken af ​​det andet lag forsigtigt på en gennemsigtig glasplade ved hjælp af tape.
    7. Placer glaspladen forsigtigt med den tilsluttede maske til justeringsapparatet, og juster masken og det første lag på siliciumpladen ved hjælp af krydsjusteringsmærkerne ved hjælp af inspektionsmikroskopet til justeringsapparatet.
    8. Udsigt den fotoresistbelagte siliciumwafer til UV for at mønstre celleindlæsnings- og gradientkanalerne.
    9. Fjern forsigtigt glaspladen og tag silicium w udafer. Bages siliciumwaferen på en kogeplade ved 65 ° C i 2 minutter, og overfør derefter siliciumwaferen til en anden varmeplade på 95 ° C og bages i 6 min.
    10. Overfør siliciumpladen til røgen og placér den i en glasplade, der indeholder SU-8-udvikleren. Ryst forsigtigt dette i 6 min.
    11. Rengør siliciumwaferen ved hjælp af en frisk SU-8-udvikler efterfulgt af IPA inden i dampdækslet.
    12. Tør siliciumskiven tørret ved hjælp af nitrogengas inde i dampkoglen. Anbring siliciumwaferen på en kogeplade og hårdbages formen ved 150 ° C i 30 minutter; Det andet lag er klar.
  5. Master form overfladen modifikation.
    BEMÆRK: Et silaniseringsoverflade modifikationstrin påføres SU-8-støbeformen for at lette polydimethylsiloxan (PDMS) frigivelse fra støbeformen i blød lithografi.
    1. Tag 10 μl tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl- (trichlorosilan) opløsning i en mikropipettip. Sæt mikropipettepinden i et 15 ml plastrør aOg løsn rørets låg.
    2. Placer røret og SU-8 mønstret siliciumwafer inde i en tørremiddel og anbring vakuumet i 1 time; Maskeformen er klar til fremstilling af PDMS-enheden.
  6. Fremstil PDMS-enheden.
    1. Forbered PDMS-opløsningen ved at blande 40 g PDMS base og 4 g hærdemiddel i et plastbægre. Placer den tilberedte SU-8 mesterskimmel i en Petri-skål og hæld 44 g PDMS-opløsningen forsigtigt på formen.
    2. Placer petriskålen i en tørremiddel og påfør vakuum for at afgrænse PDMS-opløsningen i 20 min. Derefter placeres Petri-skålen i en ovn og hærder PDMS ved 80 ° C i 2 timer.
    3. Efter bagning skal du tage Petri-skålen ud og placere den på en ren bænk. Skær forsigtigt og fjern PDMS-pladen fra SU-8-støbeformen.
    4. Stans celleindlæserporten ved hjælp af en 3 mm diameter puncher. Punch ud kemikalieindløbsreservoirerne og affaldsstikket med en 6 mm diameter puncher.
    5. Fjern støvet påOverflade af PDMS-pladen med tape. Placer PDMS-pladen og en ren glasskinne i plasma-maskinen. Påfør vakuumet i 3 minutter.
    6. Tænd for plasmakraften og indstil niveauet til HØJ. Juster luftventilen forsigtigt og plasmatreat PDMS-pladen og glasskinnen i 3 minutter.
    7. Sluk for plasmaenergien og sluk for vakuumet. Tag forsigtigt PDMS-pladen og glasskinnen ud med pincet.
    8. Placer PDMS-pladen (med kanalkonstruktioner med forsiden nedad) straks på glaspladen; Tryk forsigtigt på PDMS-pladen for at binde det til glasset. Fyld den mikrofluidiske kanal straks med deioniseret vand; Fremstillingen og samlingen af ​​mikrofluidiske apparater er afsluttet.

2. Fremstilling af mikrofluidcelle migrationsassay

  1. Microfluidic device preparation.
    1. Forbered 50 μg / ml fibronectinopløsning ved at fortynde 50 μl stock fibronectinopløsning (1 mg / ml) til 95081; L Dulbeccos fosfatbufrede saltvand (DPBS) inde i et biosikkerhedsskabe.
    2. Forbered migrationsmediet ved at blande 9 mL Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640) og 1 mL RPMI-1640 med 4% bovint serumalbumin (BSA).
    3. Fjern deioniseret vand fra enheden.
    4. Tilsæt 100 μL fibronectinopløsning til enheden fra udløbet. Vent 3 min for at sikre, at alle kanalerne er fyldt med fibronectinopløsning. Anbring den mikrofluidiske enhed i en overdækket petriskål i 1 time ved stuetemperatur.
    5. Fjern fibronectinopløsningen fra enheden. Tilsæt 100 μL migrationsmedium fra udløbet. Vent 3 min for at sikre, at alle kanaler er fyldt med migrationsmedium.
    6. Inkubér enheden i yderligere 1 time ved stuetemperatur; Anordningen er så klar til kemotaxis-eksperimentet.
  2. Kemoattraktantopløsningspræparat til kemotaksisforsøg.
    1. Forbered 100 nM fMLP opløsning i t1 ml migrationsmedium. Bland 5 μl lager FITC-Dextran (10 kDa, 1 mM) med fMLP opløsningen i et 1,5 ml rør.
      BEMÆRK: FITC-Dextran bruges til gradientmåling. Alternativt kan du bruge Rhodamine som gradientindikator. FMLP-kemoattraktantopløsningen er derefter klar til kemotaksisforsøg.
  3. Sputumprøveforberedelse.
    BEMÆRK: Neutrofile kemotakser induceret af en gradient af sputumprøve fra COPD-patienter blev testet som en klinisk diagnostisk anvendelse af denne all-on-chip-metode.
    1. Skaff en human etisk protokol til at indsamle sputumprøver fra COPD patienter.
      BEMÆRK: Vi opnåede godkendelser til at indsamle prøver på Seven Oaks General Hospital i Winnipeg (godkendt af University of Manitoba).
    2. Hent de informerede skriftlige samtykkeformularer fra alle fag.
    3. Saml COPD-patienters spontane sputumprøver. Placer 500 μL sputumprøve i et 1,5 ml rør.
    4. Tilsæt 500 μl 0,1% diThiothreitol i 1,5 ml rør og bland forsigtigt. Anbring røret i et vandbad ved 37 ° C i 15 minutter.
    5. Centrifuger prøven ved 753 xg i 10 minutter og opsamler derefter supernatanten. Centrifuger supernatanten ved 865 xg i 5 minutter og opsamler derefter den sidste supernatant. Opbevar den opsamlede supernatant inde i en fryser på -80 ° C før brug.
    6. Tænk sputumopløsningen, når den er klar til kemotaxisforsøg. Overfør 900 μL migrationsmedium til et 1,5 ml rør og bland med 100 μL sputumopløsning inde i et biosafetyskabinet; Sputumopløsningen er derefter klar til kemotaksisforsøg.
  4. Indsamling af blodprøver.
    1. Skaff en humanetisk protokol til at indsamle blodprøver fra sunde donorer. Hent de informerede skriftlige samtykkeformer fra alle bloddonorer.
      BEMÆRK: Her blev der indhentet prøver på Victoria General Hospital i Winnipeg (godkendt af Det Etiske Fakultet for Forskningsfag ved University of Manitoba).
    2. Saml blodprøven ved venipunktur og sæt prøven i et EDTA-belagt rør. Hold røret i et biosikkerhedsskabe før eksperimentet.

3. All-on-chip Chemotaxis Assay Operation

  1. On-chip celleisolering ( Figur 1B ).
    1. Anbring 10 μl helblod i et 1,5 ml rør inde i et biosafetyskabinet.
      BEMÆRK: Oplysninger om indsamling af blodprøver findes i afsnit 2.4.
    2. Tilsæt 2 μL antistof cocktail (Ab) og 2 μL magnetiske partikler (MP) fra neutrofilt isolationssæt (se materialebordet) i 1,5 ml rør og bland forsigtigt; Dette vil mærke celler i blodet undtagen neutrophils.
    3. Inkubér blod-Ab-MP-blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: Dette vil magnetisk mærke de antistofmærkede celler i blod.
    4. Vedhæft to små magnetdiske til de to sider af celleindlæsningen pEnhed af enheden. Aspirere mediet fra alle portene på enheden.
    5. Bland langsomt 2 μl blod-Ab-MP i mikrofluidindretningen fra celleindlæserporten.
      BEMÆRK: De magnetisk mærkede celler er fanget til sidevæggene i cellebelastningsporten, mens neutrofiler vil strømme ind i anordningen og blive fanget ved celledockingstrukturen.
    6. Vent nogle få minutter, indtil nok neutrofiler er fanget på celledockingsområdet.
  2. Chemotaxis assay ( figur 1C ).
    1. Anbring den mikrofluidiske anordning på det temperaturstyrede mikroskopstrin ved 37 ° C.
    2. Tilsæt 100 μL kemoattraktantopløsning (fMLP eller sputumopløsning) og 100 μl migrationsmedium til deres udpegede indløbsreservoarer ved anvendelse af to pipettere; Dette vil danne en kemoattraktantgradient i gradientkanalen ved kontinuerlig laminær flowbaseret kemisk blanding assisteret af en trykE balanceringsstruktur.
      BEMÆRK: Oplysninger om sputumindsamling fra COPD-patienter findes i afsnit 2.3.
      1. For medium kontrol eksperimentet, kun tilføj migration medium til begge indløb reservoarer.
    3. Få fluorescensbilledet af FITC-Dextran i gradientkanalen.
    4. Importer billedet til ImageJ software ved hjælp af kommandoen "File | Open".
    5. Mål fluorescensintensitetsprofilen over gradientkanalen ved hjælp af kommandoen "Analyze | Plot Profile".
    6. Eksporter måledataene til et regneark for yderligere planlægning.
    7. Inkuber enheden på det temperaturstyrede mikroskopstrin eller i en konventionel cellekulturinkubator i 15 minutter.
    8. Billedgradientkanalen bruger et 10X objektiv til at registrere cellernes endelige positioner til dataanalyse.
    9. Optag celleoverførslen i enheden ved hjælp af time-lapse-mikroskopi, hvis det er nødvendigt.

4. Celleoverførsel DAta-analyse ( figur 1C )

  1. Analyser kemotaxis-analysen ved at beregne cellemigrationsafstanden fra dockingstrukturen som beskrevet nedenfor. Se figur 1C .
  2. Importer billedet i NIH ImageJ software (ver. 1.45).
  3. Vælg midten af ​​hver celle, der flyttede ind i gradueringskanalen.
  4. Mål koordinaterne for de valgte celler for deres endelige positioner. Mål koordinatet for et punkt ved kanten af ​​dockingstrukturen som den indledende referenceposition.
  5. Eksporter de målte koordinatdata til en regnearksoftware ( f.eks. Excel). Beregn migrationsafstanden for cellerne som forskellen mellem en celle endelige position og den oprindelige referenceposition langs gradientretningen.
  6. Kalibrere afstanden til en mikrometer. Beregn gennemsnittet og afvigelsen af ​​migrationsafstanden for alle celler som et mål for kemotaxis.
  7. Sammenlign migRation afstand i nærværelse af en kemoattraktant gradient til medium kontrol eksperiment ved hjælp af Studentens t- test.
  8. Hvis de tidsmæssige billeder af cellemigrationen registreres, kan cellemigrering og kemotaxis analyseres yderligere ved hjælp af celleopfølgningsanalyse 15 .
    BEMÆRK: Materialerne, der kræves for at konstruere og udføre chemotaxis-analysen på hele chip, er beskrevet i materialetabellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neutrofile selekteres negativt fra en dråbe fuldblod direkte i den mikrofluide enhed. Renheden af ​​de isolerede neutrofiler blev verificeret ved on-chip Giemsa-farvning, og resultaterne viste de typiske ringformede og lobeformede kerner af neutrofiler ( figur 2A ) 25 . Dette indikerer en effektiv neutrofile isolering på chip ved høj renhed fra et lille volumen af ​​helblod. Endvidere kan dockningsstrukturen effektivt justere celler ved siden af ​​gradientkanalen før påføring af den kemiske gradient ( figur 2B ) 25 .

Gradientgenerering er baseret på den kontinuerlige laminære flow kemiske blanding, og strømningerne drives af trykforskellen fra de forskellige niveauer af indløbs- og udløbsløsningerne. Ingen eksterne pumper er påkrævet. Den kemiske gradienT er etableret inden for et par minutter i den mikrofluide indretning, som er karakteriseret ved fluorescensintensitetsprofilen af ​​FITC-Dextran over gradientkanalen. Gradienten er stabil i mindst 1 time, hvilket er nok tid til det nuværende neutrofile kemotaksisforsøg ( Figur 1C ).

For at demonstrere anvendelsen af ​​all-on-chip-metoden til celle-migrationsforskning blev neutrofile kemotaksier i medium alene eller i en fMLP-gradient sammenlignet. Testresultaterne viste, at få celler gennemsøgt gennem barrierkanalen i medium kontrol eksperimentet. I modsætning hertil bevægede mange neutrofiler hurtigt gennem barrialkanalen og migreret mod 100 nM fMLP-gradienten ( Figur 2B ) 25 . Cellemigrationstesten måles kvantitativt af migrationsafstanden, hvilket er signifikant højere for fMLP-gradienten end medietekontrollen ( 25 .

Desuden blev all-on-chip-metoden demonstreret for potentielle kliniske anvendelser ved at sammenligne neutrofilmigrationen alene i medium til en gradient af sputumprøve fra COPD-patienter. Resultaterne viste en stærk celle-migration til COPD-sputumgradienten, hvilket kvantitativt er angivet ved den signifikant højere migrationsafstand sammenlignet med mediekontrollen ( figur 2B - C ) 25 .

figur 1
Figur 1: Illustration af all-on-chip-metoden til analyse af neutrofile kemotaxier. ( A ) Illustration af den mikrofluidiske enhed. Enheden indeholder to lag. Det første lag (4 μm høje) definerer cellenL docking barriere kanal for at fange cellerne ved siden af ​​gradientkanalen. Det andet lag (60 μm høje) definerer gradientgenereringskanalen, porten og kanalen til cellebelastning, kemikalieindløbsreservoirerne og affaldsstikket. Justeringsmærker er designet til de to lag. For det andet lag er længden og bredden af ​​den opstrøms serpentin-indgangskanal henholdsvis 60 mm og 200 μm; Længden og bredden af ​​den nedstrøms serpentin-indgangskanal er henholdsvis 6 mm og 280 μm; ( B ) Illustration af all-on-chip-cellisoleringsmetoden; ( C ) Illustration af kemotaxis testen. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Repræsentative resultater afAll-on-chip neutrofil kemotaxis analyse 25 . ( A ) Giemsa-farvningsbillede (ved anvendelse af et 60X objektiv) af alle-on-chip-isolerede celler i den mikrofluidiske kanal; ( B ) Sammenligning af celledistributionen i mediumstyringen, en 100 nM fMLP-gradient og en COPD-sputumgradient; ( C ) Den gennemsnitlige celle-migrationsafstand i gradientkanalen i mediumstyringen, en fMLP-gradient og en COPD-sputumgradient. Fejlfelterne angiver standardfejl for middelværdien (SEM). * Angiver p <0,05 fra Studentens t- test. Tallene er tilpasset fra reference 25 med tilladelse fra World Scientific Publishing. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette dokument blev der beskrevet en detaljeret protokol til direkte isolering af neutrofile fra fuldblod efterfulgt af kemotaxis-testen, alt på en enkelt mikrofluidisk chip. Denne metode giver nyttige funktioner i sin nemme drift, negativt udvalg af neutrofiler med høj renhed, hurtig prøve-til-resultat kemotaxis-test, reducerede reagenser og prøveforbrug og nøjagtig analyse af celleoverførselsdata. Som et groft skøn indlæsede mindst 25% af neutrofilerne fra den indgående helblodprøve effektivt dockningsstrukturen i anordningen, og vi fandt, at neutrofile renheden er høj ved on-chip Giemsa-farvning.

Denne udviklede all-on-chip chemotaxis analysemetode har stort potentiale i forskellige celle migrationsforskning og kliniske anvendelser. En forskningssøgning af denne metode blev påvist ved sammenligning af neutrofile kemotaxier i medium alene til en fMLP-gradient. Tilsvarende kan denne metode anvendes til at teste neutrofil kemotaxis i COPD spuTum som et eksempel på udvikling af en cellefunktionel biomarkør til klinisk diagnose. Med denne metode kan en forsker nemt teste neutrofil kemotaxis til forskellige kemoattraktanter individuelt eller i kombinationer. Forskere kan også teste neutrofil kemotaksis til komplekse kemotaktiske faktorer fra patienter eller testneutrofiler fra syge patienter for det potentielt ændrede kemotaksrespons ved anvendelse af denne metode. Denne integrerede all-on-chip-metode er særlig nyttig til at udføre testen i forskning eller kliniske laboratorier, der ikke har specialiseret cellekultur og levende celledannelsesfaciliteter. Testen kan let betjenes af forskere eller klinikere, der følger denne protokol. For mere avancerede forskningsapplikationer giver denne metode mulighed for tidsforskydningsmikroskopi til at spore individuel cellebevægelse.

Generelt er denne all-on-chip-metode nem at betjene og resultatet er robust. Flere tekniske påmindelser vil yderligere sikre et vellykket eksperiment. Først, thE PDMS replika skal forsigtigt presses på klassesubstratet under plasmabinding for at undgå at skade den meget tynde barriere kanal. For det andet kan fordampningen af ​​mediet i cellebelastningsporten forstyrre den kemiske gradient. Det anbefales at dække cellebelastningsporten med en forseglingsfane under kemotaxis testen. For det tredje skal blodprøven forsigtigt lægges på enheden for at undgå højt tryk, der kan skubbe cellerne over barrierekanalen før kemotaksisforsøg. For det fjerde anbefaler vi at holde magneterne fastgjort til cellebelastningsporten under kemotaxis-analysen for at forhindre uønskede celler i at komme ind i kanalen. Alternativt kan et separat stykke PDMS med et gennemgående hul og de tilknyttede magnetiske diske justeres til indlæsningsporten på enheden. I dette tilfælde kan den øverste PDMS-del med magnetisk diske og de fangede celler fjernes fra anordningen efter cellisolering.

Denne all-on-chIp-metoden kan videreudvikles til at overvinde dens nuværende begrænsninger og forbedre og udvide dens funktionaliteter. For det første tillader den nuværende enhed kun et enkelt assay ad gangen og begrænser således gennemstrømningen. Yderligere udvikling af enheden med flere parallelle testenheder vil forbedre det eksperimentelle gennemløbskrav. For det andet begrænser den nuværende strømningsbaserede kemiske gradientgenerator gradientgenerering i 1D. Yderligere udvikling af 2D eller 3D strømningsfri gradientgeneratorer vil bedre efterligne de fysiologiske gradientforhold. For det tredje kan denne all-on-chip-metode i princippet bruges til at teste andre hvide blodlegemetyper, såsom T-celler, B-celler og NK-celler ved anvendelse af lignende magnetcelleisoleringssæt. Det vil være vigtigt at studere, om denne metode effektivt kan bruges til at teste blodcellepopulationerne ved lavere frekvens og de celler, der kræver aktivering og kultivering på chip før kemotaxis-testen. Så er all-on-chip-cellisoleringsmetoden ca.N forlænges yderligere for nogle andre applikationer. Forskellig barrierekanaltykkelse blev testet, og resultaterne viste, at 3-4 μm er mest egnet til neutrofilmigrationseksperimentet; Det vil sige, at den fangede tilstrækkeligt de ustimulerede celler og lod cellerne kravle gennem barrierkanalen efter stimulering. Barrierekanaldimensionen bør optimeres for forskellige celletyper. Endelig vil denne integrerede og hurtige kemotaxis-test give forskere mulighed for at udforske relevante kliniske applikationer. For at muliggøre praktisk test i klinikker er der udviklet et bærbart system, der integrerer den mikrofluidiske enhed, temperatur og scenekontrol, samt smartphone-baserede optiske billeddannelses- og dataanalysemoduler. Udover den COPD-relaterede undersøgelse som vist i dette dokument, testes cellemigrationen for andre relevante sygdomme som kronisk nyresygdom ved hjælp af denne all-on-chip-metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Der er ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgements

Dette arbejde støttes delvist af stipendier fra Canadas Naturvidenskabsforskningsråd (NSERC) og de canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR). Vi takker Det Kliniske Institut for Anvendt Forskning og Uddannelse på Victoria General Hospital i Winnipeg og Seven Oaks General Hospital i Winnipeg til styring af kliniske prøver fra mennesker. Vi takker Dr. Hagit Peretz-Soroka for en god diskussion om analyseprocessen. Vi takker professor Carolyn Ren og Dr. Xiaoming (Cody) Chen fra University of Waterloo for deres generøse støtte i filmen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Device fabrication
Mask aligner ABM N/A
Spinner Solitec 5000
Hotplate VWR 11301-022
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-001
Vacuum dessicator Fisher Scientific 08-594-15A
Digital scale Ohaus CS200
SU-8 2000 thinner Microchem SU-8 2000
SU-8 2025 photoresist Microchem SU-8 2025
SU-8 developer Microchem SU-8 developer
Si wafer Silicon, Inc LG2065
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-4
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane Gelest 78560-45-9
Polydimethylsiloxane
(PDMS)
Ellsworth Adhesives 2065622
Petri Dish Fisher Scientific FB0875714
Glass slides Fisher Scientific 12-544-4
Cutting pad N/A N/A Custom-made
Punchers N/A N/A Custom-made
Name Source Catalog Number Comments
On-chip cell isolation and chemotaxis assay
RPMI 1640 Fisher Scientific SH3025502
DPBS Fisher Scientific SH3002802
Bovine serum albumin
(BSA)
Sigma-Aldrich SH3057402
Fibronectin VWR CACB356008
fMLP Sigma-Aldrich F3506-10MG
Magnetic disks Indigo Instruments 44202-1 5 mm in diameter,
1 mm thick
FITC-Dextran Sigma-Aldrich FD10S
Rhodamine
Sigma-Aldrich
R4127-5G
Giemsa stain solution Rowley Biochemical Inc. G-472-1-8OZ
EasySep Direct Human
Neutrophil Isolation
Kit
STEMCELL
Technologies Inc
19666
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
Nikon Ti-U inverted fluorescent microscope Nikon Ti-U
Microscope environmental chamber. InVivo Scientific N/A
CCD camera Nikon DS-Fi1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, (13), 159-175 (2013).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6, (12), 1182-1190 (2005).
  3. Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43, (6), 1430-1435 (2013).
  4. Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132, (4), 612-630 (2008).
  5. Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3, (12), 921-930 (2003).
  6. Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11, (3), e1004651 (2015).
  7. Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210, (7), 1283-1299 (2013).
  8. Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139, (7), 1349-1360 (1997).
  9. Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23, (3), 149-158 (2013).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, (3), 453-466 (1962).
  11. Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13, (13), 2484-2499 (2013).
  12. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, (7491), 181-189 (2014).
  13. Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2, (11-12), 584-603 (2010).
  14. Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6, (2), 191-198 (2006).
  15. Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33, (4), 475-482 (2005).
  16. Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2, (11-12), 639-647 (2010).
  17. Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9, (12), e114509 (2014).
  18. Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5, (7), e11921 (2010).
  19. Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10, (5), e0126523 (2015).
  20. Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120, (14), e45-e53 (2012).
  21. Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8, (12), 2054-2061 (2008).
  22. Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
  23. Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100, (1), 241-247 (2016).
  24. Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111, (16), 5813-5818 (2014).
  25. Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04, (02), 104-109 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics