המדידה בו זמנית HDAC1 ופעילות HDAC6 הלה תאים באמצעות UHPLC-MS

* These authors contributed equally
Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

השיטה הנוכחית משמש לזיהוי מעכבי isoform ספציפיים של היסטון deacetylases (HDAC) בתאים הלה על ידי ניתוח UHPLC-MS של סובסטרטים מרובים. זוהי שיטה ללא נוגדנים שפותחו כדי לשקף את פעילות HDAC1, HDAC6 החיים בסביבת תא, בניגוד חד-isoform תא ללא מבחני.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Simões-Pires, C. A., Zwick, V., Cretton, S., Cuendet, M. Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS. J. Vis. Exp. (126), e55878, doi:10.3791/55878 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

החיפוש אחר חדש היסטון deacetylase (HDAC) מעכבי היא גוברת ההתעניינות גילוי תרופות. Isoform סלקטיביות באור הזרקורים מאז האישור של romidepsin, מחלקה אני HDAC מעכב טיפול בסרטן, החקירה קליני של מעכבי HDAC6 ספציפיים עבור מיאלומה נפוצה. השיטה הנוכחית משמש כדי לקבוע את פעילות המעכבת של תרכובות מבחן על HDAC1 ועל HDAC6 בתאים. הפעילות isoform נמדד באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של ביצועים גבוהה במיוחד – ספקטרומטר מסה (UHPLC-MS) ניתוח של סובסטרטים ספציפי מודגרות עם תאים הלה טיפול ללא טיפול. השיטה יש את היתרון של המשקף את הפעילות HDAC אנדוגני של סביבת התא, בניגוד ללא תא הביוכימי מבחני שנערכו על איזופורמים מבודד. יתר על כן, משום שהיא מבוססת על כימות של סובסטרטים סינתטי, השיטה אינה דורשת הכרה נוגדן של חלבונים acetylated אנדוגני. . זה בקלות לצורכי מספר שורות תאים, תהליך אוטומטי. השיטה כבר הוכיח שימושי למצוא את תרכובות סלקטיבית HDAC6 neuroblasts. נציג התוצאות מוצגות כאן עם תקן HDAC מעכבי trichostatin (שאינם ספציפיים), MS275 (HDAC1-ספציפי), tubastatin (HDAC6-ספציפי) באמצעות תאים הלה.

Introduction

HDACs שייך למשפחת אנזימים מסוגלים deacetylate שינויים היסטוניים בתוך מבנה כרומטין. הם גם יש מצעים חלבונים אחרים ציטוזול, ממוקמים תאים תאים שונים. סך של 18 HDAC איזופורמים זוהו עד כה, קשורה עם מספר מנגנונים התא, לרבות ברגולציה של גורמי שעתוק גנים, וכן איתות התא ולהעביר1,2,3,4,5,6,7. מעכבי קטליטי HDAC הופיעו כמו תרופות טיפולית לטיפול בסרטן. רוב מעכבי HDAC כעת אושרה על ידי ה-FDA לטיפול של לימפומה T-cell, מיאלומה נפוצה, הן מעכבי HDAC שאינם ספציפיים, כגון vorinostat (סאהה), belinostat panobinostat8,9. עם זאת, סדרה של תופעות לוואי קושרו עם פאן-מעכבי, החיפוש אחר מולקולות קטנות isoform ספציפי הוא נושא חם בגילוי כימיה, סם מרפא. בהתאם לכך, המחלקה אני romidepsin מעכב סלקטיבי (HDAC1-3 ו- HDAC8) הוא סמים שאושרו כבר10, בעוד HDAC6 ספציפיים מעכבי מהתוואי ניסויים קליניים, עם הגדלת הפוטנציאל הטיפולי מיאלומה11,12,13,14,15.

הקרנת מבחני לאפיין HDAC מעכבי מבוססים על הדגירה של מצע HDAC עם מקור אנזימטי (isoform בודד, תמצית גרעיני או תא lysate). המצע הוא בדרך כלל רצף פפטיד קטן המכיל של שאריות ליזין אצטיל מצמידים fluorophore cleavable (למשל, קומרין), כגון N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)16. כדי להבחין בין פעילויות ספציפיות isoform, נפרד ללא תא מבחני מעורבים כל isoform נחוצים ולא עשוי לשקף את הפעילות isoform אמיתי בתאים חיים. מצעים Isoform ספציפיים זמינים מסחרית, כגון בנזיל (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 סובסטרט מסוים), (אסתר טרט חומצה-בוטיל S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic (BATCP, המצע ספציפי HDAC6) (איור 1B). עם זאת, תערובת מצע מרובה המכילה מאל, MOCPAC, BATCP ניתנה לתאים חיים לא ארשה זיהוי המוצרים deacetylated הבודדים על ידי מדידה fluorometric, נתון כי הם נושאים את אותו fluorophore cleavable.

השיטה המתוארת כאן מאפשר זיהוי, כימות היחסי של כל המצע ואת המוצר שלה deacetylated בתאים הלה שימוש assay המצע מרובה ואחריו ניתוח UHPLC-ESI-MS/MS17. HDAC assay מתנהל על הלה תאים כדי לאפשר זיהוי ישיר של פעילות המעכבת HDAC ושל יחודיות של מבחן והמתחמים HDACs אנדוגני. יש דגש על HDAC1 ו HDAC6, אשר יוערכו בו זמנית. כדי להשיג אלה מידות אנזימטי וזמינותו דגירה יחיד, תערובת של סובסטרטים HDAC שאינם ספציפיים ולא ספציפי מתווסף תאים הלה טיפול ללא טיפול מצופה על צלחת 96-ובכן. בעקבות שלב הדגירה, התאים הם lysed כדי לשחרר את סובסטרטים ומוצרים שלהם התגובה המתאימים, אשר מופרדים וזוהה באמצעות שיטה UHPLC-MS (איור 1C). המוצרים deacetylated של סובסטרטים מל, MOCPAC ו- BATCP הם מל deacetylated (dMAL) deacetylated MOCPAC (dMOCPAC), deacetylated BATCP (dBATCP), בהתאמה. יכול להיות בנוי עקומות מנה-תגובה עם חומרים פעילים.

Figure 1
איור 1: ערכת כללי עבור מבוססת-תא HDAC וזמינותו לזהות מעכבי ספציפיים HDAC1 או HDAC6 על ידי ניתוח UHPLC-MS של סובסטרטים מרובים. בסכמה (A) צלחת 96-ובכן אופייני המכיל מטופלים (מבחן תרכובות), תאים הלה אינו מטופל (שליטה), כמו גם ללא תאים ריקים. (B) המבנה הכימי של סובסטרטים הוסיף תערובת (21 מיקרומטר כל) כדי להיות deacetylated על ידי HDACs אנדוגני. (ג) chromatogram UHPLC טיפוסי-MS מציג את הפסגות של סובסטרטים הוסיף את (MAL, MOCPAC ו BATCP) ומוצרים deacetylated שלהם (dMAL, dMOCPAC, ו- dBACTP, בהתאמה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תרבית תאים

הערה: השלבים הבאים מבוצעות בשכונה רגילה תרביות רקמה. היכרות עם סטרילי טכניקה צפוי.

  1. התרבות התאים הלה עד 80% confluency בבקבוקון תרבות תא T75 ב MEM בתוספת 10% סרום שור עוברית, פניצילין G (100 U/mL), ואת סטרפטומיצין (100 מ"ג/מ"ל).
    הערה: התרבות תאים, וטיפול, פירוק צעדים מתנהלים תחת זרימה שכבתית, בצעדים הדגירה תא ב 37 מעלות צלזיוס הופיעה אווירה humidified של 5% CO2 בתנאים סטריליים.
  2. לשטוף את התאים פעמיים עם 5 מ של DPBS, וארוקן את DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של ריאגנט דיסוציאציה התא. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לנתק את התאים.
  3. 9 מיליליטר MEM תרבות בינוני, ביסודיות resuspend התליה תא, וספירה התאים באמצעות של hemocytometer.
  4. להתאים את הצפיפות של התליה תא 6 x 104 תאים/מ במם.
  5. להוסיף 100 µL של השעיה התא לפקד ובדוק הבארות של צלחת 96-ובכן סטרילי, שטוח התחתונה, שטופלו תרביות רקמה (איור 1 א').
  6. להוסיף µL 100 מם תרבות בינוני בארות ריק של צלחת 96-ובכן (איור 1 א').
  7. דגירה לצלחת 96-ובכן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    הערה: דגירה 24 שעות ביממה הוא זמן מתאים כדי לבדוק את פעילות HDAC אנדוגני בתאים הלה. סוגי תאים שונים בפעילות לא נודע HDAC עשוי להזדקק הערכה timecourse של תאים שליטה.

2. התא טיפול עם מבחן תרכובות ותערובות גידול HDAC

  1. האחות המדיום מן הבארות של צלחת 96-ובכן.
  2. להוסיף 25 µL של 2 x תרכובות מבחן (למשל, trichostatin A, MS275, tubastatin A) ב MEM לבדיקת בארות. להוסיף 25 µL של גברת וולס ריק ובקרה.
    הערה: הריכוז של תרכובות מבחן זה יותאם לספק מגוון של המבחן האחרון לפחות 5 ריכוזי (ריכוז אחד לכל טוב). דימתיל סולפוקסיד הריכוז הסופי במבחן תרכובת לא יעלה על 0.5%, צריכה להיות זהה בכל היטב, לרבות כדורי סרק, ופקדים. אמצעי האחסון הדגירה הסופי נמצא µL 50 לכל טוב. Trichostatin A נבדק בריכוזים 5 ועד 500 1.95 nM (דילול 1:4). MS275 ו- tubastatin A נבדקים בריכוזים 5 ועד 8,000 6.17 nM (דילול 1:6). הריכוז במבחן הסופי הרצוי עבור כל בדיקה מורכבת צריך להיקבע על ידי כל משתמש בודד על-ידי יצירת עקומת מנה-תגובה.
  3. להוסיף 25 µL של תערובת מצע (42 מיקרומטר של מל, מיקרומטר 42 של MOCPAC מיקרומטר 42 של BATCP ב MEM) וולס בקרה ובדיקה. להוסיף 25 µL של גברת וולס ריק.
    הערה: הריכוז הסופי של כל המצע הוא 21 מיקרומטר. MOCPAC ו- BATCP להבחין בין פעילות HDAC1 ו- HDAC6, בהתאמה (איור 1B). כאשר אין פעילות נצפית עם מצעים האלה, הזיהוי של פעילות נגד isoform HDAC אחרת שעשויה להוביל השימוש מאל.
  4. דגירה לצלחת 96-ובכן ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות % 5 humidified CO2 מיכלים.
    הערה: הפעם הדגירה מתאים הלה תאים ומאפשר את HDAC אנדוגני לקיים אינטראקציה עם סובסטרטים סינתטי. שורות תאים שונים עשויים לדרוש התאמות בריכוז זמן ו/או המצע הדגירה.

3. תא פירוק והכנה מדגם UHPLC-ESI-MS/MS

התראה: השלבים הכנה מדגם משתמשים כימיקלים אורגניים, שהן מאוד דליק, רעילים על ידי בליעה או שאיפה. לענוד הגנה אישי המתאים, כגון כפפות בטיחות משקפיים.

  1. להוסיף 10 µL 6 x RIPA מאגר (מדולל מהמאגר x RIPA 10) בתוספת מעכב פרוטאז מכל קידוח של צלחת 96-ובכן.
  2. לעצור את התגובה על-ידי הוספת 160 µL של acetonitrile קר מכל קידוח ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    הערה: שמור את acetonitrile ב-20 ° C לפני צעד זה.
  3. מניחים על הצלחת במקפיא-80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. הסר את הלוחית מהמקפיא ולהעביר µL 220 של התוכן של כל טוב צלחת שאינו סטרילי, 96-ובכן חרוט-התחתון (V-למטה). Centrifuge את הצלחת ב 5,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: שלב זה נועד להסרת חלבונים ומלח. במידת הצורך, ניתן הפתרונות להעביר צינורות בודדים צנטריפוגה חרוט לפני צנטריפוגה או מסוננים דרך סדרה של 96-ובכן, 0.65 מיקרומטר PVDF מסנן צלחות. הסרת מוצלח של התמיסה נדרשת לפני ניתוח UHPLC.
  5. להעביר µL 200 תגובת שיקוע (או פילטרט של) לתוך צלחת 96-ובכן תואם עם מערכת UHPLC, לאטום אותו בנייר peelable, חום איטום באמצעות סילר לאיטום של צלחת.
    הערה: יש להימנע pipetting כדורי בעת הסרת את supernatants. אם הניתוח UHPLC אין אפשרות לבצע באופן מיידי, ניתן לאחסן את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס לכל היותר 24 שעות עד הניתוח.

4. UHPLC/MS-MS ניתוח

  1. להכין את המערכת UHPLC באמצעות מילוי זה עם מערכת שלב ניידים (95% A:5% B):
    ת: H2O, HPLC-כיתה, המכיל חומצה פורמית 0.1% (להכנת 1 ליטר)
    ב': Acetonitrile, HPLC-כיתה, המכיל חומצה פורמית 0.1% (להכנת 1 ליטר).
    התראה: השלב הנייד מכיל כימיקלים אורגניים, שהן מאוד דליק, רעילים על ידי בליעה או שאיפה. לענוד הגנה אישי המתאים, כגון כפפות בטיחות משקפיים.
  2. מקם את הצלחת 96-ובכן לתוך למנהל מדגם המכיל בעל צלחת. הפעל את הדגימות בהתאם לתנאי UHPLC-ESI-MS/MS הניתנים טבלה 1.
    הערה: כל עמודה של צלחת 96-ובכן האנליטי צריך פקד אחד טוב וכל אחד ריק (כפי שהיא מתוארת התכנית צלחת של איור 1 א'). פקדים הם נציג של 100% פעילות אנזימטי בתור תא שנבדקו, בעוד ריקים נמצאים שם כדי לבדוק אם המקור MS מספקת רקע עקבית. יש להתייחס בקפידה יוצא דופן פסגות MS זוהה על ריק נתון כדי למנוע שינויים רגישות MS.

5. ניתוח נתונים

  1. לשלב אזור שיא לכל סובסטרט, המוצר deacetylated שלה עם תוכנה לשילוב המתאים UHPLC.
    הערה: השתמש בפרמטרים שילוב אוטומטי עם שיטת החלקת (ממוצע, גודל החלון 3, ומספר חלקה 2, לדוגמה). באמצעות התנאים כרומטוגרפי הניתנים טבלה 1, • תנאי הסדר הוא dMAL (5.8 דקות), dBATCP (6.0 דקות), dMOCPAC (6.2 דקות), מל (7.6 דקות), MOCPAC (8.9 דקות) ו BATCP (9.8 דקות), כפי שהיא מתוארת דמות 1C.
  2. לכל סובסטרט, לחשב את היחס אזור הפסגה (deacetylated/acetylated) על כל chromatogram (בדיקה ובקרה דגימות).
  3. לחשב עיכוב HDAC אחוז של כל מדגם הבדיקה:
    Equation
    הערה: עיכוב HDAC1 מחושבת באמצעות היחס באזור שיא של dMOCPAC/MOCPAC; עיכוב HDAC6 מחושבת dBATCP/BATCP. יחס dMAL/מל יכול לשמש כדי להביע את עיכוב HDAC כללי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להדגים את היישום של השיטה לזיהוי מעכבי לא בררניים, סלקטיבי עבור HDAC1 (מחלקה אני) ו HDAC6 (כיתה IIb), הלה תאים שטופלו תרכובות ידועות סטנדרטי: trichostatin A (לא בררניים בין HDAC1 ו HDAC6)18, MS275 (מעכב סלקטיבי-HDAC1)19ו- tubastatin (מעכב סלקטיבי-HDAC6)20. באמצעות השיטה הנוכחית (איור 1), IC50 ערכים יכול ישירות שיקבע בתאים חיים עבור HDAC1 (על-ידי צפייה MOCPAC deacetylation), HDAC6 (מסתכל BATCP deacetylation) (איור 2). Trichostatin A היה מעכב חזק אבל לא בררניים לכיוון HDAC1 ו- HDAC6. מצד שני, MS275 היה סלקטיבי עבור HDAC1, בעוד tubastatin A היה בבירור סלקטיבית עבור HDAC6.

Figure 2
איור 2: IC50 מנה-תגובה עקומות בעת ובעונה אחת השיג עבור HDAC1 ו- HDAC6 של שלושה מעכבי HDAC סטנדרטי: את trichostatin לא בררניים A, את MS275 HDAC1 סלקטיבית, את tubastatin HDAC6 סלקטיבית א IC50 הערכים המוצגים בטבלה סמוכים הם זאת אומרת ± SD של שלוש מדידות עצמאי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

נפח הזרקה 5 ΜL
טור סי18 (2.6 μm, זיהוי 100 מ"מ x 3 מ"מ)
טור טמפרטורה 40 ° C
קצב הזרימה • תנאי 0.8 mL/min (טווח הלחץ טיפוסי: 400-600 ברים)
• תנאי מעבר צבע 5-45% B תוך עשר דקות
45-98% B-2 דקות
לשטוף את שלב 98% B למשך 2 דקות
שלב equilibrating 5% B במשך 4 דקות
ESI-MS/MS קונוס מתח, 30 וולט; צינור קפילר מקור מתח, 3.0 kV; צינור קפילר טמפרטורה, 350 ° C; מקור החום, 120 ° C; מעטפת גז - חנקן (600 L/h); התנגשות לחץ גז, ארגון מוגדר mbar-3 3 x 10
התנגשות פרמטרים וערוצי התגובה ממוטבת עם זמן להתעכב של 0.1 s, 0.01 s של אנרגיית התנגשות ועיכובים interscan שוכן בגובה 20 eV.
מל הזיהוי עם המוני מעברים 446 ← 346 (MAL) ו- 404 ← 304 (dMAL).
גילוי MOCPAC עם המוני מעברים 494 ← 449 (MOCPAC), 439 ← 394 (dMOCPAC).
גילוי BATCP עם המוני מעברים 500 ← 400 (BATCP), 476 ← 376 (dBATCP).

טבלה 1: UHPLC-ESI-MS/MS תנאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עיכוב HDAC הוא נושא חם, גילוי תרופות, תוך התמקדות מעכבי HDAC6 סלקטיבית עבור סרטן טיפול21הנוכחי. HDAC סלקטיביות מוערך בדרך כלל על ידי סדרה של מבחני תפוקה גבוהה, ללא תאים, אשר מתכוון לקבוע את העוצמה מעכבות לכיוון HDAC בודדים איזופורמים21. עם זאת, מידת הבררנות של מעכב יש בנוסף לאשר בתאים חיים הערכת המצב acetylation של מצעים חלבון אנדוגני, כגון שינויים היסטוניים (עבור מחלקה אני HDACs) וטובולין (עבור HDAC6). לכן, תא מבחני מעורבים זיהוי נוגדנים (למשל, immunostaining תספיג, cytometry זרימה, אליסה) בדרך כלל נחוצים כדי להשיג הערכה כמותית או חצי כמותית של isoform העוצמה של תרכובת נתונה חי תאים21. . זה לא נדיר כי מתחם זה היה סלקטיבי assay אנזימטי ללא תא הופך להיות לא בררניים17,של תאים או רקמות-22, סגן להיפך19... זו יכולה להיות מוסברת על ידי הבדלים שאינם סטנדרטיים מקורות אנזימטי והיעדר שיתוף גורמים או חלבון שותפים מבחני הביוכימי21.

השיטה המתוארת כאן היא חלופה מהירה, ללא נוגדנים ומאפשר למדידה ישירה של מחלקה אני (HDAC1) ו class IIb (HDAC6) עוצמת מעכבות בסלון תא הסביבה17. יתרון נוסף של השיטה הוא כי זה בקלות ניתן להתאים שורות תאים שונים, כגון neuroblasts23, עם אפשרות המזעור, אוטומציה, כפי שתואר קודם לכן עבור אחרים מבחני מבוססת תא24. הגילוי של סובסטרטים ספציפי באמצעות ספקטרומטר מסה תורמת למדידה מדויקת של המוצרים deacetylated, לספק תוצאות כמותיות דומות. זה השיטה הראשונה זמין עבור קביעת ערכי50 IC לכיוון איזופורמים HDAC ספציפי בתאים חיים. למען ההשוואה, לפרופיל סלקטיבי שאינם כמותיים של מעכבי HDAC שנצפה על ידי תספיג הוכחו להיות בקו אחד עם הפרופיל סלקטיביות שהושג עם השיטה המתוארת כאן17. גם אם שיטה זו פותחה עבור הגילוי של מעכבי HDAC סלקטיבית מחלקה חדשה, זה יכול גם להיות מיושם למדוד פעילות HDAC בתוך התא מודלים לאורך ימי מחלה. זה יכול לתרום הבהרה של מנגנוני epigenetic ומולקולרית מחלות רלוונטיות, יוכל לזהות פוטנציאל המועמדים סמים. לאור חיוץ בשיטה זו כלפי איזופורמים HDAC חוץ HDAC1, HDAC6, התפתחות חדשה-סלקטיבית HDAC סובסטרטים הוא מומלץ מאד. יתר על כן, יחודיות המצע של MOCPAC ו- BATCP צריך להיות באופן מלא מאופיין מבחינת פילוח איזופורמים יחיד. ואכן, בעוד MOCPAC מסווג כ המצע HDAC1 ספציפיים (מחלקה אני מעל class II), סביר יותר כי זה כללי מחלקה אני המצע (כולל HDAC3 isoform), כפי שהוכח בעבר25. בהתאם לכך, BATCP הוא מצע HDAC6 סלקטיבית ידועים (מחלקה השני מעל מחלקה אני HDACs), אבל ירידה לפרטים שלו כלפי אחרים class II HDACs, כגון HDAC4, מגיע עוד יותר אפיון25.

פעילות אנזימטי עשוי להשתנות בהתאם לקו תא, תא מספר, confluency, וזמן הדגירה. כאשר קו תא משמשת בפעם הראשונה ב וזמינותו, חשוב לבחון את מגוון של ריכוז המצע בתאים שליטה, בנקודות זמן שונות, כדי לנתח את קינטיקה אנזימטית על-ידי UHPLC-MS (למשל, דרך מגרש קינטיקת מיכאליס-מנטן). זה יאפשר לחוקרים לבחור את המתאימים ביותר הדגירה הזמן המצע הריכוז. בחירה זו מסתמכת על שני פרמטרים עיקריים: קינטיקה אנזימטית 1) ו- 2) הזיהוי של מצעים ומוצרי deacetylated שלהם. בעת ניתוח קינטיקה אנזימטית, זה חיוני כדי להעריך את ערכי מהירות התחלתית (קרי, בעת היווצרות המוצר נמצא בטווח לינארי) להקים את קינטיקה אנזימטית. בהתאם קינטיקה, ריכוז המצע מתחת Km צריך להיבחר כדי לספק של אחוז מדויק של עיכוב, במיוחד במקרה של מעכבי תחרותי and תחרותי26. מצד שני, ריכוז המצע שבחרת צריך לספק אותות MS לזיהוי, הניתנת לכימות המצע וגם מוצר deacetylated (יחס אות לרעש ≥ 20)17. כאשר משתמשים מרובים סובסטרטים, השיטה כרומטוגרפי יבטיח את ההפרדה של פסגות כל כדי להיות מנותח. מערכות כרומטוגרפי אלטרנטיבית עשויים לדרוש שינויים בסוג הדרגתי ועמודה ההפרדה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים להכיר עלות פעולה CM1406 (Epigenetic ביולוגיה כימית). מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי קרן פייר מרסייה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BATCP Sigma-Aldrich B4061
MAL Sigma-Aldrich SCP0168 Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC Sigma-Aldrich M2195
MS275 Sigma-Aldrich EPS002
Trichostatin A Sigma-Aldrich T8552
Tubastatin A Sigma-Aldrich SML0044
Acetonitrile, HPLC grade Fisher Scientific 10660131
Formic acid, LC/MS grade Fisher Scientific 10596814
H2O, HPLC grade distilled H2O filtered through a Milli-Q purification system
HeLa cells ATCC ATCC CRM-CCL-2
Cell dissociation reagent TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604013
DMSO, cell culture grade Applichem 146463
DPBS ThermoFisher Scientific 14190144
Fetal bovine serum Biowest S1810
MEM ThermoFisher Scientific 22561021
Penicillin-Streptomycin Bioconcept 4-01F00-H
10x RIPA buffer Abcam ab156034
SigmaFast protease inhibitor tablets Sigma-Aldrich S8820
96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning VWR 29442-058
96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning VWR 29442-404 used in the centrifugation step
96-well plate, conical bottom, Nunc ThermoFisher Scientific 249944 compatible with the Acquity UHPLC system
T75 cell culture flasks Corning Sigma-Aldrich CLS430641
Peelable heat sealing foil Waters 186002789
Acquity UPLC system Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R Fisher Scientific 05-413-323
Integration software: MassLynx V4.1 Waters Catalog number not available
Combi thermo-sealer SP-0669/240 Waters Catalog number not available
Quattro micro API Tandem Quadrupole System Waters Catalog number not available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11, (5), 384-400 (2012).
  2. Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26, (14), R644-R648 (2016).
  3. Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7, (8), (2012).
  4. Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115, (6), 727-738 (2003).
  5. Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26, (7), 2782-2790 (2006).
  6. Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12, (2), 142-148 (2002).
  7. Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs? Mol Neurodegener. 8, (7), 1-16 (2013).
  8. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20, (3), 3898-3941 (2015).
  9. Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
  10. Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28, (12), 1259-1266 (2010).
  11. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215). Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211).
  12. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma. Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012).
  13. U.S. National Institutes of Health. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma. Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013).
  14. U.S. National Institutes of Health. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma. Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015).
  15. Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17, (11), 1569-1578 (2016).
  16. Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13, (6), 935 (2003).
  17. Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31, (1), 209-214 (2016).
  18. Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409, (2), 581-589 (2008).
  19. Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325, (3), 683-690 (2004).
  20. Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132, (31), 10842-10846 (2010).
  21. Jung, M., Yong, K. -J., Velena, A., Lee, S. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. Sippl, W., Jung, M. Wiley-VCH. (2010).
  22. Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10, (3), 1191-1207 (2011).
  23. Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26, (20), 4955-4959 (2016).
  24. Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372, (1), 72-81 (2008).
  25. Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47, (21), 5235-5243 (2004).
  26. Copeland, R. A. Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. Wiley. (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics