सेमी स्वचालित के लिए बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड समानता एजेंट खोज और परिणामस्वरूप अलग करने का विश्लेषण

Biochemistry
 

Summary

panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों पेप्टाइड अपनत्व एजेंट, एंटीबॉडी के लिए एक मजबूत विकल्प की खोज के लिए एक सिद्ध तकनीक है । अर्द्ध स्वचालित छंटाई विधि इस के साथ साथ झूठी सकारात्मक की घटना को कम करने के लिए panning सुव्यवस्थित है । यहां हम सोचा प्रक्रिया और उंमीदवारों के मूल्यांकन में लागू तकनीकों और बहाव विश्लेषण को कम करने का वर्णन ।

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Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

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Abstract

panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों दोनों बायोटिक और अजैव लक्ष्यों की पहचान के लिए पेप्टाइड समानता एजेंट खोज के लिए एक सिद्ध तकनीक है । पेप्टाइड संबध एजेंट संवेदन और चिकित्सकीय सहित एंटीबॉडी के लिए इसी तरह के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन अधिक मजबूत और अधिक चरम वातावरण में प्रदर्शन करने में सक्षम हैं । पेप्टाइड कैप्चर एजेंटों के हित के एक प्रोटीन लक्ष्य के लिए विशिष्ट संवर्धन अर्द्ध का उपयोग कर बढ़ाया है स्वचालित तरीकों जो बाध्यकारी और धो चरणों में सुधार और इसलिए झूठी सकारात्मक बांधने की घटना में कमी । एक अर्द्ध स्वचालित छंटाई विधि एक वाणिज्यिक स्वचालित चुंबकीय के साथ उपयोग के लिए इस के साथ साथ प्रयोग के लिए बताया गया है सेल छँटाई एक स्वैच्छिक जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय यादृच्छिक 15-मेर पेप्टाइड्स एक्सप्रेस छँटाई. मामूली संशोधनों के साथ, इन तरीकों अन्य स्वचालित उपकरणों, अन्य छंटाई पुस्तकालयों के लिए विस्तार कर रहे हैं, और अन्य जीवों. इस काम का एक प्राथमिक लक्ष्य के लिए एक व्यापक पद्धति प्रदान करना और सोचा व्याख्या विश्लेषण में लागू की प्रक्रिया और उंमीदवारों के परिणामस्वरूप पूल ंयूनतम है । इन तकनीकों का विश्लेषण करने के लिए ऑन-सेल बाइंडिंग का उपयोग प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष सॉर्टिंग (FACS), सॉर्टिंग के दौरान और विशिष्टताओं का आकलन करने के लिए और व्यक्तिगत उंमीदवारों की तुलना में, और पेप्टाइड अनुक्रम के विश्लेषण प्रवृत्तियों की पहचान करने के लिए और सहमति और संभावित हित के लक्ष्य के लिए समानता और विशिष्टता में सुधार के लिए अनुक्रम ।

Introduction

panning एक सिद्ध तकनीक अपनत्व reagent खोज के लिए है, बैक्टीरियल डिस्प्ले पुस्तकालयों के साथ पेप्टाइड संबंध के लिए एक सुविधाजनक स्रोत 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. इसी प्रकार फेज प्रदर्शन के लिए 25,26 और खमीर प्रदर्शन 27,28, पेप्टाइड्स सेल सतह पर उजागर कर रहे हैं और इन बातचीत के साथ, दोनों बायोटिक और अजैव लक्ष्य के लिए बाध्य करने के लिए उपलब्ध हैं दोनों पेप्टाइड रीढ़ और एमिनो एसिड पक्ष के अद्वितीय गुणों से प्रेरित- 29जंजीरों । फेज प्रदर्शन के विपरीत, बैक्टीरिया स्वयं नकल कर रहे है और सभी आनुवंशिक बाध्य फेज और कोशिकाओं के पुनः संक्रमण के रेफरेंस के बिना प्रदर्शन के लिए आवश्यक सामग्री शामिल हैं । खमीर प्रदर्शन के विपरीत, बैक्टीरियल प्रदर्शन तेजी के कारण तेजी से है (लगभग 20 मिनट 30) ई कोलाईके दोहरीकरण समय । आने वाले पेप्टाइड संबध एजेंट बंद सेल संवेदन प्लेटफार्मों की एक किस्म में उपयोग के लिए उत्पादन किया जा सकता है 16,17,26 और जब-सेल 2 पर प्रदर्शित सामग्री के रूप में जीवित रहने के रूप में उपयोग के लिए क्षमता है , 31 , ३२. के रूप में विशिष्ट लक्ष्यों को मांयता के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की तुलना में, पेप्टाइड्स बहुत छोटे है और अधिक लचीला है, और पेप्टाइड प्रदर्शन पुस्तकालयों आसानी से डीएनए के स्तर पर हेरफेर किया जा सकता है विशिष्ट अमीनो एसिड से बचने के लिए, जैसे cysteine ३३ . पेप्टाइड्स तेजी से चिकित्सकीय ३४,३५,३६ और अन्य अनुप्रयोगों के लिए शोषण कर रहे हैं, जहां एंटीबॉडी आमतौर पर डिस्कवरी के अपने आसानी की वजह से उपयोग किया जाएगा, प्रतिलिपि सिंथेटिक (ऑफ सेल ) उत्पादन, और चरम वातावरण में प्रदर्शन के बेहतर रखरखाव, भी उच्च तापमान या प्रशीतन के बिना लंबी अवधि के भंडारण के लिए जोखिम के बाद एक कार्यात्मक एजेंट प्रदान ३७,३८। रिएजेंट के भंडारण के लिए शीत श्रृंखला पर काबू पाने की क्षमता विशेष रुचि के रक्षा विभाग के लिए है, उदाहरण के लिए, जो चरम वातावरण में काम करना चाहिए । थर्मल स्थिरता इसलिए इस पांडुलिपि में उदाहरण के रूप में दिए गए चुने हुए लक्ष्यों को पहचानने के लिए एक वांछनीय विशेषता थी ।

हाल ही में, panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों अर्द्ध स्वचालित चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (एमएसीएस या MCS) तरीकों 9,14,३९के उपयोग के साथ और भी अधिक सरल और विश्वसनीय हो गया है । इन तरीकों जैविक लक्ष्य के लिए विभिंन लाभों के साथ कई समान छंटाई प्लेटफार्मों का उपयोग कर, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्वचालित चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई (autoMCS या) साधन (के तालिका देखें सहित का प्रदर्शन किया गया है सामग्री) 1,14,15 और अधिक विशेष उपकरणों जो एक डिस्पोजेबल कारतूस 7,9 या चिप ३९, के साथ उपयोग के लिए एक मूल्यवान विनिर्देश में नमूना संलग्न जीवों या विषाक्त पदार्थों है कि सुरक्षा के स्तर 2 (बीएसएल-2) या उच्चतर7हैं । इन अर्द्ध स्वचालित तरीकों को अजैव सामग्री को बांध अगर सामग्री चुंबकीय है या एक चुंबकीय मनका पर लेपित होने की क्षमता है पेप्टाइड्स के लिए क्रमबद्ध करने के लिए बढ़ाया जा सकता है, और विभिंन जीवों (जैसे anaerobic बैक्टीरिया के रूप में) के साथ प्रयोग के लिए अगर छंटाई और विकास की स्थिति बदल रहे हैं । बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों छंटाई के अलावा, वाणिज्यिक autoMCS साधन यहां इस्तेमाल किया भी भाग में मानव एकल श्रृंखला एंटीबॉडी टुकड़े की खोज के प्रारंभिक चरणों के लिए इस्तेमाल किया गया है खमीर की सतह पर प्रदर्शित, आगे अलगाव के बाद फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटाई का प्रयोग (FACS) ४०। अर्द्ध स्वचालन के लिए प्राथमिक लाभ समय और प्रयास छँटाई कम कर रहे हैं, और अधिक मजबूत और धोने चरणों के दौरान चुंबकीय मोतियों से unbounded कोशिकाओं के प्रतिलिपि उन्मूलन, कम झूठी सकारात्मक करने के लिए अग्रणी, कम आवश्यक छंटाई दौर, और कम जटिल नीचे-स्ट्रीम विश्लेषण 9,14. वाणिज्यिक autoMCS साधन के मामले में, विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इष्टतम हो सकता है जो कई पूर्व लोड कार्यक्रम कर रहे हैं, जैसे नकारात्मक पूर्व छँटाई (घट), शुद्धता को प्राथमिकता, अंतिम नमूना मात्रा को कम करने, और बढ़ाने या दुर्लभ कोशिकाओं के अलगाव के लिए संवेदनशीलता को कम करने ४१.

इस काम का ध्यान केंद्रित एक जीवाणु प्रदर्शन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध autoMCS साधन का उपयोग कर पुस्तकालय panning के लिए कार्यप्रणाली का प्रदर्शन है, और सोचा व्याख्या विश्लेषण और में उंमीदवारों के परिणामस्वरूप पूल को कम करने में लागू की प्रक्रिया अंय अनुप्रयोगों के लिए विस्तार की सुविधा के लिए आदेश । प्रदर्शन पुस्तकालय यहां इस्तेमाल किया (सामग्री की तालिका देखें) 12,13 में लगभग 109-1011 अद्वितीय 15-मेर पेप्टाइड्स जीवाणु बाहरी झिल्ली प्रोटीन OmpX के एक संशोधित संस्करण के माध्यम से प्रदर्शित होता है एक में सेल की सतह पर स्वैच्छिक प्रकृति, जो समाधान में मुक्त पेप्टाइड के प्रतिनिधि होने की उंमीद है अगर सिंथेटिक का उत्पादन किया । इस प्रोटीन पाड़ अतिरिक्त YPet मोना के लिए बाध्यकारी के माध्यम से अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए सी-टर्मिनस में एक सकारात्मक नियंत्रण P2X पेप्टाइड शामिल हैं । हालांकि, उपयुक्त विविधता और अंय वांछित आवेदन के लिए आवश्यक अंय विशेषताओं के साथ एक खरीदा या उपंयास पुस्तकालय इस जैव panning प्रक्रिया के साथ इसी तरह काम करना चाहिए, हालांकि कुछ मामूली परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है । इस panning प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1में सचित्र है । इसके अतिरिक्त, प्रोटोकॉल अंय स्वचालित चुंबकीय प्लेटफार्मों और अंय छंटाई रणनीतियों छंटाई के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । मैनुअल चुंबकीय एक benchtop चुंबक के साथ छंटाई सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है, हालांकि अधिक जटिल और समय लेने बहाव के साथ वृद्धि झूठी सकारात्मक 14की वजह से आवश्यक विश्लेषण के साथ, और फिर भी एक वैकल्पिक विकल्प प्रदान करता है कोई स्वचालित चुंबकीय कक्ष सॉर्टिंग डिवाइस उपलब्ध नहीं है, तो autoMCS चरण ।

Protocol

1. autoMCS का उपयोग कर एक panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों

नोट: इस autoMCS-आधारित छंटाई प्रोटोकॉल पहले 14वर्णित किया गया है, और एक और अधिक गहन "नए उपयोगकर्ताओं के लिए विस्तारित प्रोटोकॉल" इस पांडुलिपि के लिए पूरक सामग्री में और अधिक विस्तार के लिए उपलब्ध है, संभावित का एक स्पष्टीकरण सहित संशोधनों. यदि सॉर्टिंग के लिए कोई autoMCS डिवाइस उपलब्ध नहीं है, तो 14में उस कार्य के बाद मैनुअल सॉर्टिंग प्रोटोकॉल का भी वर्णन किया जाता है, क्योंकि, स़डक एट al. २०१५ से पूरक प्रोटोकॉल देखें । autoMCS प्रोटोकॉल यहां प्रदान की गई है और अधिक सुधार विशिष्टता 1,15के लिए अतिरिक्त नकारात्मक छंटाई कदम शामिल अनुकूलित किया गया है । इस panning प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्रा 1में सचित्र है ।

  1. नकारात्मक छंटाई पार करने के लिए की संभावना को हटाने के लिए चुंबकीय मोतियों के साथ प्रतिक्रिया छँटाई
    1. लगाना ५०० Luria शोरबा मिलर (पौंड) के लगभग 1 x 10 एक विविध जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय छंटाई के11कोशिकाओं के साथ उचित एंटीबायोटिक युक्त की मिलीलीटर (सामग्री की तालिका देखें) ।
      नोट: बैक्टीरियल प्रदर्शन पेप्टाइड पुस्तकालय यहां इस्तेमाल किया (सामग्री की तालिका देखें) शामिल लगभग 109-1011अद्वितीय सदस्य 8,12 और 25 µ जी/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल (पौंड सेमी25) युक्त पौंड में उगाया जाता है । इस प्रोटोकॉल के शेष मान जाएगा कि इस लायब्रेरी का उपयोग किया जाता है ।
    2. २२५ RPM पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जब तक संस्कृति ०.५-०.५५ के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता है । ०.०४% डब्ल्यू के साथ पेप्टाइड अभिव्यक्ति प्रेरित/वी एल-arabinose द्वारा कमजोर एक 4% शेयर 1:100, ४५ मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर २२५ RPM में मिलाते हुए ।
    3. बर्फ पर प्रेरित संस्कृति प्लेस । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ६००० x g पर लगभग 2 x 1011 कोशिकाओं के केंद्रापसारक । १.५ मिलीलीटर पंजाब में धीरे से घूमता supernatant और reसस्पैंड कोशिकाओं निकालें ।
      नोट: एक आयुध डिपो६०० १.० लगभग 1 x 109 कोशिकाओं के लिए ई. कोलाईके लिए एमएल/
      नोट: इस के रूप में भंवर नहीं यह कोशिकाओं लाइसे सकता है; हाथ से या संक्षेप में ≤ २२५ RPM, 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते द्वारा reसस्पेंड ।
    4. microcentrifuge ट्यूब (ओं) के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर स्पिन । निकाल supernatant. 1 मिलीलीटर फॉस्फेट में सेल गोली reसस्पेंड (पंजाब) ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन युक्त (BSA; पंजाबियों-बी) ।
    5. धो ३०० streptavidin-लेपित मोतियों की µ एल (के बारे में 3 x 109 मोती, सामग्री की तालिका देखें) में 1 मिलीलीटर पंजाब-बी और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ≥ ५,००० x जी (RT पर) । एक बेंच शीर्ष चुंबकीय कण विभाजक में ट्यूब प्लेस । सावधानी से supernatant निकालें, गोली से परहेज ।
    6. सेल से अधिक पंजाबियों में मोतियों की माला फिर से सस्पेंड-बी मिश्रण ऊपर तैयार । ४५ मिनट के लिए एक घूर्णन मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन बर्फ पर नमूने प्लेस ।
    7. सिस्टम को प्रारंभ करने के लिए autoMCS इंस्ट्रूमेंट चालू करें । प्रधानमंत्री लाइनों के निर्माता चलाने और धोने का उपयोग कर (सामग्री की तालिका देखें) का चयन "जुदाई" मेनू में स्क्रीन के तल पर "अब धो", तो "कुल्ला" और "भागो" ।
    8. प्रधानमंत्री ने पंजाब के साथ प्रणाली-बी, पंजाब का उपयोग कर-b दोनों धोने बफर के रूप में और अगले चरणों में बफर चल रहा है. ऊपरी नेविगेशन पट्टी से "जुदाई" मेनू का चयन करें और "अब धो" का चयन करें. चुनें "कुल्ला" और प्रधानमंत्री के लिए "भागो" ताजा पंजाबियों के साथ प्रणाली बी ।
    9. स्थानांतरण सेल और मनका मिश्रण एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए मशीन कदम से । नमूना स्लॉट में इस ट्यूब प्लेस, और खाली 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों सकारात्मक और नकारात्मक चयन स्लॉट में, एक पूर्व ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) रैक (सामग्री की तालिका देखें) । साधन मंच पर रैक प्लेस ।
    10. रैक पर प्रत्येक नमूने के लिए एक जुदाई कार्यक्रम निरुपित (अप करने के लिए 5 नमूने एक रन में हल किया जा सकता है) । एक "कुल्ला" चरण में प्रत्येक नमूने और अंतिम नमूने के बाद के बीच जोड़ें । कक्ष पृथक्करण प्रारंभ करने के लिए "चलाएं" चुनें । पर्याप्त बफ़र उपलब्ध है की पुष्टि करने के लिए "ठीक" का चयन करें ।
      नोट: "Posselds" पृथक्करण प्रोग्राम के लिए अच्छी तरह से काम करता है नकारात्मक सॉर्टिंग और धनात्मक सॉर्टिंग राउंड 1 और "Posseld" 2-4 राउंड सॉर्टिंग के लिए पसंद किया जाता है, लेकिन इन प्रोग्रामों के दोनों सफलतापूर्वक सभी नकारात्मक और धनात्मक सॉर्टिंग के लिए उपयोग किया गया है 14 ,15 और अंय प्रोग्राम किसी विशेष अनुप्रयोग के लिए बेहतर साबित हो सकते है (चर्चा में आगे वर्णित है) ।
    11. जब कार्यक्रम पूरा हो गया है, रैक निकालें और उचित अंश को बनाए रखने । यहां, एक नकारात्मक प्रकार के लिए, नकारात्मक अंश (मोतियों के बिना कोशिकाओं से युक्त) बनाए रखने के । बर्फ पर जगह ।
    12. ०.२% w/v D-ग्लूकोज के साथ LB Cm25 की लगाना 1L करने के लिए अपनी संपूर्णता में नकारात्मक क्रमबद्ध अंश का उपयोग करें । ३७ ° c पर रातोंरात हो जाना, २२५ RPM पर मिलाते हुए ।
    13. autoMCS उपकरण को बंद करने से पहले, चलाएं और धोने बफ़र्स निर्माता के चलाने के लिए परिवर्तित करें और बफ़र्स (सामग्री की तालिका देखें) को धो दें । चुनें "अब धो लो", तो "कुल्ला" और "भागो" । जब समाप्त हो, तो सुनिश्चित करें कि वहां है ७०% इथेनॉल में संक्रमण लाइन, तो प्रेस "शक्ति आइकन" स्क्रीन के शीर्ष दाएं कोने पर और चुनें "हां" ।
    14. जब सिस्टम शट डाउन पूर्ण है (बोतलें बैंगनी हो जाएगा), मशीन बंद कर दें ।
    15. अगले दिन, रातोंरात संस्कृति का उपयोग करने के बारे में 1 x 1011के साथ पौंड में शीशी प्रति कोशिकाओं के साथ फ्रीजर शेयर 15% ग्लिसरॉल । साथ ही, या वैकल्पिक रूप से, अगले चरण में इस culture का उपयोग करें: अतिरिक्त ऋणात्मक सॉर्टिंग (खंड १.२) या पहले राउंड की धनात्मक सॉर्टिंग (खंड १.३) ।
  2. नकारात्मक छंटाई को पार करने के लिए ब्याज के अंय लक्ष्यों के साथ प्रतिक्रिया की संभावना bindings
    नोट: यदि कोई आगे नकारात्मक छंटाई की जरूरत है या वांछित है धारा १.२ छोड़ दिया जा सकता है । उस मामले में, धारा १.३ के लिए आगे बढ़ें । किसी भी अवांछित लक्ष्य के लिए अवशिष्ट बाध्यकारी FACS द्वारा खंड 2 में के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता: छंटाई दौर के FACS विश्लेषण ।
    1. नकारात्मक के लिए एक विशिष्ट प्रोटीन लक्ष्य, जैसे क्षमता के साथ एक समान प्रोटीन के लिए भी बांध की खोज पेप्टाइड्स 1,15, दोहराने के विकास और प्रेरण कदम 1.1.1-1.1.3, के एक जमे हुए शेयर के साथ शुरू के खिलाफ छंटाई कदम से streptavidin-समाप्त पुस्तकालय 1.1.15 या कदम 1.1.12 से रातोंरात संस्कृति (६०० आयुध डिपो का उपयोग करने का अनुमान है और 1 x 1011 कोशिकाओं के साथ लगाना) ।
    2. microcentrifuge ट्यूब (ओं) के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर स्पिन । निकाल supernatant. ६०० एनएम biotinylated पार प्रतिक्रियाशील प्रोटीन लक्ष्य युक्त 1 एमएल पंजाब में सेल गोली reसस्पेंड । एक घूर्णन मंच पर ४५ मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      नोट: ६०० एनएम एक का सुझाव दिया शुरू एकाग्रता है, जो बदला जा सकता है अगर एक उल्लेखनीय लाभ मनाया जाता है । प्रोटीन लक्ष्य की Biotinylation प्राप्त किया जा सकता है और सामग्री की तालिका में सुझाए गए रिएजेंट का उपयोग मात्रा ।
    3. इस बीच, धो १०० streptavidin-लेपित मोतियों की µ एल (के बारे में 1 x 109 मोती) 1 मिलीलीटर में पंजाब-बी और 5 मिनट के लिए ≥ ५,००० x g पर (आरटी) । एक बेंच शीर्ष चुंबकीय कण विभाजक में ट्यूब प्लेस और ध्यान से supernatant हटाने, गोली से परहेज ।
    4. 5 मिनट (आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ६,००० x g पर लक्ष्य-बाध्य कोशिकाओं केंद्रापसारक, supernatant हटाने, और 1 मिलीलीटर पंजाब में सेल गोली पुनः स्थगित-बी । धोया कोशिकाओं को पार-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन लक्ष्य के लिए बाध्य की पूरी मात्रा में मोती reसस्पेंड । 30 मिनट के लिए एक घूर्णन मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    5. बर्फ पर जगह का नमूना और पूरा कदम एक नकारात्मक प्रकार के लिए 1.1.7-1.1.15, उपयुक्त फ्रीजर स्टॉक कर रही है । एक सकारात्मक प्रकार के लिए धारा १.३ के लिए जारी रखें यदि सभी वांछित नकारात्मक छंटाई प्राप्त किया गया है, या एक और संभावित पार प्रतिक्रियाशील प्रोटीन के खिलाफ नकारात्मक प्रकार के लिए धारा १.२ को दोहराने ।
  3. दौर 1 सकारात्मक प्रकार
    नोट: दौर 1 सकारात्मक एक विशिष्ट प्रोटीन लक्ष्य के खिलाफ छंटाई एक विशिष्ट छंटाई लक्ष्य के खिलाफ एक नकारात्मक प्रकार के समान है (१.२ देखें) सिवाय इसके कि मनका युक्त, सकारात्मक अंश बनाए रखा है ।
    1. लगाना £ Cm25 के लगभग 1 x 1011की कोशिकाओं के साथ ५०० मिलीलीटर एक विविध बैक्टीरियल पुस्तकालय छंटाई प्रदर्शन की है कि streptavidin समाप्त हो गया है और रातोंरात बड़े हो (कदम से 1.1.12) या जमे हुए (कदम 1.1.15 से) और बर्फ पर गल, या कि गया है इसके अलावा अन्य पार करने के लिए बाँधने के घट-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन लक्ष्य (कदम से 1.2.5), के रूप में वांछित.
    2. २२५ RPM पर मिलाते के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन जब तक संस्कृति ०.५-०.५५ के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता है । ०.०४% डब्ल्यू के साथ पेप्टाइड अभिव्यक्ति प्रेरित/वी एल-arabinose द्वारा कमजोर एक 4% शेयर 1:100, ४५ मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर २२५ RPM में मिलाते हुए ।
    3. बर्फ पर प्रेरित संस्कृति प्लेस । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ६,००० x g पर लगभग 2 x 1011 कोशिकाओं के केंद्रापसारक । (हाथ से या संक्षेप में ≤ २२५ RPM, 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए) द्वारा धीरे घूमता द्वारा १.५ मिलीलीटर पंजाब में supernatant और reसस्पेंड कोशिकाओं को हटा दें ।
    4. microcentrifuge ट्यूब (ओं) के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर स्पिन । निकाल supernatant.
    5. 1 मिलीलीटर पंजाब में सेल गोली reसस्पेंड ६०० एनएम biotinylated प्रोटीन ब्याज का लक्ष्य युक्त । एक घूर्णन मंच पर ४५ मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      नोट: ६०० एनएम एक का सुझाव दिया शुरू एकाग्रता है, जो बदला जा सकता है अगर एक उल्लेखनीय लाभ मनाया जाता है । प्रोटीन लक्ष्य की Biotinylation प्राप्त किया जा सकता है और सामग्री की तालिका में सुझाए गए रिएजेंट का उपयोग मात्रा ।
    6. इस बीच, धो १०० streptavidin-लेपित मोतियों की µ एल (के बारे में 1 x 109 मोती) 1 मिलीलीटर में पंजाब-बी और 5 मिनट के लिए ≥ ५,००० x g पर (आरटी) । एक बेंच शीर्ष चुंबकीय कण विभाजक में ट्यूब प्लेस, और ध्यान से supernatant हटाने, गोली से परहेज ।
    7. लक्ष्य के साथ मशीन पूरा हो गया है, जब किसी भी असीम लक्ष्य प्रोटीन को दूर करने के लिए 5 मिनट (आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस) के लिए ६,००० x g पर लक्ष्य-बाध्य कोशिकाओं केंद्रापसारक । supernatant निकालें और सेल गोली 1 एमएल पंजाबियों में reसस्पेंड-बी । धोया कोशिकाओं को प्रोटीन लक्ष्य के लिए बाध्य की पूरी मात्रा में मोती reसस्पेंड । बर्फ पर 30 min. Place के लिए एक घूर्णन मंच पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    8. सिस्टम को प्रारंभ करने के लिए autoMCS इंस्ट्रूमेंट चालू करें । प्रधानमंत्री लाइनों का उपयोग कर निर्माता के भागो और धोने बफ़र्स (सामग्री की तालिका देखें) का चयन "अब धो" जुदाई मेनू में स्क्रीन के तल पर, तो "कुल्ला" और "भागो" ।
    9. प्रधानमंत्री ने पंजाब के साथ प्रणाली-बी, पंजाब का उपयोग कर-b दोनों धोने बफर के रूप में और अगले चरणों में बफर चल रहा है. ऊपरी नेविगेशन पट्टी से जुदाई मेनू का चयन करें और अब धोने का चयन करें. चुनें कुल्ला और प्रधानमंत्री ताजा पंजाबियों के साथ प्रणाली को चलाने बी ।
    10. स्थानांतरण सेल और मनका मिश्रण से ऊपर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए कदम, एक अतिरिक्त ५०० µ एल के साथ ट्यूब धोने पंजाब-बी और नमूना के साथ धो पूलिंग । नमूना स्लॉट में इस ट्यूब प्लेस, और खाली 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों सकारात्मक और नकारात्मक चयन स्लॉट में, एक पूर्व ठंडा (4 डिग्री सेल्सियस) रैक (सामग्री की तालिका देखें) । साधन मंच पर रैक प्लेस ।
    11. रैक पर प्रत्येक नमूने के लिए एक जुदाई कार्यक्रम निरुपित (अप करने के लिए 5 नमूने एक रन में हल किया जा सकता है) । एक "कुल्ला" चरण में प्रत्येक नमूने और अंतिम नमूने के बाद के बीच जोड़ें । कक्ष पृथक्करण प्रारंभ करने के लिए "चलाएं" चुनें । पर्याप्त बफ़र उपलब्ध है, यह पुष्टि करने के लिए "ठीक" या "जारी रखें" का चयन करें ।
      नोट: "Posselds" पृथक्करण प्रोग्राम के लिए अच्छी तरह से काम करता है नकारात्मक सॉर्टिंग और धनात्मक सॉर्टिंग राउंड 1 और "Posseld" 2-4 राउंड सॉर्टिंग के लिए पसंद किया जाता है, लेकिन इन प्रोग्रामों के दोनों सफलतापूर्वक सभी नकारात्मक और धनात्मक सॉर्टिंग के लिए उपयोग किया गया है 14 फेरे , 15 और अंय प्रोग्राम किसी विशेष अनुप्रयोग के लिए बेहतर साबित हो सकते है (चर्चा में आगे वर्णित) ।
    12. जब कार्यक्रम पूरा हो गया है, रैक निकालें और उचित अंश को बनाए रखने । यहां, एक सकारात्मक प्रकार के लिए, सकारात्मक भागों को बनाए रखने (कोशिकाओं और मोतियों से युक्त) । बर्फ पर जगह ।
    13. autoMCS उपकरण को बंद करने से पहले, चलाएं और धोने बफ़र्स निर्माता के चलाने के लिए परिवर्तित करें और बफ़र्स (सामग्री की तालिका देखें) को धो दें । चुनें "अब धो लो", तो "कुल्ला" और "भागो" । जब समाप्त हो, तो सुनिश्चित करें कि वहां है ७०% इथेनॉल में संक्रमण लाइन, तो प्रेस "शक्ति आइकन" स्क्रीन के शीर्ष दाएं कोने पर और चुनें "हां" ।
    14. जब सिस्टम शट डाउन पूर्ण है (बोतलें बैंगनी हो जाएगा), मशीन बंद कर दें ।
    15. ०.२% w/v D-ग्लूकोज के साथ LB Cm25 की लगाना 1L करने के लिए अपनी संपूर्णता में सकारात्मक क्रमबद्ध अंश का उपयोग करें । ३७ ° c पर रातोंरात हो जाना, २२५ RPM पर मिलाते हुए ।
    16. अगले दिन, रातोंरात संस्कृति का उपयोग करने के लिए पौंड में फ्रीजर स्टॉक 15% ग्लिसरॉल, और/या १.४ अनुभाग में 2 दौर छंटाई सकारात्मक करने के लिए जारी है ।
  4. बाद सकारात्मक छंटाई दौर
    नोट: आमतौर पर, चार छँटाई दौर सिफारिश कर रहे हैं, हालांकि तीन छँटाई राउंड आम तौर पर पर्याप्त हैं 14,15. छंटाई रोकने के लिए जब खंड 2 में वर्णित छंटाई दौर के FACS विश्लेषण के द्वारा सहायता प्रदान की है । लक्ष्य और चुंबकीय मनका मात्रा की सांद्रता प्रत्येक बाद सकारात्मक दौर छंटाई के साथ कमी ।
    1. पिछले छंटाई दौर से रातोंरात संस्कृति का उपयोग करना (या उस दौर से एक जमे हुए सेल शेयर), लगाना 5 मिलीलीटर १०० µ एल कोशिकाओं (1:50 कमजोर पड़ने) के साथ25 एमएल पौंड सेमी । २२५ RPM पर मिलाते के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन जब तक संस्कृति ०.५-०.५५ के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता है ।
    2. ०.०४% डब्ल्यू/वी एल-arabinose के साथ पेप्टाइड अभिव्यक्ति प्रेरित, ४५ मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर २२५ RPM पर मिलाते हुए । बर्फ पर प्रेरित कोशिकाओं जगह है ।
      नोट: यह प्रेरित संस्कृति भी छंटनी दौर यह से उत्पंन के लिए बाध्यकारी संबंध और विशिष्टता का आकलन किया जा सकता है, के रूप में नीचे खंड 2 में वर्णित है ।
    3. 1 x 108 कोशिकाओं पर ६,००० x जी या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए । supernatant निकालें और ५० µ एल पंजाबियों में आधा biotinylated प्रोटीन की एकाग्रता छंटाई के पिछले दौर के लिए इस्तेमाल किया ब्याज के लक्ष्य से reसस्पेंड (इसलिए ३०० दौर 2 के लिए समुद्री मील, 3 दौर के लिए १५० एनएम, और 4 दौर के लिए ७५ एनएम हमारे सुझाव से प्रारंभिक बिंदु) । बर्फ पर ४५ मिनट के लिए मशीन (या 4 ° c एक घूर्णन मंच पर) ।
    4. इस बीच, धो streptavidin-लेपित मोती (दौर 2 के लिए 15 µ एल, दौर 3 के लिए 8 µ एल, और 4 दौर के लिए 4 µ एल) में 1 मिलीलीटर पंजाब-बी और 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक पर ≥ ५,००० x जी (RT पर) । एक बेंच शीर्ष चुंबकीय कण विभाजक में ट्यूब प्लेस और ध्यान से supernatant हटाने, गोली से परहेज । ५० में reसस्पेंड मोती µ l पंजाबियों-B.
    5. चरण 1.4.3 में लक्ष्य के साथ ४५ मिनट की मशीन के बाद, आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, supernatant को दूर, और ५० µ एल में कोशिकाओं reसस्पैंड 1.4.4 से मोती धोया । बर्फ पर नमूना रखें और एक सकारात्मक प्रकार के लिए 1.3.7-1.3.13 पूरा कदम ।
    6. लगाना £ Cm25 की एक 5 मिलीलीटर संस्कृति ०.२% डब्ल्यू/वी डी के साथ पूरक-पूरी तरह से सकारात्मक, मनका युक्त अंश के साथ ग्लूकोज ।
    7. अगले दिन, रातोंरात संस्कृति का उपयोग करने के लिए पौंड में फ्रीजर स्टॉक 15% ग्लिसरॉल और/या अगले सकारात्मक दौर छंटाई के लिए जारी रखने के लिए, कदम 1.4.1 लौटने ।
      नोट: नीचे अनुभाग 2 में वर्णित के रूप में बाध्यकारी समानता और विशिष्टता का आकलन करने के लिए 1.4.2 से प्रेरित संस्कृति का उपयोग कर यह निर्धारित करने में मदद कर सकते है जब छंटाई बंद करो । एक पंक्ति में दो सॉर्टिंग राउंड समान बाइंडिंग समानता दिखाएँ, या बाद में राउंड ब्याज के लक्ष्य के लिए बाइंडिंग समानता कम दिखाता है, तो सॉर्टिंग को रोकने के लिए यह एक वांछनीय स्थान है । अंतिम दौर के बाद, वापसी के लिए कदम 1.4.1 लेकिन 1.4.2 पर रोक ।

2. छंटाई दौर के FACS विश्लेषण

  1. प्रत्येक छंटाई दौर, या समान संस्कृतियों के लिए कदम 1.4.2 से प्रेरित कोशिकाओं का उपयोग करना, 5 µ एल प्रेरित कोशिकाओं को जोड़ने के लिए बाध्यकारी आकलन के लिए निंनलिखित तैयार समाधानों में से प्रत्येक के 25 µ एल (भी सामग्री की तालिका देखें): अकेले पंजाबियों; १५० एनएम YPet मोना के साथ पंजाबियों (YPet 12,13; अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक नियंत्रण), यदि उपलब्ध है; ९०० एनएम प्रोटीन लक्ष्य संयुग्मित एक फ्लोरोसेंट डाई करने के लिए, इस तरह के उत्सर्जन के साथ अमीन-प्रतिक्रियाशील डाई के रूप में/उत्तेजना पर ४९३ एनएम ⁄ 518 एनएम (लक्ष्य-४८८); ९०० एनएम पार-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन लक्ष्य (ओं) नकारात्मक छंटाई के लिए इस्तेमाल किया एक ही फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल (पार प्रतिक्रियाशील प्रोटीन-४८८); और ९०० एनएम streptavidin-आर-phycoerythrin (SAPE) । ४५ मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    नोट: कदम 1.4.2 से सीधे जारी रखने के लिए, इस कदम को हमेशा उस दौर के लिए panning के बाद दिन में किया जाएगा नीचे के बाद से चयनित पुस्तकालय रातोंरात हो गया था तो उपसंस्कृतिी और अगले दिन प्रेरित हो गया पूरा हो गया । संस्कृतियों हो गया है और इसी तरह जमे हुए छंटाई दौर शेयरों से प्रेरित भी इस्तेमाल किया जा सकता है; उस मामले में, सभी राउंड परीक्षण किया जा सकता है और एक एकल प्रयोग में तुलना ।
  2. आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । बर्फ पर supernatant और स्टोर के नमूने निकालें ।
    नोट: सेल छर्रों बर्फ पर संग्रहित किया जा सकता है जब तक सभी नमूनों के विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।
  3. FACS साधन चालू करें, सॉफ्टवेयर खोलने, सिस्टम स्टार्ट-अप, और निर्माता के निर्देशों का पालन साधन जांच ४३,४४.
  4. FACS सॉफ्टवेयर के भीतर, पर क्लिक करें "व्यवस्थापक" और वांछित फ़ोल्डर पर क्लिक करें या एक नया फ़ोल्डर बनाने के लिए । स्क्रीन के शीर्ष बाएं पर "नया प्रयोग" आइकन पर क्लिक करें । सही क्लिक करें "का नाम बदलें" प्रयोग के लिए आइकन । उस प्रयोग के भीतर, "वैश्विक कार्यपत्रकों" पर क्लिक करें ।
  5. "डॉट प्लॉट" आइकन पर क्लिक करें, फिर इस scatterplot को बनाने के लिए वैश्विक कार्यपत्रक स्प्रेडशीट पर क्लिक करें । डॉट प्लॉट ग्राफ पर ही क्लिक करें, तो स्क्रीन के शीर्ष पर "निरीक्षक" आइकन का चयन और "Y अक्ष" और खुली खिड़की में "एक्स अक्ष" के बगल में बक्से का चयन करके biexponential प्रदर्शन करने के लिए अक्ष समायोजित करें । X क्लिक करके biexponential प्रदर्शन विंडो बंद करें ।
  6. स्क्रीन के ऊपर छोड़ दिया पर आइकन पर क्लिक करके एक "नई ट्यूब" बनाएँ और सही "वैश्विक वर्कशीट" के तहत नमूना आइकन पर क्लिक करके और "नाम बदलें" का चयन करके उचित जानकारी के साथ नमूना का नाम बदलें. (+) पर हस्ताक्षर क्लिक करके नमूना का विस्तार करें, तो ट्यूब आइकन पर डबल क्लिक करें, उस पर ठीक क्लिक करें, और फिर से का चयन करें "का नाम बदलें" नमूना का वर्णन करने के लिए ।
  7. डिफ़ॉल्ट एसएससी के साथ इस डॉट भूखंड ग्राफ का प्रयोग करें-एक बनाम FSC-एक अकेले पंजाब में एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना है कि ट्यूब पर डबल क्लिक करके या इसे अगले तीर का चयन चलाने के लिए । बस नमूना चलाने से पहले, ५०० µ एल बर्फ शीत FACS में एक FACS ट्यूब के लिए बफर और हस्तांतरण नमूना चल रहे सेल गोली reसस्पेंड (सामग्री की तालिका देखें), pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और ट्यूब झाड़ । reसस्पैंड कोशिकाओं नमूना इंजेक्शन ट्यूब उपकरण के (बैठो) पर रखें । ३०,०००-५०,००० पर "प्रदर्शन करने के लिए इवेंट" के साथ "डेटा प्राप्त करें" दबाएँ और १०,००० पर रिकॉर्ड करने के लिए ईवेंट, प्रवाह दर कम (प्रारंभ करने के लिए; बढ़ाएँ यदि आवश्यक हो), और "फ्लशिंग" चयनित.
    नोट: उपयुक्त गति (कम, मध्यम, या उच्च) की घटनाओं की संख्या लगभग २०० और २००० के बीच है, जिस पर गति है ।  सभी चरणों के लिए इस श्रेणी का उपयोग करें ।
  8. प्राप्त करते समय, photomultiplier ट्यूब (PMT) वोल्टेज थ्रेशोल्ड समायोजित करें यदि "थ्रेशोल्ड" टैब का चयन करके आवश्यक हो तो "मान" पर क्लिक करके बदलें. आगे और साइड कैटर (FSC और एसएससी) के लिए वोल्टेज को समायोजित ऐसे कि अकेले पंजाब में नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं केंद्र के नीचे थोड़ा गिर जाते हैं ।
    नोट: अतिरिक्त पैरामीटर (जैसे एसएससी) "थ्रेसहोल्ड" "जोड़ें" आइकन का उपयोग कर टैब में जोड़ा जा सकता है । आमतौर पर, पीएमटी वोल्टेज के बारे में ७०० वी दोनों एसएससी और FSC के लिए 1000V करने के लिए अच्छी तरह से ई. कोलाईके लिए काम करते हैं ।
  9. नमूना ठीक से पढ़ रहा है, तो 200-2000 घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए प्रवाह दर समायोजित करें और "रिकॉर्ड डेटा" दबाएँ. जब समाप्त रिकॉर्डिंग, बैठो और बर्फ पर जगह से ट्यूब हटा दें ।  "बहुभुज गेट" आइकन चुनें और scatterplot में सेल जनसंख्या के बहुमत के चारों ओर एक गेट आकर्षित करने के लिए माउस का उपयोग करें । डॉट प्लॉट पर दायां क्लिक करें और "जनसंख्या पदानुक्रम दिखाएं" चुनें ।
  10. जनसंख्या पदानुक्रम में "p1" पर क्लिक करके एक माता पिता के रूप में इस "p1" गेट का उपयोग करें । चरण २.५ निम्न एक नया डॉट प्लॉट बनाएँ । प्रत्येक अक्ष पर दायां क्लिक करें और Y-अक्ष को FITC-a और X-अक्ष को FSC-a में बदलें । गेट नकारात्मक नियंत्रण (अकेले पंजाबियों) "बहुभुज गेट" आइकन का उपयोग कर, के रूप में तंग के रूप में संभव के रूप में ऊपर और आबादी के बाईं ओर फाटक के साथ ।
    नोट: P1 गेट P2 गेट के एक माता पिता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए डबल जनसंख्या पदानुक्रम की जांच करें । यदि ऐसा नहीं है, यह P1 गेट के साथ लाइन में दिखाई देगा और "सभी घटनाओं" माता पिता हो जाएगा; गेट हटाएँ और यह चरण २.१० का पालन पुन: बनाएँ ।
  11. का चयन करें "P2" जनसंख्या पदानुक्रम में, ठीक क्लिक करें, और "उलटा फाटक" का चयन करें । P2 गेट के साथ डॉट साजिश पर दायां क्लिक करें और चुनें "जनसंख्या दिखाएं" । चुनें आबादी "p2" और प्रदर्शन के लिए "p2 नहीं" (जनसंख्या का 1% से कम फाटक के बाहर पड़ना चाहिए) ।
  12. दायां क्लिक करें P2 गेट के साथ साजिश डॉट और चुनें "आंकड़े देखें बनाएं" । आँकड़े देखें विंडो पर दायाँ क्लिक करें और "संपादित करें आँकड़े देखें" चुनें. "आबादी" टैब पर क्लिक करें और जोड़ें या आबादी को दूर, माता पिता की आबादी सहित वांछित, के रूप में, P1 (p2, और p2 नहीं पहले से ही दिखाया जाना चाहिए) । "सांख्यिकी" टैब पर क्लिक करें और जोड़ें "FITC-एक औसत" और ब्याज की किसी भी अंय आंकड़े । विंडो को ठीक दबाकर बंद करें ।
  13. पीई के लिए एक समान डॉट भूखंड ग्राफ बनाएं-a vs FSC-ए और गेट का उपयोग कर पंजाब अकेला नमूना (पिछले भूखंडों दोहराया और बदला जा सकता है). सभी नमूनों को चलाने के लिए इस स्प्रेडशीट का उपयोग करें (प्रत्येक fluorophore-लेबल किए गए लक्ष्य के साथ मशीन की गई ऋणात्मक नियंत्रण कक्षों सहित), प्रत्येक के लिए १०,००० ईवेंट्स के बारे में रिकॉर्डिंग करना.
    नोट: कोशिकाओं है कि लक्ष्य के साथ मशीन के बाद गेट के बाहर गिर-४८८ प्रोटीन, YPet सकारात्मक नियंत्रण, आदि है कि प्रोटीन के लिए बांधने हैं, और "नहीं पिक्स" से मूल्य (जहां X कि ग्राफ के लिए gated जनसंख्या की संख्या है)% बाध्य के रूप में दर्ज किया जाना चाहिए । नकारात्मक नियंत्रण के रूप में SAPE का उपयोग करते समय, पीई-a vs FSC-a प्लॉट का उपयोग करें । औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) P1 की भी यह% बंधन से परे जानकारी देता है के रूप में दर्ज किया जाना चाहिए, रिश्तेदार शर्तों में बंधन की हद तक दिखाने के लिए, और अधिक मजबूत outliers ४५की उपस्थिति में है । माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (कोई N-टर्मिनल पेप्टाइड के साथ) एक पाड़ केवल नकारात्मक नियंत्रण के mfi द्वारा प्रत्येक पेप्टाइड के mfi विभाजित करके (nMFI) सामान्यीकृत किया जा सकता है, या एक क्लोन एक पेप्टाइड अनुक्रम है कि ब्याज का लक्ष्य बांध नहीं है युक्त, गर्मी के बाद इसी टारगेट के साथ ही संयुग्मित को 14fluorophore । यदि ये नकारात्मक नियंत्रण कक्ष अनुपलब्ध हैं, तो एक ही लक्ष्य के साथ और उसी fluorophore के साथ लेबल किए गए उत्प्रेरण कक्ष भी सामान्यीकरण के लिए उपयोग किए जा सकते हैं.

3. संभावित उंमीदवारों के अनुक्रम विश्लेषण और बाध्यकारी संबध का आकलन

  1. पेप्टाइड अनुक्रम निर्धारण
    1. का चयन करें और अनुक्रम दसियों या (आम तौर पर राउंड 3 और/या 4) panning के अंतिम दौर (ओं) से बैक्टीरियल कालोनियों के सैकड़ों ।
    2. हम विकसित किया है कि मैक्रो फ़ाइल का उपयोग कर अनुक्रम डेटा का विश्लेषण (कोड के लिए जानकारी का समर्थन देख, "उप eCPX_Sequencing") विशेष रूप से 15mer की तालिका में सूचीबद्ध panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालय से उत्पन्न अनुक्रम का विश्लेषण करने के लिए सामग्री. सामग्री, या अंय पसंदीदा संगत सॉफ्टवेयर की तालिका में सूचीबद्ध स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।
      नोट: उपकरण के एक नंबर ऑनलाइन उपलब्ध है कि भी डीएनए अनुक्रम विश्लेषण ४७में सहायता कर सकते हैं । यदि पसंदीदा, अनुक्रम विश्लेषण के लिए एक अलग स्थापित विधि का उपयोग करें और 3.1.3 कदम छोड़ ।
      1. डाउनलोड अनुक्रम फ़ाइलों का सेट (. seq फ़ाइलें, पाठ दस्तावेज़ भी काम) और उंहें एक नए फ़ोल्डर में निकालें । यदि आवश्यक हो, ले जाएं या कंप्यूटर की हार्ड ड्राइव (के रूप में एक नेटवर्क फ़ोल्डर के लिए) में सुधार की गति के लिए फ़ोल्डर की प्रतिलिपि बनाएं ।
      2. कोई नई स्प्रेडशीट विंडो खोलें । मैक्रोज़ सक्षम करें और सभी सुविधाओं को सक्षम करने के लिए सुनिश्चित करें, यदि उन संदेशों को पॉप ।
        नोट: चरण 3-6 नीचे केवल मैक्रो उपयोग किया जाता है पहली बार पूरा करने की आवश्यकता चाहिए । बाद के विश्लेषण के लिए, बस "मैक्रो भागो" 7 कदम से शुरू ।
      3. "Sub eCPX_Sequencing" फ़ाइल में पाए गए मैक्रो की संपूर्ण सामग्री की प्रतिलिपि बनाएं ।
        नोट: वर्तमान संस्करण 15-मेर सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध पुस्तकालय के लिए पार्श्व दृश्यों के साथ स्थापित है और उन दोनों के बीच अमीनो एसिड का अनुवाद करेंगे । अतिरिक्त अनुक्रम स्तंभ A में 5 ' पार्श्व अनुक्रम की नकल और स्प्रेडशीट के स्तंभ B में 3 ' पार्श्व अनुक्रम, प्रत्येक के लिए 10 अनुक्रम, मैक्रो चलाने से पहले की प्रतिलिपि बनाकर किया जा सकता है ।
      4. रिक्त स्प्रेडशीट फ़ाइल में, "दृश्य" टैब का चयन करें, फिर "मैक्रोज़" पर डबल क्लिक करें । personal. xlb फ़ोल्डर का चयन करें । यदि यह अनुपलब्ध है, तो यह प्रकट करने के लिए कोई मैक्रो पहले रिकॉर्ड करें ।
      5. पर क्लिक करें "बनाएं" या "में कदम", क्या उजागर किया जा सकता है पर निर्भर करता है । संपूर्ण मैक्रो को मॉड्यूल में चिपकाएं ।
      6. सहेजें आइकन पर क्लिक करें या फ़ाइल पर जाएँ, सहेजें. मॉड्यूल से बाहर निकलें । यदि कोई विंडो पॉप अप है, तो ठीक दबाएं ।
      7. मैक्रो चलाएँ: जहाँ इच्छित. seq फ़ाइलें स्थित हैं फ़ोल्डर पर जाएँ । फ़ोल्डर स्थान देखने के लिए शीर्ष पर फ़ोल्डर के चिह्न के आगे पट्टी पर क्लिक करें । इसकी प्रतिलिपि बनाएं ।
      8. नई स्प्रेडशीट विंडो पर जाएं । दृश्य टैब का चयन करें, फिर मैक्रोज़ पर डबल क्लिक करें । सूची से "eCPX_Sequencing" चुनें और "चलाएं" क्लिक करें ।
      9. ऊपर चबूतरे बॉक्स में, चरण 7 में प्रतिलिपि बनाई गई फ़ाइल स्थान चिपकाएं और enter दबाएं । स्थूल अनुक्रम के माध्यम से जा रहा है और उंहें विभिंन पत्रकों पर तालिकाओं में आयोजन शुरू कर देना चाहिए ।
      10. यदि यह त्रुटियों के लिए ट्रेस फ़ाइलों की जाँच करें और मैन्युअल रूप से सुधार करने के लिए आवश्यक हो जाएगा यह निर्धारित करने के लिए "सारांश तालिका" पत्रक का उपयोग करें (अनुक्रम हो "X" या अनुवादित नहीं किया जा सका) ।
        नोट: "सारांश तालिका" अनुवादित पेप्टाइड अनुक्रम प्रदर्शित करता है, एमिनो एसिड अनुक्रम (से A से Z), के द्वारा सॉर्ट किया गया जब तक कि एक अनुक्रमण त्रुटि अनुवाद रोका । एक "एक्स" एक व्यक्ति एमिनो एसिड है कि निर्धारित नहीं किया जा सकता है ।
    3. एक बार अनुक्रम अनुवाद, संगठित, और किसी भी sequencing त्रुटियों को ठीक कर रहे हैं, किसी भी दोहराए जाने वाले अनुक्रम के लिए "सारांश तालिका" पत्रक पर सॉर्ट किए गए पेप्टाइड अनुक्रम सूची की जाँच करें ।
    4. 5 मिलीलीटर पौंड सेमी25 में 37 डिग्री सेल्सियस में (एक न्यूनतम पर ध्यान देने योग्य प्रवृत्तियों के साथ दोहराता और/या पेप्टाइड्स सहित) ब्याज की अनुक्रम कालोनियों के लिए रातोंरात संस्कृतियों बढ़ाएँ, २२५ RPM पर मिलाते हुए, और फ्रीजर 15% ग्लिसरॉल युक्त पौंड में अगले दिन स्टॉक, के रूप में कदम में सहेजें 1.4.7. FACS खंड में वर्णित विधियों का उपयोग कर बाइंडिंग समानता और विशिष्टता के लिए दोहराए जाने वाले दृश्यों के साथ पेप्टाइड्स का परीक्षण करें और अनुक्रम सूची (पूर्ण सूची और केवल दोहराता है) का फसता स्वरूप का उपयोग करने के लिए पसंदीदा संरेखण का उपयोग कर अनुक्रम संरेखित करें और विश्लेषण कार्यक्रम, के रूप में ३.२ अनुभाग में ।
  2. अनुक्रम Clustal ओमेगा, Kalign, और इसी तरह के कार्यक्रमों का उपयोग कर संरेखण
    1. मैक्रो की फसता स्प्रेडशीट से फसता स्वरूप में अनुक्रम की प्रतिलिपि बनाएं, या अंयथा (जैसे चरण 3.1.3 से उन के रूप में) संरेखित करने के लिए अनुक्रम से फसता फ़ाइलों की एक सूची बनाएँ ।
      नोट: स्तंभ A में फसता फ़ाइलें संख्यात्मक क्रम में "Seq #" द्वारा होती है जबकि स्तंभ B उंहें "सारांश तालिका" पत्रक से "AA अनुक्रम" द्वारा सॉर्ट किया गया प्रदर्शित करता है । एमिनो एसिड अनुक्रम द्वारा क्रमबद्ध पेप्टाइड अनुक्रम की सूची में शीर्ष पर अनुपयोगी दृश्यों, जैसे खाली सदिश प्रदर्शित करेगा (के रूप में "# खाली") और उन दृश्यों जिसमें न तो 5 ' या 3 ' खोज मापदंड पाए गए थे (के रूप में "# Value") । यह सुविधा आसान अद्यतन या विश्लेषण से उन दृश्यों को हटाने के लिए अनुमति देता है ।
    2. वेबसाइट ५०,५१, या अनुक्रम संरेखण के लिए अंय पसंदीदा सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए जा रहा द्वारा खुला Clustal ओमेगा४८ या Kalign४९ सॉफ्टवेयर । कॉपी और फसता अनुक्रम सूची पेस्ट करें और यह नीचे बॉक्स में इनपुट "किसी भी समर्थित प्रारूप में अनुक्रम". बदलें "Kalign में अधिक विकल्प" के तहत 30 के लिए "अंतर खुला जुर्माना" (यह Clustal ओमेगा में संभव नहीं है), लेकिन अंयथा क्लिक करने से पहले डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें "भेजें" ।
    3. विश्लेषण अनुक्रम संरेखण Jalview ५२,५३ सॉफ्टवेयर सीधे Clustal ओमेगा और Kalign ऑनलाइन सॉफ्टवेयर के भीतर संरेखण के ऊपर "परिणाम सारांश" टैब का चयन करके और फिर "Jalview" आइकन पर क्लिक करके ।
      नोट: यदि पसंदीदा, या वैकल्पिक कार्यक्रमों द्वारा उत्पंन अनुक्रम संरेखण के विश्लेषण के लिए, ५४ सॉफ़्टवेयर को अलग से डाउनलोड करें और प्रतिलिपि बनाएं और विश्लेषण विंडो, जो "फ़ाइल", "इनपुट संरेखण", और "पर क्लिक करके खोला है में संरेखण चिपकाएं" पाठ बॉक्स से "। यह आसानी से यदि एक आम सहमति अनुक्रम इनपुट अनुक्रम संरेखण में मौजूद है यह निर्धारित करने के लिए एक साधन प्रदान करता है ।
  3. FACS का उपयोग बंधन संबध और विशिष्टता की तुलना
    1. लगाना 5 मिलीलीटर LB Cm25 के साथ ०.२% w/v D-ग्लूकोज के साथ प्रत्येक व्यक्ति को अलग अलग ब्याज की (से कदम 3.1.4 और/या धारा ३.२ में आगे अनुक्रम विश्लेषण से ब्याज की कालोनियों, आदि) और एक उचित नकारात्मक नियंत्रण (प्रदर्शन पाड़ केवल या एक पेप्टाइड कि लक्ष्य बांध नहीं है, के रूप में २.१३ कदम के लिए नोट में वर्णित) । ३७ ° c पर रातोंरात हो जाना, २२५ RPM पर मिलाते हुए ।
    2. ६० µ l कोशिकाओं (1:50 कमजोर पड़ने) के साथ 3 मिलीलीटर LB Cm25 लगाना करने के लिए रातोंरात संस्कृतियों का उपयोग करें । २२५ RPM पर मिलाते के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन जब तक संस्कृति ०.५-०.५५ के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंचता है । ०.०४% डब्ल्यू/वी एल के साथ पेप्टाइड अभिव्यक्ति प्रेरित-arabinose प्लस 2 मिमी EDTA (पेप्टाइड प्रदर्शन की सुविधा के लिए ४२), ४५ मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर २२५ RPM में मिलाते हुए ।
    3. बर्फ पर प्रेरित संस्कृतियों प्लेस । प्रत्येक को अलग करने के लिए, 5 µ एल कोशिकाओं को जोड़ने के लिए 25 µ l पंजाबियों अकेले या पंजाबियों युक्त: १५० एनएम YPet 12,13 (अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक नियंत्रण), यदि उपलब्ध है; २५० एनएम लक्ष्य-४८८; २५० एनएम पार-प्रतिक्रियाशील प्रोटीन (एस)-४८८; और २५० एनएम SAPE (अधिक विस्तार के लिए २.१ देखें) । ४५ मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    4. आरटी या 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ६,००० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक । सावधानी से गोली के विपरीत पक्ष से तरल ड्राइंग द्वारा supernatant निकालें । स्टोर सेल बर्फ पर छर्रों सभी नमूनों तक और विश्लेषण के लिए तैयार हैं ।
    5. ५०० µ एल बर्फ ठंड FACS चल बफर में प्रत्येक सेल गोली reसस्पेंड, pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण और ट्यूब फ़्लिक, बस एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर पढ़ने से पहले (सामग्री की तालिका देखें) ।
      नोट: गेटिंग और nMFI की गणना बंधन संबध और विशिष्टता की तुलना करने के लिए आगे विवरण के लिए कदम २.१३ नोट्स देखें । गैर-बाइंड करने वालों या गैर-विशिष्ट binders अब आगे विश्लेषण से निकाला जा सकता है, और उच्चतम संबध बाइंडर्स अनुक्रम संरेखण द्वारा पुन: मूल्यांकन किया जाना चाहिए ३.२ आगे रुझान है कि प्रारंभिक अनुक्रम में याद किया गया हो सकता है के लिए देखने के लिए आबादी. वर्गों ३.२ और ३.३ नए रुझान और आम सहमति दृश्यों के रूप में की जरूरत के रूप में दोहराया जा सकता है नोट । अगर रुझान नहीं देखा जाता है तो इस विश्लेषण में अधिक यादृच्छिक अनुक्रम शामिल हो सकते हैं.

Representative Results

स्वचालित चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई (autoMCS) के बजाय मैनुअल चुंबकीय सेल छँटाई के उपयोग के साथ, गलत नकारात्मक उंमीदवारों बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों 9,14के panning के दौरान काफी कम कर रहे हैं । नकारात्मक छंटाई कदम भी ब्याज के लक्ष्य के लिए गैर विशिष्ट binders को कम करने की जरूरत के रूप में जोड़ा जा सकता है, और यह एक ंयूनतम पर सुझाव दिया है चुंबकीय मोती के खिलाफ एक नकारात्मक तरह खुद को जोड़ने के सामने । चुंबकीय मोतियों के खिलाफ यह नकारात्मक चयन खुद को सुरक्षात्मक प्रतिजन के लिए चुना बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालय panning के चार दौर से पहले पूरा किया गया था (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) binders, के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, और अतिरिक्त नकारात्मक चयन से पहले rivax के खिलाफ और abrax के लिए सकारात्मक चयन के चार दौर, के रूप में चित्रा 3में दिखाया गया है । यहां इस्तेमाल किया मोती biotinylated प्रोटीन का कब्जा करने के लिए streptavidin के लिए संयुग्मित हैं, तो खुद को streptavidin के लिए बाध्यकारी पेप्टाइड्स के अवांछित अलगाव एक चिंता का विषय है और FACS के साथ streptavidin-संयुग्मित का उपयोग कर निगरानी की जाती है (चित्र 3 , SAPE). एक कम से कम, streptavidin के लिए बाध्यकारी किसी भी होनहार व्यक्तिगत उंमीदवारों के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए जब लक्ष्य प्रोटीन के लिए बाध्यकारी का आकलन । SAPE के लिए nMFI प्रतिशत बाइंडिंग और सभी सॉर्टिंग राउंड्स में कम मान होना चाहिए । streptavidin के लिए बाध्यकारी के स्तर पर प्रत्येक छँटाई दौर के साथ कुछ हद तक वृद्धि कर सकते हैं, के रूप में चित्रा 3में हुई है, क्योंकि जनसंख्या बार बार प्रत्येक छँटाई दौर के बाद streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों को उजागर कर रहा है. पृष्ठभूमि streptavidin बंधन के स्तर बहाव विश्लेषण करने के लिए समस्याग्रस्त हो जाता है, तो आगे नकारात्मक चुंबकीय मोतियों के खिलाफ छंटाई जो streptavidin बंधन जनसंख्या में वृद्धि हुई सकारात्मक छंटाई दौर के बाद किया जा सकता है आदेश झूठी सकारात्मक के बहाव स्क्रीनिंग को कम करने के लिए । प्रोटीन या सामग्री उपलब्ध है जो विशेष रूप से एक विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए पेप्टाइड के बहाव के उपयोग के साथ हस्तक्षेप कर सकता है, या जो संरचनात्मक और/या अनुक्रम समानता के कारण लक्ष्य के लिए संबध रिएजेंट के साथ प्रतिक्रिया को पार करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं, इसके अलावा नकारात्मक है कि प्रोटीन या सामग्री के खिलाफ छंटाई की सिफारिश की है । एक उदाहरण abrax बाइंडिंग पेप्टाइड्स, संरचनात्मक समानता और अनुक्रम समरूपता इन दो प्रोटीन 1,15के कारण के अलगाव से पहले rivax के खिलाफ नकारात्मक छंटाई है । फिर, पार प्रतिक्रियाशील नकारात्मक छंटाई कदम के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन के लिए बाध्यकारी FACS (चित्रा 3, Rivax-४८८) का उपयोग कर छंटाई दौर के विश्लेषण के दौरान निगरानी की जा सकती है । सबसे अच्छा मामला परिदृश्य में, प्रतिशत बाइंडिंग और nMFI, इस उदाहरण में के रूप में कम हैं ।

जब उपलब्ध है, इस तरह के सी में P2X पेप्टाइड के रूप में एक निश्चित सकारात्मक नियंत्रण पेप्टाइड,-प्रदर्शन के लिए यहां प्रतिनिधि परिणाम में इस्तेमाल किया पुस्तकालय द्वारा उत्पादित पाड़ की टर्मिनस, मदद कर सकते हैं निर्धारित अगर FACS परख में बाध्यकारी संबंध की कमी है कारण प्रदर्शन पाड़ ही की अभिव्यक्ति की कमी के बजाय, लक्ष्य के लिए पेप्टाइड (ओं) के संबंध की कमी है । चित्रा 2 में और चित्रा 3, YPet मोना इस P2X पेप्टाइड के लिए बाध्यकारी पर नजर रखी है और दर्शाता है कि छंटाई के प्रारंभिक दौर व्यक्त पाड़ खराब । यह संभावना मुख्य रूप से यादृच्छिक पुस्तकालय, जिसका अर्थ है कि पाड़ ही उत्पादन नहीं किया गया था में एन टर्मिनल पेप्टाइड्स में रोक codons की उच्च आवृत्ति के कारण है । अंय प्रभाव इसके अतिरिक्त ऐसे पेप्टाइड्स की उपस्थिति के रूप में योगदान कर सकते हैं, ई. कोलाईके लिए अप्रत्याशित विषाक्त प्रभाव के साथ, या अन्य कारणों के लिए वृद्धि या पेप्टाइड प्रदर्शन दरों (जैसे बैक्टीरियल जीनोम में उत्परिवर्तनों) के रूप में). प्रेरण के दौरान EDTA के अलावा ४२छंटाई के इन शुरुआती दौर के दौरान अभिव्यक्ति में सुधार हो सकता है, लेकिन अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है । प्रत्येक panning जनसंख्या में YPet मोना के लिए बाध्यकारी 3 दौर से काफी सुधार हुआ है. चित्रा 2 चित्रा 3करने के लिए तुलना, यह भी स्पष्ट है कि अभिव्यक्ति स्तर में वृद्धि प्रेरण समय से सुधार किया जा सकता है ९० मिनट (के रूप में चित्रा 2, YPet मोना) के बजाय ४५ मिनट (के रूप में चित्रा 3, YPet मोना) में, हालांकि ४५ min आमतौर पर पर्याप्त है । ध्यान दें कि YPet मोना के लिए nMFI नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं के YPet मोना बाइंडिंग स्तर के लिए सामान्यीकृत है, इसलिए अभिव्यक्ति स्तर स्वीकार्य है, तो १.० के पास मान विशिष्ट हैं । सामांय YPet मोना mfi अकेले पंजाब के लिए एक ही नमूना से mfi भी सापेक्ष अभिव्यक्ति स्तर की तुलना करने के लिए एक वैध तरीका है, लेकिन बहुत अधिक मूल्यों देता है (तुलना चित्रा 2 और चित्रा 3 स़डक से परिणाम के साथ एट अल । २०१५ 15).

इस पुस्तकालय के हित के विशिष्ट लक्ष्य के लिए बाध्यकारी पेप्टाइड्स के लिए संवर्धन आम तौर पर तीन सकारात्मक छंटाई दौर के भीतर हासिल की है, लेकिन छंटाई के एक चौथे दौर के लिए जारी फायदेमंद हो सकता है, के रूप में चित्रा 2 और चित्रा 3 में दिखाया . यहां, प्रतिशत बाउंड कोशिकाओं और nMFI दोनों उदाहरण लक्ष्य, फिलीस्तीनी अथॉरिटी और abrax, जो लाल रंग में चित्रा 2 और चित्रा 3, क्रमशः में बॉक्सिंग कर रहे है के लिए दौर 3 से वृद्धि करने के लिए जारी है । उच्चतम संबध पेप्टाइड अनुक्रम पहले से ही 3 दौर में मौजूद हो सकता है, लेकिन आगे के रूप में अच्छी तरह से 4 दौर में समृद्ध होने की संभावना है, जो नीचे में एड्स संभावित उंमीदवारों की चयन 14। 4 दौर से दृश्यों का विश्लेषण करने के लिए दोहराया दृश्यों का पता चलता है, और इन दोहराए दृश्यों अपनत्व और विशिष्टता विश्लेषण और आम सहमति अनुक्रम निर्धारण के लिए एक उत्कृष्ट प्रारंभिक बिंदु हैं । इस पांडुलिपि को एक पूरक के रूप में प्रदान की eCPX_Sequencing मैक्रो इस प्रारंभिक विश्लेषण को कारगर बनाने में मदद करता है, के रूप में चित्रा 4में दिखाया गया है । . seq या पाठ फ़ाइलों के एक फ़ोल्डर के साथ शुरू, डीएनए अनुक्रम जो चुना 5 ' और 3 ' दृश्यों के बीच निहित है अनुवाद, एमिनो एसिड अनुक्रम द्वारा आयोजित, और प्रत्येक पेप्टाइड में व्यक्तिगत अमीनो एसिड अवशेषों की संख्या के लिए विश्लेषण किया । पृथक पेप्टाइड अनुक्रम की सॉर्ट की गई सूची, जैसा कि आरेख 4में सारांश तालिका पत्रक स्क्रीनशॉट पर दिखाया गया है, आसानी से यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि कौन सा अनुक्रम दोहराए और किस आवृत्ति पर । इस स्प्रेडशीट में दोहराए जाने वाले अनुक्रम वाले कक्ष आसान विश्लेषण के लिए विभिंन रंगों में उल्लिखित हैं । यह आम सहमति अनुक्रम और अंय प्रवृत्तियों के लिए इन दोहरा दृश्यों की जांच की सिफारिश की है । इस तरह के Kalign और Clustal ओमेगा के रूप में अनुक्रम संरेखण सॉफ्टवेयर से सहायता प्राप्त है, और विश्लेषण पूरे अनुक्रम उत्पादन पर प्रदर्शन किया जा सकता है (दोनों दोहरा और आवृत्ति वे दिखाई में गैर-दोहरा दृश्यों सहित) और नीचे से चयनित सूची पर दोहरा दृश्यों (के साथ या उनके रिश्तेदार आवृत्ति के बिना) । फिलीस्तीनी अथॉरिटी और abrax के लिए प्रतिनिधि परिणाम, खाते में आवृत्ति लेने के बिना, चित्र 5 और 5B, क्रमशः में दिखाए जाते हैं । ध्यान दें कि पीए टारगेट के लिए चित्रा 5 में, व्यक्तिगत दोहरा दृश्यों के कई स्वयं आम सहमति अनुक्रम WFCFTC (या एक समान अनुक्रम), लाल, जो एक Kalign के लिए Jalview सॉफ्टवेयर विश्लेषण लागू करने से निर्धारित किया गया था में रेखांकित दोहराए जाने वाले अनुक्रम का अनुक्रम संरेखण । इस आम सहमति, WXCFTC के रूप में, पहले से एक PA बाध्यकारी आम सहमति है, जो छंटाई विधि 9में विश्वास प्रदान करता है निर्धारित किया गया था । चित्रा 5Bमें, जहाँ abrax लक्ष्य के लिए दोहराए जाने वाले दृश्यों का उसी ढंग से विश्लेषण किया गया था, परिणाम काफी भिन्ना था. पहले, वहां केवल पांच दृश्यों कि abrax binders के लिए panning के दौर 4 में दोहराया गया, के रूप में पंद्रह दोहरा अनुक्रम फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए panning के 4 दौर से अलग करने का विरोध किया (हालांकि ४४% अधिक कालोनियों भी फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए अनुक्रम थे) । दूसरा, पांच दोहराने दृश्यों में से कोई भी सबसे होनहार "आम सहमति" अनुक्रम (FWAWF, बैंगनी में रेखांकित) निहित है, हालांकि उंमीदवार कुल्हाड़ी-A15 अनुक्रम है कि सबसे अच्छा मिलान (FWDTWF) निहित । इसके अलावा विश्लेषण, बंधन संबध और विशिष्टता दृढ़ संकल्प सहित, चित्रा 5Cमें abrax बंधन के लिए शीर्ष पांच उंमीदवारों से निर्धारित FWDTWF की आम सहमति प्रदान करने में मदद की, के रूप में नीचे बताया ।

प्रत्येक दोहरा अनुक्रम से एक प्रतिनिधि कॉलोनी और abrax बाध्यकारी पेप्टाइड्स के लिए panning से दोहराने दृश्यों के लिए चित्रा 6A के रूप में, FACS का उपयोग कर पर सेल संबध और विशिष्टता के लिए आगे विश्लेषण किया जा सकता है. यहां यह स्पष्ट है कि सभी पांच दोहरा दृश्यों abrax के लिए उच्च समानता है, इच्छित लक्ष्य, rivax से, संरचनात्मक समान प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया नकारात्मक छंटाई, या streptavidin, जो के लिए इस्तेमाल किया चुंबकीय मोतियों की वजह से सॉर्ट के दौरान मौजूद है panning. यह अपनत्व और छंटाई दौर की विशिष्टता के लिए पहले से ही होनहार परिणाम के साथ संगत है चित्रा 3में दिखाया गया है, जहां यह स्पष्ट है कि इरादा लक्ष्य, abrax के लिए बाध्यकारी के लिए संवर्धन, जबकि panning के प्रत्येक दौर के साथ बढ़ती जा रही है समानता के लिए समान प्रोटीन, rivax, नहीं है । हालांकि, एक संतोषजनक आम सहमति अनुक्रम राउंड 4 अकेले (चित्रा 5B और ऊपर चर्चा) से दोहरा दृश्यों का उपयोग कर abrax सॉर्ट के लिए निर्धारित नहीं किया गया था । 4 दौर से १०० अनुक्रम कालोनियों के लिए रिटर्निंग, तथापि, यह आँख से नोट किया गया था जब एक अतिरिक्त उंमीदवार, ax-A12, FWDTWF अनुक्रम अलग ax-A15 में नोट किया गया था कि अनुमानित आम सहमति के लिए सबसे अच्छा मैच के समान दृश्यों के लिए खोज , और कि एक अंय उंमीदवार, कुल्हाड़ी-A14, एक समान अनुक्रम, DWNTWF समाहित । ये और अंय दृश्यों कि या तो दोहराया दृश्यों को समाहित समानताएं, अंय गैर को समानताएं-दोहराया दृश्यों का प्रदर्शन किया, या बेतरतीब ढंग से चुना गया, बंधन संबध और विशिष्टता के लिए FACS द्वारा विश्लेषण किया गया । उन परीक्षित को स़डक एट al. २०१६ 1 में क्रमित किया गया है और इस विश्लेषण से शीर्ष 5 बाइंडर फिगर घमण्डमें दर्शाए गए हैं, जो FWDTWF होने के लिए निर्धारित किए गए आम सहमति अनुक्रम के साथ, चित्रा 5Cमें दर्शाए गए हैं ।

ऐसे पेप्टाइड्स कि पीए लक्ष्य को पहचान के लिए panning के दौर में दोहराया पेप्टाइड दृश्यों के लिए बंधन संबध का एक समान विश्लेषण से पता चला कि सबसे अच्छा बांधने, के रूप में पीए-४८८ nMFI के अनुपात के द्वारा क्रमबद्ध: SAPE nMFI, निहित WXCFTC आम सहमति या एक समान अनुक्रम (तालिका 1) । इस अनुपात का उपयोग करना, उन है कि आम सहमति और उन है कि नहीं था शामिल में स्वयं का आयोजन किया । आम सहमति से संबंधित सभी दृश्यों वाले शीर्ष उंमीदवारों, चित्रा 6में abrax के लिए ऊपर वर्णित तरीकों के लिए इसी तरह का विश्लेषण किया गया, के रूप में स़डक एट अल. २०१५ 14में प्रस्तुत किया । इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि कुछ लक्ष्यों के लिए, दोहराया दृश्यों के साथ पेप्टाइड्स का विश्लेषण महत्वपूर्ण समानता और एक चुना लक्ष्य के लिए विशिष्टता के साथ binders प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हो सकता है, और एक आम सहमति अनुक्रम है कि, अपने आप में, पर्याप्त हो सकता है निर्धारित करने के लिए त्यात बंधनकारक आहे. नोट, तथापि, कि दोहराने की संख्या जरूरी नहीं कि रुचि के लक्ष्य (तालिका 1) के लिए संबंधित बाइंडिंग संबध को प्रतिबिंबित । जब अकेले दोहराने दृश्यों का विश्लेषण एक पैटर्न का निर्धारण करने के लिए पर्याप्त नहीं है, यह अनुक्रम विश्लेषण और बाध्यकारी विश्लेषण के बीच वैकल्पिक करने के लिए उंमीदवारों के पूल नीचे संकीर्ण और उच्च समानता के साथ उन उंमीदवारों के बीच प्रवृत्तियों की जांच सहायक है . यहां तक कि जब एक प्रवृत्ति अकेले दोहरा दृश्यों का विश्लेषण करने से मनाया जाता है, अतिरिक्त गैर दोहराया अनुक्रम एक ही प्रवृत्तियों, या अंय प्रवृत्तियों, आगे की जांच पर प्रदर्शन कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के लिए panning प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध । के रूप में यहां सचित्र, panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों एक चक्रीय प्रक्रिया है । बैक्टीरियल डिस्प्ले लाइब्रेरी में प्रत्येक कोशिका (सामग्री की तालिका देखें) में प्लाज्मिड डीएनए होता है जो कि जब तक कोशिकाओं को एंटीबायोटिक की उपस्थिति में उगाया जाता है, जिसके लिए प्लाज्मिड एक प्रतिरोध जीन होता है (इस मामले में choloramphenicol) । प्रत्येक प्लाज्मिड भी प्रदर्शन पाड़ प्रोटीन जो सेल के बाहरी करने के लिए एक यादृच्छिक पेप्टाइड उजागर encodes । के बाद से प्रत्येक कोशिका केवल एक प्लाज्मिड डीएनए अनुक्रम शामिल होना चाहिए, प्रत्येक कोशिका केवल एक पेप्टाइड प्रदर्शित करना चाहिए, सेल झिल्ली भर में कई स्थानों में. जैव panning के शुरू में पुस्तकालय विविधता के स्तर पर निर्भर करता है और प्रत्येक छँटाई दौर के बाद, डीएनए अनुक्रम हो सकता है या सेल से सेल करने के लिए अद्वितीय नहीं हो सकता है. panning उनकी बाहरी झिल्ली पर व्यक्तिगत पेप्टाइड्स प्रदर्शित करने के लिए सेल पुस्तकालय की वृद्धि और प्रेरण के साथ शुरू होता है । इन पेप्टाइड्स तो एक लक्ष्य प्रोटीन के साथ बातचीत कर सकते है (जो biotinylated है या अंयथा कब्जा के लिए टैग) । चुंबकीय के लिए सक्रिय सेल छँटाई (MCS), असीम प्रोटीन हटा दिया जाता है और कोशिकाओं चुंबकीय मोती है कि एक पर कब्जा प्रोटीन के साथ लेपित रहे हैं के साथ मशीन हैं (इस उदाहरण में streptavidin, जो बायोटिन के साथ एक मजबूत बातचीत है). पूरी संस्कृति तो एक चुंबक से अवगत कराया है असीम कोशिकाओं से बंधे कोशिकाओं को अलग । एक स्वचालित चुंबकीय छँटाई डिवाइस का उपयोग कोशिका जुदाई झूठी सकारात्मक को कम करने के लिए पसंद है. यहां सचित्र एक सकारात्मक प्रकार है, जिसमें कोशिकाओं है कि करने के लिए बाध्य कर रहे हैं और सह चुंबकीय मोतियों के साथ elute रखा जाता है. एक नकारात्मक प्रकार है, जो हम आम तौर पर सामने प्रदर्शन के लिए, प्रक्रिया को छोड़कर एक ही है कि कोशिकाओं है कि चुंबकीय मोतियों की बंद धोया जाता है के बजाय बरकरार रहे हैं । रुचि के पुस्तकालय अंश, (सकारात्मक प्रकार) या असीम (नकारात्मक प्रकार) बाध्य, रातोंरात हो गया है और छंटाई के अगले दौर में इस्तेमाल किया । सकारात्मक panning के प्रत्येक बाद के दौर stringency में सुधार करने के लिए लक्ष्य एकाग्रता और मनका मात्रा में कमी की आवश्यकता है । के प्रत्येक दौर के बाद panning, अपनत्व और प्रोटीन लक्ष्य के लिए पेप्टाइड्स की विशिष्टता प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कर जब panning रोकने के लिए और व्यक्तिगत उंमीदवारों की जांच शुरू करने के लिए निर्धारित करने में मदद का आकलन कर रहे हैं । आवश्यकतानुसार, डीएनए अनुक्रमण और पेप्टाइड अनुक्रम विश्लेषण किया जाता है । ये विश्लेषण कदम स्वयं में एक चक्रीय प्रक्रिया है, विशेष रूप से अलग करने में प्रवृत्तियों का खुलासा करने के लिए, panning के अंतिम दौर के बाद हो सकता है । इस बिंदु पर, पेप्टाइड अनुक्रम प्रवृत्तियों और/या आम सहमति बाध्यकारी संबध और विशिष्टता के साथ संबंधित हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: सॉर्टिंग राउंड के FACS विश्लेषण के लिए उदाहरण डेटा: PA लक्ष्य. FACS द्वारा निर्धारित के रूप में बाध्यकारी समानता (सकारात्मक प्रकार) panning के लक्ष्य के लिए बाध्यकारी पेप्टाइड्स के लिए चुना बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालय, सुरक्षात्मक प्रतिजन (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) के 4 दौर के बाद दिखाया गया है । यह पहले streptavidin-लेपित चुंबकीय मोतियों के खिलाफ एक नकारात्मक तरह प्रदर्शन के बाद प्रदर्शन किया गया था । बाध्यकारी आकलन के लिए, कोशिकाओं ०.४% L-arabinose लक्ष्य और नियंत्रण समाधान और FACS द्वारा विश्लेषण के साथ मशीनीकरण से पहले ९० मिनट के लिए प्रेरित किया गया । इच्छित लक्ष्य के लिए बाइंडिंग संबध विश्लेषण लाल रंग में बॉक्स्ड है । यहां दिखाया गया है FITC के तितर बितर भूखंड-एक बनाम FSC-एक और प्रतिशत कोशिकाओं के लिए मान बंधे (के रूप में gated नकारात्मक अकेले पंजाबियों के साथ गर्मी नियंत्रण की तुलना में) और सामान्यीकृत माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (nMFI, के रूप में पेप्टाइड की तुलना में मुक्त नकारात्मक नियंत्रण के साथ मशीन एक ही fluorophore-प्रेरित कोशिकाओं है कि के साथ ४५ मिनट के लिए मशीन थे के लेबल प्रोटीन): पंजाबियों अकेले बफर, १५० एनएम YPet मोना (पेप्टाइड अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक नियंत्रण), या २५० एनएम पीए-४८८ (लेबल लक्ष्य) । panning के प्रत्येक दौर के बाद ब्याज के लक्ष्य के लिए बाध्यकारी समानता में वृद्धि संवर्धन ध्यान दें । आरेख 3के विपरीत, सभी autoMCS कक्ष पृथक्करण प्रोग्राम Posselds का उपयोग करके पूर्ण किए गए थे । इस डेटा का एक हिस्सा भी FITC-एच बनाम FSC-h में स़डक एट अल के तितर बितर भूखंडों में visualized किया जा सकता है. २०१५-एक बनाम FSC-एक यहां दिखाया भूखंड की तुलना के लिए 14कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: सॉर्टिंग राउंड के FACS विश्लेषण के लिए उदाहरण डेटा: abrax लक्ष्य. इसी प्रकार चित्रा 2के लिए, यहां दिखाया गया है एक पूर्ण panning प्रयोग के लिए तुलनात्मक बाध्यकारी समानता, के रूप में FACS द्वारा निर्धारित । जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय streptavidin लेपित चुंबकीय मोतियों के खिलाफ नकारात्मक छंटाई के अधीन किया गया था, चित्रा 2के रूप में, लेकिन तब समान संरचना के साथ एक मुताबिक़ प्रोटीन के खिलाफ नकारात्मक छंटाई के एक अतिरिक्त दौर के अधीन था और समारोह, rivax, इरादा लक्ष्य, abrax के लिए बाध्यकारी पेप्टाइड्स के लिए सकारात्मक panning के 4 दौर प्रदर्शन करने से पहले. बाध्यकारी आकलन के लिए, लक्ष्य, सकारात्मक नियंत्रण, और नकारात्मक नियंत्रण और FACS पर पढ़ने के लिए बाध्य करने से पहले ४५ मिनट के लिए कोशिकाओं ०.४% L-arabinose के साथ प्रेरित किया गया । इच्छित लक्ष्य के लिए बाइंडिंग समानता लाल रंग में बॉक्स की गई है । यहां दिखाया गया है FITC के तितर बितर भूखंड-a vs FSC-a (या पीई-a बनाम FSC-a SAPE के मामले में) और प्रतिशत के लिए मान कोशिकाओं को बाध्य (के रूप में gated नकारात्मक अकेले पंजाबियों के साथ मशीन नियंत्रण की तुलना में) और प्रेरित कोशिकाओं के nMFI कि ४५ मिनट के लिए के साथ मशीन थे : पंजाबियों बफर अकेले, १५० एनएम YPet मोना (पेप्टाइड अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक नियंत्रण), २५० एनएम Abrax-४८८ (लेबल प्रोटीन लक्ष्य), २५० एनएम Rivax-४८८ (संभावित पार प्रतिक्रियाशील प्रोटीन लक्ष्य लेबल), या २५० एनएम SAPE (नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए सीधे बाध्यकारी के लिए streptavidin-लेपित चुंबकीय मोती) । ब्याज के लक्ष्य के लिए बंधन संबध में बढ़ती संवर्धन नोट, abrax, के प्रत्येक दौर के बाद panning, और संरचनात्मक रूप से समान प्रोटीन के लिए ंयूनतम बाध्यकारी समानता, rivax । इसके विपरीत में चित्रा 2, सकारात्मक panning दौर 1 autoMCS Posselds कार्यक्रम का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, जबकि बाद छंटाई दौर कार्यक्रम Posseld का उपयोग कर पूरा कर रहे थे, के रूप में इस पांडुलिपि में panning के लिए सुझाव दिया । इस डेटा में FITC-h vs FSC-h के कैटरिंग प्लॉट्स में भी visualized किया जा सकता है । २०१६-ए vs FSC-एक यहां दिखाए गए भूखंडों की तुलना के लिए 15 FITC कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: "eCPX_Sequencing" मैक्रो का उपयोग करके उदाहरण अनुक्रम विश्लेषण आउटपुट. दिखाया ४८ PA Posselds विधि का उपयोग कर बांधने के लिए चुना बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालय panning के 4 दौर से कॉलोनियों अनुक्रम का एक स्क्रीनशॉट है । "सारांश तालिका" पत्रक यहां दिखाया गया है । ध्यान दें कि कालोनियों में अनुक्रमण प्रक्रिया के दौरान उनके दिए गए फ़ाइल नाम के वर्णमाला क्रम में गिने गए थे और यह है कि अनुक्रम के आसपास के बक्से को दोहराने के लिए एक से कम एक बार आसान डेटा विश्लेषण के लिए विभिंन रंगों में उल्लिखित हैं । eCPX_Sequencing मैक्रो एक पूरक कोड फ़ाइल के रूप में प्रदान किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: अनुक्रम संरेखण और दो अलग प्रोटीन लक्ष्य के लिए आम सहमति दृढ़ संकल्प । यहां दिखाए गए सभी छवियों Kalign ऑनलाइन विश्लेषण सॉफ्टवेयर ५१का उपयोग कर संरेखित अनुक्रम के बाद Clustal_X रंग के साथ Jalview सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उत्पन्न किया गया. A) फिलीस्तीनी अथॉरिटी से दोहरा दृश्यों का संरेखण 4 दौर ( 1 तालिकाके साथ संगत) । ख) abrax से दोहराने दृश्यों के संरेखण 4 दौर panning ( चित्रा 6Aके साथ संगत) । ग) व्यक्तिगत उंमीदवारों के FACS विश्लेषण द्वारा निर्धारित के रूप में abrax panning दौर 4 से शीर्ष 5 उम्मीदवारों की संरेखण ( चित्रा घमण्डके साथ मेल खाती है). लाल रेखा एक और सी में आम सहमति अनुक्रम को रेखांकित करता है, जबकि बी में बैंगनी रेखा आम सहमति अनुक्रम abrax बाइंडिंग के लिए निर्धारित करने के लिए अग्रदूत साबित जब केवल दोहरा दृश्यों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक रेखांकित एक आम सहमति से पहले FACS का उपयोग कुछ मामलों में निर्धारित किया जा सकता है । भिंन विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ उत्पंन समान संरेखण को स़डक एट al. २०१५ 14 और स़डक एट al. २०१६ 1में देखा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6: व्यक्तिगत उंमीदवारों के लिए उदाहरण बाध्यकारी संबंध और विशिष्टता FACS का उपयोग कर विश्लेषण किया । यहां दिखाया सामान्यीकृत माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (nMFI) एक के लिए FACS का उपयोग कर निर्धारित) दोहरा दृश्यों और ख) शीर्ष 5 उंमीदवारों, के रूप में लक्ष्य, abrax, के लिए तुलनात्मक बाध्यकारी समानता द्वारा निर्धारित के रूप में 4 दौर से panning । डेटा औसत (सलाखों) और तीन स्वतंत्र के मानक विचलन (त्रुटि पट्टियां) का प्रतिनिधित्व करता है प्रयोग दोहराने । ध्यान दें कि सभी उंमीदवारों को दिखाया काफी abrax के लिए विशिष्ट है (abrax-४८८, हरी सलाखों) एक संरचनात्मक समान प्रोटीन पर, rivax (rivax-४८८, लाल सलाखों), और streptavidin नकारात्मक नियंत्रण (SAPE, काली सलाखों) । एक (ax-07 और ax-15) में दोहरा अनुक्रम के दो हालांकि b में शीर्ष 5 उंमीदवारों के बीच भी थे, a और b में परिणामों की तुलना यह दर्शाता है कि अकेले दोहराए जाने वाले दृश्यों का विश्लेषण उच्चतम संबध पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है । यहां दिखाया गया डेटा स़डक एट al. २०१६ 1से अनुकूलित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: व्यक्तिगत दोहराए गए उंमीदवारों के लिए गैर-विशिष्ट बाइंडिंग के लिए विशिष्ट बाइंडिंग का अनुपात । इस उदाहरण में, दोहराने अनुक्रम की संख्या और फिलीस्तीनी अथॉरिटी (लक्ष्य) nMFI करने के लिए SAPE (नकारात्मक नियंत्रण) nMFI का अनुपात पीए panning दौर 4 से दोहराया उंमीदवार अनुक्रम के लिए दिखाया गया है । इस डेटा रिश्तेदार PA nMFI द्वारा हल किया गया था: SAPE nMFI अनुपात और ज्ञात WXCFTC आम सहमति, या एक समान अनुक्रम है, जो बोल्ड फ़ॉन्ट में दिखाया गया है और रेखांकित की उपस्थिति के लिए विश्लेषण. सूचना है कि जुगाड़ स्वयं ऐसी है कि आम सहमति के साथ उन उंमीदवारों का आयोजन सबसे अधिक PA nMFI: SAPE nMFI अनुपात है, और इसलिए लक्ष्य के साथ अधिक विशेष रूप से बातचीत । दिखाए गए परिणाम एकल FACS प्रयोग से हैं । लक्ष्य के लिए ंयूनतम संबध के साथ पेप्टाइड्स अतिरिक्त प्रतिकृतियां और विश्लेषण जो स़डक एट al. २०१५ 14में प्रकाशित किए गए थे से बाहर रखा गया था ।

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Discussion

panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों संबंध रिएजेंट के अलगाव के लिए एक सफल दृष्टिकोण किया गया है, और पेप्टाइड्स जब विशिष्ट मानदंडों की आवश्यकता होती है मांयता के लिए एंटीबॉडी के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करते हैं, ऐसे चरम वातावरण में स्थिरता के रूप में । इन पुस्तकालयों की autoMCS यहां वर्णित तरीकों का उपयोग कर सुव्यवस्थित किया गया है, और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध autoMCS मंच एक बहुत व्यापक दर्शकों के लिए इस तकनीक का विस्तार । पारंपरिक अदल MCS/FACS की तुलना में बैक्टीरियल डिस्प्ले पुस्तकालयों के लिए छंटाई तरीकों, autoMCS तरीकों कम खर्चीला है क्योंकि वे छंटाई और बाध्य कोशिकाओं को अलग करने में सक्षम एक और अधिक महंगी FACS साधन में निवेश की आवश्यकता नहीं है, बजाय प्रवाह cytometer के प्रकार है कि यहां प्रयोग किया जाता है, जो केवल 14विश्लेषण करने में सक्षम है । सफल autoMCS द्वारा panning के लिए महत्वपूर्ण कदम जुदाई कार्यक्रम चयन, नकारात्मक संभावित पार reactants के खिलाफ छंटाई झूठी सकारात्मक को कम करने के लिए, FACS का उपयोग कर जब panning बंद करने के लिए निर्धारित करने के लिए पुस्तकालय संवर्धन की निगरानी शामिल हैं, और सैकड़ों अभ्यर्थियों की बोझिल स्क्रीनिंग से बचने के लिए प्रत्याशी पूल का स्मार्ट एनालिसिस कराएंगे ।

उदाहरण के साथ साथ वर्णित दो अलग लक्ष्य, फिलीस्तीनी अथॉरिटी और abrax के लिए चुना जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय के सफल panning, हालांकि थोड़ा अलग विश्लेषण के प्रत्येक पूल के लिए पेप्टाइड दृश्यों में मतभेदों के कारण रणनीतियों के साथ प्रदर्शन चार राउंड के बाद उम्मीदवार panning. फिलीस्तीनी अथॉरिटी और अधिक सरल मामला था, अनुक्रम के साथ पेप्टाइड दृश्यों से स्पष्ट प्रवृत्तियों का प्रदर्शन विश्लेषण है कि एक बार कम से १४४ कालोनियों में दोहराया । अकेले यह pa लक्ष्य के लिए एक आम सहमति अनुक्रम निर्धारित करने के लिए पर्याप्त था, और उन कालोनियों कि आम सहमति या एक समान अनुक्रम निहित streptavidin नकारात्मक नियंत्रण के लिए बाध्यकारी बनाम फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए बाध्यकारी के अनुपात के संदर्भ में सबसे अच्छा उंमीदवार थे । हालांकि, यह हमेशा मामला नहीं होगा । abrax लक्ष्य के लिए, sequencing १०० कालोनियों पांच दोहराने अनुक्रम के लिए नेतृत्व किया, लेकिन इन दृश्यों में प्रवृत्ति कम स्पष्ट था, एक प्रवृत्ति के अलावा सुगंधित एमिनो एसिड अवशेषों और एसपारटिक एसिड या asparagine शामिल करने के लिए. दोहराया दृश्यों से भविष्यवाणी की "आम सहमति" केवल उत्पादन किया गया है और abrax के लिए संबंध के लिए परीक्षण कर सकते हैं, लेकिन जब से कोई माता पिता के दृश्यों कि सटीक आम सहमति अनुक्रम निहित है, हम अनुक्रम कालोनियों की सूची में लौटे और कहा कि अंय उंमीदवारों कि एक दूसरे के साथ आम में और अधिक प्रवृत्तियों था । वास्तव में, दो कालोनियों अकेले दोहराता से "आम सहमति" के लिए एक समान अनुक्रम निहित, (FWAWF के बजाय FWDTWF), जो tryptophan, फेनिलएलनिन, और एसपारटिक एसिड अवशेषों की एक ही प्रवृत्ति थी लेकिन अलग रिक्ति के साथ । इन पेप्टाइड्स में से एक एक दोहरा अनुक्रम था, एक नहीं था । इन दो दृश्यों, एक तिहाई एक समान संस्करण युक्त अनुक्रम के साथ, शीर्ष 5 abrax के लिए अपनत्व के मामले में परीक्षण binders के बीच में थे । शीर्ष बांधने की मशीन समग्र, कुल्हाड़ी A05, भी इसी तरह की प्रवृत्तियों प्रदर्शित । abrax के लिए परिणाम प्रदर्शित करता है कि एक दृष्टिकोण है जो अनुक्रम विश्लेषण और अपनत्व और विशिष्टता विश्लेषण के बीच कई बार वैकल्पिक कभी आवश्यक होगा, चुना लक्ष्य के आधार पर । abrax लक्ष्य के लिए परिणाम भी विशिष्ट है कि एक बहुत ही प्रोटीन (rivax 1,15) से अधिक प्राप्त किया जा सकता है के स्तर पर प्रदर्शित करता है ।

हमारे अध्ययन के लिए चयनित autoMCS कार्यक्रमों Posselds और Posseld, जो कम आवृत्ति के साथ लेबल लक्षित कोशिकाओं के सकारात्मक चयन के लिए दोनों कर रहे थे, प्रारंभिक आबादी का कम से 5%. दोनों ही मामलों में, कक्ष दो चुंबकीय स्तंभों से गुज़रते हैं । हालांकि, Posselds प्रोग्राम के मामले में, सेल एक्सपोज़र समय ४१बढ़ाने के लिए पहले स्तंभ के माध्यम से अधिक धीमे गुजरते हैं । व्यावसायिक autoMCS डिवाइस के निर्माता द्वारा दिए गए प्रोग्राम विवरणों के अतिरिक्त ( सामग्री तालिका) ४१देखें, इन प्रोग्रामों को कई संभावित प्रोग्रांस की आरंभिक तुलना के बाद चुना गया था । नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं की एक समरूप संस्कृति से बाहर झूठी सकारात्मक खींच से बचने के लिए प्रत्येक कार्यक्रम की क्षमता है, और सफलतापूर्वक एक कम से नुकीला नकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं से युक्त मिश्रित संस्कृति से ब्याज की एक लक्ष्य के लिए एक ज्ञात बांधने की मशीन को अलग करने के लिए ज्ञात बांधने का प्रतिशत, की तुलना में थे । यदि महत्वपूर्ण यहां वर्णित अनुप्रयोगों से deviating, एक समान तुलना नए आवेदन के लिए कार्यक्रम के चयन में सहायक हो सकता है । हालांकि, पहले से प्रकाशित इन दो कार्यक्रमों की तुलना परिणाम (Posseld और Posselds) फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए पेप्टाइड संबंध रिएजेंट के अलगाव के लिए पता चला है कि या तो इन प्रोग्रामों के सभी चार दौर के लिए एक समान के साथ पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए नेतृत्व के लिए उपयोग WXCFTC आम सहमति के पीए और दृढ़ संकल्प के लिए अपनत्व और विशिष्टता । मुख्य अंतर है कि Posseld, अपनी तेजी से प्रवाह की दर के साथ थे, और अधिक तेजी से और लक्ष्य के लिए बाध्यकारी संबंध हल किया गया था इसलिए उच्च panning के केवल दो दौर के बाद, जबकि Posselds का उपयोग अधिक अद्वितीय दृश्यों के लिए नेतृत्व में panning के चार दौर के बाद 14. इस से सीखना, रणनीति थोड़ा बदल गया था जब abrax बाध्यकारी पेप्टाइड्स के लिए panning दोनों लाभ को शामिल करने के लिए: Posselds 1 दौर के लिए इस्तेमाल किया गया था इस महत्वपूर्ण कदम के दौरान अधिक जोखिम समय की अनुमति जहां विविधता सबसे अधिक है, लेकिन फिर कार्यक्रम राउंड 2-4 1,15के दौरान सबसे अधिक आत्मीयता बांधने के तेजी से अलगाव के लिए Posseld के लिए बंद किया गया था । यह abrax के लिए आदर्श है, खासकर के बाद से nMFI और बंधन प्रतिशत दोनों abrax के लिए उच्च दौर 4 छंटाई के रूप में या तो कार्यक्रम के साथ दौर 4 छंटाई की तुलना में अधिक थे ( चित्रा 2 और चित्रा 3 और स़डक एट अल. २०१५ 14), लेकिन एक प्रत्यक्ष तुलना एक ही लक्ष्य के साथ दूसरे बनाम एक रणनीति का उपयोग अधिक निर्णायक तुलना के लिए आवश्यक होगा । कौन सा कार्यक्रम एक विशेष अनुप्रयोग के लिए सबसे अच्छा है व्यक्तिगत लक्ष्य पर निर्भर हो सकता है, छंटाई पुस्तकालय का इस्तेमाल किया, और पेप्टाइड अभिव्यक्ति है कि यहां वर्णित शर्तों को किसी भी परिवर्तन के साथ हासिल की है स्तर ।

चर्चा नहीं यहां अजैव सामग्री के साथ panning से संभावित परिणाम हैं, लेकिन हम भी थोक एल्यूमीनियम 2के खिलाफ panning के लिए एक ही जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालय का इस्तेमाल किया है । इस अध्ययन autoMCS का उपयोग नहीं किया गया था, लेकिन इसी तरह के अध्ययन autoMCS का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है अगर सामग्री पर उपलब्ध है, या पर या संयुग्मित, एक चुंबकीय मनका लेपित किया जा सकता है । थोक एल्यूमीनियम अध्ययन में, व्यक्तिगत एमिनो एसिड विश्लेषण और माध्यमिक संरचना मॉडलिंग अलग पेप्टाइड्स के बंधन संबध चला रहा था क्या समझने में मददगार था, के बाद से कोई आम सहमति अनुक्रम 2निर्धारित किया गया था । यहां तक कि जैविक लक्ष्य के साथ, यह समझने की आवश्यकता हो सकती है कि कुछ लक्ष्यों के लिए बाध्यकारी समानता क्या है, यही कारण है कि "eCPX_Sequencing" मैक्रो से उत्पंन स्प्रेडशीट व्यक्तिगत अवशेष आवृत्ति विश्लेषण के साथ एक टैब भी शामिल है । एक आम सहमति की कमी के अलावा कोई दोहरा दृश्यों देखा जाता है, और अवशेषों आवृत्ति कोई पैटर्न से पता चलता है, तथापि, विश्लेषण के अन्य प्रकार की आवश्यकता हो सकती है. इसके अतिरिक्त, आगे छंटाई दौर नीचे के लिए उंमीदवारों की एक बहुत बड़ी संख्या में वांछित लक्ष्य के लिए पर्याप्त संबंध के साथ उन लोगों के चयन स्क्रीनिंग से बचने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

अगली पीढ़ी अनुक्रमण की बढ़ती उपलब्धता के साथ, एक अधिक गहन अध्ययन के लिए अपनत्व का परीक्षण करने से पहले सबसे होनहार उंमीदवारों का निर्धारण करने के लिए और जैव panning के प्रत्येक दौर के बाद संवर्धन की हद निर्धारित करने के लिए प्रदर्शन किया जा सकता है । हालांकि, बाइंडिंग विश्लेषण चरण पर ले जाने वाले अनुक्रम को क्लोनिंग द्वारा पुन: बनाया जा सकता है, अगर वे दसियों या सैकड़ों कालोनियों के नियमित कॉलोनी अनुक्रमण के साथ आसानी से अलग करने के लिए उच्च पर्याप्त आवृत्ति के नहीं होते हैं । इस प्रौद्योगिकी अग्रिमों के रूप में, कम खर्चीला और अधिक दिनचर्या बनने, और विशेष रूप से कॉलोनी अलगाव के लिए एक विकल्प के साथ, यह संभावना सबसे अच्छा तरीका है panning डेटा का विश्लेषण होगा । यह तरीका व्यक्तिगत दृश्यों के elucidation के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और पूरे पुस्तकालय, विकसित । इसके अतिरिक्त, छंटाई पुस्तकालय में बैक्टीरिया समय के साथ रूपांतरित हो सकता है, जो तेजी से वृद्धि दर या बैक्टीरिया के साथ कोशिकाओं की ओर छंटाई पूर्वाग्रह सकता है कि जीनोमिक को भी प्रदर्शन पाड़ और पेप्टाइड अभिव्यक्ति के बिना एक सामग्री बांध सक्षम प्रोटीन, के लिए आवृत्ति. कि कारण के लिए, एक बार होनहार उंमीदवारों उभरने, यह प्लाज्मिड डीएनए को अलग करने लायक है, नए सिरे से ई. कोलाई बदलने, और FACS के माध्यम से पुष्टि पेप्टाइड बाध्यकारी । यदि किसी कक्ष-मुक्त स्वरूप में पेप्टाइड का उपयोग करने की योजना बना रहा है, तो मुक्त पेप्टाइड के लिए संबध भी मूल्यांकन किया जाना चाहिए । उदाहरण के लिए, एसईबी लक्ष्य के लिए बैक्टीरियल डिस्प्ले के माध्यम से की खोज पेप्टाइड संबंध reएजेंट-सेल का उत्पादन किया गया और एंजाइम से जुड़े immunosorbant परख (एलिसा) के रूप में और अधिक परंपरागत तरीकों से विश्लेषण, और पर सेल (FACS के माध्यम से) और ऑफ सेल (एलिसा के माध्यम से) संबंध दोनों तरीकों 7द्वारा निर्धारित Kdका उपयोग कर तुलना की गई ।

हालांकि बायोटिन की ताकत-streptavidin बातचीत यह प्रोटीन लक्ष्य और बाध्य पेप्टाइड्स पर कब्जा करने के लिए एक आदर्श रणनीति बनाता है, इस प्रक्रिया को अन्य कब्जा रणनीतियों के लिए संशोधित किया जा सकता है । इस तरह के epoxy और carboxylic एसिड मोतियों के रूप में चुंबकीय मोतियों को प्रोटीन के प्रत्यक्ष युग्मन, सफल रहा है और एक बाध्यकारी कदम को हटा । हालांकि, अनुलग्नक रणनीति के आधार पर प्रत्यक्ष अनुलग्नक संभावित बाइंडिंग साइटों को किसी विशिष्ट या गैर-विशिष्ट तरीके से बाधा पहुंचा सकता है । streptavidin मोतियों का उपयोग करने के लिए एक अतिरिक्त लाभ यह है कि कम स्थिर प्रोटीन लक्ष्य हौसले से 30 मिनट में biotinylated किया जा सकता है या जमे हुए संग्रहीत, अगर जरूरत है, जबकि मोती खुद को पार के लिए प्रोटीन के साथ अब गर्मी की आवश्यकता को जोड़ने और कर रहे है आम तौर पर 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित । सुझाया biotinylated प्रोटीन की एकाग्रता शुरू यहां लक्ष्य, ६०० एनएम, कई लक्ष्यों के लिए सफल रहा है, लेकिन यह वृद्धि हुई आत्मीयता के साथ पेप्टाइड कैप्चर एजेंट को अलग करने के लिए संभव हो सकता है अगर यह एकाग्रता कम है । इसके अतिरिक्त, इस विधि के लिए बढ़ाया जा सकता है और अंय जीवाणु प्रदर्शन पुस्तकालयों और अंय जीवों के लिए संशोधित । उदाहरण के लिए, इन चरणों anaerobes के साथ उपयोग के लिए ऑक्सीजन के अभाव में किया जा सकता है, या extremophiles के साथ उपयोग के लिए अंय वातावरणों में विशिष्ट गुणों के साथ पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए । ब्याज की एक विशेष लक्ष्य के लिए निर्धारित पेप्टाइड्स और/आम तौर पर एक जीवित सामग्री के रूप में सेल पर इस्तेमाल किया जा सकता है, या सिंथेटिक ऑफ सेल का उत्पादन किया । कृत्रिम रूप से उत्पादित पेप्टाइड्स आगे भी उच्च आत्मीयता और अधिक मजबूत प्रोटीन Catalyzed कैप्चर (पीसीसी) सेंसर में उपयोग के लिए एजेंटों के विकास के लिए परिपक्व हो सकता है, या अन्य अनुप्रयोगों के लिए जहां एंटीबॉडी आम तौर पर बाध्यकारी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा या मान्यता ३८,५५. आणविक मॉडलिंग भी अपने लक्ष्य के साथ पेप्टाइड की बाध्यकारी स्थान निर्धारित करने में मदद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में हाल ही में abrax बाध्यकारी पेप्टाइड्स और आम सहमति के लिए किया गया था चित्रा 5C में सूचीबद्ध 1. कुल मिलाकर, पेप्टाइड संबंध के लिए गैर-panning बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों एक तेजी से, सीधी, और शक्तिशाली पहचान और प्रोटीन लक्ष्य का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए विकल्प है, और इस अर्द्ध स्वचालित panning दृष्टिकोण दूरगामी अनुप्रयोगों के साथ विश्वसनीय परिणाम का उत्पादन किया है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है

Acknowledgments

लेखकों को अमेरिकी सेना अनुसंधान प्रयोगशाला (ARL) Postdoctoral फैलोशिप कार्यक्रम, ARL के साथ एक अनुबंध के माध्यम से ओक रिज संबद्ध विश्वविद्यालयों द्वारा प्रशासित, डॉ जस्टिन पी Jahnke की नियुक्ति के माध्यम से का समर्थन स्वीकार करना चाहूंगा । शेष धन ARL पर संवेदकों एवं इलेक्ट्रॉनक उपकरणों संचालनालय द्वारा प्रदान किया गया. लेखकों को भी UCSB पर बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालय और YPet मोना रिएजेंट क्लोनिंग के लिए जानकारी साझा करने के लिए Daugherty लैब धंयवाद करना चाहूंगा, डॉ Bryn एडंस YPet में ARL मोना रिएजेंट क्लोनिंग में समर्थन के लिए, डॉ यहोशू Kogot पर अपने प्रारंभिक काम के लिए और बैक्टीरियल प्रदर्शन पुस्तकालयों के जैव panning में प्रशिक्षण, Edgewood रासायनिक और जैविक केंद्र के Alena शांत व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल plasmids बांटने के लिए और abrax और rivax प्रोटीन, फिलीस्तीनी अथॉरिटी बाध्यकारी पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए तकनीकी सहायता के लिए ब्रांडी डोर्सी, किन गुओ abrax बाध्यकारी पेप्टाइड्स के अलगाव के लिए प्रारंभिक प्रयोगों की तकनीकी सहायता के लिए, और डॉ जेसिका Terrell उपयोगी इस पांडुलिपि के बारे में चर्चा के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

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