Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biochemistry
 

Summary

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת לגילוי פפטיד זיקה ריאגנט לזיהוי של מטרות-ביוטי והן והאביוטיים. פפטיד זיקה ריאגנטים יכול לשמש עבור יישומים דומים כדי נוגדנים, כולל חישה הרפוי, אך מסוגל לבצע בסביבות קיצוניות יותר ועמיד יותר. העשרת ספציפי של פפטיד לכידת סוכנים מטרה חלבון עניין היא משופרת באמצעות שיטות המיון האוטומטי למחצה אשר לשפר את איגוד, לשטוף את השלבים, לכן להקטין את המופע של קלסרים חיובי כוזב. שיטת המיון האוטומטי למחצה מתואר בזאת לשימוש עם מסחרי האוטומטי המגנטי תא לפעיל על-מיון מכשיר עם צג חיידקי ולמשחקי מיון ספריית לבטא פפטידים 15 אקראי-מר. עם שינויים קלים, שיטות אלה ניתנת להארכה לשני אוטומטית התקנים, ספריות אחרות מיון אורגניזמים אחרים. מטרה ראשית של עבודה זו היא לספק מתודולוגיה מקיפה (התורה) בתהליך החשיבה המוחלת בניתוח וצמצום הבריכה וכתוצאה מכך של מועמדים. טכניקות אלה כוללים ניתוח של איגוד-תאים באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), כדי להעריך זיקה וספציפיות במהלך מיון, בהשוואה בין מועמדים בודדים, ואת הניתוח של פפטיד רצף לזהות מגמות ו רצפי הקונצנזוס ההבנה ושיפור באופן פוטנציאלי את זיקה וספציפיות עבור היעד עניין.

Introduction

Biopanning היא טכניקה מוכחת לגילוי ריאגנט זיקה, עם בקטריאלי להציג ספריות מקור נוח עבור פפטיד זיקה ריאגנטים 1,2,3,4,5, 6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24. באופן דומה כדי phage להציג 25,26 שמרים ויציג 27,28, פפטידים נחשפים על-פני התא, הינם זמינים לאגד-ביוטי והן והאביוטיים יעדים, באמצעות אינטראקציות אלה מונע על ידי עמוד השדרה פפטיד והן את המאפיינים הייחודיים של הצד-שרשראות חומצת אמינו 29. בניגוד phage תצוגה, החיידקים עצמם משכפלים ומכילים חומר גנטי כל הנדרש לתצוגה ללא • תנאי של phage מאוגד או הדבקה חוזרת של תאים. בניגוד שמרים תצוגה, תצוגה חיידקי הוא מהיר עקב המהירה (כ 20 דקות 30) הכפלת זמן של Escherichia coli. יכול להיות מיוצר ריאגנטים זיקה פפטיד שנוצר מחוץ תאים לשימוש במגוון רחב של פלטפורמות 16,17,26 חישה ויש פוטנציאל לשימוש כמו חומרי חיים כאשר הוא מוצג בהתא 2 , 31 , 32. לעומת נוגדנים חד-שבטיים זיהוי של מטרות ספציפיות, פפטידים הן הרבה יותר קטן וגמיש יותר, ניתן לטפל בקלות תצוגה מעבדות ברמת ה-DNA כדי להימנע חומצות אמינו ספציפיות, כגון ציסטאין 33 . פפטידים, יותר ויותר מנוצלות הרפוי 34,35,36 ויישומים אחרים שבו נוגדנים היה בדרך כלל להיות מנוצל הודות לקלות שלהם של גילוי, לשחזור סינתטיים (הנחה-תא ) ייצור ותחזוקה מעולה של ביצועים בסביבות קיצוניות, מתן חומר מגיב תפקודית גם לאחר חשיפה בטמפרטורה גבוהה או לאחסון לטווח ארוך ללא קירור 37,38. היכולת להתגבר על שרשרת קר עבור אחסון של ריאגנטים הוא עניין מיוחד למשרד ההגנה, למשל, אשר עליו לפעול בסביבות קיצוניות. יציבות תרמית היה לכן תכונה רצויה עבור ריאגנטים באהדה להכרת המטרות שבחרת לתת דוגמאות כתב יד זה.

לאחרונה, ספריות התצוגה חיידקי biopanning הפך להיות עוד יותר פשוטה ואמינה עם השימוש של חצי אוטומטי מגנטי תא לפעיל על-מיון (מקינטוש או MCS) שיטות 9,14,39. שיטות אלה הוכחו עבור מטרות ביולוגיות באמצעות מספר דומה מיון פלטפורמות עם יתרונות שונים, לרבות זמינים מסחרית האוטומטי המגנטי תא לפעיל על-מיון כלי נגינה (autoMACS או autoMCS) (ראה טבלה של חומרים) 1,14,15 והתקנים יותר מיוחדים אשר מכניס את הדגימה מחסנית חד פעמיות 7,9 או שבב 39, מפרט יקר עבור שימוש עם אורגניזמים או רעלים אבטחה ברמה 2 (BSL-2) או גבוה יותר7. אפשרות להאריך בשיטות אוטומטיות למחצה אלה כדי למיין על פפטידים מסוגל לקשור חומרים והאביוטיים אם החומרים מגנטיים או יש את היכולת להיות מצופה חרוז מגנטי, ועל לשימוש עם אורגניזמים שונים (כגון חיידקים אנאירוביים) אם המיון שונו תנאי הגידול. בנוסף מיון התצוגה חיידקי ספריות, הכלי autoMCS מסחרי המשמש כאן שימש גם בחלקו על השלבים הראשונים של גילוי של נוגדן חד-שרשרת אנושית קטעים המוצג על פני השטח של שמרים, ואחריו בבידוד נוסף באמצעות פלורסנט מופעל התא מיון (FACS) 40. היתרונות העיקריים של אוטומציה למחצה הן ירידה מיון זמן, מאמץ, יותר לשחזור ועמיד חיסול תאים לא מאוגד החרוזים מגנטי במהלך שטיפת צעדים, המוביל מופחתת תוצאות חיוביות שגויות, בפחות סיבובים המיון נדרש, ולא פחות ניתוח ה-down stream מורכב 9,14. במקרה של המכשיר autoMCS מסחרי, יש מספר תוכניות טעון מראש, אשר עשוי להיות אופטימלית ליישומים שונים, כגון שלילי-מיון (דלדול), מתן עדיפות טוהר, צמצום נפח דגימה הסופי, הגדלת או הפחתת רגישות עבור בידוד של תאים נדיר 41.

המוקד של עבודה זו היא להדגים את המתודולוגיה עבור biopanning ספריה חיידקי התצוגה באמצעות מכשיר autoMCS זמינים מסחרית, להסביר את התהליך המחשבתי המוחלת בניתוח וצמצום הבריכה וכתוצאה מכך של מועמדים סדר כדי להקל על סיומת ליישומים אחרים. הספרייה התצוגה המשמש כאן (ראה טבלה של חומרים) 12,13 מכיל כ 109-11 10 15 ייחודי-מר פפטידים מוצגים דרך גירסה שונה של החלבון הממברנה החיצונית חיידקי OmpX ב הטבע ללא הגבלה על פני התא, אשר צפוי להיות נציג פפטיד חינם בתמיסה אם הפיק לאכסון. להגיע לגרדום הזה חלבון בנוסף מכיל פפטיד בקרה חיובית P2X-קצה קרבוקסילי לניטור ביטוי באמצעות קשירה מונה YPet. עם זאת, ספרייה שנרכשו או רומן עם גיוון מתאימים ומאפיינים אחרים הדרושים עבור היישום הספציפי הרצוי יש לעבוד באופן דומה עם הליך זה biopanning, למרות כמה שינויים קלים העשויים להידרש. תיאור סכמטי של פרוטוקול biopanning זה מודגם באיור1. בנוסף, הפרוטוקול יכול להיות מותאם השני אוטומטית פלטפורמות מיון מגנטי ואסטרטגיות מיון אחרים. מיון מגנטי ידני עם מגנט benchtop בהצלחה הוכח, אמנם עם ניתוח במורד הזרם יותר מסובך וצורכת זמן נדרש עקב הגדילה תוצאות חיוביות שגויות 14, והוא בכל זאת מספק אפשרות חלופית צעדים autoMCS אם אין תא מגנטי אוטומטיות מיון המכשיר זמין.

Protocol

1. Biopanning התצוגה חיידקי באמצעות ספריות autoMCS

הערה: פרוטוקול מיון זה מבוסס על autoMCS היה שתואר לעיל 14, וזמינה יסודית יותר "הרחיב פרוטוקול עבור משתמשים חדשים" את החומרים המשלימים עבור כתב יד זה לפרטים נוספים, כולל הסבר על הפוטנציאל שינויים. אם התקן autoMCS אינו זמין לצורך מיון, ראה פרוטוקול משלים מ Sarkes et al. . 2015 מאז ידנית מיון פרוטוקול מתואר גם בזה לעבוד 14. פרוטוקול autoMCS בתנאי כאן נוסף הותאם לכלול שלבים המיון שליליים נוספים עבור ירידה לפרטים משופרת 1,15. תיאור סכמטי של פרוטוקול biopanning זה מודגם באיור1.

  1. שלילי מיון כדי להסיר קלסרים סביר להניח Cross-React עם חרוזים מגנטי
    1. לחסן 500 מ"ל של מילר מרק לוריא (LB) המכיל המתאים לאנטיביוטיקה עם עונה 1 פרק 1011תאים של בקטריאלי מגוונים להציג ספריית מיון (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: פפטיד הספרייה התצוגה חיידקי משמש כאן (ראה טבלה של חומרים) מכיל כ 109- 1011חברים ייחודי 8,12 , גדל LB המכיל µg/mL 25 כלורמפניקול (25ס מ LB). השארית של פרוטוקול זה מניח כי נעשה שימוש בספריה זו.
    2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 סל ד עד התרבות מגיע עם יתר600 של 0.5 - 0.55. זירוז פפטיד הביטוי של 0.04% w/v L-אראבינוז על ידי דילול מטריים מניות של 4%, רועדת-225 סל"ד למשך 45 דקות ב 37 º C.
    3. המקום המושרה תרבות על קרח. צנטריפוגה כ 2 x 10 תאים11 ב 6000 x g למשך 20 דקות ב 4 º C. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בתאים 1.5 mL PBS מאת מתערבל בעדינות.
      הערה: OD600 של 1.0 כ שווה 1 x 109 תאים למ"ל עבור e. coli.
      הערה: לא מערבולת כמו זה ייתכן lyse התאים; resuspend ידנית או ע י ניעור בקצרה-≤ 225 סל ד, 4 מעלות צלזיוס.
    4. להעביר תאים microcentrifuge צינור ו ספין ב 6,000 g x 5 דקות ב RT או 4 ° C. הסר את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא בתוך 1 מ"ל buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) המכילה 0.5% אלבומין שור (BSA; PBS-B).
    5. לשטוף µL 300 של חרוזים מצופים streptavidin (בערך 3 x 109 חרוזים, ראה טבלה של חומרים) 1 מ"ל PBS-B, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב≥5, 000 g x (ב RT). הכנס צינור ספסל חלקיקים מגנטיים העליונה מפריד. הסר בזהירות את תגובת שיקוע, הימנעות בגדר.
    6. Resuspend את החרוזים תא בתוספת תערובת PBS-B המוכן מעל. דגירה ב 4° C על פלטפורמה מסתובבת לדוגמאות במקום 45 דקות על קרח.
    7. הפעל את כלי הנגינה autoMCS לאתחל את המערכת. פריים קווים באמצעות ההפעלה של היצרן ועל מאגרי לשטוף (ראה טבלה של חומרים) על-ידי בחירה "לשטוף עכשיו" בתחתית המסך בתפריט "ההפרדה", "לשטוף" ואז "הפעל".
    8. ראש המערכת עם PBS-B, באמצעות PBS-B מאגר שטיפת והן הפעלת מאגר בשלבים הבאים. בחר בתפריט "ההפרדה" בבר הניווט העליון ובחר "לשטוף עכשיו". בחר "לשטוף" ואת "הפעל" לשפר את המערכת עם PBS טריים-בי
    9. העבר תערובת תא חרוז מהשלב הדגירה צינור חרוטי 15 מ"ל. במקום הצינור הזה בתוך החריץ מדגם ולרוקן 15 מ"ל צינורות חרוט במכונה הבחירה חיוביים ושליליים, של ארון טרום מקורר (4 ° C) (ראה טבלה של חומרים). במקום ארון תקשורת על מכשיר פלטפורמה.
    10. להקצות תוכנית ההפרדה עבור כל דגימה על המדף (עד 5 דוגמאות ניתן למיין בהפעלה אחת). הוסף צעד "שטיפה" בין כל מדגם ואחרי הדגימה האחרונה. בחר "הפעל" כדי להתחיל את ההפרדה התא. בחר "אישור" כדי לאשר כי מספיק מאגר זמין.
      הערה: התוכנית ההפרדה "Posselds" עובד היטב עבור מיון שלילי ולא חיובי מיון עגול 1 ו- "Posseld" הוא המועדף לצורך מיון כדורים 2-4, אבל שתי התוכניות שימשו בהצלחה עבור כל שלילי וחיובי מיון סיבובים 14 ,15 ותוכניות אחרות עשויה טוב יותר עבור יישום מסוים (שמתואר בהמשך הדיון).
    11. עם השלמת התוכנית, להסיר את המדף ולשמר את השבר המתאים. . הנה, עבור סוג שלילי, שומרים על שברים שלילי (המכיל תאים ללא חרוזים). מניחים על קרח.
    12. השתמש השבר מיון שלילי בשלמותו לחסן 1 ליטר של ס מ LB25 עם 0.2% w/v D-גלוקוז. לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת-225 סל ד.
    13. לפני כיבוי המכשיר autoMCS, לשנות המאגרים לרוץ, תשטוף ההפעלה של היצרן ועל מאגרי לשטוף (ראה טבלה של חומרים). בחר "לשטוף עכשיו", "לשטוף" ואז "הפעל". בסיום, להיות בטוח שיש 70% אתנול בשורה טיהור, ולאחר מכן הקש על הסמל"כוח" בפינה הימנית העליונה של המסך, בחר "כן".
    14. השלמת כיבוי מערכת (בקבוקים יהיה סגול), כבה את המכונה.
    15. למחרת, להשתמש התרבות לילה כדי להפוך מניות מקפיא עם עונה 1 פרק 1011תאים לכל מבחנה ליברות עם 15% גליצרול. בנוסף, או לחלופין, להשתמש תרבות זו בשלב הבא: מיון שליליים נוספים (סעיף 1.2) או בסיבוב הראשון של מיון חיובי (סעיף 1.3).
  2. שלילי מיון כדי להסיר קלסרים סביר להניח Cross-React עם מטרות נוספות של עניין
    הערה: סעיף 1.2 יכול יבוצע אם אין יותר שלילי מיון צריך או רצוי. במקרה זה, להמשיך סעיף 1.3. איגוד שיורית כל מטרות בלתי רצויה יכול להיות מוערך על ידי FACS כמו סעיף 2: ניתוח FACS מיון סיבובים.
    1. לצורך מיון שלילי נגד יעד חלבון ספציפי, למשל חלבון דומה עם פוטנציאל גם לאגד 1,פפטידים שהתגלו15, חזור על שלבים וצמיחה של אינדוקציה 1.1.1 - 1.1.3, עם מלאי הקפוא של תחילת ספריית מדולדל streptavidin שלב 1.1.15 או התרבות לילה מהשלב 1.1.12 (תוך שימוש-יתר600 כדי להעריך לחסן עם תאים עונה 1 פרק 1011 ).
    2. להעביר תאים microcentrifuge צינור ו ספין ב 6,000 g x 5 דקות ב RT או 4 ° C. הסר את תגובת שיקוע. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל PBS המכיל 600 nM biotinylated cross-reactive חלבון המטרה. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על פלטפורמה מסתובבת.
      הערה: 600 ננומטר הוא ריכוז ההתחלתי המוצע, אשר ניתן לשנות, אם טובת הנאה ציין נצפית. Biotinylation של חלבון המטרה תושג והציע את ריאגנטים באמצעות כימות בטבלה של חומרים.
    3. בינתיים, לשטוף 100 µL של מצופים streptavidin חרוזים (בערך 1 x 109 חרוזים) ב 1 מ"ל PBS-B ו צנטריפוגה עבור 5 דקות אצל ≥ 5,000 x ג'י (ב- RT). למקם את צינור ספסל חלקיקים מגנטיים העליונה מפריד בזהירות הסר תגובת שיקוע, הימנעות בגדר.
    4. Centrifuge תאי היעד מכורך ב 6,000 g x עבור 5 דקות (RT או 4° C), הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל PBS-בי Resuspend חרוזים ב כל נפח התאים שטף מאוגדים cross-reactive חלבון המטרה. דגירה ב 4° C על פלטפורמה מסתובבת במשך 30 דקות.
    5. במקום מדגם על קרח, כל השלבים 1.1.7 - 1.1.15 עבור סוג שלילי, הפיכת מניות המקפיא המתאים. המשך סעיף 1.3 עבור סוג חיובי אם כל הרצוי שלילי מיון הושגה, או חזור על סעיף 1.2 על מיין שלילי נגד עוד חלבון cross-reactive פוטנציאליים.
  3. סיבוב 1 מיון חיובי
    הערה: עגול מיון חיובי 1 נגד חלבון ספציפי למטרה דומה טיפוס שלילי נגד יעד המיון ספציפי (ראה 1.2) חוץ השבר המכילות חרוז, חיובי נשמר.
    1. לחסן 500 מ ל LB ס מ25 עם עונה 1 פרק 1011תאים של בקטריאלי מגוונים להציג ספריית מיון זה יש כבר streptavidin מדולדל, גדל לילה (מתוך שלב 1.1.12) או מוקפאים (מתוך שלב 1.1.15) ומופשרים על הקרח, או זה היה דלה יותר של קלסרים מטרות נוספות-חלבון cross-reactive (מתוך שלב 1.2.5), כרצונכם.
    2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 סל ד עד התרבות מגיע עם יתר600 של 0.5 - 0.55. זירוז פפטיד הביטוי של 0.04% w/v L-אראבינוז על ידי דילול מטריים מניות של 4%, רועדת-225 סל"ד למשך 45 דקות ב 37 º C.
    3. המקום המושרה תרבות על קרח. צנטריפוגה כ 2 x 10 תאים11 ב 6,000 g x עבור 20 דקות ב 4 º C. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בתאים 1.5 mL PBS מאת בעדינות מתערבל (ידנית או ע י ניעור בקצרה-≤ 225 סל ד, 4° C).
    4. להעביר תאים microcentrifuge צינור ו ספין ב 6,000 g x 5 דקות ב RT או 4 ° C. הסר את תגובת שיקוע.
    5. Resuspend תא גלולה ב 1 מ"ל PBS המכיל 600 nM biotinylated חלבון המטרה של עניין. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על פלטפורמה מסתובבת.
      הערה: 600 ננומטר הוא ריכוז ההתחלתי המוצע, אשר ניתן לשנות, אם טובת הנאה ציין נצפית. Biotinylation של חלבון המטרה תושג והציע את ריאגנטים באמצעות כימות בטבלה של חומרים.
    6. בינתיים, לשטוף 100 µL של מצופים streptavidin חרוזים (בערך 1 x 109 חרוזים) ב 1 מ"ל PBS-B ו צנטריפוגה עבור 5 דקות אצל ≥ 5,000 x ג'י (ב- RT). למקם את צינור מפריד חלקיקים מגנטיים העליון ספסל, הסר בזהירות את תגובת שיקוע, הימנעות בגדר.
    7. בתום דגירה עם היעד, centrifuge תאי היעד מכורך ב 6,000 g x עבור 5 דקות (RT או 4° C) כדי להסיר את כל חלבון המטרה לא מאוגד. הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל PBS-בי Resuspend חרוזים ב כל נפח התאים שטף מאוגדים חלבון המטרה. דגירה ב 4° C על פלטפורמה מסתובבת במשך 30 דקות במקום על קרח.
    8. הפעל את כלי הנגינה autoMCS לאתחל את המערכת. פריים קווים באמצעות ההפעלה של היצרן ועל מאגרי לשטוף (ראה טבלה של חומרים) על-ידי בחירה "לשטוף עכשיו" בתחתית המסך בתפריט ' הפרדה ', "לשטוף" ואז "הפעל".
    9. ראש המערכת עם PBS-B, באמצעות PBS-B מאגר שטיפת והן הפעלת מאגר בשלבים הבאים. בחר בתפריט ' הפרדה ' מסרגל הניווט העליון ובחר לשטוף עכשיו. בחר שטיפה ולהפעיל לשפר את המערכת עם PBS טריים-בי
    10. העברה תא תערובת חרוז משלב הדגירה מעל 15 מ"ל חרוט צינור שטיפה ברכבת התחתית עם µl 500 נוספים של PBS-B ואיגום לשטוף את הדוגמה. במקום הצינור הזה בתוך החריץ מדגם ולרוקן 15 מ"ל צינורות חרוט במכונה הבחירה חיוביים ושליליים, של ארון טרום מקורר (4 ° C) (ראה טבלה של חומרים). במקום ארון תקשורת על מכשיר פלטפורמה.
    11. להקצות תוכנית ההפרדה עבור כל דגימה על המדף (עד 5 דוגמאות ניתן למיין בהפעלה אחת). הוסף צעד "שטיפה" בין כל מדגם ואחרי הדגימה האחרונה. בחר "הפעל" כדי להתחיל את ההפרדה התא. בחר "אישור" או "המשך" כדי לאשר כי מספיק מאגר זמין.
      הערה: התוכנית ההפרדה "Posselds" עובד היטב עבור מיון שלילי ולא חיובי מיון עגול 1, "Posseld" הוא המועדף לצורך מיון כדורים 2-4, אבל שתי התוכניות שימשו בהצלחה עבור כל שלילי וחיובי מיון סיבובים 14 , 15 ותוכניות אחרות עשויה טוב יותר עבור יישום מסוים (שמתואר בהמשך הדיון).
    12. עם השלמת התוכנית, להסיר את המדף ולשמר את השבר המתאים. . הנה, עבור סוג חיובית, שומרים על שברים חיוביים (מכיל תאים, חרוזים). מניחים על קרח.
    13. לפני כיבוי המכשיר autoMCS, לשנות המאגרים לרוץ, תשטוף ההפעלה של היצרן ועל מאגרי לשטוף (ראה טבלה של חומרים). בחר "לשטוף עכשיו", "לשטוף" ואז "הפעל". בסיום, להיות בטוח שיש 70% אתנול בשורה טיהור, ולאחר מכן הקש על הסמל"כוח" בפינה הימנית העליונה של המסך, בחר "כן".
    14. השלמת כיבוי מערכת (בקבוקים יהיה סגול), כבה את המכונה.
    15. השתמש השבר מיון חיובי בשלמותו לחסן 1 ליטר של ס מ LB25 עם 0.2% w/v D-גלוקוז. לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת-225 סל ד.
    16. למחרת, להשתמש התרבות לילה כדי להפוך מקפיא מניות LB המכיל גליצרול 15%, ו/או המשך חיובי מיון בסיבוב 2 בסעיף 1.4.
  4. לאחר מכן סיבובים מיון חיובי
    הערה: בדרך כלל, ארבעה סיבובים המיון מומלץ, למרות בשלושה סיבובים המיון 14,בדרך כלל מספיקות15. כאשר להפסיק מיון נעזר הניתוח FACS סיבובים מיון המתוארות בסעיף 2. עם כל סיבוב העוקבים מיון חיובי ירידה ריכוזים של היעד ונפח חרוז מגנטי.
    1. באמצעות התרבות לילה המיון בסיבוב הקודם (או מניה קפוא תא בסבב הזה), לחסן ס מ מ ל LB25 עם 100 תאי µl (1:50 דילול). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 סל ד עד התרבות מגיע עם יתר600 של 0.5 - 0.55.
    2. זירוז פפטיד הביטוי של 0.04% w/v L-אראבינוז, רועדת-225 סל"ד למשך 45 דקות ב 37 º C. המקום המושרה תאים על קרח.
      הערה: תרבות המושרה זו יכולה לשמש גם כדי להעריך זיקה מחייבת וספציפיות בסיבוב מיון שזה מקורו, כמתואר בסעיף 2 להלן.
    3. צנטריפוגה עונה 1 פרק 108 תאים ב 6,000 g x 5 דקות ב RT או 4 ° C. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- PBS µL 50 המכילה חצי את הריכוז של חלבון biotinylated היעד עניין להשתמש בסיבוב הקודם של מיון (לכן 300 ננומטר עגול 2, 150 nM עבור סיבוב 3, ו- 75 ננומטר עבור סיבוב 4 מ שלנו הציע נקודת ההתחלה). תקופת דגירה של 45 דקות על קרח (או ב 4 ° C פלטפורמה מסתובבת).
    4. בינתיים, לשטוף חרוזים מצופים streptavidin (µL 15 עבור סיבוב 2, µL 8 עבור סיבוב 3, ו 4 µL עבור סיבוב 4) ב 1 mL PBS-B וצנטריפוגה למשך 5 דקות אצל ≥ 5,000 x ג'י (ב- RT). למקם את צינור ספסל חלקיקים מגנטיים העליונה מפריד בזהירות הסר תגובת שיקוע, הימנעות בגדר. Resuspend חרוזים ב- 50 µL PBS-בי
    5. לאחר הדגירה 45 min המטרה בשלב 1.4.3, centrifuge את התאים ב 6,000 g x 5 דקות ב RT או 4° C, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים µL 50 שטף חרוזים מ 1.4.4. לשמור דגימות קרח, כל השלבים 1.3.7 - 1.3.13 עבור סוג חיובי.
    6. לחסן תרבות מ של ס מ LB25 בתוספת 0.2% w/v D-גלוקוז עם השבר כולו חיובי, המכילות חרוז במיון.
    7. למחרת, השתמש התרבות לילה כדי להפוך מקפיא מניות LB המכיל גליצרול 15% ו/או להמשיך המיון חיובית הבאה בסיבוב, חוזרים שוב ושוב אל שלב 1.4.1.
      הערה: באמצעות התרבות המושרה מ 1.4.2 להעריך זיקה מחייבת וספציפיות כמתואר בסעיף 2 להלן יעזרו לקבוע מתי להפסיק מיון. אם שני סיבובים המיון ברציפות להראות זיקה מחייבת דומה, או סיבוב מאוחר יותר מראה ירידה זיקה חזקה ביעד של ריבית, זה רצוי המקום להפסיק מיון. לאחר הסיבוב האחרון, לחזור שלב 1.4.1 עוצרות אבל 1.4.2.

2. FACS ניתוח של מיון סיבובים

  1. באמצעות התאים המושרה מהשלב 1.4.2 עבור כל סיבוב המיון, או תרבויות זהות, מוסיף 5 µL המושרה תאים 25 µL של כל אחד מהצעדים הבאים שהוכנו פתרונות עבור איגוד הערכה (ראה גם טבלת חומרים): PBS לבד; PBS עם 150 nM YPet מונה (YPet 12,13; בקרה חיובית לביטוי), אם זמין; 900 ננומטר חלבון המטרה מצומדת כדי הפלורסנט, כגון צבע אמין-תגובתי עם פליטה/עירור ב nm⁄518 493 nm (היעד-488); 900 target(s) חלבון cross-reactive ננומטר, משמש לצורך מיון שלילי המסומנת באותה הפלורסנט (Cross-Reactive חלבון-488); nM 900 streptavidin-R-phycoerythrin (SAPE). דגירה על קרח למשך 45 דקות.
    הערה: אם המשך ישירות משלב 1.4.2, זה שלב יהיה תמיד ייעשה יום לאחר biopanning לסיבוב הזה היה שהושלמו מאז הספרייה שנבחר למטה היה גדל בין לילה לאחר מכן subcultured, המושרה ביום המחרת. ניתן להשתמש גם תרבויות גדל, המושרה באופן דומה ממניות עגול המיון קפוא; במקרה הזה, כל הסיבובים יכול להיות נבדק, בהשוואה בניסוי יחיד.
  2. צנטריפוגה תאים ב 6,000 g x 5 דקות ב RT או 4° C. להסיר את תגובת שיקוע ולאחסן דוגמאות על קרח.
    הערה: תא כדורי ניתן לאחסן בקירור עד כל דוגמאות מוכן לניתוח.
  3. הפעל מכשיר FACS, לפתוח את התוכנה, סטארט-אפ המערכת, ולאחר כיול המכשיר בעקבות של יצרן הוראות 43,44.
  4. בתוך התוכנה FACS, לחץ על "מנהל", לחץ על התיקיה הרצויה או ליצור "תיקיה חדשה". לחץ על "הניסוי החדש" סמל בחלק העליון השמאלי של המסך. נכון לחצו על סמל "שנה שם" הניסוי. במסגרת הניסוי הזה, לחץ על "גליונות עבודה גלובלי".
  5. לחץ על סמל "נקודה עלילה", ואז ללחוץ על הגיליון חוברת העבודה הכללית כדי ליצור את scatterplot הזה. לחץ על התרשים מגרש נקודה עצמה ולאחר מכן בחר 'מפקח' סמל בחלק העליון השמאלי של המסך ולהתאים את הצירים כדי biexponential התצוגה על-ידי בחירה בתיבות לצד "ציר Y" ו- "ציר X" החלון הפתוח. סגור את חלון התצוגה של biexponential על-ידי לחיצה על X.
  6. ליצור "צינור" על-ידי לחיצה על סמל בחלק העליון השמאלי של המסך ולשנות את הדגימה. עם המידע המתאים על-ידי לחיצה ימנית על סמל הדגימה תחת "חוברת העבודה הכללית" ובחירה "שנה שם". להרחיב את הדגימה על ידי לחיצה על המקש (+) סימן ולאחר מכן לחיצה כפולה על הסמל שפופרת, לחץ לחיצה ימנית על זה, ואני שוב בחר "שנה שם" כדי לתאר את הדגימה.
  7. השתמש גרף מגרש זה נקודה עם ברירת המחדל האס-A vs FSC-A לפעול דגימת בקרה שלילית ב- PBS לבד על-ידי לחיצה על אותו צינור זוגי או בחירה על החץ שלצידו. רק לפני הפעלת המדגם, resuspend בגדר תא ב- 500 µL קרח קר FACS רץ מאגר ודגימת העברה FACS צינור (ראה טבלה של חומרים), לערבב היטב על ידי pipetting, מצליף את הצינור. מקם את התאים resuspended ברכבת התחתית הזרקה מדגם (SIT) של המכשיר. הקש "לרכוש" ועם "אירועים כדי להציג" ב- 30,000-50,000 "אירועים כדי שיא" ב 10,000, זרימת הנתונים קצב נמוך (להתחיל; להגדיל במידת הצורך), ו- "שב מיושרות" נבחר.
    הערה: המהירות המתאימה (נמוכה, בינונית או גבוהה) הוא המהירות שבה מספר אירועים/s הוא בערך בין 200 ל-2000.  השתמש טווח זה עבור כל השלבים.
  8. בעת רכישת, להתאים האופטיקה צינור (PMT) מתח הסף במידת הצורך על-ידי בחירת הכרטיסיה "סף" לחץ על ולשנות את "ערך". התאם מתח עבור פיזור קדימה ואת הצד (FSC ו האס) כך התאים בקרה שלילית ב- PBS לבד ליפול מעט מתחת למרכז.
    הערה: ניתן להוסיף פרמטרים נוספים (כגון האס) בכרטיסיה "סף" באמצעות הסמל "הוסף". בדרך כלל, PMT המתחים כ- 700 V עד 1000V עבור האס והן FSC עובד היטב עבור e. coli.
  9. אם המדגם הוא קורא כראוי, להתאים את קצב הזרימה כדי להציג אירועים 200-2000/s והקש "רשומת נתונים". כאשר סיים הקלטה, להסיר את צינור שב והנח על קרח.  לבחור את הסמל "מצולע שער", להשתמש בעכבר כדי לצייר שער סביב רוב האוכלוסייה תא scatterplot. לחץ לחיצה ימנית על נקודה מגרש ובחר "להראות היררכיה האוכלוסייה".
  10. השתמש את השער "P1" כהורה על ידי לחיצה על "P1" בהירארכיה של האוכלוסייה. צור מגרש נקודה חדשה בעקבות צעד 2.5. קליק ימני אחד מהצירים ושנה את ציר ה-y FITC-א וה-x FSC-א שער הפקד שלילי (PBS לבד) באמצעות הסמל "מצולע שער", עם השער הכי צמוד ככל האפשר מהצד העליון והשמאלי של האוכלוסייה.
    הערה: בדוק את ההיררכיה האוכלוסייה על מנת להבטיח כי השער P1 הוא הורה של השער P2. אם זה לא, הוא יופיע קו עם השער P1, "כל האירועים" יהיה ההורה; למחוק את השער וליצור מחדש לאחר השלב 2.10.
  11. בחר "P2" בהירארכיה של האוכלוסייה, קליק ימני ובחר "invert שער". לחץ לחיצה ימנית על העלילה נקודה P2 שער עם ובחר "אוכלוסיות להראות". בחר את אוכלוסיות "P2" ו- "לא P2" עבור תצוגה (פחות מ 1% של האוכלוסייה יפול מחוץ לשער).
  12. העלילה נקודה P2 שער עם קליק ימני ובחר "ליצור תצוגת נתונים סטטיסטיים". חלון תצוגת נתונים סטטיסטיים קליק ימני ובחר "עריכת תצוגת סטטיסטיקות". לחץ על הכרטיסיה "אוכלוסיות", הוספה או הסרה של אוכלוסיות, לפי הצורך, כולל האוכלוסייה האב, P1 (P2, ו- P2 לא צריך כבר להיות מוצג). לחץ על הכרטיסייה "סטטיסטיקה" ולהוסיף "FITC-A חציון" כל נתונים סטטיסטיים אחרים מעניינים. סגור את החלון על-ידי לחיצה על הלחצן ' אשר '.
  13. ליצור גרף מגרש נקודה דומה עבור PE-A vs FSC-A ושער באמצעות דוגמה לבד PBS (מגרשים הקודם יכול להיות משוכפל ואין לשנותן). להשתמש גיליון אלקטרוני זה כדי להפעיל כל דוגמאות (כולל תאי בקרה שלילית מודגרות עם כל מטרה התווית על-ידי fluorophore) באופן זה, הקלטת אירועים כ-10,000 עבור כל אחד.
    הערה: התאים שנמצאים מחוץ לשער לאחר דגירה עם חלבון המטרה-488, YPet חיובי שליטה וכדומה הן קלסרים את הפרוטאין, צריך להיות רשמה את הערך של "לא PX" (כאשר X הוא מספר האוכלוסייה מגודרת את הגרף) % מאוגד. בעת שימוש SAPE כפקד שלילי, השתמש העלילה FSC-A vs PE-A. גם צריך להיות הקליט את עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני (MFI) P1 וגם זה נותן מידע מעבר איגוד %, כדי להראות את מידת איגוד במונחים יחסיים, עמידים יותר בנוכחות ליניאריים 45. עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני יכול להיות מנורמל (nMFI) על-ידי חלוקת MFI של כל פפטיד מאת MFI פקד השלילי היחיד לגרדום (עם פפטיד N-מסוף לא), או שיבוט המכיל רצף פפטיד אינו מאגד את המטרה של עניין, לאחר דגירה לאותו היעד מצומדת כדי fluorophore אותו 14. אם תאים אלה שליטה שלילי אינן זמינות, תאים uninduced מודגרות לאותו היעד ומוענקת לו fluorophore אותה יכול לשמש גם עבור נרמול.

3. רצף ניתוח של מועמדים פוטנציאליים והערכה של איגוד זיקה

  1. קביעת רצף פפטיד
    1. בחרו, רצף עשרות או מאות מושבות חיידקים מן round(s) הסופית של biopanning (בדרך כלל כדורים 3 או 4 הם מספיקים 14).
    2. לנתח את הרצף נתונים באמצעות קובץ ה-מאקרו פיתחנו (ראה מידע תמיכה עבור קוד, "Sub eCPX_Sequencing") כדי במיוחד לנתח את רצפי המופקים biopanning הספרייה התצוגה חיידקי 15mer המפורטים בטבלה של חומרים. השתמש בתוכנת הגיליון האלקטרוני של המפורטים בטבלה של חומרים, או תוכנה תואמת מועדפת אחרת.
      הערה: מספר כלים זמינים באינטרנט זה יכול גם לסייע ניתוח רצף ה-DNA 47. אם מועדף, השתמש בשיטה שונה הוקמה לניתוח רצף ודלג לשלב 3.1.3.
      1. הורד את סידרת הקבצים ברצף (.seq קבצים, מסמכי טקסט גם לעבוד) ולחלץ אותם לתוך תיקיה חדשה. במידת הצורך, להעביר או להעתיק את התיקיה בכונן הקשיח של המחשב (בניגוד תיקיית רשת) עבור מהירות משופרת.
      2. פתח חלון חדש של הגיליון האלקטרוני. ודא להפעיל פקודות מאקרו ולאפשר את כל התכונות, אם ההודעות האלה צצים.
        הערה: שלבים 3-6 להלן צריך רק להסתיים בפעם הראשונה שהמאקרו נמצא בשימוש. לניתוח שלאחר מכן, פשוט "להפעיל המאקרו" החל מ- שלב 7.
      3. העתק את כל התוכן של המאקרו נמצא בקובץ "Sub eCPX_Sequencing".
        הערה: הגרסה הנוכחית מוגדרת עם איגוף רצפים של הספריה 15-מר המפורטים בטבלה של חומרים, תתרגם את חומצות אמינו ביניהם. יכול להיות שלא יהיה רצפים נוספים על-ידי העתקת 5' איגוף רצפים בעמודה A, 3' איגוף רצפים בעמודה B של הגיליון, עד 10 רצפים עבור כל אחד, לפני הפעלת המאקרו.
      4. בקובץ גליון נתונים ריק, בחר בכרטיסייה "View" ולאחר מכן לחץ פעמיים על "מאקרו". בחר את התיקיה personal.xlb. אם זו אינה זמינה, להקליט מאקרו קודם לעשות זה להופיע.
      5. לחץ על "צור" או "להיכנס", תלוי מה יכול להיות מודגשים. הדבק את המאקרו כולו לתוך המודול.
      6. לחץ על שמור את הסמל או ללכת קובץ, שמירה. יציאה המודול. אם חלון צץ, לחץ על אישור.
      7. להפעיל את המאקרו: קדימה אל התיקיה שבה ממוקמים הקבצים desired.seq. לחץ על הבר ליד הסמל של תיקיה בקומה העליונה כדי להציג את מיקום התיקיה. עותק.
      8. . לך לחלון גיליון אלקטרוני חדש בחר את הכרטיסיה תצוגה ולאחר מכן לחץ פעמיים על מאקרו. בחר "eCPX_Sequencing" מתוך הרשימה ולחץ על "הפעל".
      9. בתיבה שבו מופיע, להדביק את מיקום הקובץ שהועתק בשלב 7, והקישו על enter. המאקרו צריך להתחיל עובר את רצפי ולארגן אותם לטבלאות בגיליונות שונים.
      10. להשתמש את גיליון "סיכום טבלת" כדי לקבוע אם יהיה צורך לבדוק קבצי מעקב שגיאות, לבצע תיקונים באופן ידני (אם רצפים מכילים "X" או לא ניתן היה לתרגם).
        הערה: "טבלת סיכום" מציגה את רצפי פפטיד מתורגם, הממוינים לפי רצף חומצות אמיניות (מא' עד ת'), אלא אם שגיאת רצף מנעה תרגום. "X" מציין חומצת אמינו בודדות כי לא היתה אפשרות לקבוע.
    3. פעם רצפי מתורגמים, מאורגן, תוקנו שגיאות רצף, עיין ברשימה רצף ממוינות פפטיד גיליון "סיכום טבלת" על כל רצפי החוזרת.
    4. לגדול תרבויות לילה מושבות ברצף עניין (כולל את חזרה ו/או פפטידים עם מגמות מורגש לכל הפחות) ב 5 מ ל LB ס מ25 -37 מעלות צלזיוס, רועדת-225 סל ד, ולשמור במקפיא מניות למחרת ב- LB המכיל גליצרול 15%, כמו שלב 1.4.7. לבדוק את פפטידים עם חוזרים רצפים עבור איגוד זיקה, ירידה לפרטים באמצעות השיטות FACS המתוארות בסעיף 3.3 ולהשתמש התבנית FASTA של הרשימה רצף (הרשימה המלאה, חזרה בלבד) כדי ליישר את רצפי באמצעות יישור המועדפת, ניתוח תוכניות, כמו סעיף 3.2.
  2. עימוד רצפים באמצעות אומגה Clustal, Kalign ותוכניות דומות
    1. העתק רצפים בתבנית FASTA מהגיליון FASTA של המאקרו, או אחרת ליצור רשימה של קבצים FASTA רצפי ייושר (כגון אלה מהשלב 3.1.3).
      הערה: שעמודה A מכילה את הקבצים FASTA לפי סדר מספרי על ידי "Seq #" בעוד עמודה B מציג אותם ממוין לפי "AA רצף" מתוך גליון "טבלת סיכום". רשימת רצפי פפטיד ממוין לפי רצף חומצות אמיניות יציג רצפים לא שמיש ברמה העליונה, כגון וקטור ריק (כמו "# ריק") ורצפים אלה אשר לא נמצאו לקריטריוני החיפוש 5" או 3' (כמו"# ערך"). תכונה זו מאפשרת עדכון קל או הסרה של רצפים אלה מניתוח.
    2. פתח Clustal אומגה48 או תוכנה49 Kalign על ידי הולך 50,האתר51, או להשתמש בתוכנות המועדפת עבור עימוד רצפים. העתק ו הדבק את הרשימה רצף FASTA קלט את זה מתחת "רצפים בכל פורמט נתמך". לשנות "עונש פתח פער" 30 תחת "אפשרויות נוספות" ב- Kalign (זה לא אפשרי באומגה Clustal), אבל אחרת לשמור הגדרות ברירת המחדל לפני לחיצה על "שלח".
    3. לנתח עימוד רצפים באמצעות תוכנה53 52,Jalview ישירות בתוך תוכנה באינטרנט אומגה Clustal ו- Kalign על-ידי בחירה בכרטיסיה "תוצאת סיכום" מעל היישור ולאחר מכן לחיצה על הסמל "Jalview".
      הערה: אם מועדף, או לניתוח של רצף היישורים שנוצרו על ידי תוכניות אלטרנטיביות, להוריד 54 התוכנה בנפרד, העתק והדבק את היישור החלון ניתוח, שנפתח על ידי לחיצה על "קובץ", "יישור קלט", ו " מן הטקסט". זה מספק אמצעים בקלות לקבוע אם קיים רצף קונצנזוס ביישור לרצף הקלט.
  3. השוואה בין זיקה מחייבת וספציפיות באמצעות FACS
    1. לחסן ס מ מ ל LB25 בתוספת 0.2% w/v D-גלוקוז עם בידוד בודדים בכל עניין (מתוך שלב 3.1.4 ו/או מושבות של עניין של ניתוח רצף נוסף סעיף 3.2, וכו '), פקד שלילי המתאים (תצוגה רק לגרדום או פפטיד זה אינו מאגד היעד, כפי שתואר בהערה עבור שלב 2.13). לגדול בין לילה ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת-225 סל ד.
    2. השתמש התרבויות לילה כדי לחסן 3 מ ל LB ס מ25 עם תאים µl 60 (1:50 דילול). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות-225 סל ד עד התרבות מגיע עם יתר600 של 0.5 - 0.55. זירוז פפטיד הביטוי של 0.04% w/v L-אראבינוז פלוס 2 מ מ EDTA (עבור ההנחיה של פפטיד התצוגה 42), רועדת-225 סל"ד למשך 45 דקות ב 37 º C.
    3. המקום המושרה תרבויות על קרח. עבור כל המבודד, מוסיף 5 תאים µL 25 µL PBS לבד או PBS המכיל: 150 nM YPet 12,13 (חיובי בקרת ביטוי), אם זמין; 250 ננומטר היעד-488; Protein(s) Cross-Reactive 250 ננומטר-488; ל-250 ננומטר SAPE (ראה 2.1 לקבלת פרטים נוספים). דגירה על קרח למשך 45 דקות.
    4. צנטריפוגה תאים ב 6,000 g x 5 דקות ב RT או 4° C. הסר בזהירות את תגובת שיקוע על ידי ציור נוזל מן הצד ההפוך של בגדר. לאחסן תא כדורי קרח עד כל שאתה מוכן לניתוח ודוגמאות.
    5. Resuspend צנפה כל תא ב- 500 µL קרח קר FACS הפעלת מאגר, לערבב היטב על ידי pipetting, כקבוצה – עלים ברכבת התחתית, לפני הקריאה באמצעות cytometer של זרימה (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: ראה שלב 2.13 הערות הסבר נוסף של gating, חישוב של nMFI כדי להשוות בין זיקה מחייבת וספציפיות. Non-קלסרים או שאינם ספציפיים קלסרים ועכשיו ניתן להסיר ניתוח נוסף, וצריך להעריך מחדש החוברות זיקה הגבוה ביותר על ידי עימוד רצפים בעקבות סעיף 3.2 לחפש עוד יותר מגמות ייתכן הוחמצו ב הראשונית וסודרו אוכלוסייה. סעיפים 3.2 ו- 3.3 עשוי לחזור כנדרש כמו מגמות חדשות, רצפי הקונצנזוס המונפשים. ניתוח זה יכול לכלול רצפים אקראיים יותר אם מגמות לא ניתן לראותה.

Representative Results

עם השימוש האוטומטי המגנטי תא לפעיל על-מיון (autoMCS) במקום מיון ידני תא מגנטי, מועמדים שלילי כוזב מופחתים בצורה משמעותית במהלך biopanning של חיידקי התצוגה ספריות 9,14. שלבי המיון שלילית ניתן גם ניתן להוסיף לפי הצורך כדי לצמצם את שאינם ספציפיים קלסרים ביעד של ריבית, הוא הציע לכל הפחות כדי להוסיף סוג שלילי נגד המגנטי חרוזים עצמם מלפנים. בחירה זו שלילי נגד beads מגנטי עצמם הושלמה לפני ארבעה סיבובים של biopanning הנבחרת חיידקי להציג ספריית עבור קלסרים מגן אנטיגן (PA), כפי שמוצג באיור2, ולפני נוספים לבחירה שלילי נגד rivax, ארבעה סיבובים של הבחירה חיובי עבור abrax, כפי שמוצג באיור3. החרוזים המשמש כאן הם מצומדת כדי streptavidin עבור לכידה של חלבונים biotinylated, כך הבידוד לא מכוונות של פפטידים מחייב את streptavidin עצמה היא דאגה, ונשאר להשגחה באמצעות FACS עם streptavidin מצומדת כדי Phycoerythrin (איור 3 , SAPE). לכל הפחות, מחייב streptavidin צריך להיבדק למועמדים בודדים מבטיח כלשהו בעת הערכת מחייב חלבון המטרה. איגוד אחוז והן nMFI עבור SAPE צריך להיות ערכים נמוכים ב כל הסיבובים המיון. הרמה של קשירה streptavidin יכול להגדיל במידת מה עם כל סיבוב המיון, כפי שקרה איור 3, כי האוכלוסייה חשוף שוב ושוב החרוזים מגנטי מצופה streptavidin לאחר כל סיבוב המיון. אם הרמה של הרקע streptavidin מחייב הופך בעייתי ניתוח במורד הזרם, עוד יותר שלילי מיון נגד החרוזים מגנטי היה יכול. להתבצע לאחר הסיבוב מיון חיובי שבו האוכלוסייה מחייב streptavidin עלה ב סדר כדי להפחית הקרנה במורד הזרם של תוצאות חיוביות שגויות. כאשר חלבונים או חומרים זמינים אשר עלולה להפריע במיוחד במורד הזרם השימוש פפטיד עבור יישום מסוים, או אשר צפויים cross-react עם זיקה ריאגנטים עבור היעד בשל מבנה ו/או רצף דמיון, עוד יותר שלילי מיון נגד זה חלבון או חומר מומלץ. לדוגמה, מיון שלילי נגד rivax לפני ניתוקה של פפטידים איגוד abrax, בשל דמיון מבני והומולוגיה רצף של שני חלבונים אלה- 1,15. שוב, cross-reactive מחייב חלבונים המשמשים שלילי מיון השלבים ניתן לנטר במהלך הניתוח של מיון סיבובים באמצעות FACS (איור 3Rivax-488). התרחיש הטוב ביותר, מחייב אחוז ו- nMFI הם נמוכים, כמו בדוגמה זו.

כשהם זמינים, פפטיד בקרה חיובית קבועה, כגון פפטיד P2X-C-הסופית של לגרדום התצוגה המיוצרים על ידי הספרייה התצוגה חיידקי המשמשים את התוצאות נציג כאן, יכול לעזור לקבוע אם חוסר מחוייב זיקה וזמינותו FACS בשל חוסר ביטוי של התצוגה לגרדום עצמו, ולא חוסר אהדה של peptide(s) המטרה. באיור 2 ו- איור 3, מונה YPet מחייב את זה P2X פפטיד מנוטר ומדגים הסבבים המוקדמים של מיון אקספרס לגרדום לקוי. זהו ככל הנראה בעיקר בגלל תדירות גבוהה של עצירה codons ב N-מסוף פפטידים בספריה אקראי, מה שאומר לגרדום עצמה לא הופק. תופעות אחרות יכול בנוסף לתרום, כגון הנוכחות של פפטידים עם אפקטים רעיל בלתי צפויה e. coli, או ירד המחירים להציג צמיחה או פפטיד מסיבות אחרות (כגון מוטציות בגנום חיידקי). תוספת של EDTA במהלך הגיוס עשוי לשפר את הביטוי במהלך סיבובים מוקדמים אלה של מיון 42, אך עדיין לא נבדק. מחייב מונה YPet על biopanning כל האוכלוסייה משופרת באופן משמעותי על-ידי סיבוב 3. השוואה בין איור 2 באיור3, זה גם ניכר כי רמת הביטוי ניתן לשפר על ידי הגדלת זמן אינדוקציה 90 דקות (כמו באיור 2מונה YPet) במקום 45 min (כמו באיור 3YPet מונה), למרות 45 min מספיקה בדרך כלל. שימו לב כי nMFI ממונה YPet הוא מנורמל לרמה מחייב מונה YPet של תאי בקרה שלילית, אז הערכים ליד 1.0 אופייניות אם רמת הביטוי מקובל. נרמול YPet מונה MFI כדי MFI לבד PBS מדגם זהה היא גם דרך חוקית כדי להשוות בין רמות הביטוי יחסי, אבל נותן הרבה ערכים גבוהים יותר (להשוות איור 2 ו- איור 3 עם נובעת Sarkes et al. 2015 15).

העשרה של הספרייה פפטידים מחייב למטרה ספציפית עניין מושגת בדרך כלל בתוך שלושה סיבובים מיון חיובי, אך ממשיכות רבע סיבוב של המיון יכול להיות מועיל, כפי שמוצג באיור 2 , איור 3 . כאן, אחוז מאוגד תאים, nMFI להמשיך ולהגדיל מ 3 סיבוב לסיבוב 4 עבור מטרות למשל, הרשות הפלסטינית והן abrax, אשר מאוכסנים באדום באיור 2 ו- איור 3, בהתאמה. הרצפים פפטיד זיקה הגבוהה ייתכן כבר נוכח עגול 3 אבל סביר להעשיר עוד יותר עגול 4, אשר מסייע למטה-בחירת מועמדים פוטנציאליים 14. אנליזה של רצפים עגול 4 נוטה לחשוף רצפים חוזרים, חוזרים רצפים אלה נקודת התחלה מצוינת עבור זיקה וספציפיות ניתוח ואת הקונצנזוס רצף נחישות. במאקרו eCPX_Sequencing מסופקים כתוספת כתב יד זה עוזר כדי לייעל את ניתוח ראשוני זה, כפי שמוצג באיור4. התחלה עם תיקיה של .seq או קבצי טקסט, רצף הדנ א הנמצא בין שבחרת 5' ו- 3' רצפים מתורגם, מאורגן על ידי רצף חומצות אמיניות, ניתח מספר שאריות חומצת אמינו בודדות כל פפטיד. הרשימה הממוינת של רצפים פפטיד מבודד, כפי שמוצג על המסך גיליון סיכום בטבלה איור 4, ניתן בקלות לקבוע אילו רצפים חוזרים ועל איזה תדר. התאים בגיליון הזה המכיל רצפים חוזרים מתוארים בצבעים שונים עבור ניתוח קל יותר. מומלץ לבדוק את אלה רצפים חוזרים עבור רצפי הקונצנזוס ומגמות אחרות. זה מסתייעת רצף יישור תוכנה כגון Kalign ו- Clustal אומגה ולאחר הניתוח יכול להתבצע על הפלט רצף כולו (כולל רצפים חוזרים וגם שאינם חוזרים בתדר שהופיעו), הרשימה שנבחר למטה חוזרות רצפים (עם או בלי התדירות היחסית שלהם). תוצאות נציג הרשות הפלסטינית והן abrax חוזרות רצפים, בלי לקחת תדר בחשבון, מוצגות באיור איור 5A , 5B, בהתאמה. שימו לב כי ב איור 5A עבור המטרה הפלסטינית, מספר הרצפים החוזרים בודדים בעצמם מכילים את רצף קונצנזוס WFCFTC (או רצף דומה), נמתח קו תחתון אדום, אשר נקבע על-ידי החלת ניתוח תוכנה Jalview Kalign עימוד רצפים של הרצף החוזר. הסכמה זו, כמו WXCFTC, היה בעבר נחוש בדעתו להיות קונצנזוס איגוד הרשות הפלסטינית, אשר מספק ביטחון ב שיטת המיון 9. ב- איור 5B, איפה רצפים חוזרים עבור היעד abrax נותחו באופן זהה, התוצאה הייתה שונה לגמרי. ראשית, היו רק חמישה רצפי אשר חוזר על עצמו 4 סיבוב של biopanning עבור קלסרים abrax, בניגוד הרצפים החוזרים 15 מבודד 4 סיבוב של biopanning עבור הרשות הפלסטינית קלסרים (למרות 44% יותר המושבות היו רצף גם עבור הרשות הפלסטינית). שנית, אף אחד של הרצף החוזר חמש הכיל את הרצף "קונצנזוס" המבטיחים ביותר (FWAWF, תחתון בסגול), למרות המועמד AX-A15 הכיל רצף הכי מתאימים (FWDTWF). ניתוח נוסף, כולל מחייבת נחישות זיקה וספציפיות, עזר לספק הקונצנזוס של FWDTWF מחילופי מועמדים העליון עבור איגוד abrax ב איור 5C, כמוסבר להלן.

מושבה נציג של כל רצף חוזר ניתן לנתח נוסף עבור תאים זיקה וספציפיות באמצעות FACS, כמו באיור 6A על הרצף החוזר של biopanning עבור abrax מחייב פפטידים. כאן ברור כי כל חמש רצפים חוזרים יש זיקה גבוהה יותר עבור abrax, המטרה העיקרית, מאשר rivax, החלבון מבנית דומה משמש מיון שלילי, או streptavidin, אשר נוכח במהלך המיון עקב החרוזים מגנטי משמש biopanning. זה עולה בקנה אחד עם התוצאות כבר מבטיח עבור זיקה, יחודיות של הסיבובים המיון שמוצג באיור 3, כאשר ברור כי העשרה עבור איגוד אל המטרה המיועדת, abrax, גוברת עם כל סיבוב של biopanning בזמן אהדה עבור החלבון דומה, rivax, היא לא. עם זאת, רצף קונצנזוס משביע רצון לא נקבע עבור המיון abrax שימוש חוזר את רצף לבד עגול 4 (איור 5B ומעלה לדיון). שחזר למושבות ברצף 100 עגול 4, עם זאת, צוין לפי העין בעת חיפוש רצפים הדומה ההתאמה הטובה ביותר עבור הקונצנזוס החזוי הזה מועמד נוסף אחד, AX-A12, הכיל את רצף FWDTWF צוין לבודד AX-A15 , כי עוד מועמד, AX-A14, כלולים דומה רצף, DWNTWF. אלה וחלבונים אחרים הכלולים למחזהו רצפים חוזרים, הפגינו דמיון רצפים אחרים שאינם חוזרים, או נבחרו באופן אקראי, נותחו על ידי FACS עבור איגוד זיקה וספציפיות. אלה נבדקו מדורגים Sarkes. ואח 2016 1 , החוברות 5 העליון של ניתוח זה מוצגות באיור איור 6B, עם רצף קונצנזוס נחוש בדעתו להיות FWDTWF, המוצגת באיור 5C.

ניתוח דומה של איגוד זיקה חוזרות רצפים פפטיד 4 סיבוב של biopanning עבור פפטידים לזהות את המטרה הפלסטינית חשף כי החוברות הטוב ביותר, כפי מדורגת על ידי היחס של הרשות הפלסטינית-488 nMFI:SAPE nMFI, הכלולים הקונצנזוס WXCFTC או דומה רצף (טבלה 1). באמצעות היחס הזה, רצפי עצמית מסודרים אלו שהכילו הקונצנזוס ואלו לא. המועמדים המובילים, המכיל כל רצפי הקשורים הקונצנזוס, נותחו בדומה לשיטות שתוארו לעיל עבור abrax איור 6, כפי שהוצג Sarkes. ואח 2015 14. תוצאות אלו ממחישות כי עבור כמה מטרות, ניתוח של פפטידים עם רצפים חוזרים עשוי להיות הולם להשגת קלסרים עם זיקה משמעותית וספציפיות עבור יעד שבחרת, וכן לקבוע רצף קונצנזוס עלול להיות, כשלעצמו, מספיק עבור איגוד. עם זאת, שים לב כי מספר חזרה ואינם משקפים בהכרח את היחסי זיקה חזקה ביעד של ריבית (טבלה 1). בעת ניתוח של חוזרות רצפים לבד אינה מספיקה לקבוע דפוס, היא מסייעת למעבר בין רצף ניתוח וניתוח מחייבת לצמצם את מאגר מועמדים, לבחון מחדש את המגמות בקרב אלה מועמדים עם זיקה גבוהה יותר . גם כאשר מגמה נצפית מבדיקת הרצפים החוזרים לבד, רצפים שאינם חוזרים נוספים עשויים להפגין המגמות אותו, או מגמות אחרות, בעת חקירה מתמשכת.

Figure 1
איור 1: סכימטי של פרוטוקול biopanning עבור ספריות התצוגה חיידקי. כמופיע כאן, ספריות התצוגה חיידקי biopanning הוא תהליך מעגלי. כל תא בהספרייה התצוגה חיידקי (ראה טבלה של חומרים) מכיל דנ א פלסמיד אשר נשמר כל עוד התאים גדלים בנוכחות אנטיביוטיקה עבורו פלסמיד מכיל גן עמידות (choloramphenicol במקרה זה). כל פלסמיד מקודד גם החלבון לגרדום התצוגה שחושף פפטיד אקראי כדי החיצוני של התא. מאז כל תא צריך להכיל רק רצף הדנ א פלסמיד יחיד, כל תא צריך להציג רק פפטיד יחיד, במיקומים שונים ברחבי קרום התא. בהתאם רמת ספריית גיוון בתחילתו של biopanning, לאחר כל סיבוב המיון, רצף הדנ א יכול או לא יכול להיות ייחודי מתא לתא. Biopanning מתחיל עם הצמיחה, אינדוקציה של הספרייה תא כדי להציג פפטידים בודדים על הממברנה החיצונית שלהם. פפטידים אלה יכול מכן לקיים אינטראקציה עם חלבון המטרה (אשר biotinylated או מתויגים אחרת עבור לכידת). עבור תא מגנטי מופעל מיון (MCS), חלבון לא מאוגד יוסר ולא התאים מודגרת עם חרוזים מגנטי הם מצופים לכידת חלבון (streptavidin בדוגמה זו, אשר יש את הכוח הגרעיני החזק עם ביוטין). התרבות כולה ואז חשופים מגנט כדי להפריד בין תאים מאוגד מתאי לא מאוגד. שימוש בהתקן מיון מגנטי אוטומטית עדיף להפרדה תא לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות. מאויר כאן הוא חומר חיובי, שבו נשמרים התאים מאוגדים, elute משותפת עם החרוזים מגנטי. עבור סוג שליליים, אשר אנחנו בדרך כלל לבצע מלפנים, התהליך הוא זהה חוץ מזה התאים נשטפים ממני החרוזים מגנטי נשמרות במקום. השבר ספריית מעניינים, מאוגדים (מיון חיובי) או לא מאוגדות (מיון שלילי), גדל בין לילה, המשמשים את הסיבוב הבא של מיון. כל סיבוב העוקבים של biopanning חיובי מחייב ירידה ברמת הריכוז היעד וכרך חרוז לשיפור לכתחילה. לאחר כל סיבוב של biopanning, זיקה וספציפיות של פפטידים עבור היעד חלבון הם העריכו באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) כדי לקבוע מתי להפסיק biopanning ולהתחיל לחקור מועמדים בודדים. לפי הצורך, רצפי DNA וניתוח רצף פפטיד מבוצעות. השלבים ניתוח עשוי להיות בעצמם תהליך מעגלי, במיוחד עבור חשיפת מגמות מבודד בודדים לאחר בסיבוב האחרון של biopanning. בשלב זה, מגמות רצף פפטיד ו/או הסכמה נמצאים בקורלציה עם איגוד זיקה וספציפיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נתוני לדוגמה לניתוח FACS של מיון סיבובים: הרשות הפלסטינית היעד. איגוד זיקה כפי שנקבע על ידי FACS מוצג לאחר 4 סיבובים של biopanning (מיון חיובי) בקטריאלי שבחרת להציג ספריה עבור פפטידים מחייב את המטרה, מגן אנטיגן (PA). זה בוצעה לאחר הראשונה ביצוע טיפוס שלילי נגד beads מגנטי מצופה streptavidin. להערכת איגוד, התאים היו המושרה עם 0.4% L-אראבינוז במשך 90 דקות לפני הדגירה עם יעד פתרונות שליטה וניתוח מאת FACS. מחייב ניתוח אהדה עבור המטרה הוא התאגרף באדום. המוצגים כאן הם פיזור חלקות vs FITC-A FSC-A וערכים עבור אחוז תאים מאוגדים (לעומת שליליים הפקד מגודרת מודגרות עם PBS לבד), מנורמל עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני (nMFI, לעומת שליטה ללא פפטיד שלילי מודגרות עם החלבון אותו התווית על-ידי fluorophore) של תאים המושרה היו הדגירה למשך 45 דקות עם: PBS מאגר לבד, 150 nM YPet מונה (חיובי בקרת ביטוי פפטיד) או 250 ננומטר הרשות הפלסטינית-488 (הנקראת היעד). הערה את העשרת הגוברת מחייבים אהדה ביעד של ריבית לאחר כל סיבוב של biopanning. בניגוד איור 3, הושלמו כל הפרדות תא autoMCS באמצעות תוכנת Posselds. חלק נתונים אלה, ניתן לאבחן גם בפיזור חלקות vs FITC-H FSC-H. ואח 2015 Sarkes 14 להשוואה כדי vs FITC-A החלקות FSC-A המוצג כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נתוני לדוגמה לניתוח FACS של מיון סיבובים: יעד abrax. באופן דומה ל- איור 2, המוצגת כאן היא זיקה מחייבת השוואתי עבור ניסוי biopanning מלאה, כפי שנקבע על ידי FACS. הספריה התצוגה חיידקי היה נתון למיון שלילי נגד מצופים streptavidin מגנטי החרוזים, כמו באיור 2, אך היה נתון אז לסיבוב נוסף של מיון שלילי נגד חלבון הומולוגי עם מבנה דומה, פונקציה, rivax, לפני ביצוע 4 סיבובים של biopanning חיובי עבור פפטידים מחייב את המטרה, abrax. להערכת איגוד, התאים היו המושרה עם 0.4% L-אראבינוז למשך 45 דקות לפני מחייב את היעד, בקרה חיובית ופקדים שלילי ולקרוא על FACS. איגוד אהדה כלפי המטרה הוא התאגרף באדום. המוצגים כאן הם פיזור חלקות vs FITC-A FSC-A (או PE-A vs FSC-A במקרה של SAPE), ערכים עבור אחוז תאים מאוגדים (לעומת שליליים הפקד מגודרת מודגרות עם PBS לבד), nMFI של המושרה התאים היו הדגירה למשך 45 דקות עם : PBS מאגר לבד, 150 nM YPet מונה (בקרה חיובית לביטוי פפטיד), 250 ננומטר Abrax-488 (שכותרתו חלבון המטרה), 250 nM Rivax-488 (שכותרתו cross-reactive חלבון המטרה הבאה), או 250 ננומטר SAPE (שליטה שלילי עבור איגוד ישיר כדי מצופים streptavidin beads מגנטי). הערה את העשרת הגוברת זיקה חזקה ביעד של ריבית, abrax, לאחר כל סיבוב של biopanning, ואת זיקה מחייבת מינימלי עבור החלבון מבנית דומה, rivax. בניגוד איור 2, חיובי biopanning עגול 1 התבצע בעזרת autoMCS תוכנית Posselds בזמן שלאחר מכן מיון סיבובים הושלמו באמצעות תוכנית Posseld, כפי שהוצע עבור biopanning בכתב היד. נתונים אלה, ניתן לאבחן גם בפיזור חלקות vs FITC-H FSC-H Sarkes. ואח 2016 15 להשוואה כדי vs FITC-A החלקות FSC-A המוצג כאן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דוגמה רצף ניתוח הפלט באמצעות מאקרו "eCPX_Sequencing". המוצג הוא מסך של המושבות ברצף 48 מ 4 סיבוב של biopanning לספרייה שבחרת להציג חיידקי עבור הרשות הפלסטינית קלסרים בשיטת Posselds. גיליון "סיכום טבלת" מוצגים כאן. שים לב כי המושבות היו ממוספרים לפי סדר אלפביתי של שם קובץ נתון שלהם במהלך תהליך עריכה ברצף התיבות שמסביב רצפים שחוזרים על פחות פעם אחת מתוארים בצבעים שונים עבור ניתוח נתונים קל יותר. המאקרו eCPX_Sequencing מסופק בתור קובץ קוד משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: רצף קביעת היישור ואת הקונצנזוס עבור שני יעדים ברורים חלבון. כל התמונות המוצגות כאן נוצרו באמצעות תוכנת Jalview עם Clustal_X צביעה לאחר יישור רצפים באמצעות תוכנת ניתוח מקוון Kalign 51. א) יישור של חוזרות רצפים של הרשות הפלסטינית biopanning עגול 4 (מתכתב עם טבלה 1). B) יישור של חוזרות רצפים של abrax biopanning עגול 4 (מתכתב עם איור 6A). ג) יישור של חמשת המועמדים מ abrax biopanning עגול 4, כפי שנקבע על ידי ניתוח FACS מועמדים בודדים (מתכתב עם איור 6B). הקו האדום מדגיש את רצף קונצנזוס בתוך A ו- C, ואילו הקו הסגול ב' מדגיש למבשר רצף קונצנזוס שנקבע abrax מחייב כשבוחנים רצפים חוזרים בלבד, הדגשת הפוטנציאל צריכים לבדוק זיקה מחייבת באמצעות FACS לפני קונצנזוס יכול להיקבע במקרים מסוימים. היישורים דומה שנוצר עם תוכנת ניתוח שונות ניתן לראות Sarkes. ואח 2015 14 ו- Sarkes. ואח 2016 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: זיקה מחייבת דוגמה וספציפיות למועמדים בודדים נותחה באמצעות FACS. המוצגת כאן היא עוצמת קרינה פלואורסצנטית החציוני מנורמל (nMFI) באמצעות FACS עבור רצפים חוזרים א) ו- B) העליון 5 המועמדים, כפי שנקבע על ידי זיקה מחייבת השוואתי על המטרה, abrax, מ 4 סיבוב של biopanning. הנתונים מייצג את ממוצע (ברים) ואת סטיית התקן (קווי שגיאה) של 3 ניסויים שכפל עצמאית. שים לב כי כל המועמדים המוצגים הם מאוד ספציפיות עבור abrax (abrax-488, ירוק ברים) מעל חלבון דומים מבחינה מבנית, rivax (Rivax-488, רד ברים), ואת הפקד שלילי streptavidin (SAPE, קווים שחורים). אמנם שני הרצפים החוזרים (AX-07 ו AX-15) היו גם בקרב המועמדים המובילים 5 ב', השוואה של תוצאות בתוך A ו- B מדגים כי ניתוח לחזור על רצף לבד לא ניתן מספיק כדי לבודד פפטידים הגבוהה של זיקה. הנתונים המוצגים כאן הותאם Sarkes. ואח 2016 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: יחס של איגוד ספציפיים שאינם ספציפיים לכריכה למועמדים חוזרים בודדים. בדוגמה זו, את מספר רצפים חוזרים ואת היחס של הרשות הפלסטינית (יעד) nMFI כדי nMFI SAPE (בקרה שלילית) מוצג על הרצף המועמד החוזרת מן הרשות הפלסטינית biopanning עגול 4. נתונים אלה ממוינות לפי יחסי הרשות הפלסטינית nMFI:SAPE nMFI יחס וניתח לנוכחות של הקונצנזוס WXCFTC ידוע, או רצף דומה, אשר המוצגות באותיות מודגשות, עם קו תחתון. שים לב כי רצפי עצמי לארגן כזה אלה מועמדים עם הקונצנזוס יש את היחס הגבוה של nMFI nMFI:SAPE הרשות הפלסטינית, ולכן אינטראקציה באופן ספציפי עם המטרה. התוצאות המוצגות הן מניסוי FACS יחיד. פפטידים עם זיקה הנמוך ביותר עבור היעד לא נכללו את משכפל נוסף וניתוח שפורסמו בשנת Sarkes. ואח 2015 14.

Suppplemental קובץ 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

קובץ Suppplemental 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Discussion

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning כבר הגישה מוצלחת של הבידוד של זיקה ריאגנטים, ויש פפטידים מציעים אלטרנטיבה יעילה נוגדנים עבור זיהוי כאשר נדרשים קריטריונים ספציפיים, כגון יציבות בסביבות קיצוניות. Biopanning של ספריות אלה התייעלה בשיטות autoMCS המתוארות כאן, פלטפורמה autoMCS זמינים מסחרית משתרע טכנולוגיה זו קהל הרבה יותר רחב. בהשוואה מסורתיים מתחלפים MCS/FACS שיטות המיון בקטריאלי להציג ספריות, שיטות autoMCS הן פחות יקר כי הם אינם מצריכים השקעה מכשיר FACS יקר יותר מסוגל מיון של בידוד תאי מאוגד, במקום סוג זרימת cytometer המשמש כאן, המסוגלת רק ניתוח 14. לשלבים הקריטיים עבור biopanning מוצלחת מאת autoMCS כוללים מבחר תוכנית ההפרדה, שלילי מיון נגד הצלב-המגיבים פוטנציאליים כדי לצמצם את תוצאות חיוביות שגויות, ניטור ספריית העשרה באמצעות FACS כדי לקבוע מתי להפסיק biopanning, ו ניתוח חכם של בין המועמדים כדי להימנע מסורבלת ההקרנה של מאות מועמדים.

הדוגמאות המתוארים בזאת להדגים biopanning מוצלחת של הספרייה התצוגה חיידקי שבחרת עבור שתי מטרות נפרדות, הרשות הפלסטינית והן abrax, אך עם אסטרטגיות ניתוח שונה במקצת עקב הבדלים ברצף פפטיד עבור כל מאגר של מועמדים לאחר ארבעה סיבובים של biopanning. הרשות הפלסטינית היה המקרה יותר הגונים, עם רצף ניתוח הוכחת מגמות ברורות מן הרצפים פפטיד זה חוזר על עצמו לפחות פעם אחת במושבות 144. זה לבד היה מספיק לקבוע רצף קונצנזוס עבור היעד הרשות הפלסטינית, ואת אלה מושבות שהכיל הקונצנזוס או רצף דומה היו המועמדים הטובים ביותר מבחינת היחס של איגוד הפלסטינית נגד איגוד אל הפקד streptavidin שלילי. עם זאת, זה לא תמיד יהיה המקרה. עבור המטרה abrax, מושבות 100 רצף הוביל חמש רצפים חוזרים אבל המגמה ברצפים אלה היה פחות ברור, מלבד נטייה להכיל שאריות חומצת אמינו ארומטיות, חומצה אספרטית או אספרגין. החזוי "הקונצנזוס" מן הרצף החוזר רק יכול יש כבר הפיק ונבדק זיקה abrax, אבל מאז רצפים האב לא הכיל את רצף הסכמה המדויק, אנו החזיר לרשימה של המושבות ברצף, נצפתה האחר מועמדים שהיה יותר מגמות המשותף לכל. למעשה, שתי מושבות הכיל רצף דומה ל "הקונצנזוס" מן חוזר לבד, (FWDTWF במקום FWAWF), שהייתה מגמה זהה גם שאריות טריפטופן, פנילאלנין, חומצה אספרטית אך עם מרווח שונים. אחד של פפטידים אלה היה רצף חוזר, אחד לא היה. רצפי שני אלה, יחד עם רצף השלישי המכיל גרסה דומה, היו בין החוברות למעלה 5 נבדקו מבחינת האהדה abrax. קלסר העליונה הכוללת, AX-A05, מוצגים גם מגמות דומות. התוצאות עבור abrax מדגימים כי גישה שיחליף מספר פעמים בין רצף ניתוח וניתוח זיקה וספציפיות לפעמים יהיה נדרש, בהתאם למטרה שבחרת. התוצאות עבור המטרה abrax גם להוכיח את רמת היחודיות אשר יכולה להיות מושגת על חלבון דומה מאוד ( 1,rivax15).

התוכניות autoMCS שבחרת עבור המחקרים שלנו היו Posselds, Posseld, שהן שתיהן לבחירה חיובית של התאים היעד שכותרתו עם תדירות נמוכה, פחות מ- 5% מהאוכלוסייה הראשונית. בשני המקרים, התאים עוברים שני טורים מגנטי. במקרה של התוכנית Posselds, עם זאת, תאים עוברים לאט יותר העמודה הראשונה כדי להגדיל את זמן החשיפה 41. בנוסף לתיאורים התוכנית ניתנה על ידי היצרן של ההתקן autoMCS המסחרי (ראה טבלת חומרים) 41, תוכניות אלה נבחרו לאחר השוואה ראשונית של מספר תוכניות אפשריות. היכולת של כל תוכנית כדי למנוע הוצאת תוצאות חיוביות שגויות מתרבות הומוגנית של תאי בקרה שלילית, בהצלחה לבודד קלסר ידוע ליעד עניין מתרבות מעורב המכיל תאים שליטה שלילי מתובל הפחתת אחוז קלסר ידוע, הושוו. אם באופן משמעותי לסטות היישומים המתוארים כאן, השוואה דומה יכול לעזור בבחירה תוכנית עבור היישום החדש. עם זאת, שפורסמו קודם לכן תוצאות השוואת שתי תוכניות אלה (Posseld ו- Posselds) עבור בידוד של פפטיד זיקה ריאגנטים עבור הרשות הפלסטינית הראה כי באחת מתוכניות אלה עבור כל ארבעה סיבובים של biopanning הוביל לבידוד של פפטידים דומים זיקה, ירידה לפרטים עבור הרשות הפלסטינית והנחישות של הקונצנזוס WXCFTC. ההבדלים העיקריים היו Posseld הזה, עם קצב הזרימה מהירה יותר שלה, למיין במהירות רבה יותר, מחייב אהדה עבור היעד היה לכן גבוה יותר לאחר שני סיבובים של biopanning, ואילו שימוש Posselds הוביל רצפים ייחודי נוסף לאחר ארבעה סיבובים של biopanning 14. ללמוד מזה, האסטרטגיה השתנה מעט כאשר biopanning עבור abrax פפטידים איגוד לשלב שני יתרונות: Posselds שימשו עגול 1 כדי לאפשר יותר זמן חשיפה במהלך שלב זה קריטי איפה הגיוון הוא הגבוה ביותר, אבל אז תוכנית הוחלפה Posseld עבור בידוד מהיר של החוברות זיקה הגבוהה ביותר במהלך סיבוב 2-4 1,15. זה הופיע להיות אידיאלי abrax, במיוחד מאז nMFI ואיגוד אחוז גבוה יותר עבור abrax מיון עגול 4 לעומת הרשות מיון 4 עגול עם תוכנית או שניהם היו (איור 2 ו. איור 3 ו- Sarkes et al. 2015 14), אבל השוואה ישירה באמצעות אסטרטגיה אחת מול השנייה לאותו היעד להידרש להשוואה יותר חד משמעיות. איזו תוכנית היא הטובה ביותר עבור יישום מסוים שעשוי להיות תלוי על המטרה בודדים, הספרייה מיון המשמש את רמת הביטוי פפטיד מושגת עם כל שינוי בתנאים המתוארים כאן.

לא נדון להלן התוצאות האפשריות של biopanning עם חומרים והאביוטיים, אבל השתמשנו גם באותה ספריה חיידקי התצוגה עבור biopanning נגד בצובר אלומיניום 2. מחקר זה לא בוצעה באמצעות autoMCS, אך מחקרים דומים יכול להתבצע באמצעות autoMCS אם החומר זמין, או יכול להיות מצופה על או מצומדת כדי, חרוז מגנטי. במחקר אלומיניום בתפזורת, חומצת אמינו בודדות ומודלים מבנה שניוני עזר להבנת מה נהג על זיקה מחייבת של פפטידים מבודד, מאז אין רצף הסכמה היה נחוש 2. אפילו עם מטרות ביולוגיות, ייתכן שהדבר נדרש להבין במה הוא נוהג על זיקה מחייבת עבור מטרות מסוימות, ולכן הגיליון המופקים המאקרו "eCPX_Sequencing" כוללת כרטיסיה עם ניתוח תדירות שאריות בודדים. אם אין רצפים חוזרים נראים בנוסף היעדר קונצנזוס, שאריות תדירות מראה שום דפוס, עם זאת, סוגים אחרים של ניתוח עשוי להידרש. בנוסף, מיון נוסף סיבובים ייתכן שיהיה צורך להימנע הקרנת מספר גדול יותר של מועמדים לבחירה למטה-כאלה עם זיקה מספקת המטרה הרצויה.

עם הזמינות הגוברת של רצף הדור הבא, לימוד יותר מעמיק יכול להתבצע כדי לקבוע את המועמדים המבטיחים ביותר לפני בדיקת זיקה וכדי לקבוע את מידת ההעשרה לאחר כל סיבוב של biopanning. עם זאת, רצפים הלאה לשלב ניתוח איגוד ייתכן שיהיה עליך ליצור מחדש על-ידי שיבוט, אם הם אינם של תדר גבוה מספיק כדי לבודד בקלות עם המושבה שגרתית רצף של עשרות או מאות מושבות. כמו טכנולוגיה זו מקדמות, הופך להיות פחות יקר, שגרתיות יותר, במיוחד עם אפשרות לבידוד המושבה, שכן סביר להניח להיות הדרך הטובה ביותר כדי לנתח נתונים biopanning. זה עלול להוביל הבהרה של הרצפים דרך בודדים, ואת כל ספריה, להתפתח. בנוסף, החיידק בספריה מיון אולי מוטציה לאורך זמן, אשר יכולת הטיה מיון לקראת תאים עם שיעורי צמיחה מהירה או חיידקים overexpress מסוגל לכריכת חומר גם ללא תצוגה לגרדום הבעה פפטיד, עבור גנומית חלבונים מופע. מסיבה זו, ברגע מועמדים מבטיחים להגיח, זה שווה לבודד את פלסמיד ה-DNA, retransforming טריים e. coli, ולאשר פפטיד איגוד באמצעות FACS. אם מתכנן להשתמש את פפטיד בתבנית ללא תאים, וצריך להעריך זיקה גם עבור פפטיד חינם. לדוגמה, פפטיד זיקה ריאגנטים שהתגלו במהלך התצוגה חיידקי עבור היעד SEB הופקו לאכסון את התא ואת שנותחה באמצעות שיטות מסורתיות יותר כמו מקושרים-אנזים immunosorbant assay (אליסה), ו על תאים (דרך FACS)-את-תא (דרך אליסה) זיקה הושוו באמצעותדK s נקבע על ידי שתי שיטות 7.

למרות עוצמת האינטראקציה ביוטין-streptavidin הופך אסטרטגיית אידיאלי עבור לכידה של חלבון המטרה, פפטידים מאוגד, הליך זה יכול להיות שונה עבור אחרים אסטרטגיות ללכוד. צימוד ישיר של חלבון כדי beads מגנטי, כמו אפוקסי ו חומצה קרבוקסילית חרוזים, הצליחה ומסירה צעד מחייב. עם זאת, ישיר של שעלולות להפריע אתרי קישור פוטנציאליים באופן ספציפי או בלתי מסוימים, בהתאם מצורף אסטרטגיה. יתרון נוסף של השימוש streptavidin חרוזים היא פחות חלבון יציב מטרות יכול להיות טרי biotinylated ב- 30 דקות או המאוחסנים קפוא, במידת הצורך, ואילו החרוזים עצמם נוטים לדרוש יותר זמן דגירה עם החלבון cross-linking, הם בדרך כלל מאוחסנים ב 2-8° c הריכוז ההתחלתי המוצע של biotinylated חלבון המטרה כאן, 600 nM, הצליחה עבור מטרות מרובות, אך ייתכן ניתן לבודד פפטיד ריאגנטים לכידת עם זיקה מוגברת, אם זה ריכוז מופחתת. בנוסף, שיטה זו ניתן יהיה להרחיב, שונה עבור ספריות אחרות התצוגה חיידקים ואורגניזמים אחרים. לדוגמה, ניתן לבצע שלבים אלה, בהעדר חמצן לשימוש עם anaerobes, או בסביבות אחרות לשימוש עם extremophiles כדי לבודד פפטידים עם מאפיינים ייחודיים. פפטידים ו/או הסכמה נחושה עבור מטרה מסוימת עניין יכול להיות פוטנציאל להשתמש על תאים כמקור פרנסה גשמי, או לאכסון המיוצר את התא. פפטידים לאכסון המיוצר יכול התבגר עוד יותר להתפתחות של זיקה גבוהה יותר וסוכנים עמידים יותר חלבון מזורז ללכוד (PCC) לשימוש בחיישנים, או עבור יישומים אחרים שבו נוגדנים בדרך כלל ישמש עבור איגוד או זיהוי 38,55. מידול מולקולרי יכול לשמש גם כדי לקבוע מחייב מיקום פפטיד עם המטרה שלו, כפי בוצעה לאחרונה כדי להפוך את abrax מחייב פפטידים קונצנזוס המופיעים 5C איור 1. בסך הכל, biopanning ספריות חיידקי התצוגה עבור פפטיד זיקה ריאגנטים היא חלופה מהירה, פשוטה ורבת בייצור נוגדנים עבור זיהוי זיהוי של מטרות חלבון ושל biopanning חצי אוטומטית זו הגישה הפיק תוצאות אמינות עם מרחיקת לכת יישומים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

המחברים רוצה להכיר את התמיכה של מעבדת מחקר צבא ארה ב (ARL) לתוכנית המשתלמים הבתר, מנוהל על ידי אלון רכס Associated האוניברסיטאות באמצעות חוזה עם ARL, הודות למינויו של ד ר ג'סטין עמ' Jahnke. הנותרים מימון סופק על ידי חיישנים מנהל התקנים אלקטרונים ARL. המחברים גם רוצה להודות המעבדה דוהרטי-UCSB על שיתוף את התצוגה חיידקי ספרייה ומידע לקראת שיבוט הכימית YPet מונה, ד ר אדמס ברין לקבלת תמיכה בשיבוט הכימית YPet מונה-ARL, ד ר יהושע קוגוט עבור עבודתו הראשונית על ו הכשרה biopanning של חיידקי התצוגה ספריות, עופרה השקט של Edgewood כימית, ביולוגית מרכז לשיתוף פלסמידים נהגו לבטא ולטהר abrax וחלבונים rivax, ברנדי דורסי לקבלת תמיכה טכנית עבור בידוד של הרשות הפלסטינית איגוד פפטידים, צ'ין גואו לקבלת תמיכה טכנית של ניסויים ראשוני עבור בידוד של פפטידים איגוד abrax, ד ר טרל ג'סיקה לדיונים מועיל לגבי כתב היד הזה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21, (11), 1504 (2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25, (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17, (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27, (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6, (11), e26925 (2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32, (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21, (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15, (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6, (4), 1 (2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. InTech. 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7, (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5, (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15, (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248, (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66, (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10, (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290, (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28, (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13, (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15, (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18, (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189, (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21, (8), 985 (2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13, (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22, (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9, (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9, (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114, (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79, (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1, (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8, (11), e80474 (2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19, (2), 156-165 (2012).
  46. Genewiz. DNA Sequencing Services. Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309, (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, (1), 539 (2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6, (1), 298 (2005).
  50. EMBL-EBI. Clutal Omega. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. EMBL-EBI. Kalign. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20, (3), 426-427 (2004).
  53. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25, (9), 1189-1191 (2009).
  54. Jalview. Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7, (10), 9452-9460 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics