Mantenimento di Aedes aegypti zanzare infettate con Wolbachia

Biology

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Summary

Le zanzare Aedes aegypti infettate con Wolbachia vengono rilasciate in popolazioni naturali di sopprimere la trasmissione dell'arbovirus. Descriviamo i metodi retro Ae. aegypti con Wolbachia infezioni in laboratorio per esperimenti e rilascio di campo, prendendo precauzioni per ridurre al minimo la selezione e l'adattamento di laboratorio.

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Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

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Abstract

Le zanzare Aedes aegypti infettate sperimentalmente con Wolbachia stanno utilizzandi in programmi per controllare la diffusione di arbovirus come dengue, chikungunya e Zika. Wolbachia-zanzare infette possono essere rilasciate nel campo di ridurre dimensioni di popolazione attraverso accoppiamenti incompatibili o trasformare popolazioni con le zanzare che sono refrattari alla trasmissione del virus. Per queste strategie avere successo, le zanzare rilasciate nel campo dal laboratorio devono essere competitive con le zanzare autoctone. Tuttavia, mantenere le zanzare in laboratorio può provocare inbreeding, deriva genetica e adattamento di laboratorio che può ridurre la loro idoneità nel campo e può confondere i risultati degli esperimenti. Per verificare l'idoneità dei diversi Wolbachia infezioni per la distribuzione in campo, è necessario mantenere le zanzare in un ambiente di laboratorio controllato attraverso più generazioni. Descriviamo un protocollo semplice per mantenere le zanzare Ae. aegypti in laboratorio, che è adatto per entrambi Wolbachia-zanzare infette e wild-type. I metodi minimizzare adattamento di laboratorio e implementano esogamici per aumentare la rilevanza degli esperimenti alle zanzare di campo. Inoltre, colonie sono mantenute in condizioni ottimali per massimizzare la loro idoneità per i rilasci di campo aperto.

Introduction

Le zanzare Aedes aegypti sono responsabili della trasmissione di alcune dell'arbovirus più importanti del mondo, tra cui la dengue, Zika e chikungunya1. Questi virus stanno diventando una crescente minaccia per la salute globale, come la distribuzione capillare di Ae. aegypti nei tropici continua ad espandersi2,3,4. Femmina Ae. aegypti preferenzialmente si nutrono di sangue umano5 e quindi tendono a vivere in prossimità di esseri umani, soprattutto nelle aree urbane, dove le popolazioni sono più densi. Attraverso questa stretta associazione con gli esseri umani si sono adattati anche per allevare in habitat artificiali, compresi i pneumatici, vasi, grondaie e serbatoi acqua6,7. AE. aegypti anche facilmente adattarsi ad ambienti di laboratorio dove può essere mantenute senza requisiti speciali dopo essere raccolte direttamente dal campo, a differenza di alcune altre specie nel genere Aedes 8, 9,10. La facilità di manutenzione ha visto loro ampiamente studiato in laboratorio in una vasta gamma di campi, in ultima analisi, con l'obiettivo di controllare le malattie zanzare può trasmettere.

Tradizionalmente, controllo arbovirus dipende fortemente l'uso di insetticidi per ridurre le popolazioni di zanzare. Tuttavia, vi è crescente interesse approcci dove le zanzare modificate sono allevate in laboratorio e poi rimesso in popolazioni naturali. Rilasciate le zanzare possono essere modificate geneticamente11,12,13, biologicamente14,15, attraverso irradiazione16, trattamento chimico17,18, o con combinato tecniche19 per sopprimere le popolazioni di zanzare o sostituirli con le zanzare che sono refrattari a arbovirus trasmissione20.

Wolbachia sono batteri che vengono attualmente utilizzati come agente di controllo biologico per gli arbovirus. Diversi ceppi di Wolbachia recentemente sono stati introdotti in Ae. aegypti sperimentalmente mediante microiniezione embrionali21,22,23,24. Questi ceppi riducono la capacità dell'arbovirus di diffondere e replicare nella zanzara, diminuendo la loro trasmissione potenziale23,25,26,27,28 . Wolbachia infezioni vengono trasmessi dalla madre alla prole, tuttavia alcuni ceppi inducono sterilità quando infetti maschi si accoppiano con le femmine non infetti22. Wolbachia-maschi infetti pertanto possono essere rilasciati in grandi quantità per sopprimere popolazioni di zanzara naturale, come recentemente dimostrati in altri15,specie di Aedes 29. Tuttavia, poiché Wolbachia inoltre inibiscono la trasmissione arbovirus in Ae. aegypti, zanzare possono essere rilasciate anche per sostituire le popolazioni native con vettori più poveri. Ae. aegypti infettati sperimentalmente con Wolbachia ora vengono rilasciate nel campo in diversi paesi che utilizzano questo approccio posteriore14,30,31.

Wolbachia-approcci di basati per controllo arbovirus si basano su una solida comprensione delle interazioni tra Wolbachia, la zanzara e l'ambiente. Wolbachia si presentano naturalmente in una vasta gamma di insetti, e le deformazioni introdotte le zanzare sono diverse nei loro effetti32. Come vengono introdotti nuovi tipi di infezione di Wolbachia in Ae. aegypti24, è necessario caratterizzare ogni ceppo per i loro effetti sulla zanzara fitness, riproduzione e arbovirus interferenza in una gamma di condizioni. Rigorosa sperimentazione in laboratorio è pertanto necessaria per valutare il potenziale per i ceppi di Wolbachia avere successo nel campo.

Uscite di campo aperto di Ae. aegypti con Wolbachia infezioni possono spesso richiedono migliaia o decine di migliaia di zanzare per zona di rilascio per essere allevato ogni settimana14,30,31. Il successo delle versioni iniziali può essere migliorato attraverso il rilascio di zanzare di grandi dimensioni per massimizzare la loro fecondità33 e accoppiamento successo34,35. Le zanzare dovrebbero anche essere adattate alle condizioni che essi sperimenteranno nel campo, tuttavia a lungo termine laboratorio allevamento può causare cambiamenti nel comportamento e fisiologia che poteva avere un impatto campo prestazioni36,37, 38.

Descriviamo un semplice protocollo per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio con attrezzature di base. Questo protocollo è adatto per entrambi selvaggio-tipo e Wolbachia-infettato le zanzare, il posteriore di quale può richiedere particolare attenzione come alcuni ceppi di Wolbachia hanno effetti sostanziali sulla zanzara vita-storia tratti39, 40. le condizioni di allevamento evitare sovraffollamento e competizione per il cibo per produrre le zanzare di una dimensione coerente, che è critica per competenza vettoriale ed esperimenti di fitness e garantisce che le zanzare sono sane per il rilascio di campo41 . Inoltre prendiamo precauzioni per minimizzare laboratorio adattamento e consanguineità riducendo le pressioni selettive e garantire che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale. Tuttavia, ambienti di laboratorio sono distintamente differenti da condizioni di campo e manutenzione a lungo termine in condizioni rilassate potrebbe ridurre l'idoneità delle zanzare al momento del rilascio in campo37,42,43 . Attraversiamo quindi le femmine da linee di laboratorio ai maschi di campo-raccolti periodicamente, conseguente colonie che sono geneticamente simili per confronti sperimentali e che sono adattati per la destinazione campo popolazione39. I metodi non richiede attrezzature specializzate e possono essere scalati a posteriore decine di migliaia di individui a settimana per i rilasci di campo. Il protocollo inoltre assegna una priorità l'idoneità delle zanzare all'interno e attraverso le generazioni, una considerazione importante per insetti destinati per l'istituzione nelle popolazioni naturali. Il protocollo è adatto per la maggior parte dei laboratori che richiedono manutenzione di Ae. aegypti, particolarmente per i confronti sperimentali dove una qualità costante di zanzare e relatability al campo sono importanti.

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Protocol

Alimentazione di sangue di zanzare su soggetti umani è stato approvato dall'Università di Melbourne Comitato etica umana (approvazione n.: 0723847). Tutti i volontari forniti informato consenso scritto.

1. larvale allevamento

Nota: Le zanzare sono tenute presso 26 ± 0,5 ° C e 50-70% di umidità relativa, con un fotoperiodo di 12:12 h (luce: scuro) per questo protocollo di manutenzione di Colonia. Queste condizioni sono simili alle condizioni climatiche media a Cairns, Australia e all'interno della gamma termica ottima per Ae. aegypti sopravvivenza e sviluppo44,45,46. Temperature elevate possono causare la perdita di Wolbachia infezioni da colonie di zanzare e dovrebbero essere evitato47. Manteniamo almeno 500 persone per popolazione per minimizzare la consanguineità; mantenimento di colonie di dimensioni inferiori può avere conseguenze di fitness [Ross et al. inedito]. Sotto queste condizioni e supponendo che una nutrizione adeguata, il tempo di generazione medio è di 28 giorni (Vedi tabella 1).

  1. Immergere le uova sul substrato in vassoi (Figura 1A) contenente 3 L di acqua (acqua di osmosi inversa o acqua di rubinetto invecchiata, generato lasciando l'acqua del rubinetto in vassoi per 24 h prima dell'uso), ~ 300 mg di cibo per pesci (uno schiacciato tablet, Vedi Materiali tavolo) e un alcuni grani di lievito secco attivo per indurre la schiusa48.
  2. Un giorno dopo la schiusa, usare una pipetta di vetro per trasferire circa 500 larve ai vassoi contenenti 4 L di acqua (Figura 1B), conteggio utilizzando un contatore di clicker. Aggiungere due compresse di cibo di pesce schiacciato ogni vassoio. Se necessario, utilizzare contenitori di diverse dimensioni per l'allevamento di larve (Figura 1A), ma tieni larvale densità inferiori a 0,5 larve/mL per evitare sovraffollamento.
  3. Verifica i vassoi di ogni giorno per assicurare che le larve hanno cibo a sufficienza; aggiungere circa due compresse di cibo ai vassoi ogni due giorni. Fornire cibo ad libitum , ma garantire che 0,5 mg/larva/giorno è disponibile durante questo periodo per garantire sviluppo è sincrono e dimensione corporea è coerente, altrimenti possono essere confusi i risultati degli esperimenti (Vedi risultati rappresentante).
  4. Fare attenzione a evitare la sovralimentazione delle larve, particolarmente in contenitori più piccoli allevamento con acqua meno volume e superficie. Se l'acqua sembra nuvoloso o se non esiste una significativa mortalità larvale, sostituirlo con acqua fresca; mortalità deve essere trascurabile se le larve sono alimentate in modo ottimale.

2. adulti emersione

Nota: Le larve cominceranno a pupate da cinque giorni dopo la schiusa, se ben nutriti e la maggior parte dovrebbe pupate di sette giorni dopo la schiusa. Gli adulti inizierà emergenti circa due giorni dopo l'impupamento, se mantenuta in modo ottimale a 26 ° C (Vedi Risultati rappresentante). Lo sviluppo larvale è tipicamente influenzato da Wolbachia infezioni quando un ampio è previsto il23,39,49.

  1. Sette giorni dopo la schiusa versare l'intero contenuto del vassoio attraverso una maglia fine (poro formato 0,4 mm). Mantenere l'acqua filtrata larvale per un uso successivo in ovicups (Vedi sezione "Sangue alimentazione e deposizione delle uova"). Invertire la mesh e immergerlo in un recipiente di plastica con 200 mL di acqua per trasferire le pupe. Fornire cibo supplementare se qualsiasi larve rimangono.
  2. Preparare le gabbie di emersione adulto (Figura 1) fornendo due tazze di soluzione di saccarosio al 10% (Figura 1F) e due Coppe di ovatta umida per evitare il disseccamento (Figura 1E).
  3. Se non è necessario che le pupe essere filtrate per sesso, mettere i contenitori con coperchio di pupe nella gabbia e lasciare il coperchio leggermente aperta per permettere gli adulti ad emergere nella gabbia. In alternativa, posizionare un imbuto rovesciato sopra il contenitore per ridurre al minimo l'annegamento. Assicurarsi che tutti gli adulti sono emerse prima di rimuovere il contenitore dalla gabbia per impedire la selezione contro gli sviluppatori lenti.

3. pupal sessaggio per esogamici

  1. Se le pupe devono essere ordinati dal sesso (ad es., per esogamici), pipettare le pupe da vassoi larvale e separare i due sessi (Figura 2) in contenitori di plastica (Figura 1A) con 200 mL di acqua ogni 24 ore fino al numero desiderato di ciascun sesso è stato raggiunto. Mettere i coperchi sui contenitori e lasciarli chiusi.
  2. Gli adulti emergerà nei contenitori; confermare loro sesso prima di rilasciare in gabbie (Figura 2). Rimuovere eventuali adulti sessuati in modo non corretto con un aspiratore entro 24 h dalla emersione prima che raggiungano la maturità sessuale. Una volta che i sessi sono stati confermati, rilasciare gli adulti in gabbie ogni 24 ore.
  3. Per ottenere Wolbachia-colonie infettate di un simile background genetico di una popolazione naturale, outcross aggiungendo Wolbachia-infettati femmine da colonie di laboratorio nelle gabbie dei maschi non infetti derivati da uova raccolte da ovitrap in il campo39, mantenendo la densità prescritta di 500 persone per popolazione.
    1. Ripetere l'esogamici per almeno tre generazioni successive per la produzione di colonie che sono almeno 87,5% simili geneticamente per la popolazione di campo39. Critico: Assicurarsi che i sessi siano corretti in questa fase (Vedi punto 3.1).
  4. Femmina Ae. aegypti sono solitamente refrattari all'ulteriore inseminazione entro ore di accoppiamento50. Quando esogamici colonie, consentire le femmine e i maschi a maturare in gabbie separate per due giorni e quindi aspirare le femmine nella gabbia maschio di fornire pari opportunità a tutti i maschi.

4. sangue alimentazione e deposizione delle uova

  1. Attendere almeno tre giorni dopo l'ultima femmina è emerso prima sangue alimentazione per consentire un ampio tempo per maturare. Sangue di nutrire le femmine entro due settimane dalla nascita per prevenire la mortalità eccessiva, in particolare per le zanzare con le infezioni di Wolbachia che influenzare negativamente la longevità22,24,49. Togliere le tazze di zucchero il giorno prima della poppata per migliorare i tassi di alimentazione.
    1. Chiedere ad un volontario per inserire loro avambraccio nella gabbia per consentire le zanzare femmina da sfamare. La maggior parte delle femmine dovrebbero nutrire di replezione entro 5 min, ma per ridurre la selezione contro lenti mangiatoie, lasciare l'avambraccio nella gabbia per 15 minuti, o fino a quando tutte le femmine sono visibilmente gonfie; un guanto di lattice per proteggere la mano da morsi è facoltativo ma consigliato.
    2. Due giorni dopo il pasto di sangue, posizionare due tazze di plastica contenente acqua di allevamento larvale e foderato con una striscia di carta vetrata (Figura 1) (o carta da filtro (Figura 1 H)) nella gabbia per le femmine per deporre le uova. Parzialmente e immergere la striscia di carta vetrata in acqua per mantenerla umida. Rimuovere altre fonti di acqua per impedire che le femmine depongono le uova fuori la Coppa di deposizione delle uova.
      Nota: l'acqua del rubinetto può essere utilizzato nelle coppe, ma acqua di allevamento larvale incoraggia la deposizione delle uova51,52 e femmine deporranno le uova più in modo sincrono.

5. uovo raccolta e condizionamento

  1. Le femmine deporranno le uova sulla carta vetrata appena sopra la linea di galleggiamento; raccogliere e sostituire le strisce di carta vetrata al giorno fino a quando non più uova. Nota che tale deposizione delle uova può continuare fino a una settimana.
  2. Strisce di carta vetrata parzialmente asciugare tamponando delicatamente su un tovagliolo di carta per 30 s, facendo attenzione a non per staccare le uova. Avvolgere le strisce in un foglio di scottex asciutto, quindi metterlo in un sacchetto di plastica sigillabile (Figura 1I).
  3. Verificare lo stato delle uova sotto un microscopio per dissezione (Figura 3). Se la carta vetrata le strisce sono troppo bagnati, uova possono nascere prima di essere immerso in acqua (Figura 3B), ma se secchi troppo duramente, uova possono sprofondare (Figura 3).
  4. Le uova possono essere covate in qualsiasi momento di là di post-raccolta tre giorni; si schiudono tutte le uova da ogni Colonia, raccolte attraverso tutti i giorni, nello stesso contenitore di acqua per assicurare che la prossima generazione è campionata da una grande piscina casuale degli individui.
  5. Per l'archiviazione a lungo termine, mantenere le uova in un contenitore sigillato con un'umidità elevata (> 80%) a circa 20 ° C. In queste condizioni, le uova senza Wolbachia possono essere conservate per diversi mesi mantenendo alta tratteggio tariffe53,54.
  6. Come alcune infezioni di Wolbachia riducono notevolmente la redditività delle uova con età49,55, si schiudono le uova da Wolbachia-infettato linee entro una settimana dalla raccolta per evitare la mortalità eccessiva per il pertinente ceppi. Sangue nutrire le femmine nuovamente dopo una settimana se sono necessari più uova.
Giorno Passo
0 Uova di tratteggio
1 Larve di conteggio nei vassoi
7 Trasferire le larve e pupe di gabbie di Colonia
17 Sangue di alimentazione femminili adulti
21 Iniziare a raccogliere le uova
25 Terminare la raccolta delle uova
28 Uova di tratteggio

Tabella 1: Panoramica del programma di controllo Ae. aegypti Colonia a 26 ° C. I tempi di sangue-alimentazione femmina e la schiusa delle uova è flessibili, ma lunghe durate in queste fasi dovrebbero essere evitate, in particolare per le zanzare infettate con Wolbachia, al fine di ridurre al minimo la mortalità. Seguendo questo programma riduce al minimo la selezione contro le zanzare che sono veloce o lento per sviluppare o maturo in tutte le fasi di vita, a condizione che le larve sono alimentate in modo ottimale.

Figure 1
Figura 1: Attrezzature utilizzate per l'allevamento di Ae. aegypti in laboratorio. Contenitori di plastica (A) utilizzati per uova da cova o di allevamento di larve con volumi di 500, 750 e 5.000 mL (da sinistra a destra). (B) vassoi utilizzati per l'allevamento di larve ad una densità controllata, solitamente 500 larve in 4 L di acqua. (C) (D), 3L gabbie utilizzate per adulti di alloggiamento e 19,7 L. Una densità di 25 adulti o meno al litro dovrebbe essere mantenuto per fornire spazio sufficiente. Coppa di 35 mL (E) con ovatta umida fornita come una fonte di acqua per gli adulti. (F) tazza da 35 mL con soluzione di saccarosio fornita attraverso un cavo o stoppino dentale come una fonte di zucchero. (GH) Tazze riempite con acqua di allevamento larvale e fiancheggiata da un substrato di deposizione delle uova di carta vetrata o carta da filtro (G e H, rispettivamente). (io) chiusura lampo sacchetto usato per la conservazione di strisce di carta vetrata o carta da filtro. Macchie nere sulla carta vetrata sono uova di zanzara. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Laterale (A) e dorsale (B) viste di pupe e adulti Ae. aegypti (C) dimostrando il dimorfismo sessuale. I maschi sono posizionati a sinistra e le femmine a destra in ogni pannello. Quando alimentato in modo ottimale, pupe maschi e femminile si distinguono per dimensioni; le femmine sono più grandi dei maschi (A) ed hanno un cefalotorace relativamente bulboso rispetto ai maschi che hanno i lati più piatto (B). Maschi adulti sono facilmente distinguibili dalle femmine in tutte le condizioni di allevamento, principalmente di loro antenne piumosa e palpi lunghi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Nella figura 3. Quattro giorno vecchio Ae. aegypti uova in condizioni diverse. (A) intatto uova su strisce di carta vetrata mantenuti ad un'umidità elevata (> 80%) ma senza alcun'umidità visibile. Tassi del portello devono essere superiore al 90% per il selvaggio-tipo Ae. aegypti se mantenuta correttamente. (B) le uova che si schiudono prima di essere immerso in acqua (schiusa precoce) si distinguono per un cappuccio staccato uovo e larva visibile. Questo indica che la striscia di carta vetrata è stata mantenuta troppo umida. (C) le uova che sono asciugate troppo duramente potrebbero collassare e sono chiaramente visibili dalla loro apparenza concava. Se la carta vetrata si irrigidisce ciò indica anche che le uova possono essere troppo asciutte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

Figura 4 illustra gli effetti della nutrizione suboptimale sullo sviluppo delle larve di Ae. aegypti . Quando sono disponibili contenitori con 0,25 mg di cibo al larva al giorno o meno, aumenta il tempo di sviluppo per sia i maschi che le femmine, ed è meno sincrona rispetto in contenitori fornita con 0,5 mg di cibo. Se un'alimentazione adeguata non viene fornita per tutta la durata dello sviluppo larvale, questo potrebbe avere un impatto negativo sul programma di manutenzione. Lento-lo sviluppo di individui sono a rischio di essere selezionati contro, sangue alimentazione può essere ritardata, e c'è un elevato rischio di mortalità adulti prima riproduzione si verifica.

La figura 5 Mostra la lunghezza dell'ala (una stima delle dimensioni del corpo) di Ae. aegypti adulti allevati sotto una varietà di regimi alimentari. Lunghezza ala sia maschi che femmine diminuisce sostanzialmente e diventata più variabile quando la nutrizione è suboptimale. Dimensioni del corpo uniforme sono importanti per i confronti sperimentali come dimensione del corpo è associato positivamente con fecondità, e grandi zanzare sono tenute ad esporre una maggiore fitness sotto campo condizioni33,34,35 .

Gli effetti delle infezioni di Wolbachia i tratti di cui sopra sono descritti in altri studi, ma in genere c'è poco o nessun effetto23,39,49.

Figure 4
Figura 4: Percentuale cumulativa di Ae.aegypti (A) le femmine e i maschi (B) sviluppo all'età adulta sotto diversi regimi alimentari a 26 ° C. 100 larve sono state allevate in contenitori da 500 mL di acqua (una densità larvale di 0,2 larve per mL), forniti con diversi livelli di cibo (vedere tabella materiali) e segnato per il loro tempo di sviluppo. Solo le larve che sono sopravvissuti fino all'età adulta sono stati incluse. Barre di errore sono errori standard, con n = 4 ripetizioni per ogni trattamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Lunghezza dell'ala di Ae.aegypti (A) le femmine e i maschi (B) sviluppare sotto diversi regimi alimentari a 26 ° C. 100 larve erano allevate in contenitori da 500 mL di acqua (una densità larvale di 0,2 larve / mL) e fornite con diversi livelli di cibo. Un sottoinsieme degli adulti è stato misurato quindi per la loro lunghezza ala utilizzando metodi precedentemente descritti56. Barre di errore sono deviazioni standard. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Seguendo il protocollo presentato qui per la manutenzione di Wolbachia-infetti Ae. aegypti dovrebbero assicurare che le zanzare sane di una qualità costante sono prodotte per esperimenti e aprire campo releases. A differenza di altri protocolli che privilegiano la produzione di massa quantità di zanzare (Vedi riferimento57), i metodi si concentrano su come massimizzare la loro idoneità, sia all'interno di generazioni implementando rilassate condizioni di allevamento e da altra parte generazioni, riducendo al minimo adattamento inbreeding, di selezione e di laboratorio. Questo protocollo è anche progettato specificamente per Ae. aegypti con Wolbachia infezioni ma dovrebbe essere adatto per qualsiasi tipo di Ae. aegypti. Tuttavia, non è adatto per l'allevamento di massa quantità (nell'ordine di milioni a settimana), che può essere necessaria per i rilasci di insetti sterili o incompatibile che richiedono un numero elevato di raggiungere la popolazione soppressione57,58.

Ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguite attentamente. È importante nutrire le larve in modo ottimale ed evitare sovraffollamento per tutta la durata del loro sviluppo. Questo assicurerà che le zanzare sviluppano in modo sincrono e sono di dimensioni consistenti. Cura speciale dovrebbe anche essere presa quando condizionata le uova; le larve molto facilmente possono covare troppo presto o uova possono essiccare se i substrati di deposizione delle uova sono troppo bagnato o asciutto, rispettivamente. In tutte le fasi del protocollo, si consiglia di consentire abbastanza tempo per come molti individui nella Colonia possibili per completare ogni fase. Selezione contro gli individui che sono lenti a sviluppare, maturo, sangue di mangimi, oviposit o si schiudono porteranno probabilmente alla perdita di variabilità genetica.

Notiamo alcune ulteriori considerazioni per la manutenzione di Wolbachia-infettato le zanzare che non sono descritti nel protocollo di cui sopra. È possibile che infezioni di Wolbachia andranno persi da colonie di laboratorio, e si consiglia, pertanto, che le colonie ordinariamente essere monitorati per il loro stato di infezione di Wolbachia . Usiamo quantitativa della polimerasi reazione a catena (qPCR)49,59 per testare almeno 30 individui da ogni Wolbachia-infettati linea ogni generazione. Se qualsiasi individui test negativo per l'infezione di Wolbachia appropriato, colonie possono essere purificate isolando le femmine come molti come possibile dalla Colonia interessata e quindi utilizzando progenie da madri infette solo, a fondare la prossima generazione. La causa della perdita di alcuni ceppi di Wolbachia di colonie di laboratorio è in gran parte sconosciuta, ma potrebbe essere spiegata dal fallimento del controllo della temperatura, come alte temperature possono causare la perdita di Wolbachia infezioni47, 60.

Colonie ed esperimenti anche possono essere contaminati con persone provenienti da diverse linee, se la cura non è presa quando allevamento. La contaminazione può derivare da pipettaggio incurante delle larve, mescolando le partite di uova, erronea gabbie o erroneamente sexing pupe in croci. Speciale dovrebbe pertanto prestare attenzione quando si maneggiano le colonie con diversi tipi di infezione di Wolbachia . Pulire accuratamente qualsiasi tazze di deposizione delle uova, allevamento vassoi e gabbie prima di riutilizzarli, pulire pipette prima di maneggiare ogni nuovo vassoio di larve e pulire la mesh ogni volta durante il trasferimento di larve e pupe di altri contenitori. Inoltre, ispezionare le dita per le uova quando si maneggiano carta vetrata strisce e utilizzare asciugamani di carta fresca quando essiccazione ciascuna striscia, assicurare che gli adulti siano il sesso corretto prima di rilasciarli in gabbie e affrontare rapidamente eventuali fuggitivi. Prendendo queste precauzioni dovrebbe evitare contaminazione la maggior parte, ma colonie ancora devono essere regolarmente monitorati utilizzando saggi diagnostici59.

Femmina Ae. aegypti richiedono un pasto di sangue per deporre le uova, e laboratori di tutto il mondo forniscono loro in una varietà di modi, da membrana alimentazione sistemi57, trattenuto animali61 e, in misura minore, sangue artificiale62 . Tuttavia, le zanzare con infezioni sperimentali di Wolbachia spesso scadenti su sangue non-umani e possono esibire fecondità ridotta e tassi del portello e trasmissione incompleta di Wolbachia a loro prole63, 64 , 65. mantenendo la ricettività delle femmine agli odori umani è anche importante per le zanzare essere rilasciato nel campo, e nutrirli attraverso membrane o altri animali possono compromettere questa capacità37. Abbiamo quindi optare per utilizzare l'avambraccio di volontari umani per questo protocollo di manutenzione di Colonia, anche se altri metodi sono tenuti in alcune circostanze. Sangue dovrebbe essere fornita con altri mezzi, quando si lavora direttamente con gli arbovirus, e cura dovrebbe essere presa quando colonie provengono da popolazioni di campo con alta carica virale come transovarial trasmissione di arbovirus può verificarsi66. Volontari umani dovrebbero anche non sangue feed se recentemente hanno visitato paesi endemici arbovirus come ci può essere un rischio di trasmissione.

La nostra manutenzione protocollo mira a ridurre al minimo il laboratorio adattamento e pressioni selettive, ma c'è spazio per ulteriori miglioramenti. Leftwich et al. 42 fornire ulteriori consigli per mantenere l'idoneità delle zanzare releases in campo aperto, compreso l'uso di diete larvale più diversificate e naturale, riducendo la densità degli adulti in gabbie e fornendo un ambiente complesso. Queste considerazioni possono migliorare l'idoneità degli Ae. aegypti a un livello superiore, anche se attualmente non esiste alcuna prova dei cambiamenti di fitness dovuto adattamento di laboratorio nell'ambito del protocollo di manutenzione descritto qui [Ross et al. inedito]. Alcune misure aggiuntive non possono essere fattibile per i laboratori con spazio limitato e risorse, ma sono tuttavia vale la pena indagare. Mantenendo dimensioni grande popolazione, evitando grandi pressioni selettive attraverso protocolli di allevamento e di attuazione periodica esogamici alle zanzare di campo dovrebbe contribuire a garantire alta idoneità di Ae. aegypti per campo aperto releases. I principi coinvolti nell'approccio possono essere applicati all'allevamento di altre specie di vettori di malattia per il rilascio di manipolare o sopprimere popolazioni naturali.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgements

Riconosciamo Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson e Clare Doig per il loro contributo allo sviluppo dei nostri metodi di manutenzione di Colonia e tre utenti anonimi per i suggerimenti che ci ha aiutato a migliorare il manoscritto. La nostra ricerca è supportata da un programma grant e la fellowship di AAH dal National Health e il Medical Research Council e una traduzione concedere dal Wellcome Trust. PAR è un destinatario di un australiano governo ricerca formazione programma di borsa di studio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

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