Wolbachia से संक्रमित एडीज aegypti मच्छरों को बनाए रखने

Biology

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Summary

एडीज aegypti Wolbachia से संक्रमित मच्छरों arboviruses के संचरण को दबाने के लिए प्राकृतिक आबादी में जारी किया जा रहा है । हम प्रयोगों और क्षेत्र के रिलीज के लिए प्रयोगशाला में Wolbachia संक्रमण के साथ रियर एई. aegypti तरीकों का वर्णन, प्रयोगशाला अनुकूलन और चयन को कम करने के लिए सावधानियों ले ।

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Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

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Abstract

एडीज aegypti मच्छरों प्रयोग से संक्रमित Wolbachia जैसे डेंगू, chikungunya और Zika के रूप में arboviruses के प्रसार को नियंत्रित करने के लिए कार्यक्रमों में उपयोग किया जा रहा है । Wolbachiaसंक्रमित मच्छरों के क्षेत्र में जारी किया जा सकता है या तो असंगत संभोग के माध्यम से जनसंख्या आकार को कम करने के लिए या मच्छरों कि वायरस संचरण के लिए दुर्दम्य है के साथ आबादी को बदलने । इन रणनीतियों के लिए सफल होने के लिए, प्रयोगशाला से क्षेत्र में जारी मच्छरों देशी मच्छरों के साथ प्रतिस्पर्धी होना चाहिए । हालांकि, प्रयोगशाला में मच्छरों को बनाए रखने के लिए रिश् तों में परिणाम कर सकते हैं, आनुवंशिक बहाव और प्रयोगशाला अनुकूलन जो क्षेत्र में अपनी फिटनेस को कम कर सकते हैं और प्रयोगों के परिणामों को पाया जा सकता है । क्षेत्र में तैनाती के लिए विभिन्न Wolbachia संक्रमण की उपयुक्तता का परीक्षण करने के लिए, यह कई पीढ़ियों भर में एक नियंत्रित प्रयोगशाला वातावरण में मच्छरों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । हम प्रयोगशाला में एई. aegypti मच्छरों को बनाए रखने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो Wolbachia-संक्रमित और जंगली प्रकार के मच्छरों दोनों के लिए उपयुक्त है । तरीकों प्रयोगशाला अनुकूलन को कम करने और क्षेत्र मच्छरों के लिए प्रयोगों की प्रासंगिकता को बढ़ाने के लिए पार करने को लागू. इसके अतिरिक्त, कालोनियों इष्टतम शर्तों के तहत खुला क्षेत्र रिलीज के लिए अपनी फिटनेस को अधिकतम करने के लिए बनाए रखे हैं ।

Introduction

एडीज aegypti मच्छरों को डेंगू, Zika और chikungunya1सहित दुनिया में सबसे महत्वपूर्ण arboviruses में से कुछ को हस्तांतरित करने के लिए जिंमेदार हैं । इन वायरस वैश्विक स्वास्थ्य के लिए एक बढ़ती खतरा होते जा रहे है एई. aegypti के बड़े पैमाने पर उष्णकटिबंधीय में वितरण के रूप में विस्तार करने के लिए जारी है2,3,4। महिला एई. aegypti तरजीह मानव रक्त5 पर फ़ीड और इस तरह मनुष्य को करीब निकटता में रहते हैं, विशेष रूप से शहरी क्षेत्रों में जहां आबादी सबसे घने हैं । मानव के साथ इस बंद के सहयोग से वे भी कृत्रिम निवास में टायर, बर्तन, गटर और पानी के टैंक6,7सहित नस्ल के लिए अनुकूलित किया है । Ae. aegypti भी आसानी से प्रयोगशाला के वातावरण के लिए अनुकूल है जहां वे किसी विशेष आवश्यकताओं के बिना बनाए रखा जा सकता है के बाद सीधे क्षेत्र से एकत्र किया जा रहा है, एडीज जीनस8में कुछ अंय प्रजातियों के विपरीत, 9,10. रखरखाव के अपने आसानी उंहें खेतों की एक विस्तृत रेंज में प्रयोगशाला में व्यापक रूप से अध्ययन देखा है, अंततः बीमारियों को नियंत्रित करने के लिए लक्ष्य मच्छरों संचारित कर सकते हैं ।

परंपरागत रूप से, arboviral नियंत्रण मच्छर की आबादी को कम करने के लिए कीटनाशकों के उपयोग पर काफी निर्भर करता है । हालांकि, वहां दृष्टिकोण में रुचि बढ़ रही है जहां संशोधित मच्छरों प्रयोगशाला में पीछे है और फिर प्राकृतिक आबादी में जारी है । जारी मच्छरों आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जा सकता है11,12,13, जैविक रूप से14,15, विकिरण के माध्यम से16, रासायनिक उपचार17,18, या संयुक्त तकनीक के साथ19 या तो मच्छरों की आबादी को दबाने या उंहें मच्छरों कि arboviral संचरण20के लिए दुर्दम्य है के साथ बदलें ।

Wolbachia बैक्टीरिया है कि वर्तमान में arboviruses के लिए एक जैविक नियंत्रण एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है Wolbachia के कई उपभेदों हाल ही में एई में पेश किया गया । aegypti प्रयोग भ्रूण microinjection21,22,23,24। इन उपभेदों arboviruses की क्षमता को कम करने के लिए प्रसार और मच्छर में दोहराने, उनके संचरण क्षमता कम23,25,26,27,28 . Wolbachia संक्रमण मां से वंश के लिए प्रेषित कर रहे हैं, लेकिन कुछ उपभेदों जब संक्रमित पुरुषों के साथ22संक्रमित महिलाओं को बाँझता प्रेरित । Wolbachia-संक्रमित पुरुषों इसलिए बड़ी मात्रा में प्राकृतिक मच्छर आबादी को दबाने के लिए जारी किया जा सकता है, के रूप में हाल ही में अंय एडीज प्रजातियों में प्रदर्शन किया15,29। हालांकि, के बाद से Wolbachia भी एई. aegyptiमें arboviral संचरण बाधित, मच्छरों को भी गरीब वैक्टर के साथ मूल आबादी की जगह जारी किया जा सकता है । Ae. aegypti Wolbachia के साथ प्रयोग संक्रमित अब कई देशों में इस बाद दृष्टिकोण का उपयोग कर14,30,31में क्षेत्र में जारी किया जा रहा है ।

arboviral नियंत्रण के लिए Wolbachia-आधारित दृष्टिकोण Wolbachia, मच्छर और पर्यावरण के बीच बातचीत की एक ध्वनि समझ पर भरोसा करते हैं । Wolbachia कीड़ों की एक व्यापक रेंज में स्वाभाविक रूप से होते हैं, और मच्छरों में शुरू उपभेदों उनके प्रभाव३२में विविध रहे हैं । के रूप में नए Wolbachia संक्रमण प्रकार Ae. aegypti24में पेश कर रहे हैं, यह मच्छर स्वास्थ्य पर अपने प्रभाव के लिए प्रत्येक तनाव विशेषताएं, प्रजनन और शर्तों की एक श्रेणी के तहत arboviral हस्तक्षेप आवश्यक है । प्रयोगशाला में कठोर प्रयोग इसलिए क्षेत्र में सफल होने के लिए Wolbachia उपभेदों के लिए क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है ।

खुला क्षेत्र Wolbachia संक्रमण के साथ एई. aegypti की विज्ञप्ति अक्सर हजारों के लिए की आवश्यकता कर सकते है मच्छरों की रिहाई क्षेत्र प्रति हजारों के लिए प्रत्येक सप्ताह14,30,31येते । प्रारंभिक रिलीज की सफलता के लिए एक बड़े आकार के मच्छरों को रिहा करके सुधार किया जा सकता है उनके fecundity३३ और संभोग सफलता३४,३५अधिकतम । मच्छरों भी शर्तों वे क्षेत्र में अनुभव होगा के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, लेकिन लंबी अवधि के पालन प्रयोगशाला व्यवहार और शरीर विज्ञान जो क्षेत्र के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है में परिवर्तन का कारण हो सकता है३६,३७, ३८.

हम बुनियादी उपकरणों का उपयोग कर प्रयोगशाला में एई. aegypti पालन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन । इस प्रोटोकॉल दोनों जंगली प्रकार और Wolbachiaसंक्रमित मच्छरों के लिए उपयुक्त है, जिसके बाद विशेष ध्यान की आवश्यकता होती है के रूप में कुछ Wolbachia उपभेदों मच्छर जीवन पर पर्याप्त प्रभाव है-इतिहास लक्षण३९, ४०. पालन शर्तों भीड़ और भोजन के लिए प्रतिस्पर्धा से बचने के लिए एक सुसंगत आकार के मच्छरों का उत्पादन है, जो वेक्टर क्षमता और फिटनेस प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है, और यह सुनिश्चित करता है कि मच्छरों क्षेत्र के लिए स्वस्थ है रिलीज४१ . हम यह भी सावधानी बरतने के लिए प्रयोगशाला अनुकूलन और चयनात्मक दबाव को कम करने और यह सुनिश्चित करना है कि अगली पीढ़ी के एक बड़े, यादृच्छिक पूल से नमूना है द्वारा रिश् ते कम करने के लिए ले । हालांकि, प्रयोगशाला वातावरण स्पष्ट रूप से क्षेत्र की स्थितियों से अलग हैं, और आराम की स्थिति के तहत लंबी अवधि के रखरखाव के क्षेत्र में रिलीज पर मच्छरों की फिटनेस को कम कर सकता है३७,४२,४३ . इसलिए हम प्रयोगशाला लाइनों से महिलाओं के क्षेत्र के लिए पार-पुरुषों के एकत्र समय, कालोनियों कि प्रयोगात्मक तुलना के लिए आनुवंशिक रूप से समान है और जो लक्ष्य क्षेत्र जनसंख्या३९के लिए अनुकूलित कर रहे है में जिसके परिणामस्वरूप । तरीकों किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है और क्षेत्र विज्ञप्ति के लिए प्रति सप्ताह व्यक्तियों के हजारों के रियर दसियों के लिए बढ़ाया जा सकता है । प्रोटोकॉल भी मच्छरों की फिटनेस को प्राथमिकता के भीतर और पीढ़ियों के पार, प्राकृतिक आबादी में स्थापना के लिए किस्मत में कीड़ों के लिए एक महत्वपूर्ण विचार । प्रोटोकॉल सबसे प्रयोगशालाओं कि एई. aegyptiके रखरखाव की आवश्यकता के लिए उपयुक्त है, विशेष रूप से प्रयोगात्मक तुलना के लिए जहां मच्छरों की एक सुसंगत गुणवत्ता और क्षेत्र के लिए संबंधित है महत्वपूर्ण हैं ।

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Protocol

मानव विषयों पर मच्छरों का रक्त पिलाना विश्वविद्यालय मेलबोर्न मानव आचार समिति (अनुमोदन #: ०७२३८४७) द्वारा अनुमोदित किया गया. सभी स्वयंसेवकों को लिखित सहमति प्रदान की गई ।

१. लार्वा पाहिजे

नोट: मच्छरों 26 ± ०.५ डिग्री सेल्सियस और 50-70% सापेक्ष आर्द्रता में आयोजित कर रहे हैं, एक 12:12 एच के साथ (प्रकाश: डार्क) इस कॉलोनी रखरखाव प्रोटोकॉल के लिए photoperiod । इन स्थितियों केर्न्स, ऑस्ट्रेलिया में औसत जलवायु परिस्थितियों के समान है और एई. aegypti अस्तित्व और विकास के लिए इष्टतम थर्मल रेंज के भीतर४४,४५,४६। उच्च तापमान मच्छर कालोनियों से Wolbachia संक्रमण के नुकसान में परिणाम कर सकते है और४७से बचना चाहिए । हम जनसंख्या के अनुसार कम से ५०० व्यक्तियों को रिश् ते को कम करने के लिए बनाए रखते हैं; एक छोटे आकार की कालोनियों को बनाए रखने के फिटनेस परिणाम हो सकते है [रॉस एट अल. अप्रकाशित] । इन शर्तों के तहत और पर्याप्त पोषण संभालने, औसत पीढ़ी के समय 28 दिन है ( तालिका 1देखें) ।

  1. ट्रे में सब्सट्रेट पर अंडे को जलमग्न (चित्र 1a) जिसमें पानी की 3 L (रिवर्स असमस पानी या वृद्ध नल का पानी, उपयोग करने से पहले 24 घंटे के लिए ट्रे में नल का पानी छोड़ने के द्वारा उत्पंन), ~ ३०० मछली खाद्य (एक कुचल गोली के मिलीग्राम, सामग्री की तालिकादेखें) और एक सक्रिय सूखी खमीर के कुछ अनाज४८सेने प्रेरित करने के लिए ।
  2. एक दिन के बाद सेने, एक ग्लास पिपेट का उपयोग करने के लिए लगभग ५०० लार्वा पानी की 4 L से युक्त ट्रे को हस्तांतरण (आंकड़ा 1b), एक क्लिकर काउंटर का उपयोग कर गिनती । प्रत्येक ट्रे के लिए दो कुचल मछली खाद्य गोलियाँ जोड़ें । यदि आवश्यक हो, तो लार्वा (चित्र 1a) के पालन के लिए विभिन्न आकारों के कंटेनरों का उपयोग करें, लेकिन भीड़ से बचने के लिए ०.५ लार्वा/एमएल के नीचे लार्वा घनत्व रखें ।
  3. लार्वा पर्याप्त भोजन सुनिश्चित करने के लिए दैनिक ट्रे की जांच करें; हर दो दिन में ट्रे को लगभग दो खाद्य गोलियाँ जोड़ें. खाद्य विज्ञापन libitum प्रदान करें लेकिन यह सुनिश्चित करें कि विकास को सुनिश्चित करने के लिए इस अवधि के दौरान ०.५ मिलीग्राम/लार्वा/दिन उपलब्ध है तुल्यकालिक और शरीर का आकार सुसंगत है, अंयथा प्रयोगों के परिणाम (प्रतिनिधि परिणाम देखें) पाया जा सकता है ।
  4. कम पानी की सतह क्षेत्र और मात्रा के साथ छोटे पालन कंटेनरों में विशेष रूप से लार्वा के पिलाए जाने से बचने के लिए ध्यान रखना । यदि पानी बादल लग रहा है या अगर वहां महत्वपूर्ण लार्वा मृत्यु है, यह ताजा पानी से बदलें; अगर लार्वा बेहतर ढंग से खिलाया जाता है तो मृत्युदर नगण्य होनी चाहिए ।

2. वयस्क उद्भव

नोट: लार्वा सेने के बाद पांच दिन से कोषस्थ करना शुरू करेगा अगर अच्छी तरह से खिलाया और बहुमत के बाद सात दिनों तक कोषस्थ करना चाहिए. वयस्कों कोषस्थ के बाद लगभग दो दिन उभर शुरू होगा अगर 26 डिग्री सेल्सियस पर बेहतर बनाए रखा ( प्रतिनिधि परिणामदेखें) । लार्वा विकास आम तौर पर Wolbachia संक्रमण से अप्रभावित है जब पर्याप्त भोजन23,३९,४९प्रदान की जाती है ।

  1. सात दिन सेने के बाद एक ठीक जाल के माध्यम से ट्रे की पूरी सामग्री डालो (ताकना आकार ०.४ mm) । ovicups में बाद में उपयोग के लिए फ़िल्टर्ड लार्वा पानी रखें (देखें "रक्त पिलाने और Oviposition" अनुभाग). जाल पलटना और कोषस्थों हस्तांतरण करने के लिए पानी की २०० मिलीलीटर के साथ एक प्लास्टिक कंटेनर में डुबकी । यदि कोई भी लार्वा रहता है तो अतिरिक्त भोजन प्रदान करें ।
  2. वयस्क उद्भव पिंजरों (चित्रा 1C) 10% सुक्रोज समाधान (चित्रा 1F) और दो कप नम कपास ऊन के सुखाना (चित्रा 1E) को रोकने के लिए दो कप प्रदान करके तैयार करें ।
  3. यदि कोषस्थों सेक्स के द्वारा हल करने की जरूरत नहीं है, पिंजरे में कोषस्थों के lidded कंटेनरों जगह और ढक्कन थोड़ा अझर छोड़ने के लिए वयस्कों के पिंजरे में उभरने की अनुमति है । वैकल्पिक रूप से, डूबते को कम करने के लिए कंटेनर पर एक औंधा फ़नल रखें. सुनिश्चित करें कि सभी वयस्कों के पिंजरे से कंटेनर को हटाने के लिए धीमी डेवलपर्स के खिलाफ चयन को रोकने से पहले उभरा है ।

3. ुपाल सीमन को पार करने के लिए

  1. यदि कोषस्थों को सेक्स के द्वारा क्रमबद्ध किया जाना चाहिए (उदा., पार करने के लिए), लार्वा ट्रे से कोषस्थों पिपेट और लिंगों (चित्रा 2) में प्लास्टिक कंटेनर (आंकड़ा 1a) के साथ २०० मिलीलीटर पानी हर 24 एच प्रत्येक सेक्स की वांछित संख्या तक अलग पहुंच गया है । कंटेनरों पर ढक्कन लगाएं और उंहें बंद कर दें ।
  2. वयस्क कंटेनरों में उभर आएंगे; पिंजरों (चित्र 2c) में जारी करने से पहले उनके सेक्स की पुष्टि करें । किसी भी वयस्कों sexed के साथ गलत तरीके से एक aspirator के 24 ज के भीतर आपात स्थिति से पहले वे यौन परिपक्वता तक पहुंचने । एक बार लिंगों की पुष्टि की गई है, पिंजरों में वयस्कों हर 24 एच रिलीज ।
  3. Wolbachia-एक प्राकृतिक आबादी के लिए एक समान आनुवंशिक पृष्ठभूमि के संक्रमित कालोनियों को प्राप्त करने के लिए, प्रयोगशाला कालोनियों से संक्रमित महिलाओं में ovitraps द्वारा एकत्र किए गए अंडे से व्युत्पंन के पिंजरों को Wolbachiaजोड़कर पार क्षेत्र३९, जनसंख्या प्रति ५०० व्यक्तियों के निर्धारित घनत्व को बनाए रखने ।
    1. दोहराने के लिए ंयूनतम तीन पीढ़ियों के लिए लगातार कम से कम ८७.५% ऐसी ही आनुवंशिक रूप से क्षेत्र की आबादी के लिए कर रहे है उत्पादन३९पीढ़ी । महत्वपूर्ण: सुनिश्चित करें कि लिंगों इस स्तर पर सही है (३.१ कदम देखें) ।
  4. महिला एई. aegypti आमतौर पर दुर्दम्य संभोग के घंटे के भीतर आगे गर्भाधान के लिए कर रहे है५०। जब पार कालोनियों, मादा और पुरुषों दो दिनों के लिए अलग पिंजरों में परिपक्व और फिर पुरुष पिंजरे में महिलाओं महाप्राण सभी पुरुषों के लिए एक समान अवसर प्रदान करने की अनुमति ।

4. रक्त पिलाना और Oviposition

  1. पिछले महिला खून पिलाने के लिए पर्याप्त समय परिपक्व होने की अनुमति देने से पहले उभरा है के बाद कम से तीन दिनों के लिए रुको । रक्त आपात स्थिति के दो सप्ताह के भीतर महिलाओं को खिलाने के लिए अत्यधिक मृत्यु दर को रोकने के लिए, विशेष रूप से Wolbachia संक्रमण है कि प्रतिकूल प्रभाव दीर्घायु22,24,४९के साथ मच्छरों के लिए । दूध पिलाने की दरों में सुधार करने के लिए खिलाने से पहले दिन चीनी कप निकालें ।
    1. एक स्वयंसेवक पूछो करने के लिए पिंजरे में अपनी बांह की प्रकोष्ठ डालने के लिए मादा मच्छरों को खिलाने के लिए अनुमति देते हैं । अधिकांश महिलाओं को 5 मिनट के भीतर repletion को खिलाना चाहिए, लेकिन धीमी फीडर के खिलाफ चयन को कम करने के लिए, 15 मिनट के लिए पिंजरे में प्रकोष्ठ छोड़ दो, या जब तक सभी महिलाओं को engorged दिख रहे हैं; एक लाटेकस दस्ताने काटने से हाथ की रक्षा के लिए वैकल्पिक है, लेकिन सिफारिश की ।
    2. दो दिन खून पिलाने के बाद, जगह दो प्लास्टिक लार्वा पालन पानी युक्त कप और (चित्रा 1G) (या फिल्टर कागज (चित्राएक) के लिए पिंजरा में महिलाओं के लिए अंडे देना के एक पट्टी के साथ लाइन । आंशिक रूप से पानी में सैड स्ट्रिप को नम रखने के लिए जलमग्न कर दें. oviposition कप के बाहर अपने अंडे बिछाने से महिलाओं को रोकने के लिए पानी के अन्य स्रोतों को हटा दें ।
      नोट: नल का पानी प्याले में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन लार्वा-पालन पानी oviposition५१,५२ और महिलाओं को प्रोत्साहित करती है और अधिक तुल्यकालिक अपने अंडे देना होगा ।

5. अंडा संग्रह और कंडीशनिंग

  1. मादाएं बस पानी की लाइन के ऊपर सैड पर अंडे देना होगा; लीजिए और सैड की स्ट्रिप्स की जगह रोजाना जब तक कोई और अंडे नहीं रखे जाते. ध्यान दें कि oviposition एक सप्ताह तक जारी रह सकता है ।
  2. आंशिक रूप से सैड स्ट्रिप्स को धीरे से उंहें 30 एस के लिए एक कागज तौलिया पर सोख्ता से सूखी, देखभाल करने के लिए अंडे नहीं उखाड़ लेना । फिर, सूखी कागज तौलिया के एक पत्रक में स्ट्रिप्स लपेटो और यह एक सील प्लास्टिक की थैली में जगह (चित्रा 1I) ।
  3. एक विदारक खुर्दबीन (चित्रा ३) के नीचे अंडों की स्थिति की जाँच करें. अगर सैड स्ट्रिप्स भी गीला कर रहे हैं, अंडे पानी में जलमग्न (चित्र 3 बी) से पहले हैच हो सकता है, लेकिन अगर बहुत कठोरता से सूख, अंडे (चित्रासी सी) गिर सकता है ।
  4. अंडों को तीन दिनों के बाद किसी भी समय संग्रह करके रचा जा सकता है; प्रत्येक कॉलोनी से सभी अंडे हैच, सभी दिनों में एकत्र, पानी की एक ही कंटेनर में सुनिश्चित करने के लिए कि अगली पीढ़ी के व्यक्तियों के एक बड़े, यादृच्छिक पूल से नमूना है ।
  5. लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एक सील कंटेनर में अंडे रखने के लिए एक उच्च पर (> ८०%) आर्द्रता लगभग 20 डिग्री सेल्सियस पर । इन शर्तों के तहत, Wolbachia के बिना अंडे कई महीनों के लिए संग्रहित किया जा सकता है, जबकि उच्च हैच दर५३,५४को बनाए रखने ।
  6. के रूप में कुछ Wolbachia संक्रमण बहुत उंर के साथ अंडे की व्यवहार्यता को कम४९,५५, Wolbachiaसे अंडे हैच संग्रह के एक सप्ताह के भीतर संक्रमित लाइनों के लिए प्रासंगिक के लिए अत्यधिक मृत्यु दर को रोकने के लिए संवेदनहीन. रक्त एक सप्ताह के बाद महिलाओं को फिर से फ़ीड अगर अधिक अंडे की जरूरत है ।
दिन कदम
0 अंडे हैच
1 लार्वा को ट्रे में गिनाएं
7 स्थानांतरण लार्वा और कोषस्थों कॉलोनी पिंजरों के लिए
17 रक्त फ़ीड महिला वयस्कों
21 अंडे का संग्रह शुरू
25 अंडे एकत्रित करना समाप्त करें
28 अंडे हैच

तालिका 1:26 डिग्री सेल्सियस पर एई. aegypti कॉलोनी रखरखाव अनुसूची का अवलोकन । मादा के रक्त-पिलाने और अंडों की सेने का समय लचीला होता है, लेकिन इन अवस्थाओं में लंबी अवधि से बचना चाहिए, खासतौर से मच्छरों के लिए Wolbachiaसे संक्रमित, ताकि मृत्युदर को कम किया जा सके । इस अनुसूची के बाद मच्छरों कि तेजी से या विकसित करने के लिए या सभी जीवन चरणों में परिपक्व धीमा कर रहे हैं, बशर्ते कि लार्वा इष्टतम रूप से खिलाया जाता है के खिलाफ चयन को कम करता है ।

Figure 1
चित्रा 1: प्रयोगशाला में एई. aegypti पालन के लिए इस्तेमाल उपकरण । (एक) प्लास्टिक के कंटेनर अंडे सेने या ५००, ७५० और ५,००० मिलीलीटर (बाएं से दाएं) की मात्रा के साथ लार्वा पालन के लिए इस्तेमाल किया । () एक नियंत्रित घनत्व पर लार्वा पालन के लिए इस्तेमाल ट्रे, आमतौर पर ५०० पानी के 4 एल में लार्वा । (C) १९.७ l और (D) आवास वयस्कों के लिए प्रयुक्त 3 l पिंजरों । 25 वयस्कों या प्रति लीटर कम का घनत्व पर्याप्त स्थान प्रदान करने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए । (E) वयस्कों को पानी का एक स्रोत के रूप में प्रदान की नम कपास ऊन के साथ ३५ मिलीलीटर कप । () चीनी के स्रोत के रूप में एक नाल या दंत बाती के माध्यम से प्रदान की सुक्रोज समाधान के साथ ३५ मिलीलीटर कप । (-) लार्वा पालन पानी से भरा कप और सैड या फिल्टर पेपर (जी और एच, क्रमशः) के एक oviposition सब्सट्रेट के साथ लाइन में खड़ा है । (I) ज़िप-ताला बैग सैड स्ट्रिप्स या फिल्टर कागज के भंडारण के लिए इस्तेमाल किया । सैड पर काले धब्बे मच्छर के अंडे होते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: पार्श्व (क) और पृष्ठीय (बी) कोषस्थों और वयस्क Ae. aegypti (ग) उनके यौन dimorphism प्रदर्शन के विचार । नर बाईं और प्रत्येक पैनल में सही पर महिलाओं पर तैनात हैं । जब इष्टतम खिलाया, पुरुष और महिला कोषस्थों आकार द्वारा प्रतिष्ठित हैं; महिलाओं को पुरुषों की तुलना में बड़ा कर रहे है (एक) और एक अपेक्षाकृत बल्ब पुरुषों की तुलना में cephalothorax है जो चापलूसी पक्ष () है । पुरुष वयस्कों को आसानी से सभी पालन शर्तों के तहत महिलाओं से प्रतिष्ठित हैं, मुख्य रूप से उनके plumose एंटेना और लंबे समय palps द्वारा. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. चार दिन पुराने एई aegypti विभिंन परिस्थितियों में अंडे । () सैड स्ट्रिप्स पर बरकरार अंडे एक उच्च पर बनाए रखा (> ८०) आर्द्रता लेकिन किसी भी दिखाई नमी के बिना. हैच दरें जंगली के लिए ९०% से ऊपर होना चाहिए-प्रकार Ae. aegypti यदि सही ढंग से बनाए रखा । () अंडे है कि पानी में जलमग्न होने से पहले हैच (असामयिक सेने) एक अलग अंडा टोपी और दिखाई लार्वा द्वारा प्रतिष्ठित हैं । इससे यह संकेत मिलता है कि सैड स्ट्रिप को भी नम रखा गया । () अंडे है कि बहुत कठोरता से सूख रहे है गिर सकता है, और उनकी गुफा उपस्थिति से स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । अगर सैड कड़ा हो जाता है तो यह भी संकेत देता है कि अंडे भी सूखे हो सकते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Representative Results

चित्रा 4 एई. aegypti लार्वा के विकास पर इष्टतम पोषण के प्रभाव को दर्शाता है । जब कंटेनरों ०.२५ प्रति दिन या उससे कम के प्रति लार्वा भोजन की मिलीग्राम के साथ प्रदान की जाती हैं, दोनों पुरुषों और महिलाओं के लिए विकास के समय बढ़ जाती है, और ०.५ भोजन के मिलीग्राम के साथ प्रदान की कंटेनरों की तुलना में कम तुल्यकालिक है । यदि पर्याप्त भोजन लार्वा विकास की अवधि के दौरान प्रदान नहीं किया जाता है, यह रखरखाव कार्यक्रम पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है । धीमी गति से विकासशील व्यक्तियों के खतरे में है के खिलाफ चयनित किया जा रहा है, खून पिलाने में देरी हो सकती है, और वहां प्रजनन से पहले वयस्क मृत्यु दर का एक उच्च जोखिम होता है ।

चित्रा 5 विंग लंबाई (शरीर के आकार का एक अनुमान से पता चलता है) Ae. aegypti वयस्कों के पोषण सरकारों की एक किस्म के अंतर्गत करता है । दोनों पुरुषों और महिलाओं के पंख लंबाई काफी कम हो और जब पोषण इष्टतम है और अधिक चर हो जाते हैं । वर्दी शरीर के आकार प्रयोगात्मक तुलना के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में शरीर का साइज़ fecundity के साथ सकारात्मक रूप से जुड़ा हुआ है, और बड़े मच्छरों को क्षेत्र की स्थिति के तहत अधिक से अधिक फिटनेस प्रदर्शन की उंमीद कर रहे है३३,३४,३५ .

उपरोक्त लक्षण पर Wolbachia संक्रमण के प्रभाव अंय अध्ययनों में वर्णित हैं,लेकिन आम तौर पर वहां कोई प्रभाव23,३९,४९के लिए कम है ।

Figure 4
चित्रा 4: Ae. aegypti (क) महिलाओं और (ख) के संचई अनुपात विभिंन खाद्य शासन के तहत वयस्कता के लिए 26 डिग्री सेल्सियस में विकसित पुरुषों । १०० लार्वा ५०० मिलीलीटर पानी (प्रति मिलीलीटर ०.२ लार्वा का एक लार्वा घनत्व) के कंटेनरों में दिए गए थे, जो भोजन के विभिन्न स्तरों ( सामग्री तालिका देखें) के साथ प्रदान किए गए थे और उनके विकास के समय के लिए बनाए गए थे । केवल वयस्क के लिए बच लार्वा शामिल थे । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटियां हैं, n = 4 के साथ उपचार प्रति प्रतिकृति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Ae. aegypti की विंग लंबाई (क) महिलाओं और (ख) 26 डिग्री सेल्सियस पर विभिन्न खाद्य शासन के तहत विकासशील पुरुषों. ५०० मिलीलीटर पानी (०.२ लार्वा प्रति एमएल का लार्वा घनत्व) के कंटेनरों में १०० लार्वा का पालन किया गया और भोजन के विभिंन स्तरों के साथ प्रदान की गई । वयस्कों के एक सबसेट तो पहले वर्णित तरीकों५६का उपयोग करके अपने पंख की लंबाई के लिए मापा गया था । त्रुटि पट्टियां मानक विचलन हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Wolbachia-संक्रमित एई. aegypti के रखरखाव के लिए यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बाद यह सुनिश्चित करना चाहिए कि एक सुसंगत गुणवत्ता के स्वस्थ मच्छरों प्रयोगों और खुले मैदान रिलीज के लिए उत्पादित कर रहे हैं । अंय प्रोटोकॉल है कि मच्छरों के बड़े पैमाने पर मात्रा के उत्पादन को प्राथमिकता के विपरीत (संदर्भ५७देखें), तरीकों को अपनी फिटनेस अधिकतम पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, दोनों पीढ़ियों के भीतर आराम पालन शर्तों को लागू करने से, और पार पीढ़ियों के रिश् ते को कम करके, चयन और प्रयोगशाला अनुकूलन । इस प्रोटोकॉल भी Wolbachia संक्रमण के साथ एई. aegypti के लिए विशेष रूप से बनाया गया है, लेकिन एई. aegyptiके किसी भी प्रकार के लिए उपयुक्त होना चाहिए । हालांकि, यह जन मात्रा पालन के लिए उपयुक्त नहीं है (प्रति सप्ताह लाखों के क्रम में), जो बाँझ या असंगत कीट विज्ञप्ति है कि उच्च संख्या की आवश्यकता के लिए जनसंख्या दमन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है५७,५८.

वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि ध्यान से पालन किया जाना चाहिए रहे हैं । यह लार्वा को बेहतर ढंग से खिलाने और उनके विकास की अवधि के लिए भीड़ से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । इससे यह सुनिश्चित होगा कि मच्छरों का विकास सिंक्रोनस रूप से होता है और यह एक सुसंगत आकार का होता है । अंडों को कंडीशनिंग करते समय विशेष सावधानी भी बरतनी चाहिए; लार्वा बहुत आसानी से भी जल्द ही हैच या अंडे desiccate कर सकते हैं अगर oviposition सब्सट्रेट भी गीला या शुष्क कर रहे हैं, क्रमशः कर सकते हैं । प्रोटोकॉल में सभी चरणों में, हम प्रत्येक चरण को पूरा करने के लिए संभव के रूप में कॉलोनी में कई व्यक्तियों के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देते हैं । व्यक्तियों है कि विकसित करने के लिए धीमी गति से कर रहे है के खिलाफ चयन, परिपक्व, रक्त फ़ीड, oviposit या हैच की संभावना आनुवंशिक परिवर्तन के नुकसान के लिए नेतृत्व करेंगे ।

हम Wolbachia-संक्रमित मच्छरों कि उपर्युक्त प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं है के रखरखाव के लिए कुछ और विचार ध्यान दें । यह संभव है के लिए Wolbachia संक्रमण प्रयोगशाला कालोनियों से खो दिया है, और इसलिए हम अनुशंसा करते है कि कालोनियों नियमित रूप से उनके Wolbachia संक्रमण की स्थिति के लिए निगरानी की जाएगी । हम मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR)४९,५९ प्रत्येक Wolbachia-संक्रमित लाइन से हर पीढ़ी के कम से कम 30 व्यक्तियों का परीक्षण करने के लिए का उपयोग करें । यदि किसी भी व्यक्ति को उचित Wolbachia संक्रमण के लिए नकारात्मक परीक्षण, कालोनियों के रूप में प्रभावित कॉलोनी से संभव के रूप में कई महिलाओं को अलग करके शुद्ध किया जा सकता है और फिर केवल संक्रमित माताओं से संतति का उपयोग कर, अगली पीढ़ी पाया । प्रयोगशाला कालोनियों से कुछ Wolbachia उपभेदों के नुकसान का कारण काफी हद तक अज्ञात है, लेकिन तापमान नियंत्रण की विफलता के द्वारा समझाया जा सकता है, के रूप में उच्च तापमान Wolbachia संक्रमण के नुकसान का कारण बन सकता है४७, ६०.

कालोनियों और प्रयोगों भी अलग लाइनों से व्यक्तियों के साथ दूषित हो सकता है अगर देखभाल जब पालन नहीं लिया है । संक्रमण लार्वा की लापरवाह pipetting से परिणाम कर सकते हैं, अंडे के बैचों को मिलाकर, गलत लेबलिंग पिंजरों या सीमन कोषस्थों को काटता है । विशेष देखभाल इसलिए विभिंन Wolbachia संक्रमण प्रकार के साथ कालोनियों हैंडलिंग जब लिया जाना चाहिए । अच्छी तरह से किसी भी oviposition कप, पालन ट्रे और पिंजरों उंहें फिर से उपयोग करने से पहले साफ, लार्वा की प्रत्येक नई ट्रे को संभालने से पहले पिपेट बाहर साफ और जाल हर बार जब लार्वा और अंय कंटेनरों को कोषस्थों स्थानांतरित साफ । इसके अलावा, जब सैड स्ट्रिप्स हैंडलिंग और ताजा कागज तौलिए का उपयोग जब प्रत्येक पट्टी सुखाने अंडे के लिए उंगलियों का निरीक्षण, सुनिश्चित करें कि वयस्कों उन्हें पिंजरों में जारी करने से पहले सही सेक्स कर रहे हैं, और जल्दी से किसी भी बच के साथ सौदा. इन सावधानियों को लेकर सबसे अधिक संक्रमण से बचना चाहिए, लेकिन कालोनियों अभी भी नियमित रूप से नैदानिक परख५९का उपयोग कर निगरानी की जानी चाहिए ।

महिला एई. aegypti एक रक्त भोजन की आवश्यकता के लिए अंडे देना है, और दुनिया भर में प्रयोगशालाओं उंहें तरीकों की एक किस्म में उपलब्ध कराने, झिल्ली खिला सिस्टम५७से, प्रतिबंधित पशुओं६१ और, एक हद तक कम करने के लिए, कृत्रिम रक्त६२ . हालांकि, प्रयोगात्मक Wolbachia संक्रमण के साथ मच्छरों अक्सर गैर मानव रक्त पर खराब प्रदर्शन, और कम fecundity और हैच दरों प्रदर्शन कर सकते हैं, और उनके वंश को Wolbachia के अधूरा संचरण६३, ६४ , ६५. मानव गंध के लिए महिलाओं की ग्रहणशीलता बनाए रखने के लिए भी महत्वपूर्ण है मच्छरों के क्षेत्र में जारी किया जाना है, और उंहें झिल्ली या अंय जानवरों के माध्यम से खिलाने इस क्षमता३७समझौता हो सकता है । इसलिए हम इस कॉलोनी रखरखाव प्रोटोकॉल के लिए मानव स्वयंसेवकों के प्रकोष्ठ का उपयोग करने के लिए चुनते हैं, हालांकि अंय तरीकों कुछ परिस्थितियों में आवश्यक हैं । रक्त अंय साधनों के माध्यम से आपूर्ति की जानी चाहिए जब arboviruses के साथ सीधे काम कर रहे हैं, और देखभाल जब transovarial arboviruses के संचरण के रूप में उच्च वायरल लोड के साथ क्षेत्र की आबादी से उत्पंन कर लिया जाना चाहिए६६हो सकता है । मानव स्वयंसेवकों को भी नहीं चाहिए रक्त फ़ीड अगर वे हाल ही में arboviral स्थानिकमारी वाले देशों का दौरा किया है के रूप में वहां संचरण का खतरा हो सकता है ।

हमारे रखरखाव प्रोटोकॉल के लिए प्रयोगशाला अनुकूलन और चयनात्मक दबाव को कम करना है, लेकिन वहां सुधार के लिए जगह नहीं है । Leftwich एट अल. ४२ और अधिक विविध और प्राकृतिक लार्वा आहार का उपयोग, पिंजरों में वयस्कों के घनत्व को कम करने, और एक जटिल वातावरण प्रदान करने सहित खुला क्षेत्र विज्ञप्ति के लिए मच्छरों की फिटनेस को बनाए रखने के लिए आगे की सिफारिशें प्रदान करते हैं । इन विचारों को एक अधिक से अधिक स्तर के लिए Ae. aegypti की फिटनेस में वृद्धि हो सकती है, हालांकि वर्तमान में रखरखाव प्रोटोकॉल के तहत प्रयोगशाला अनुकूलन के कारण स्वास्थ्य परिवर्तन का कोई सबूत नहीं है यहां वर्णित [रॉस एट अल. अप्रकाशित] । कुछ अतिरिक्त उपाय सीमित स्थान और संसाधनों के साथ प्रयोगशालाओं के लिए व्यवहार्य नहीं हो सकता है, लेकिन फिर भी जांच के लायक हैं । बड़ी जनसंख्या के आकार को बनाए रखना, प्रोटोकॉल पालन के माध्यम से प्रमुख चुनिंदा दबाव से बचने और क्षेत्र मच्छरों को आवधिक पार करने को लागू करने के लिए खुला क्षेत्र विज्ञप्ति के लिए एई. aegypti के उच्च स्वास्थ्य सुनिश्चित करने में मदद करनी चाहिए । दृष्टिकोण में शामिल सिद्धांतों को जारी रखने के लिए अंय रोग वेक्टर प्रजातियों के पालन के लिए लागू किया जा सकता है हेरफेर या प्राकृतिक आबादी को दबा ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgements

हम हमारे कॉलोनी रखरखाव के तरीकों के विकास के लिए उनके योगदान के लिए Heng लिन Yeap, क्रिस Paton, Petrina जॉनसन और क्लेयर Doig स्वीकार करते हैं, और उनके सुझावों जो पांडुलिपि में सुधार करने में मदद के लिए तीन गुमनाम समीक्षक । हमारे शोध को एक कार्यक्रम अनुदान और राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद से AAH को फैलोशिप और वेलकम ट्रस्ट से एक अनुवाद अनुदान द्वारा समर्थित है । सममूल्य एक ऑस्ट्रेलियाई सरकार के अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति के एक प्राप्तकर्ता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

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