Syntese af smitsomme Bakteriofager i en E. coli -baseret celle-gratis Expression System

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En ny generation af platforme, celle-fri transskription-oversættelse er blevet manipuleret til at konstruere biokemiske systemer i vitro gennem udførelse af genet kredsløb. I denne artikel beskriver vi, hvordan Bakteriofager, MS2, ΦΧ174 og T7, er syntetiseret fra deres genom ved hjælp af en alle E. coli celle-fri TXTL system.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En ny generation af celle-fri transskription-oversættelse (TXTL) systemer, manipuleret til at have en større alsidighed og modularitet, leverer nye kapaciteter til at udføre grundlæggende og anvendt videnskab i reagensglas reaktioner. I det sidste årti, er celle-fri TXTL blevet en kraftfuld teknik til en bred vifte af roman tværfaglig forskning områder relateret til kvantitative og syntetisk biologi. De nye TXTL platforme er især nyttig til at konstruere og afhøre biokemiske systemer gennem udførelse af syntetisk eller naturlig gen kredsløb. In vitro TXTL har vist sig praktisk at hurtigt prototype regulerende elementer og biologiske netværk samt at sammenfatte molekylære samlesæt mekanismer findes i levende systemer. I denne artikel vil vi beskrive, hvordan smitsomme Bakteriofager, såsom MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), og T7 (dsDNA), er helt syntetiseret fra deres genom i en-pot reaktioner ved hjælp af en alle Escherichia coli, celle-fri TXTL system. Syntese af de tre coliphages kvantificeres ved hjælp af plaque assay. Vi viser, hvordan udbyttet af syntetiserede phage afhænger af indstillingerne biokemiske reaktioner. Molekylær fortrængning, emuleret gennem en kontrolleret koncentration af PLØK 8000, påvirker mængden af syntetiserede phages af ordrer af størrelser. Vi beskriver også, hvordan til at forstærke phages og hvordan til at rense deres genomer. Sæt protokoller og resultaterne præsenteres i dette arbejde bør være af interesse for tværfagligt forskere involveret i celle-fri syntetisk biologi og bioteknologi.

Introduction

I det sidste årti, er celle-fri udtryk technology manipuleret til adresse roman applikationer i emergent tværfaglig forskning områder relateret til syntetiske og kvantitative biologi. Oprindeligt brugt til at udtrykke proteiner uafhængigt af en levende organisme, er nye celle-fri TXTL systemer udviklet til både grundlæggende og anvendt videnskab1,2, udvide anvendelsesområdet for denne teknologi betydeligt. Den nye generation af TXTL platforme er designet til at være brugervenligt, mere effektiv (nå 2 mg/mL af proteinsyntesen i batch mode3), mere alsidige på niveau med transskription4og modulære for at nemt integrere roman naturlige eller syntetiske funktioner, der udvider funktionerne i eksisterende biologiske systemer5,6. Især er celle-fri TXTL systemer blevet handy for rapid prototyping af genetiske programmer som regulerende elementer eller små genetiske kredsløb7,8,9, ved at reducere design-build-testen Gennemløb og Skift til et par dage. Bemærkelsesværdigt, de nye TXTL systemer er også kan behandle store DNA programmer såsom komplet syntesen af coliphages10,11, demonstrere stærk nok forestillinger for at støtte rekonstituering af aktive genomisk DNA kodet levende enheder.

TXTL systemer præsentere mange tekniske fordele sammenlignet med traditionelle in vitro- konstruktiv biokemiske assays. Celle-fri TXTL links proces af genekspression for det endelige produkt i en reduceret og åbent miljø, i modsætning til den komplekse cytoplasma af en levende celle. TXTL bruger DNA til at rekonstruere biokemiske systemer i vitro, som med moderne DNA forsamling teknikker, er overkommelige og hurtig ud over ikke kræver kræsen protein oprensning trin. Celle-fri udtryk giver direkte adgang til de fleste af komponenterne i de biokemiske reaktioner, hvilket giver en dybere dissektion af molekylære interaktioner12. I en TXTL reaktion, kan man ændre indstillingerne biokemiske og biofysiske efter behag, som er næsten umuligt i en levende celle. I betragtning af disse fordele og de seneste forbedringer, bliver TXTL teknologien mere og mere populær som en alternativ platform for syntetisk og kvantitative biologi. Mens Fællesskabets forskning ved hjælp af TXTL er hastigt voksende og TXTL er ved at blive en standard teknologi i bioteknologi, er det vigtigt at forstå, hvordan at bruge sådanne platforme for at udvikle passende praksis relateret til udførelse af TXTL reaktioner og til den fortolkning af resultaterne.

I denne artikel vil vi beskrive hvordan en alle E. coli TXTL system til at syntetisere Bakteriofager fra deres genom11, såsom MS2 i one-pot reaktioner, (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), og T7 (dsDNA, 40 kb). Vi viser, hvordan mængden af phages syntetiseret ændringer med hensyn til nogle af indstillingerne biokemiske reaktioner (magnesium og kalium koncentrationer). Molekylær fortrængning, emuleret gennem en vifte af PIND 8000 koncentrationer, har en dramatisk effekt på phage syntese over flere størrelsesordener. Realiseringen af sådanne store biokemiske systemer i enkelt reagensglas reaktioner, at sammenfatte sideløbende processer af transskription, translation, og samlesæt, er interessant for grundlæggende spørgsmål i forbindelse med biologi og Biofysik 10 (genregulering, samlesæt), samt for udvikling af applikationer, såsom nyorientering phage funktioner til at bygge nye nanostrukturer13. Ud over en praktisk på TXTL leverer vi metoder til phage forstærkning, genom ekstraktion og oprensning og phage kvantificering af plaque assay. De metoder, der præsenteres i dette håndskrift er passende for forskere, der anvender E. coli ekstrakt baseret celle-fri systemer og er interesseret i Bakteriofager.

De protokoller, der præsenteres i dette arbejde kan opsummeres som følger: 1) Phage forstærkning (dag 1: forberede podning celler, dag 2: indre plaque, flere phage vækst, og koncentration og dag 3: rensning af phage), 2) dobbelt-strenget genom DNA-ekstraktion (fenol/chloroform udvinding), og 3) celle-fri phage reaktion og titer eksperiment (dag 1: plade værtsceller og lave agar plader, dag 2: cell-free reaktion og vært celle før kultur, og dag 3: vært celle kultur og phage titer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOTE: følgende forstærkning trin og ekstraktion metode er i vid udstrækning generaliserbart for mange dobbelt-strenget DNA phage, fx bacteriophage T7, enterobacteria phage T4 eller enterobacteria phage λ (L). De anvendes hovedsagelig til en phage hvis genom ikke er let tilgængelige for køb fra kommercielle kilder.

1. phage forstærkning

Bemærk: single-plaque, multi-Cycle (SPMC) phage produktionsteknik er godt beskrevet for T4 phage i Chen, et al. 14 følgende phage forstærkning og DNA ekstraktion metode er en generalisering til brug med E. coli dobbelt-strenget DNA phages, fx, T7, T4 eller L. Den ultimative succes i protokollen stærkt afhænger af den valgte vært celle stamme ' s evne til at modstå superinfektion forhold. Hvis værtsceller er ustabil under superinfektion, eller superinfektion er aldrig nået, og lysis er aldrig nået i denne kritiske fase, er det bedst at fortsætte med en sammenflydende lysis protokol. Dette inkluderer adskillelse celleaffald gennem højhastigheds centrifugering, og phage pelleringsmidler ultracentrifugering hastigheder. Alle følgende betingelser og parametre er tænkt som et generelt udgangspunkt. De optimale betingelser for en lokal vært cellelinie kan være anderledes; bestemme og overholder de relevante betingelser.

  1. Forberede podning celler
    1. podes 10 mL Luria-Bertani (LB) medier i en 15 mL kultur tube med E. coli værtsceller, fx B eller K12.
    2. Sted i en shaker indstillet til 250 rpm og 37 ° C. Efterlad natten at vokse til mætning.
  2. Single-plaque, multi-Cycle phage vækst og koncentration
    1. for at forberede en plade af kompetente phage plaques, varm flere LB-agar plader ved 37 ° C i 1 time eller natten.
    2. Tilberedes flere fortyndinger af phage lager (fx T7, T4 eller L) af kendt koncentration i LB medier, satsning nemlig ~ 10 2 -10 3 phage/mL.
    3. Tilsættes 100 µL af overnight vækst af koncentreret værtsceller til hver plade.
    4. Vælg diskenheder i den forberedte phage Fortyndingerne svarende til et udvalg fra 10-100 phage/plade. Tilføje den nødvendige mængde af phage fortyndinger til hver plade (fx, 100 µL af 10 3 phage/mL; dette skal producere ~ 100 plaques). Inkuber plader ved 37 ° C og starte en count-up timer (+ 0 h). Inkuber i 4-5 h.
    5. Forberede 49 mL LB medier i en 250 mL målekolbe og sted i Rotationsapparat, indstillet til 250 rpm og 37 ° C.
    6. På + 2,5 h, fortyndet celler 50 x ved at tilføje 1 mL mættet cellekultur fra overnight vækst i en pre opvarmet kolbe, som indeholder 49 mL LB medium. Når cellerne kommer til log vækst (+ 4-5 h), måling af absorbans på 600 nm (OD 600). Bestemme koncentrationen af celler ved hjælp af konvertering OD 600 af 1.0 = 8 x 10 8 celler/mL.
    7. Dilute til 2 x 10 7 celler/mL ved hjælp af yderligere LB vækst medier. Fjerne agar plade der indeholder phage plaques fra rugemaskinen. Umiddelbart bruge slutningen af sterile Pasteur pipette til core og fjerne en enkelt plak. Blæse plak i de fortyndede celler og inkuberes ved 37 ° C i en yderligere 2 h (+ 6-7 h).
    8. Test for fuld infektion ved at tage en 500 µL prøve i en 1,5 mL tube, tilføje 10 µL chloroform (CHCL 3), og straks vortexing ved høj hastighed. Observere, hvis løsningen er afklaret. Når celler er fuldt inficeret, inkuberes i en anden 2 h (+ 8-9 h).
      Bemærk: Hvis cellerne er fuldt inficeret, vil de hurtigt lyse (< 2 min) og præcisere løsningen. Andre resultater anses i diskussion afsnittet nedenfor. Cellerne vil være superinfected men ikke vil lyse op til dette punkt. Hvis lysis begynder, tilsætning af DNase og høst ved centrifugering skal begynde straks at forhindre phage forringelse.
    9. Tilføje DNase 5 µg/mL og centrifugeres celler på 8.000 x g ved 4 ° C til pellet. Supernatanten. Resuspend toerstoffet i 10 mL af 1 x TRIS magnesiumchlorid (TM) (50 mM Tris ved pH 7,8, 10 mM MgCl 2) buffer med 5 µg/mL DNase. Tilføje 500 µL af CHCL 3 og vortex ved høj hastighed til lyse celler. Afklare ved centrifugering ved 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Decant supernatanten i en 15 mL konisk rør og opbevares ved 4 ° C.

2. Rensning af Phage

Bemærk: saccharose rensning er stort set afhængig af størrelsen af phage. Overvejelser for massen af phage at være isoleret vil skulle gøres og justeringer af gradientbetingelserne udføres. Endelige viral titers over 10 13 phage/ml kan nemt opnås med denne metode.

  1. Forberede 12 mL 5% og 45% w/v saccharose i 1 x TM buffer.
  2. Forbered 4 x 5-45% saccharose forløb af pipettering 2,5 mL af 45% saccharose i 4 ultracentrifuge rør. Top med ~ 2.6 mL 5% saccharose, stoppe når væske når 2 mm fra kanten af røret.
    Bemærk: Placer pipette tip i kontakt med overfladen af rørsukkeropløsning og meget langsomt dispensere væske. Den lettere rørsukkeropløsning vil flyde ovenpå tungere, danner en tydelig grænse. Et ordentligt lag løsning vil have ~ 1 mm interface, hvis holdt mod baggrundslys.
  3. Mix gradienter af tilt-tube rotation ved hjælp af en gradient danner instrument for 43 s på 86° på 23 rpm. Hvis det ikke umiddelbart er nødvendigt, dække med paraffin film og opbevares ved 4 ° C.
  4. Fjerne 500 µL fra toppen af hver forberedt saccharose gradient med 1 mL pipette og balance inden for ± 0,002 g.
  5. Pool phage suspensioner fra alle rør (trin 1.2.9). Brug 1 mL pipette, tilføje 500 µL af suspensionen af at bringe tip i kontakt med flydende overflade og meget langsomt udlevering diskenhed til toppen af saccharose gradient, være omhyggelig med at ikke blande gennem hurtig pipettering. Der centrifugeres ved 70.000 x g i 20 min. ved 4 ° C.
    Bemærk: Balance de forberedte forløb til inden for ± 0,002 g. mindre phages kan tage op til 1 h.
  6. Fjerne phage bands ved hjælp af en steril sprøjte og en stump kanyle.
    Bemærk: Når set fra siden, phage bandet bliver tyk og Mælkevejen i forhold til omgivelserne, ca 5 mm i højden, og beliggende halvvejs ned centrifugeglasset.
    1. Submerge en stump kanyle ind i løsning indtil spidsen er centreret om meget overkanten af phage band. Fjern bandet ved tegning i sprøjten stemplet, indtil fleste af phage band er blevet fjernet.
  7. Tilføje saccharose volumen med den suspenderede phage til 3-4 ultracentrifuge rør. Tilføj ikke mere end 1,5 mL/tube. Fyld til ~ 3-4 mm fra toppen af røret med koldt 1 x TM. Dække med paraffin film og vend for at blande. Plads tilbage i en ultracentrifuge og spin på 145.000 x g i 1 time ved 4 ° C at pellet. Mindre phages kan tage op til 2 h.
  8. Hurtigt hæld supernatanten og løbe op og ned på engangs klude. Tør på indersiden af røret med steril vatpind at fjerne overskydende supernatanten.
  9. Dele 200-400 µL koldt 1 x TM på tværs af alle pellets og resuspend natten over ved 4 ° C; ingen ryster kræves.
    Bemærk: Hvis pelleten ikke er ren, fx trævlet bits af membran, DNA, etc., pool og udføre yderligere centrifugering i en microcentrifuge på 17.000 x g.
  10. Dagen før at gøre titers, forberede en kultur af E. coli værtsceller i 10 mL LB vækst medier og efterlade i en rystende inkubator, indstillet til 250 rpm og 37 ° C natten over. Inkuber den passende mængde kultur plader ved 37 ° C i mindst 1 time før titers phage materiel.
    Bemærk: Antallet af plader at udruge afhænger af antallet af fortyndinger af phage materiel skal være forgyldt: hver unik fortynding af phage materiel kræver to kultur plader (f.eks. fire forskellige fortyndinger af phage materiel kræver otte kultur plader).
  11. Forbered 100 mL af Forside agar ved at tilføje 2,5 g LB og 0,6 g bacto-agar til en 100 mL flaske. Opløse tørstoffer i deioniseret vand i et volumen på 100 mL og autoklave. Efter autoklave, langsomt Vend flasken 6 - 8 gange at homogenisere agar hele løsningen. Placere flasken i 45 ° C vandbad i 15-20 min til Reagensglasset temperatur .
  12. Forberede seriel fortynding af phage bestande med LB løsning.
    1. Tilføje 990 µL LB til 10 µL phage lager for en 100-fold fortynding. Vortex at homogenisere. For en fortyndingsfaktoren 10, tilføje 100 µL af phage materiel til 900 µL LB. Vortex at homogenisere.
    2. Gentag de ovenstående fortyndingsrække så mange gange som nødvendigt at opnå en tællelig antal plaques (10-100 plaques).
      Bemærk: For at opnå dette, fortyndes phage lager 2-3 størrelsesordener mindre end det forventede phage udbytte i form af phage/mL reaktion. For eksempel, hvis en bestemt phage lager indeholder 10 11 smitsomme phage/mL, plade phage bestanden på en 10 8-fold eller 10 9-fold fortynding.
  13. Forberede phage titers et område ved at samle 14 mL kultur rør (antallet af kultur rør er lig med antallet af phage stock fortyndinger at være belagt). Placer de fortyndede phage stock prøver fra trin 2.12 og vært bakterieceller fra trin 2.10 på ice.
  14. Forberede en master mix af pipettering 5,25 mL top agar (trin 2.11), 220 µL fortyndet phage prøver (trin 2.12), og 50 µL vært bakterieceller (trin 2.10) til en kultur, 14 mL tube. Cap kultur tube og vortex ved høj hastighed.
    1. Gemme den resterende phage løsning på 4 ° C.
  15. Hente to kultur plader (trin 2.10) fra 37 ° C inkubator. Tilsættes 2,5 mL af master mix langsomt til midten af den første plade (uden bobler). Forsigtigt rotere pladen i hånden for at distribuere den master mix jævnt, så det spænder over hele kultur plade. Gentag med den anden plade. Vente 20 min for at sikre solidificering af den øverste agar. Inkuber plader ved 37 ° C i 4-7 h.
  16. Tæller plaques og phage koncentrationen i hver prøve, reaktion.
    Bemærk: Plaques vises som 1-2 mm klart kredse i det uigennemsigtige tæppe af værtsceller. Se figur 1 for repræsentative resultater. En vellykket phage produktion vil resultere i endelige koncentrationer af 10 12 -10 13 phage/mL.

3. Dobbelt-strenget genom DNA-ekstraktion

Bemærk: fortynding, omrystning og centrifugering trin skal optimeres for at udvikle en tyk, solid protein grænselag mellem phenol og vandfase. Dette genererer de højeste renhed genomer, som er fri for protein forurenende stoffer. Den første fortynding er afhængig af den endelige phage titer. En ekstremt høj titer phage lager (≥ 10 13 phage/mL) muligvis en 10-20-fold fortynding før udvinding, mens lav titer bestande (~ 10 10 -10 11 phage/mL) kan kun behøver en 2-fold eller ingen. Hvis det er svært at danne en solid protein lag i efterfølgende trin eller vandig suspension er for klæbrig at være brugbar på grund af den høje DNA koncentration, overveje en højere fortynding af phage bestande inden den fortsatte udvinding. Under enhver genom-håndtering trin, er det vigtigt at bruge wide-bore pipette tips når pipettering nogen vandfase. Mange phage genomer er ganske store og let fragmenterede gennem pipette klipning. Derudover eventuelle vortexing bør undgås udtrykkeligt som dette vil alvorligt shear genomer.

  1. Fortyndes en del af phage bestand fra trin 2.9 til 400 µL med 1 x TM buffer i en frisk 1,5 mL tube.
  2. Tilføje et lige saa stort volumen af Tris:Phenol:Chloroform til fortynding. Ryst blandingen forsigtigt på et laboratorium rocker eller ved hånd, for 5 min. derefter centrifugeres den resulterende emulsion på 17.000 x g i en benchtop centrifugeres i 5-10 min.
    Bemærk: Et særskilt, hvid protein lag på overfladen af den underliggende phenol fase er til stede.
  3. Fjerne den øvre vandig fase til en ny tube, pas på ikke for at forstyrre interphase grænsen.
  4. Gentag trin 3.2-3.3 yderligere 2 gange i alt 3 phenol ekstraktioner. Overføre den vandige fase til en frisk tube og tilføje et lige saa stort volumen af CHCl 3. Shake og centrifuge (trin 3.2). Overføre den vandige DNA-prøve til en ren tube.
  5. Anslår mængde oprenset DNA. Tilføje 0,4 bind 3 M natriumacetat (CH 3 COONa) og 3 bind af 95% ethanol (EtOH). Sted i-20 ° C fryser natten over fældningen. Centrifuge på 17.000 x g i en benchtop centrifuge for 10-15 min.
    Bemærk: DNA vil straks dehydrerer og blive synlig som en masse i suspension i røret. Den korrekte resulterende pellet er hvid og godt pakket mod bunden af røret.
  6. Fjerne og supernatanten ved dekantering eller pipettering. Tilsættes 500 µL 70% EtOH og Ryst forsigtigt røret indtil pelleten flyder gratis fra bunden af røret. Der centrifugeres ved 17.000 x g i 5 min. Fjern og kassér EtOH, tager sig ikke forstyrre pelleten.
  7. Gentag trin 3.6. Luft tørre pellet på benchtop for 30-60 min. tilsættes 50 µL ddH 2 O til pellet og Inkuber i 1 time på RT eller natten over ved 4 ° C til resuspend. DNA koncentrationen ved hjælp af absorption målinger på 280 nm.
    NOTE: De forventede koncentrationer er 0,5-5 µg/µL ved hjælp af denne teknik. Dele af den samlede genomisk Molekylær vægt til at bestemme den endelige genom koncentration.

4. Celle-gratis Phage reaktion og Phage Titer eksperiment

  1. forberede 25 g LB medium og 15 g bacto-agar fast, hæld i en 1 liter flaske og der tilsættes deioniseret vand til 1 L. autoklave.
  2. Efter sterilisation, vend flasken langsomt 6 - 8 gange at tage forsigtighed for at undgå dannelsen af boblerne. Flaske inversion vil homogenisere agar fast i hele 1 L opløsning. Placere flasken i en 58 ° C vandbad i 20 min. før udlevering på kultur plader.
  3. Når temperaturen på LB-agar løsning har ekvilibreres, forberede en flamme ud for kultur plader til at sterilisere miljø i nærheden af åben kultur plader. Hold 1 L flaske i vandbad til at undgå solidificering af agar samtidig med at delprøver. Der tilsættes 25 mL i en 100 mm x 15 mm kultur plade. 1 L vil producere 40 kultur plader.
  4. Afsat en kultur plade og lad størkne for mindst 1 h i RT; denne plade vil blive brugt til plating værtsceller. Lad de andre 39 kultur plader størkne i 2 dage på RT. butik ved 4 ° C eller bruge straks for at gøre titers.
  5. Plade i værtsceller af striber den passende bakterielle stamme (f.eks. vært B for T7) der var lagret på-80 ° C, på LB-agar kultur tallerken. Stribe ved siden af en åben flamme til at undgå miljøforurening. Der inkuberes natten over ved 37 ° C. Værtsceller har ingen antibiotikaresistens så arbejder i et sterilt miljø er essentielle.
  6. Celle-fri reaktion
    Bemærk: De celle-fri TXTL reaktioner er sammensat af 33% rå E. coli ekstrakt (8,9-9,9 mg/mL protein) med de øvrige 67% består af reaktion buffer og phage genom. Det rå ekstrakt er udarbejdet som tidligere beskrevet 15 , 16. Endelige reaktionsbetingelser er: 8,9-9,9 mg/mL protein (fra rå ekstrakt), 3-6 mM Mg-glutamat, 40-100 mM K-glutamat, 2-4% PLØK 8000, 3-4 mM på hver aminosyre, forberedt som tidligere beskrevet 17, og en energi mix løsningen, beskrevet tidligere 15, sammensat af 0,33-3.33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP og GTP, 0,9 mM CTP og UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, 0.068 mM folinic syre, 1 mM spermidine og 30 mM 3-PGA. DNA-type phages kræver genom koncentrationer af 0,5-10 nM og RNA-type phages kræver en række 50-150 nM. Endelige reaktion koncentrationer er unikke for den særlige phage syntetiseret og vil falde inden for de intervaller, der er beskrevet ovenfor. For optimal iltning af reaktionerne, skal endelige reaktion diskenheder være mellem 10-20 µL. Der er små variationer i reaktion-protokollen, som afhænger af formen af den genomiske molekyle. For eksempel, kræver lineære genom molekyler en ekstra komponent reaktion til at hæmme fordøjelsen af lineære DNA-stykker af det recBCD enzym findes i den rå ekstrakt.
    1. Komplet den " reaktion detaljer " afsnit i tabel 1 (PhageTXTL_JOVE) ved at angive det samlede antal reaktioner og endelige mængden af reaktion.
    2. Designe eksperimentet ved at bestemme den konstante og variable komponenter af reaktionen. Angiv fraktioneret volumenprocent master mix, som er forholdet mellem den samlede mængde af konstant reaktion komponenterne til et produkt af den endelige reaktion volumen og antallet af prøver. Angiv lager og endelige koncentrationer af reaktion reagenser i den " Master Mix reaktion opskrift " sektion i PhageTXTL_JOVE. Angiv lager og endelige koncentrationer af de variable reagensproduktets afprøves.
      Bemærk: Bind af reaktion komponenter vil automatisk blive beregnet på grundlag af master mix volumen og den endelige mængden af hvert individuelle reaktion.
    3. Fjerner den nødvendige mængde af rør (angivet i det " rør at tø " sektion af PhageTXTL_JOVE.xlsx) af rå celle ekstrakt, buffer energimix og aminosyre mix fra-20 ° C eller-80 ° C og tø på ice.
      Bemærk: Når optøet, kombinere flere delprøver af ligesom komponenter (hvis nødvendigt).
    4. Alikvot den angivne mængde af rå ekstrakt, 33% af den endelige reaktion, ind i et microcentrifuge rør.
    5. Forbereder den master mix ifølge tabel 1. Homogeniseres alle komponenter under " Master Mix reaktion opskrift " af vortexing. Tilføje den passende mængde af hver enkelt komponent til den rå ekstrakt.
    6. Hvis arbejder med en phage med lineære DNA genom (fx T7), tilføje 1 µM gam protein af bacteriophage lambda reaktion 11. Vortex homogeniseres løsningen, og Placer reaktionen i isbad i 5 min. Dette hæmmer fordøjelsen af de lineære DNA stykker af recBCD kompleks, som er endogene i den rå ekstrakt.
    7. Efter tilføjer den sidste komponent ifølge tabel 1, homogeniseres reaktionen af vortexing. Opdele den master mix i n microcentrifuge rør.
      Bemærk: Mængden af hver split er produktet af fraktioneret master mix volumenprocent og den endelige mængden af reaktion. For eksempel, for fraktioneret master mix volumenprocent af 90% og den endelige reaktion volumen af 12 µL, volumen af hver split er 10,8 µL.
    8. Tilføje de angivne mængder af de variable komponenter til matrixen master mix (Se tabel 1). Tilsæt vand til hver reaktion at nå den ønskede endelige reaktion volumen. Omrystes hver reaktion af vortexing. Inkubér microcentrifuge rør ved 29 ° C i mindst 8 timer eller natten over.
  7. Host cellekultur præ
    Bemærk: natten før kulturen er fortyndet 50: 1 at sikre, at de værtsceller til titer eksperiment i midten log fase, hvilket øger infektion effektivitet. Midten log celler er derefter igen koncentreret af 10-fold og opbevares på is.
    1. Ved hjælp af en steril pipette tip, podes en kultur tube 5 mL LB med 3-5 sunde vært celle kolonier. Arbejde ved siden af en åben flamme til at undgå forurening.
    2. Ruger kultur røret i en rystende inkubator ved 37 ° C og 250 rpm i 16 h eller natten over. Celler kan nå mætning fase af den morgendag.
  8. Vært celle kultur og prøve forberedelse til phage titer
    1. afpipetteres 50 mL LB i en 500 mL Erlenmeyer-kolbe og dæk med aluminiumsfolie. Varm kolbe ved 37 ° C i 20 min.
    2. Vært celle natten før kultur ind i den pre varmede LB. inkuberes i 3-4 timer ved 37 ° C og ryster på 250 rpm alikvot 1 mL.
    3. Centrifuge 50 mL vært cellekultur i 10 min på 5.000 x g. kassere LB.
    4. Resuspenderes med koldt (4 ° C) 5 mL LB og holde på ice.
    5. En time før start titer eksperiment, inkuberes kultur plader på 37 ° C.
      Bemærk: Hver unik phage reaktion (og tilsvarende fortyndingsfaktoren) vil bruge to plader. Derudover Inkuber 4 plader til eksperimentelle kontrol (Se figur 1 for repræsentative positive og negative kontroller).
    6. Forberede 100 mL af Forside agar (trin 2.11).
  9. Laves en seriel fortynding af den celle-fri reaktion med LB løsning som beskrevet i afsnit 2.12.
  10. Phage titer
    Bemærk: Begynder at pladen efter kultur retter har inkuberes i mindst 1 time og den øverste agar var i 45 ° C vandbad i 15-20 min efter fjernelse fra autoklave.
    1. Titer de sidste celle-gratis reaktion-LB løsning som beskrevet i afsnit 2, trin 2.14-2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser fire repræsentative resultater. I figur 1, præsenterer vi en række negative kontroller at sikre, at celle-fri TXTL system og phage DNA bestande ikke er forurenet med levende E. coli celler. Vi kontrollere, at celle-fri TXTL systemet er gratis af intakt E. coli celle kontaminering af plating både en ikke-rugede og rugede reaktion løsning blottet for genomisk DNA (figur 1A og figur 1B). Hvis celle-fri TXTL system blev forurenet med E. coli celler, ville vækst blive overholdt på pladen. Desuden, vi bekræfte den celle-fri reaktion, og derfor ikke nogen mulig forurenende celler, er ansvarlige for syntesen af phage ved plettering ikke-rugede og rugede reaktioner med phage genomet (figur 1C og Figur 1D). Pladen med de ikke-rugede reaktion (figur 1C) viser nul plaque, mens pladen med den rugede reaktion (fig. 1D) viser plak, der angiver den celle-fri TXTL system var ansvarlig for phage syntese.

I figur 2sammenligner vi en homogen versus inhomogene plaque assay. Figur 2 B illustrerer en graduering af plaque tæthed på tværs af kultur-plade, som er optimale i forhold til en homogen plaque tæthed af pladen i figur 2A. Kilden til det observerede resultat er fra den hurtige afkøling af master mix af top agar, prøve og vært bakterieceller når udleveres på en kultur tallerken under phage titer del af forsøget. For at undgå en inhomogene spredning af phage plaques, sikre at kultur plader er ekvilibreres til 37 ° C før start phage titer eksperiment.

Et kritisk trin korrekt tælle phages er at udvande phage løsning tilstrækkeligt til at opnå mellem 50 og 200 plaques pr. plade (figur 3). Under dette interval, er det vanskeligt at bestemme sande statistikker, og over dette interval, plaques overlappe, forebyggelse af nøjagtige optællinger. Antallet af phages syntetiseret i TXTL afhænger af biokemiske indstillinger koncentration af salte (kalium og magnesium), molekylære crowders og genomer. I figur 4viser vi et par eksempler på test for phages T7 og ΦΧ174. For et fag, der replikerer dens DNA, såsom T7, vi observerer en høj effektivitet af phage syntese i celle-fri reaktion: tre smitsomme phages er syntetiseret pr. genom molekyle i reaktionen. Man kan forvente en lavere effektivitet af reaktion for et fag, der ikke replikerer dens DNA, som ΦΧ174: forholdet mellem syntetiserede smitsomme phage til genom molekyle er 1:5.

Figure 1
Figur 1: Plaque assay kontrol og vellykket smitsomme phage produktion ved hjælp af en celle-fri reaktion (CFR). (A) ingen genom blev tilføjet og ingen inkubation (0 min som inkubationstiden) af CFR blev udført. Reaktionen var så forgyldt uden vært E. coli. Resultatet viser ingen levedygtig vært celle kontaminering af CFR. (B) ingen genom blev tilføjet og CFR blev udruget 12t ved 29 ° C og forgyldt uden vært E. coli. Resultaterne viser ingen levedygtig vært celle kontaminering af CFR, selv efter inkubation. (C) 1 nM genom inkluderet med ingen inkubation af CFR (0 min som inkubationstiden) og belagt med værten E. coli. Resultatet viser ingen phage kontaminering af genom løsning. (D) 1 nM genom inkluderet og CFR inkuberes 12t ved 29 ° C. og forgyldt med værten E. coli. Resultaterne viser vellykket smitsomme phage replikering i CFR. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Homogene versus inhomogene spredning af phage reaktion under titer eksperiment. En mulig effekt af udfører en phage titer på kultur plader ikke ekvilibreres til en temperatur på 37 ° C er den inhomogene spredning af phage reaktion på tværs af kultur-plade. Et godt resultat viser en homogen spredning af phage reaktion er vist i (A), hvor plaques er jævnt fordelt over hele overfladen af pladen. Et optimalt resultat er vist i (B), hvor plaques er koncentreret i den nederste venstre del af kultur-plade. Dette kan forekomme med top-agar, phage reaktion, og værten celle master mix udleveres på en kultur tallerken, der ikke er ved en temperatur på 37 ° C. Fleste af de master mix størkner i det nederste venstre område, og en homogen spredning er ikke muligt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Angive en passende fortyndingsfaktor for titers af en celle-fri phage reaktion. (A) denne plade viser en rimeligt tællelig antal plaques. Fortyndingsfaktoren anvendes til titer del af eksperimentet fortyndet udbyttet af phage reaktion nok til at forlade en tællelig antal plaques på pladen. Omvendt i (B) fortyndingsfaktoren var for lavt med hensyn til udbyttet af syntetiserede phage, og skal justeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Karakterisering af celle-fri syntesen af phages ΦΧ174 og T7. (A) antallet af syntetisk ΦΧ174 og T7 phages (PFU/mL: plaque danner enheder per milliliter) målt som en funktion af PLØK 8000 koncentration i celle-fri reaktionen, efter 16 h inkubation ved 29 ° C. (B) antallet af syntetisk ΦΧ174 og T7 phages som en funktion af magnesium-glutamat koncentration i celle-fri reaktion, målt efter 16 h inkubation ved 29 ° C. (C) det antal syntetiserede ΦΧ174 phage som funktion af ΦΧ174 DNA genom koncentration i celle-fri reaktionen, målt efter 16 h inkubation ved 29 ° C. (D) antallet af syntetiserede T7 phage som en funktion af T7 DNA genom koncentration i celle-fri reaktion, målt efter 16 h inkubation ved 29 ° C. Alle fejllinjer vises er standardafvigelser af tre gentagne forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1: reaktion sammensætning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efter teknik i Chen, et al. 14 for SPMC, en kritisk trin er nået ved fastsættelsen af de rette betingelser for superinfektion. Den parameter, der mest tæt styrer en vært stamme evne til at modstå superinfektion er ofte den oprindelige koncentration af det inficerer phage. Værtsceller skal være i logaritmisk vækstfase før første infektion med en meget lille mængde af phage. Til sidst, phage vil også nå logaritmisk vækst og målet er at tillade phage numre til hurtigt overgå celletal, giver mulighed for flere kopier af phage i hver vært celle. Dette tvinger cellen i en kvasi stabil tilstand, hvor det ikke vil gennemgå lysering. Hvis denne stat ikke er nået, vil cellerne gennemgå overlappende, sammenflydende lysis og frigive deres viral belastning. Hvis superinfektion ikke kan nås ved hjælp af de ovenfor indledende virale koncentrationer, sænke den oprindelige mangfoldighed af infektion med en faktor ti inden du foretager en efterfølgende forsøg. Hvis værtsceller lyse før høst og superinfektion ikke er nået, Fortsæt straks med en særskilt rensning procedure. Tilføje DNase I til 5 µg/mL og 500 µL CHCl3 at færdiggøre alle cellulære lysering. Fortsat swirl for en yderligere 5 min og derefter centrifugeres ved 10.000 x g fjerne celleaffald. Dekanteres og centrifugeres supernatanten ved 75.000 x g i 1-2 h til pellet phage og resuspend natten over i 1 mL total 1 x TM buffer ved 4 ° C uden rystelser. Når du tester for superinfektion ved hjælp af en lille mængde af celler, er det muligt at måle hvor tæt celler til lysering af hvor hurtigt de lyse når udsættes for den ekstra chloroform. Hvis cellerne lyse og løsningen præciserer næsten øjeblikkeligt, cellevægge er meget ustabile og celler bør høstes straks for at undgå storstilet cascade lysering. Hvis testen lyses indenfor 1-3 min, kan de større mængder fortsætte til superinfect i op til 2 timer, afhængigt af den lokale stamme af E. coli i brug. Hvis cellerne ikke lyse i 5 min, phage vækst har ikke fanget op til E. coli vækst og primære inkubation bør fortsætte. Udfør testen igen i 30-60 min.

Når rensende phage på en rede saccharose gradient, vil phage fremstå som en meget tyk, pearlescent band mellem en tredjedel og to tredjedele af vejen ned i røret. Antager en relativt vellykket lysis og cellulære rest rensning skridt, kan der være andre, lette bands men ingen lignende tæthed eller størrelse. Den store, uigennemsigtig band indeholder phage og skal fjernes fra løsningen med en steril sprøjte og en stump kanyle.

Når du starter den tredje del af protokollen, celle-fri reaktion og phage titer, er det bedst at bruge friske kultur plader (mindre end en uge gammel) nemlig vært bakterier plade (fra trin 3.5) samt kultur plader anvendes til titer analyse (fra trin 3,21). Dette vil fremme stærkere vækst af bakterier værtsceller og højere infektion effektivitet for phage titer. Phage kultur plader skal pre inkuberes ved 37 ° C i mindst 1 time før start phage titer del af protokollen. Uden præ-inkubation af phage kultur plader, vil top-agar løsning (indeholdende den syntetiserede phage og vært cellekultur) ikke administrationsprocedurerne distribueres over hele overfladen af kultur plade. I stedet, top-agar løsning vil administrationsprocedurerne størkne på overfladen (figur 2b). Dette øger sandsynligheden for flere phages lokalisering i det samme sted, som kan forårsage en undervurderer phage udbyttesats i celle-fri reaktion.

Hver plaque repræsenterer i tilfælde af en syntetiseret phage inficere en vært celle, replikerende inden for cellen vært, og lysing vært-cellen. Plaques vokse i størrelse under inkubationstiden fra de afkom phage inficerer nabo værtsceller fra den initiale infektion begivenhed. Hvis ingen plaques overholdes, er det muligt at fortyndingsfaktoren i protokollen afsnit 4.6 er for høj, hvilket resulterer i en lav sandsynlighed for at enhver syntetiserede phage inficerer en vært celle. For at afhjælpe dette, mindske fortyndingsfaktoren ved 3-4 ordrer størrelsesorden (eller efter behov) og Gentag titer eksperiment. Omvendt er kunne fortyndingsfaktoren være for høj, resulterer i plaques spænder over hele overfladen af kultur plade, hvilket gør det umuligt at tælle phage udbytte. I dette tilfælde øge fortyndingsfaktoren ved 3-4 ordrer størrelsesorden (eller efter behov). For en vel karakteriseret phage, udbyttet af den celle-fri reaktion vil være kendt og kun én fortyndingsfaktoren pr. reaktion vil være nødvendigt for titer eksperiment. Når kendetegner et nyt fag, er det bedst at inkludere 2-3 forskellige fortynding faktorer pr. reaktion, at sikre, at en af Fortyndingerne vil give en tællelig plaque (Se figur 3 for forskelle mellem en tællelig og utallige antallet af plaques på en plade).

Hvis ingen plaque er observeret efter modificerer fortyndingsfaktoren af phage titer, kunne dette indikere, at den celle-fri reaktion var mislykket, Gen-ekspression ikke forekomme. En mulig forklaring på dette kunne være strukturelle skader af reagenser/phage DNA på grund af homogenisering af celle-fri reaktion af vortexing. For at afhjælpe dette problem, gentage reaktionen og homogeniseres ved forsigtigt at trykke reaktion tube fem til syv gange med en finger, eller ved at langsomt blande reaktion med en pipette fem til syv gange.

Celle-fri reaktion systemet stammer fra E. coli og indeholder endogent både E. coli RNA polymerase og den primære sigma faktor, sigma 70, som kombineres for at danne holoenzym nødvendigt at anerkende primær fredsskaber konsensussen sekvenser af gener, E. coli . Derudover kan celle-fri reaktion system sammenfatte hele sigma faktor transskription ordning af eksogent leverer seks andre E. coli sigma faktor gener under promotor konsensus sekvens af sigma 70. Dette giver mulighed for at syntetisere alle Bakteriofager hvis genomer er kompatibel med E. coliomskrivning/oversættelse maskiner. Dette udelader et undersæt af bacteriophage, der ikke undersøgt eller syntetiseret med celle-fri reaktion systemet udnyttes her.

Celle-fri omskrivning/oversættelse platform giver et imponerende niveau af kontrol og fleksibilitet af reaktionsbetingelser i forhold til i vivo metoder til undersøgelse. Vi kan fint tune mange biokemiske og genetiske komponenter af en phage reaktion og direkte observere effekterne i mindre end 24 timer, som vist i figur 4 for Molekylær fortrængning. Virkningerne af molekylære crowders, sådan som PIND på den samlesæt af makromolekylære komplekser har været teoretisk beskrevet og dokumenteret i vitro18,19,20. Molekylær fortrængning er en entropi drevet mekanisme, der øger association konstant af store biomolekylære strukturer. Den celle-fri tilgang gør det muligt for forskeren at sonde komplicerede biologiske processer som Biofysik af samlesæt med modelsystemer, ligesom Bakteriofager, uden de iboende begrænsninger i vivo arbejde.

Denne platform giver også mulighed for undersøgelse af nytten af phages i anvendte felter. Komponenter af phage genomer kan repurposed og hurtigt testet i en celle-fri reaktion system med mål at integrere resultater til romanen nanostrukturer. Bakteriofager kan ændres for at øge selektiviteten af vært celle infektion, som vil fremme nytten af phage terapi som et alternativ til antibiotika-resistente bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer den følgende konkurrerende finansielle interest(s): Noireaux laboratoriet modtager forskningsmidler fra MYcroarray, en forhandler af MYtxtl celle-fri protein udtryk kit.

Acknowledgements

Dette materiale er baseret på arbejde støttet af Office of Naval Research award nummer N00014-13-1-0074 (til V.N.), Human Frontier Science Program giver nummer RGP0037/2015 (til V.N.), og binationale Science Foundation giver 2014400 (til V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1, (1), 29-41 (2012).
  5. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. (2015).
  6. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
  7. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (22), 12672-12677 (2003).
  8. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3, (6), 387-397 (2014).
  9. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. (2015).
  10. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1, (9), 408-413 (2012).
  11. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. (2016).
  12. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106, (4), 048104 (2011).
  13. Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7, (3), 638-641 (2007).
  14. Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69, (4), 2119-2125 (1995).
  15. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  16. Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. (2010).
  17. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58, (1), 40-43 (2015).
  18. Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).
  19. Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10, (1), 34-39 (2000).
  20. Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics