ヒト NK 細胞活性の評価の流れのフローサイトメトリーを用いた細胞毒性の試金

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Immunology and Infection

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Summary

流れ cytometry ベースの人間のナチュラル キラー細胞の細胞傷害活性を定量的に決定する方法を示しています。

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Kandarian, F., Sunga, G. M., Arango-Saenz, D., Rossetti, M. A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. J. Vis. Exp. (126), e56191, doi:10.3791/56191 (2017).

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Abstract

自然免疫系のエフェクター リンパ球のナチュラル キラー (NK) 細胞として知られている重要な役割宿主防御において異常な細胞、特に腫瘍を排除し、ウイルス感染細胞に対する。他の病理学の条件のホストとともに、約 30 知られているイネの欠陥では、機能または古典的な NK 細胞欠乏症を引き起こす、けんしょうの減少や細胞傷害活性を欠席します。歴史的には、細胞毒性を面倒な高価な潜在的に有害である放射性の方法で調べた。この資料では、合理化された、臨床応用可能な流れ cytometry ベースの NK 細胞の細胞傷害活性を定量化する方法について説明します。この分析では、末梢血単核球 (PBMCs) または NK 細胞純化は、異なる比率で共存培養 NK 細胞性細胞毒性 (NKCC) に敏感であると知られているターゲット腫瘍細胞株。標的細胞はエフェクター細胞 (NK 細胞) から差別を許可する蛍光色素をあらかじめラベルを。潜伏期間後殺された標的細胞は、死んだ細胞に浸透する具体的には核酸の汚れによって識別されます。このメソッドは、診断や研究用途との両方、フローサイトメトリーのマルチパラ メーター機能のおかげで影響を受けやすい可能性のある NK 細胞の表現型と機能のより深い分析を可能にする利点があります。

Introduction

ナチュラル キラー (NK) 細胞は、人間の生得的なリンパ球批判的に他の病原性の脅威1,2トランス ホーム細胞、ウイルス感染細胞の排除に関与の洗練されたサブセットです。NK 細胞溶解顆粒細胞傷害性タンパク質、パーフォリンなど granzymes の家します。起動時に、NK 細胞は直接ターゲット セル換散とサイトカインとケモカインの放出とともにアポトーシスの結果これらの細胞傷害性の分子がリリースされたローカルという免疫学のシナプスと呼ばれる、ターゲットとの複雑な相互作用を形成し、最終的に、炎症の誘導で1,3,4の状態します。

NK 細胞の活性化を含む複雑な文字列を活性化と抑制相互 NK 細胞受容体とリガンドの堅く調整されたシステムの形成、標的細胞の表面に発現します。NK 細胞の活性化の最も研究のメカニズムの 1 つは、「行方不明自己」です。確かに組織適合性の複雑な (MHC)、または人間の白血球の抗原 (HLA) 分子を主要なクラスの検出の欠如感染または細胞トリガー NK 細胞障害活性を変換します。腫瘍、ウイルス感染細胞レセプター一般的に NK になる T 細胞性免疫能を脱出するこれらの抗原細胞ターゲット1,3,4

NK 細胞機能の評価は主に脱顆粒や細胞毒性に分類の試金。ただし、脱顆粒関連マーカー CD107a の流れフローサイトメトリー検出などの脱顆粒の試金は NK 細胞の活性化とそれらの究極の機能は、ターゲット セル5,6,7,8の直接の殺害を示すのみ。したがって、この制限は細胞毒性の試金に指示しより直接的代替として調査官を集めています。

長年「ゴールド スタンダード」T および NK 細胞の細胞媒介性細胞傷害活性を評価するため、クロム リリース試金 (CRA)。CRA は、放射能によって51Cr を用いた標的細胞のラベリングとエフェクター細胞にそれらをインキュベート共同に含まれます。この試金は蛋白質バインド51Cr 培養上清をガンマを数えることで測定することができますリリースでそのセル換散の結果主義が染み込んでください。効果的、このアッセイはさまざまな理由のため問題となる: 困難な標準化 - ことが全体で非現実的な9,10 51Cr の自発的なリリースと放射性51Cr の処分処理高材料費。

非放射性アッセイ、蛍光標識、酵素リリースも生物発光などの数から、CRA 111412,13,,に代わるものとして開発されています。ここで NK 細胞細胞毒性活性 K562 標的細胞に簡単な敏感なと再現性のある測定用フロー フローサイトメトリーを用いた手法について述べる。K562 細胞は、人間 erythroleukemic セル HLA クラスの発現低下と私と NK 細胞媒介性細胞傷害15に特に敏感になる賦活の NK の受容器のための ligands の高められた表現です。このアッセイ K562 細胞 carboxyfluorescein ジアセテート サクシニミジルエステル (CFSE) があらかじめ付いていますいずれか末梢血単核球 (Pbmc) の様々 な比率で共培養や NK 細胞1を精製しました。CFSE はエフェクター NK 細胞16,17から標的細胞の判別ができる安定した、蛋白結合蛍光染料です。共培養後核酸染色、特に死んだ細胞の膜を浸透、殺された標的細胞 (材料の表を参照) を識別するために使用されます。流れの cytometer 死者 (すなわち、汚れ +) の割合を決定するために、サンプルを集録し、CFSE + 標的細胞。

この試金は、機能やクラシックの NK 細胞の欠乏を引き起こす約 30 の既知の欠陥がある NK 細胞コンパートメントに影響を与えるイネの欠陥、プライマリまたはセカンダリの血球貪食症候群、ルーチンの診断スクリーニングとして使用できます。また、再発、重度のヘルペス ウイルス感染症、造血幹細胞移植またはポスト免疫調節療法18,1920、次免疫再構築を評価するための基本的な研究アプリケーションのホストのため患者の NK 細胞活性を調査することをお勧めします。

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Representative Results

アッセイをセットアップする前に NK 細胞内容が好みのエフェクター人口で評価されることを強くお勧めします。図 1は、典型的な CD56 染色 (ライトブルー) の前に示しています (赤) NK 細胞濃縮後。NK 細胞は、PBMCs の最大 15% を占めるし、濃縮後の少なくとも 80% 純粋なべきであります。

このアッセイのフローサイトメトリーによる解析を含む 2 つのパラメーターの検出: CFSE、FITC; と同じチャネルの検出死んだ細胞の染色、APC (図 2 a、B) と同じチャネルで検出。データ集録、データを分析する図 2のゲートの戦略が使用されます。死者 (すなわち、死んだ細胞染色 +) K562 標的細胞はターゲット人口の内で殺された細胞の % を提供する CFSE + 人口のうちゲートが。

制御条件自体と、個別のコンポーネントに分析の有効性を確保する上で重要であります。有効と見なされる試金のための順序で次の制御条件 (6-8) に期待されるべき: ターゲットセルの間のみ (条件6) 細胞死になります < 15% (図 3 a)。エフェクター細胞のみ (条件7)、および細胞死であるべき CFSE 信号を検出する必要があります < 5% (図 3 b)。トゥイーンを介した標的細胞 (の状態8) の殺害、細胞死がする必要があります > 85% (図 3)。

ほとんどの殺害の活動が低下している NK 細胞機能の欠陥を有する患者を予想またはすべての比は、健康な人と比較してテストします。健康なドナーと図 4の患者細胞の並列は、エフェクター ターゲット細胞比率の減少ターゲット細胞死における差分、大幅に削減を示しています。

Figure 1
図 1: NK エフェクター集団内でセルの内容の評価します。染色後の代表的なヒストグラム PBMCs (水色) を合計または CD56 の NK 細胞 (赤) を精製しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 標的細胞の検出のための戦略をゲーティングしますA) FITC/SSC-A プロットの最初のゲートを設定。K562 細胞は、CFSE + イベントとしてゲートです。B)死んだ K562 細胞 (すなわち、死んだ細胞の陽性染色) CFSE + ターゲット細胞集団内で後続の APC/SSC-A プロットとしているゲートします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 代表的なデータの条件を制御しますA)率死んだ細胞染色 + K562 細胞 CFSE + ゲート (図 2のように戦略をゲート) 内条件6 (ターゲット セルのみ) - ネガティブ コントロール K562 細胞死の。B) CFSE と死んだ細胞を染色条件7の検出 (エフェクター細胞のみ - 合計 PBMCs)。C)率死んだ細胞染色 + K562 細胞 CFSE + ゲート (図 2のように戦略をゲート) 内条件8 (ターゲット セル + トゥイーン) - 肯定的な制御 K562 細胞死の。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: さまざまなエフェクター ターゲット細胞比率の希釈効果の代表的なデータです。テスト ターゲット: エフェクター細胞比は次のとおりです: 50 分の 1、25: 1;12.5: 1;6.25:1. データは背景 (条件 #6)-削除します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

サンプル 条件 エフェクター (E): ターゲット (T)
PBMCs 1 - NK 細胞障害活性の肯定的な制御 50:1 + IL-2
2 50:1
3 25:1
4 12.5: 1
5 6.25: 1
6 T のみ
7 - K562 死ネガティブ コントロール E のみ
8 - K562 死肯定的な制御 T + トゥイーン
NK 細胞 (精製) 1 - NK 細胞障害活性の肯定的な制御 5:1 + IL-2
2 5:1
3 2.5: 1
4 1.25: 1
5 0.625: 1
6 T のみ
7 - K562 死ネガティブ コントロール E のみ
8 - K562 死肯定的な制御 T + トゥイーン

テーブル 1

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Discussion

ここで説明したメソッドは、NK 細胞の細胞傷害活性を評価するために伝統的な51Cr リリース試金する簡単かつコスト効果の高い代替手段を提供します。このメソッドは、機密性の高い、再現と CRA のような前の標準的な方法より手間がかからずと臨床の両方に使用できます、アプリケーションを研究します。

アッセイ作品合計 PBMCs と濃縮の NK 細胞は、細胞集団を浄化するために必要とせず PBMCs を使用するオプションは、患者のサンプルから収集した血液またはいくつかまたは貧しい品質のセルの小さなボリュームを扱う大きなメリットです。この試金は、CFSE と死んだ細胞排除性汚れのみを利用しています。これらの 2 つのパラメーターだけを見て診断を目的として、さらにフローサイトメトリー解析における補償を必要としないという利点を簡潔かつ十分な情報を提供します。

このメソッドは、基本的な NK 細胞生物学を研究し、新規 NK 細胞標的療法をテストにも使用できます。この点では、流れの cytometers の拡大機能は、このアッセイは、NK 細胞と活性多項目分析のない CRA のような試金で実現されていたことに汎用性の非常に貴重な要素をご紹介します。研究者のニーズに合わせて代替細胞トラッキングと生存率染料は、他のチャネルで蛍光剤があります。

このプロトコルは、原型の NK 細胞ターゲット細胞 k562 の使用に最適です。ただし、それは HL 60、Daudi、U937 らじおなどの NK 細胞活性に対する感度の度合いと代替懸濁液ターゲット細胞ラインに合わせることができます。この点では、異なると各流れの cytometer 細胞が蛍光ラベルをかかる場合があります、蛍光色素とターゲット細胞ラベリングに使用する血清の濃度を各ターゲット セル行用に最適化するして必要がありますに注意する重要です。通常、ラベル付け中に血清を使用して避けるためにお勧めしますが、我々 は 2 つの理由の FBS の 0.5% とわずかな焼入れを選びました。最初に、ターゲット セル ストレスを減らす、従って背景を汚す;第二に、それは従って測定の再現性を助ける日常の設定の調整を必要とせず CFSE 信号の流れの cytometer の検出の適切な範囲内をもたらします。追加議定書のバリエーションは、異なる E:T 比と異なる活性化条件にアッセイを適応するインキュベーション時間のテストなどがあります。長期間自然放出の増加9,16が発生する傾向にあるものの、エフェクターと NK 細胞毒性をテストに標的細胞の共培養の期間が歴史的に 4-16 h からであった。私たちのメソッドで長い潜伏も失われる可能性殺害または増殖による標的細胞によってラベリングのこれらの蛍光染料は細胞分裂時に希釈したよう。つまり、タイム ウィンドウの下端に孵化が一般に好ましい、一晩培養6,16,22を超えない。

変数このアッセイの結果を及ぼしますノートを取ることが重要です。私たちの経験では、K562 標的細胞が温度変化に特に敏感です。したがって、K562 細胞ないする冷蔵しますが、むしろ室温で保管か、使用前に 37 ° C で加湿 CO2インキュベーターに配置されます。同じ理由で、プロトコルに記載されているすべての試薬を適切な温度にくるべきだった。これらの細胞に影響を与える別のパラメーターは遠心分離の速度は、細胞ストレスを最小限に抑えるために減るべきであります。また、エフェクター/ターゲットの作製と 30 分以内に共培養開始までのタイムラグを制限する最大の殺害の活動を確保し、アッセイの再現性に不可欠です。同様に、CFSE 信号は一般的に堅牢なので、正確な分注、セルと正確な潜伏の適切な混合時ラベリングと焼入れ、染色の整合性を確保することが重要です。最後に、NK 細胞の細胞傷害性機能は健常者にも非常に多様し、発達段階、性別、年齢、重量23,24,などの要因の数に影響されます25 。さらを健常者の 30% に大幅に削減や細胞機能の完全な損失場合表示採血後 24 時間以上のテストします。したがって、それは新鮮な精製使用 PBMCs または NK 細胞を可能な限り勧め。

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Disclosures

著者は経済的利害関係の競合を宣言しません。

Acknowledgments

私たちは彼女については原稿を準備するジル ナルシソ、UCLA 免疫遺伝学センターを感謝したいです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate-buffered Saline (1x, w/o Ca2+ and Mg2+) Corning (Cellgro) 21-040-CM
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02
Tween-20 Sigma BP337-100
RPMI 1640 Media Corning (Cellgro) 10-040-CV
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Omega Scientific FB-02
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140-163 Stock solution at 10,000 U/mL
IL-2 R&D Systems 202-IL-050 Lyophilized from a 0.2 μm filtered solution in Acetonitrile and TFA with BSA as a carrier protein. Reconstitute with 500 ul at 100 μg/mL in sterile 100 mM Acetic Acid containing at least 0.1% bovine serum albumin (2.1x10E6 IU/ml)
K562 Cells ATCC CCL-243 Cancer cell line 
T-75 cell culture flasks Corning 431464
CFSE cell proliferation kit Life Technologies (CellTrace) C34554 Reconstitute I vial with 18 ul DMSO to prepare a 5mM stock solution. Do not freeze/thaw.
Sytox Red Life Technologies S34859 Stock solution is provided at 5 μM in 1 mL DMSO. The DMSO solution may be subjected to multiple freeze-thaw cycles without reagent degradation.
Sodium/lithium heparin blood collection tubes BD 02-687-95
U-bottom 96-well plate Corning CLS3897
Serological pipettes BD Falcon
Polystyrene round-bottom tubes (5mL) BD Falcon 14959-5
50 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352070
15 mL polypropylene conical tube BD Falcon 352097
Reagent reservoir USA Scientific 2321-2230
Human NK cell enrichment cocktail StemCell Technologies (RosetteSep) 15065

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 09/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity.  Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was corrected from:

Figure 4

to:

Figure 4

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