डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि परख का उपयोग कर के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए visualized द्वारा Acrylamide जेल ट्रो

Biochemistry

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Summary

इस प्रोटोकॉल के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट जेल ट्रो और जेल इमेजिंग का उपयोग डीएनए का लेबल के लिए परिवर्तन के अवलोकन के माध्यम से संशोधित डीएनए के डीएनए पोलीमरेज़ संश्लेषण के लक्षण वर्णन । Acrylamide जैल छोटे न्यूक्लिक एसिड, जो आकार के आधार पर अलग दरों पर स्थानांतरित की जुदाई के उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाता है ।

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Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

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Abstract

किसी भी एंजाइम के लिए, मजबूत, मात्रात्मक तरीकों दोनों देशी और इंजीनियर एंजाइमों के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक हैं । डीएनए polymerases के लिए, डीएनए संश्लेषण polyacrylamide जेल ट्रो के बाद एक में इन विट्रो डीएनए संश्लेषण परख का उपयोग कर विशेषता हो सकती है । इस परख के लक्ष्य को दोनों प्राकृतिक डीएनए और संशोधित डीएनए (एम-डीएनए) के संश्लेषण मात्रा में है । ये दृष्टिकोण एक न्यूक्लियोटाइड संकल्प के साथ oligonucleotides को हल करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं, एंजाइमी oligonucleotide संश्लेषण के दौरान व्यक्तिगत चरणों के अवलोकन को सक्षम करने. इन तरीकों में जैव रासायनिक और भौतिक गुणों की एक सरणी के मूल्यांकन के लिए लागू किया गया है जैसे स्थिर-राज्य दर डीएनए संश्लेषण के व्यक्तिगत कदम के निरंतर की माप, डीएनए संश्लेषण की त्रुटि दर, और डीएनए बंधन संबध । सहित संशोधित घटकों का उपयोग करके, लेकिन तक ही सीमित नहीं, संशोधित nucleoside triphosphates (NTP), एम डीएनए, और/या उत्परिवर्ती डीएनए polymerases, सब्सट्रेट-डीएनए पोलीमरेज़ जोड़े के सापेक्ष उपयोगिता प्रभावी ढंग से मूल्यांकन किया जा सकता है । यहां, हम विस्तार से परख ही, परिवर्तन है कि इस तरह के निकट अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल डीएनए के रूप में गैर पारंपरिक प्राइमर डीएनए लेबलिंग रणनीतियों को समायोजित किया जाना चाहिए शामिल है । इसके अतिरिक्त, हम acrylamide जेल घनघोर और चल रहा है, जो अक्सर तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है के लिए महत्वपूर्ण तकनीकी कदम विस्तृत है ।

Introduction

डीएनए polymerases सटीक और कुशल डीएनए संश्लेषण प्रदर्शन और जीनोम अखंडता बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं । त्रुटियां बनाने के बिना प्रति सेकंड न्यूक्लियोटाइड के सैकड़ों संश्लेषित करने की क्षमता भी डीएनए polymerases आणविक जीवविज्ञान और जैव प्रौद्योगिकी में आवश्यक उपकरण बनाता है । हालांकि, इन गुणों को भी एम डीएनए सब्सट्रेट के लिए आवेदनों की सीमा; सामांयतया, प्राकृतिक डीएनए polymerases कई संभावित मूल्यवान एम-डीएनए सब्सट्रेट को संश्लेषित नहीं कर सकता, जिसकी वजह से vivo मेंगैर-मानक सब्सट्रेट का उपयोग करने के खिलाफ उच्च चयनात्मक दबाव की संभावना है । कई समूहों के उत्परिवर्ती डीएनए polymerases में सक्षम एम डीएनए संश्लेषण1ए,2,3,4,5, उत्पन्न करने के लिए निर्देशित विकास दृष्टिकोण विकसित किया है; इन प्रयासों में डीएनए6,7,8की तकनीकी उपयोगिता का विस्तार किया गया है ।

एम-डीएनए संश्लेषित करने के लिए उत्परिवर्ती डीएनए polymerases की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हम9,10, और अन्य11,12,13 आम तौर पर इन विट्रो में डीएनए की माप का उपयोग पोलीमरेज़ गतिविधि, जो इस पांडुलिपि में वर्णित हैं । इन प्रयोगों में, डीएनए polymerases एक लेबल प्राइमर/टेंपलेट द्वैध और nucleoside ट्राइफॉस्फेट सब्सट्रेट के साथ सह-मशीन हैं; उत्पादों जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन कर रहे हैं । विशिष्ट प्रयोगात्मक सवाल पर निर्भर करता है, उत्परिवर्ती डीएनए polymerases, संशोधित प्राइमरों, संशोधित टेंपलेट्स, या संशोधित nucleoside triphosphates इस्तेमाल किया जा सकता है, उत्परिवर्ती एंजाइम गतिविधि के व्यवस्थित जैव रासायनिक मूल्यांकन को सक्षम करने से ।

ऐतिहासिक, इन परख एक 5 ' रेडियोधर्मी लेबल पर भरोसा किया है डीएनए संश्लेषण ट्रैक; सबसे अधिक, ३२p और ३३p का उपयोग किया गया है; विशेष रूप से, लेबल टी-4 polynucleotide कळेनासे11का उपयोग कर हासिल की है । हालांकि, परिमित जीवनकाल और रेडियोधर्मी लेबल और उनके सुरक्षित निपटान के अपेक्षाकृत उच्च लागत के कारण, हमारे समूह के बजाय एक सिंथेटिक 5 ' के पास अवरक्त fluorophore लेबल डीएनए का उपयोग करता है । एक अपेक्षाकृत कम लागत के पास अवरक्त जेल imager का प्रयोग, हम पहले रेडियोधर्मी लेबल (अप्रकाशित परिणाम) का उपयोग कर अध्ययन करने के लिए इसी तरह का पता लगाने की सीमा मनाया है । हम सफलतापूर्वक पिछले प्रेक्षणों9reproduced है, और हम पहले से मापा दर स्थिरांक (अप्रकाशित परिणाम) के साथ किसी भी बड़े मात्रात्मक अंतर नहीं देखा है ।

डीएनए के आकार का विश्लेषण करने के लिए, और इस प्रकार, डीएनए संश्लेषण की हद तक, हम polyacrylamide जेल ट्रो विधियों पर निर्भर करते हैं मूल रूप से केशिका ट्रो15के आगमन से पहले14 सैंज अनुक्रमण के लिए विकसित. जुदाई या गतिशीलता की दूरी आणविक वजन की एक माप के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता; बड़े प्रारूप, ऊर्ध्वाधर polyacrylamide जैल एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प को प्राप्त करने, लंबाई बदलती के डीएनए oligonucleotides के मात्रात्मक अवलोकन को सक्षम कर सकते हैं ।

सामूहिक रूप से, इन प्रयोगों पोलीमरेज़ लक्षण वर्णन के लिए एक मजबूत तरीका है । प्रतिक्रियाओं के समय संवेदनशील प्रकृति के कारण, तैयारी और देखभाल प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, जबकि acrylamide जेल डीएनए संश्लेषण को मापने के लिए एक बहुत प्रभावी तरीका है, साथ ही कई अन्य डीएनए संशोधित प्रतिक्रियाओं, एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प के साथ, यह तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यहां प्रोटोकॉल उम्मीद है कि सबसे आम गलतियों से परहेज करते हुए इन प्रयोगों को करने के लिए उपयोगकर्ताओं को सक्षम हो जाएगा.

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. गतिविधि परख

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: वहां दो परख है कि अक्सर डीएनए polymerases विशेषताएं यहां वर्णित तरीकों का उपयोग कर रहे है चलाने के ठेठ प्रकार हैं । वे गुणात्मक रूप से समग्र संश्लेषण (डीएनए संश्लेषण के कई कदम शामिल) या वे मात्रात्मक व्यक्तिगत चरणों पर ध्यान केंद्रित है कि क्या में अलग है । हम नीचे इनमें से प्रत्येक के लिए आवश्यक कदम का वर्णन ।
नोट: क्योंकि सामग्री के विधानसभा अपेक्षाकृत जटिल हैं, समय के लिए संवेदनशील प्रयोगों के लिए, हम अनुशंसा करते हैं कि सभी सामग्री पहले से इकट्ठा कर रहे हैं. परख के सभी महत्वपूर्ण घटकों के व्यंजनों के नीचे सूचीबद्ध हैं । घटकों के लिए वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं तालिका में सूचीबद्ध है सामग्री .

  1. 10x एस एफ बफर recipe (10x SFB)
    नोट: हमारे परख में, हम आम तौर पर पोलीमरेज़ थरमस aquaticus, आमतौर पर टुकड़ा (एस एफ) के रूप में जाना के डीएनए Stoffel के एन टर्मिनल जनचेतना का उपयोग करें < सुप वर्ग = "xref" > १६ , < सुप वर्ग = "xref" > १७ . नुस्खा यहां एस एफ के लिए पसंदीदा बफर है < सुप वर्ग = "xref" > ३ , < सुप वर्ग = "xref" > १३ . अंय बफ़र्स विशिष्ट डीएनए पोलीमरेज़.
    के आधार पर प्रतिस्थापित किया जा सकता है नोट: 10x एस एफ बफर घटकों के अंतिम एकाग्रता ५०० मिमी Tris पीएच ८.५, ६५ मिमी MgCl 2 , ०.५ मिलीग्राम/एमएल BSA, ५०० मिमी KCl (एस), और ultrapure पानी हैं । माप एस एफ बफर के 1 मिलीलीटर, जो पैमाने पर निर्भर करता है 100-200 परख के लिए पर्याप्त है के लिए कर रहे हैं । बफ़र को-20 पर अनिश्चित रूप से संग्रहीत किया जा सकता & #176; C.
    1. गठबंधन ०.५ एमएल के 1 m Tris, ६५ & #181; l के 1 m MgCl 2 , ५० & #181; l की 10 मिलीग्राम/एमएल BSA, और ०.०३७३ जी के KCl (s) एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । Add ३८५ & #181; ultrapure पानी के एल 1 मिलीलीटर के अंतिम खंड तक पहुंचने के लिए
  2. 1x भंडारण बफर नुस्खा (1x SB)
    नोट: अंतिम एकाग्रता 1x बफ़र घटकों के ५० मिमी Tris पीएच ७.५, 1 मिमी डीटीटी, ०.६ mm EDTA, और ५०% ग्लिसरॉल हैं । नुस्खा 1x SB के 20 मिलीलीटर बनाता है ।
    1. गठबंधन ०.०१२ g डीटीटी, १०० & #181; L की ०.५ M EDTA, और Tris बनाने के लिए ५० एमएल शंकु ट्यूब ४० एमएल 2xSB (पीएच १००) की ७.५ मिलीलीटर के साथ भरें । मिश्रण से भंवरा.
    2. एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए 2x SB के 10 मिलीलीटर हस्तांतरण और नए शंकु के लिए 10 मिलीलीटर ग्लिसरॉल जोड़कर ग्लिसरॉल के साथ पतला ।
  3. शमन बफर ऑरेंज (QBO) नुस्खा
    नोट: जब रेडियोधर्मी लेबल का उपयोग किया जाता है, उपयोगकर्ताओं को अक्सर bromophenol प्रगति के लिए एक ट्रैकिंग डाई के रूप में नीले और/ हालांकि, इन रंगों के निकट अवरक्त क्षेत्र में fluoresce कमजोर होगा, डीएनए संकेत के साथ हस्तक्षेप । इस प्रकार, हम उन सभी प्रतिक्रियाओं के लिए उनके स्थान पर नारंगी जी का उपयोग करते हैं, जिनमें नमूने होते हैं. जब तक हम जेल लोडिंग ट्रैकिंग के लिए उपयुक्त होना करने के लिए नारंगी जी मिल गया है, हम ट्रो प्रगति पटरियों कि एक डाई के रूप में कम सुसंगत होना करने के लिए नारंगी जी पाया है; इस प्रकार, हम खाली जेल है कि नमूना शामिल नहीं है के बाहरी गलियों पर bromophenol नीले युक्त गलियों चलाने के क्रम में जेल प्रगति को ट्रैक करने के लिए ।
    1. गठबंधन ९५० & #181; l के ९५% formamide के साथ 25 & #181; l के ०.५ M EDTA, व 25 & #181; l ultrapure जल. ऑरेंज जी डाई (~ 10 मिलीग्राम) के 1 स्कूप जोड़ें । मिश्रण से भंवरा.
      सावधानी: Formamide विषाक्त है; ऐसे दस्ताने, चश्मा और लैब कोट के रूप में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनते हैं, और खतरनाक कचरे के रूप में निपटाने ।
< p class = "jove_title" > 2. परख भागो

  1. समग्र गतिविधि के गुणात्मक लक्षण
    नोट: इस परख के लिए, हम आम तौर पर एम-NTPs की निरंतर एकाग्रता बनाए रखने और समय बदलती हैं । लक्ष्य के लिए प्रोटीन की समग्र विशेषताओं का मूल्यांकन करने के बजाय किसी भी व्यक्ति के कदम को मापने के लिए है । एक प्रतिक्रिया, दो अलग घटकों के एक बराबर मात्रा तैयार करने के लिए, द्वैध मिश्रण (2.1.1 चरण में वर्णित) और dNTP मिश्रण (चरण 2.1.2 में वर्णित), अलग से तैयार किया जाएगा, और फिर ४९ & #181 की अंतिम मात्रा देने के लिए संयुक्त; L इसके अलावा 1 & #181; L 50x एंजाइम फिर प्रतिक्रिया आरंभ करेगा । चर समय अंक लिया जा सकता है; आमतौर पर, हम 0, 5, 15, और ६० मिनट में बुझाना ।
    1. डीएनए डुप्लेक्स मिक्स की तैयारी
      नोट: द्वैध मिश्रण 10x एस एफ बफर, प्राइमर oligonucleotide, टेंपलेट oligonucleotide, और ultrapure पानी से बना है । प्रत्येक प्रतिक्रिया में जोड़ा गया कुल वॉल्यूम है 25 & #181; l .1 & #181; एंजाइम के एल के तुरंत प्रयोग की दीक्षा से पूर्ववर्ती मास्टर मिश्रण करने के लिए जोड़ दिया जाएगा.
      नोट: हमारे परख के लिए, हम आम तौर पर एक ४५-मेर टेंपलेट और एक 18-मेर या 23-मेर प्राइमर का उपयोग करें । जबकि विभिंन लंबाई के एक नंबर इस्तेमाल किया जा सकता है, हम इस लंबाई का उपयोग करते है क्योंकि उत्पाद (18 न्यूक्लियोटाइड से ४५ न्यूक्लियोटाइड को लेकर) आसानी से वर्णित जेल ट्रो प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक एकल न्यूक्लियोटाइड स्तर पर हल कर रहे हैं । oligonucleotide उत्पादों की लंबाई में वृद्धि के रूप में, यह एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर उत्पादों को हल करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है.
      नोट: हमारे प्रयोगों में, हम एक 5 & #39 का उपयोग करें; प्राइमरी किनारा पर अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई लेबल के पास प्राइमरी उत्पादों का निरीक्षण । हम इस संशोधन असर कस्टम संश्लेषित oligonucleotides खरीद; हालांकि, इस लेबल के बाद सिंथेटिक लेबलिंग रणनीतियों के किसी भी संख्या का उपयोग कर शामिल किया जा सकता है । टेम्पलेट oligonucleotide लेबल नहीं है और इसलिए यह जेल imager का उपयोग करके स्वीकार्य नहीं है । दोनों oligonucleotides के लिए, हम oligonucleotides पर १०० & #181; M में 10 mm Tris (pH 8), 1 mm EDTA.
      स्टोर नोट: क्योंकि हम केवल किताब देख रहे हैं, एक दो टेंपलेट के अतिरिक्त गुना को सुनिश्चित करना है कि सभी प्राइमरों (डीएनए प्रजातियों मनाया जा रहा है) टेंपलेट के लिए annealed है प्रयोग किया जाता है । इस प्रतिक्रिया में अंतिम द्वैध एकाग्रता ४० एनएम है ।
      नोट: के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक अक्सर कुछ हद तक प्रकाश संवेदनशील हैं; जब संभव हो, हम किताब को कवर (और किसी भी समाधान प्राइमर युक्त) पंनी के साथ । यह polyacrylamide जेल जबकि यह चल रहा है शामिल हैं ।
      नोट: नीचे 2 & #39 के संश्लेषण का एक प्रतिनिधि उदाहरण है; च एम-डीएनए.
      1. पतला प्राइमरी 1 और टेम्पलेट 1 (देखें Table of सामग्री अनुक्रम के लिए) to 1 & #181; मी प्रत्येक राज्यात ultrapure पाणी.
      2. प्रत्येक परख प्रतिक्रिया के लिए
      3. , अलग ट्यूबों में, जुडा 5 & #181; l का 10x एस एफ बफर, 2 & #181; l के 1 & #181; मी प्राइमरी 1, 4 & #181; l के 1 & #181; मी टेम्पलेट 1, और 13 & #181; l के एक थर्मल साइकिल चालक के साथ संगत ट्यूबों में ultrapure पानी की.
      4. एनएन एक thermocycler में द्वैध निंनलिखित कार्यक्रम का उपयोग कर: ९८ & #176; ग के लिए 2 मिनट, ७० & #176; ग के लिए 5 मिनट, ५० & #176; ग के लिए 5 मिनट, ४० & #176; ग के लिए 5 मिनट, 25 & #176 पर होल्ड करें; c. विशिष्ट प्रोग्राम प्राइमर के एनीलिंग तापमान के आधार पर भिन्न हो सकते हैं/ आम तौर पर, हम एनीलिंग के तापमान पर, और फिर एक और 5 ंयूनतम कदम एक तापमान 5-10 डिग्री पर एनीलिंग तापमान के नीचे एक 5 ंयूनतम कदम शामिल करने के लिए पसंद करते हैं ।
    2. की तैयारी 2x dNTP मिश्रण
      नोट: प्रयोग के आधार पर, यह चर dNTPs और dNTPs की सांद्रता का उपयोग करने के लिए संभव है । सामांयतया, हम प्रतिक्रिया में ५०-२०० & #181; M का उपयोग करते हैं ।
      1. तैयार एक 25 & #181; L समाधान युक्त १०० & #181; मी प्रत्येक 2 & #39; च-NTP. १०० mM.
      2. पर एम NTPs स्टोर
    3. 50x प्रोटीन कमजोर पड़ने की तैयारी
      नोट: लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए एंजाइम्स को-20 & #176; सी में 1xSB रखा जाना चाहिए । जब से हटा-20 & #176; सी फ्रीजर, एंजाइमों मास्टर मिश्रण के अलावा करने से पहले हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए. एंजाइम कमजोर पड़ने प्रत्येक दिन केंद्रित स्टॉक से ताजा किया जाना चाहिए । केंद्रित एंजाइम स्टॉक-20 & #176; सी फ्रीजर तुरंत उपयोग के बाद लौट जाना चाहिए ।
      ध्यान दें: क्योंकि हम मुख्य रूप से उत्परिवर्ती डीएनए polymerases का मूल्यांकन, हम केवल एंजाइमों कि व्यक्त किया गया है और हमारी प्रयोगशाला में शुद्ध स्थापित तरीकों का उपयोग कर प्रयोग < सुप वर्ग = "xref" > 9 , < सुप वर्ग = "xref" > १० . व्यावसायिक रूप से खरीदी polymerases के लिए, उपयोगकर्ताओं को विभिन्न प्रोटीन के लिए इष्टतम बफ़र्स और यहाँ वर्णित बफ़र्स के साथ उनकी संगतता के लिए सावधान रहना चाहिए.
      नोट: एंजाइम सांद्रता प्रत्येक प्रयोग के लिए भिंन होगा । यहां हम 2 & #39; F-डीएनए संश्लेषण के लिए एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाते हैं ।
      1. एक 10 एनएम एंजाइम समाधान बनाने के लिए, 1 & #181 पतला; एंजाइम int के एलo 1x SB एक 50x अंतिम एंजाइम एकाग्रता बनाने के लिए । 50x समाधान की एकाग्रता ५०० एनएम होना चाहिए । उदाहरण के लिए, यदि स्टॉक एंजाइम एकाग्रता है ५० & #181; M, जोड़ 1 & #181; l stock एंजाइम ते ९९ & #181; l 1x SB.
        नोट: के बाद से एंजाइम आमतौर पर ५०% ग्लिसरॉल में संग्रहित है, समाधान काफी चिपचिपा है । अत्यधिक सटीक पिपेट का उपयोग करने पर भी, हम एंजाइम के कमजोर पड़ने के दौरान सटीकता और परिशुद्धता के महत्व को ध्यान में रखते हुए ०.५ & #181; L से कम pipetting की अनुशंसा नहीं करते हैं ।
    4. दीक्षा की परख
      1. के लिए एक शुष्क स्नान के तापमान सेट ५० & #176; ग.
      2. Add 24 & #181; l की annealed डुप्लेक्स मिक्स (देखें चरण 2.1.1) से 25 & #181; l की 2x dNTPs (देखें step 2.1.2).
      3. निकालें ९.८ & #181; l के मिश्रण के चरण 2.1.4.2 में और 20 & #181 के लिए जोड़; QBO के एल (रेसिपी के लिए धारा १.३ देखें). यह aliquot के रूप में कार्य करता है & #34; न एंजाइम & #34; नियंत्रण और प्रत्येक चलाने के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए ।
      4. Add ०.८ & #181; 50x एंजाइम के एल (step 2.1.3.1) को द्वैध/dNTP मिश्रण को देखें । अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए एक बड़ी मात्रा micropipette के साथ ऊपर और नीचे पिपेट ।
      5. 5, 15, और ६० मिनट के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया समाधान के 10 & #181; l को हटाकर प्रतिक्रिया को बुझाना और 20 & #181 युक्त microcentrifuge ट्यूब से जोड़ना; l QBO (धारा १.३ में वर्णित).
      6. एक बार बुझती है, प्रतिक्रियाओं में पन्ना के तहत संग्रहित किया जा सकता है अनिश्चितकालीन 4 & #176; c या-20 & #176; c.
        नोट: एम-डीएनए संश्लेषण, एक बहुत ही समान परख के व्यक्तिगत कदम के मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए मात्रात्मक Michaelis-मेनटेन मापदंडों को प्राप्त करने के लिए चलाया जा सकता है । यह परख एक ही सामग्री के सभी का उपयोग करता है । Michaelis-मेनटेन पैरामीटर dNTP के लिए मापा जा सकता है; इस मामले में, सबसे महत्वपूर्ण अंतर यह है कि, बजाय dNTP मिश्रण करने के लिए डुप्लेक्स मिश्रण जोड़ने से, यह 2x dNTP समाधान की एक श्रृंखला के लिए एंजाइम के साथ द्वैध मिश्रण कहते हैं । इसी तरह डीएनए डुप्लेक्स के लिए Michaelis-मेनटेन मापदंडों को मापा जा सकता है । विशिष्ट शर्तों को Michaelis-मेनटेन समीकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक मांयताओं को संतुष्ट करने के लिए पूरा किया जाना चाहिए । इन शर्तों, और परख के बुनियादी यांत्रिकी, एक पिछले तरीकों में अच्छी तरह से व्याख्या कर रहे है लेख < सुप वर्ग = "xref" > ११ .
< p class = "jove_title" > 3. gel ट्रो

< p class = "jove_content" > नोट: क्योंकि जेल डालने का समय संवेदनशील है, सभी सामग्रियों को पहले से इकट्ठा कर रहे हैं । परख के सभी महत्वपूर्ण घटकों के व्यंजनों के नीचे सूचीबद्ध हैं; आपूर्तिकर्ताओं सामग्री के तालिका में सूचीबद्ध है .

20% acrylamide जेल के लिए
  1. की तैयारी acrylamide ।
    नोट: यह नुस्खा acrylamide मिश्रण के 1 एल बनाता है; इस समाधान के लगभग १२० मिलीलीटर जेल प्रति प्रयोग किया जाता है । एक वर्ष तक के लिए पन्नी के तहत कमरे के तापमान पर इस समाधान की दुकान ।
    सावधानी: Polyacrylamide neurotoxic है । यह दस्ताने और जेल डालने के सभी कदम के दौरान एक प्रयोगशाला कोट पहनने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि polyacrylamide दस्ताने पर हो जाता है, दस्ताने तुरंत बदलें । यदि acrylamide बहुलक नहीं है, एक लेबल polyacrylamide अपशिष्ट बैग में दूषित सामग्री जगह है ।
    नोट: मिश्रित ४०% acrylamide युक्त ३८.६७% acrylamide और १.३३% बीआईएस-acrylamide के लिए एक मोनोमर के पार से लिंकर अनुपात इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था ।
    1. का वजन 17 ग्राम मिश्रित TBE चूर्ण है । यूरिया के ७० ग्राम (कुल ४२० ग्राम) के छह अलग भाग तौलना ।
      नोट: यूरिया भागों में जोड़ा जाना चाहिए । हम इसे छह भागों में विभाजित करने के लिए सबसे अच्छा लगता है ।
    2. एक हलचल प्लेट पर एक 2 एल प्लास्टिक चोंच सेट । यूरिन के लिए एक सिंगल बड़ी चमचे रॉड डालें । छप रोकने के लिए मिश्रण जब पंनी के साथ चोंच कवर.
    3. में ५०० मिलीलीटर की ४०% acrylamide समाधान जोड़ें । सुनिश्चित करें कि समाधान उभार रहा है ।
    4. पहले तौला-बाहर TBE जोड़ें । यूरिया की एक aliquot जोड़ें । मिश्रण करने के लिए समाधान की अनुमति दें । यूरिया धीरे से घुल और प्रारंभिक इसके अलावा पर धुंधला और सफेद दिखाई दे सकता है । धीरे से अगले एक घंटे के मिश्रण में यूरिया की शेष aliquots जोड़ें । समाधान मिश्रण जब तक यह पूरी तरह से स्पष्ट और बेरंग है चलो ।
      नोट: आमतौर पर, यह रात भर हलचल करने की अनुमति दें । यदि समाधान अभी भी भंग न हो, तो पानी की छोटी aliquots जोड़ें और यूरिया घुल जाने का इंतजार करें ।
    5. यूरिया के अलावा मात्रा में वृद्धि होगी करीब 1 l. मात्रा को ठीक करने के लिए 1 l.
    6. को बढ़ाने के लिए पानी जोड़ें
    7. एक 1 एल रंगा हुआ ग्लास बोतल में स्टोर या एल्यूमीनियम पंनी के साथ कांच की बोतल को कवर किया ।
  2. घनघोर के acrylamide जेल.
    नोट: जब ग्लास प्लेट हैंडलिंग, कांच प्लेटें और किसी भी कठिन सतह के बीच संपर्क से बचने के लिए सावधान रहना । यह किसी न किसी हैंडलिंग में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कांच में छोटे दरारें पैदा कर सकता है; ये दरारें तब तक दिखाई नहीं दे सकती जब तक कि जेल चल न जाए, जो ऊँचे तापमान पर होती है. हम इस अवांछित संपर्क को रोकने के लिए कॉर्क के छल्ले का उपयोग करें ।
    1. स्वच्छ प्लेट्स
      1. अधिग्रहण २ ३३ cm x ४२ cm जेल प्लेट्स, एक पायदान और एक निशाना प्लेट । अलग काग के छल्ले पर प्लेट रखें ।
      2. साबुन और पानी के साथ अच्छी तरह से कुल्ला प्लेटें । सुनिश्चित करें कि वहां कोई साबुन धारियां या जेल स्पॉट पीछे छोड़ दिया है ।
      3. थाली के किस पक्ष के मोती कम पानी के नोट बनाते हैं । इस ओर जेल फेसिंग साइड है.
        नोट: यदि जेल की प्लेट के दूसरी तरफ चला जाता है, यह जेल हस्तांतरण चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं ।
    2. ड्राय प्लेट्स
      1. हर प्लेट के दोनों चेहरों को सुखाने के लिए पेपर टॉवेल का इस्तेमाल करें ।
      2. नाजुक कार्य वाइपर का उपयोग करने के लिए शेष क्षेत्रों शुष्क । जहां टेप लागू किया जाएगा प्लेटों के किनारों पर विशेष ध्यान देना ।
      3. ~ ७०% इथेनॉल के साथ ग्लास प्लेटों कुल्ला, और टास्क वाइपर के साथ पोंछ ।
      4. सुनिश्चित करें कि वहां कोई कागज तौलिया फाइबर या पानी की बूंदों हैं । ये बुलबुले जब जेल डालने के कारण हो सकता है ।
    3. Add स्पेसर्स
      1. अधिग्रहण ०.७५ mm स्पेसर्स. DI पानी के तहत दस्ताने उंगलियों भागो और धीरे दस्ताने उंगलियों के साथ स्पेसर्स गीला.
      2. प्लेस स्पेसर्स पायदान प्लेट के लंबे किनारों के साथ । बाकी प्लेटों पर छप रहे किसी भी पानी को साफ कर लीजिये । सुनिश्चित करें कि स्पेसर कांच की थाली के साथ गठबंधन कर रहे है और किनारे पर लटक नहीं है ।
    4. सील जेल
      1. सूखी दस्ताने पर डाल दिया । नाजुक टास्क वाइपर के साथ फिर से शीशे के किनारों को सुखाएं ।
      2. पायदान वाले प्लेट के ऊपर अनपायदान प्लेट शीर्ष संरेखित करें, और धीरे से नीचे कम एक दूसरे के खिलाफ प्लेटों प्रेस करने के लिए । यह सुनिश्चित करने के लिए पुन: जांचें कि सभी प्लेटों के किनारों को संरेखित किया गया है ।
      3. जेल टेप का उपयोग कर, शीर्ष के अलावा सभी किनारों भर में टेप जगह है । सुनिश्चित करें कि टेप समान रूप से संरेखित है और कसकर सील है । टेप एक प्रस्ताव में लागू किया जा सकता है, या प्रत्येक पक्ष व्यक्तिगत रूप से किया जा सकता है । एक उस्तरा के साथ टेप के सिरों को काट ।
      4. जेल के नीचे करने के लिए टेप की एक अतिरिक्त परत जोड़ें । इस टेप सख्त, कम संभावना जेल जब डालने रिसाव होगा ।
      5. सफेद clamps के साथ ग्लास सैंडविच के पक्षों क्लिप । प्रत्येक पक्ष के लिए 3 क्लिप्स, और नीचे करने के लिए 4 क्लिप्स जोड़ें ।
    5. घनघोर जेल
      1. 10% अमोनियम persulfate सॉल्यूशन (एपीएस) के 3 मिलीलीटर ०.३ ग्राम अमोनियम persulfate को भंग करके कमजोर और ultrapure पानी में 3 मिलीलीटर तक कर लें.
        नोट: ए पी एस के १.२ एमएल प्रति जेल की जरूरत है । इसे बनाने के बाद ट्यूब तारीख । अनुप समाधान 2 सप्ताह में समाप्त हो जाता है, और 4 & #176 पर रखा जाना चाहिए; C.
      2. Transfer १२५ & #181; L के tetramethylethylenediamine (TEMED) को एक अलग microcentrifuge ट्यूब.
        नोट: TEMED विषाक्त है; पीपीई पहनें जैसे दस्ताने, चश्मा और लैब कोट जब भी हैंडलिंग.
      3. प्राप्त एक धारा निकलना बोतल और हटाने का इशारा कीप. एक एेसे सिलेंडर में पानी की १२५ मिलीलीटर बाहर उपाय और बोतल में जोड़ें । एक स्थाई मार्कर के साथ बोतल के बाहर पर पानी के स्तर को चिह्नित करें । पानी को त्यागें । इस संशोधित धार बोतल उचित सफाई के साथ अनिश्चित काल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (नीचे देखें) ।
      4. सिंक के बगल में काग अंगूठी सेट तो वहां एक बार जेल डाल दिया है यह डाला है । थाली सैंडविच यहां रखें । सिंक में एक काग रखो तो वहां एक जगह पर प्लेटों बैठो, जबकि जेल डाला जा रहा है । जेल एक कोण पर ग्लास प्लेट सैंडविच में डाल दिया जाएगा, तो नीचे काग पर आराम करेंगे, जबकि शीर्ष सिंक के किनारे पर आराम करेंगे । यकीन है कि वहां के मामले में इन क्षेत्रों के नीचे पैड polyacrylamide डालना बंद कर रहे हैं ।
      5. प्लेस एपीएस समाधान और TEMED समाधान सिंक के दूसरी ओर, खाली धार बोतल के साथ । प्लेटों के साथ सिंक के किनारे पर कुओं की वांछित संख्या के साथ अच्छी तरह से कंघी रखें । पास के 4 clamps रखो ।
        नोट: कार्यविधि में अगला चरण बहुत समय संवेदी होता है । इन स्टेप्स के जरिए जल्दी आगे बढ़ने के लिए तैयार रहें । polymerizes से पहले प्लेटों के बीच मिश्रण को पाने के लिए सीमित मात्रा में समय होता है । सभी घटकों (micropipettes मात्रा, समाधान, ग्लास प्लेटें सही करने के लिए पूर्व निर्धारित) सावधानी से जितनी जल्दी हो सके जेल डालने के लिए व्यवस्थित कर रहे हैं । एक धीमी बहुलकीकरण वांछित है, तो ए पी एस और TEMED सांद्रता आधा किया जा सकता है; यह, तथापि, एक लंबा बहुलकीकरण समय की आवश्यकता होगी ।
      6. 20% धार बोतल में acrylamide जेल समाधान के लिए चिह्नित बिंदु डालना । चिह्नित लाइन के ऊपर एक छोटे से अधिक जेल समाधान डालो, तो छोटे लीक के मामले में पर्याप्त समाधान है । यह लगभग १२० मिलीलीटर जेल समाधान है ।
      7. Add १२० & #181; l के TEMED और ६०० & #181; ल के अनुप के polyacrylamide जेल समाधान के लिए एक ही समय में धार बोतल में । शीघ्रता से जोड़ें एक अतिरिक्त ६०० & #181; polyacrylamide जेल समाधान के लिए एपीएस के एल.
      8. तेजी से धार बोतल और भंवर टोपी । सिंक में प्लेट सैंडविच प्लेस ।
      9. बहना शुरू
      10. . यह केवल 1-2 मिनट ले जाना चाहिए ताकि बहुलकीकरण से बचने के लिए । धीरे, लेकिन तेजी से, धार बोतल के लिए दबाव तो जेल समाधान समान रूप से बाहर आता है जोड़ें । यदि समाधान अनियमित धार बोतल से spattering शुरू होता है, दबाव जारी तो बोतल फुलाया हो जाता है, और डालना शुरू करते हैं । देखो सुनिश्चित करने के लिए जेल समाधान सभी क्षेत्रों को कवर कर रहा है, और यह पक्षों में से किसी से लीक नहीं है । हवा के बुलबुले को हटाने के लिए, प्लेटों के कोण बदल जाते हैं । बुलबुले शीर्ष पर पॉप जाएगा, और तेजी से चलेंगे अगर कोण खड़ी है । जारी रखने के लिए जब तक समाधान पायदान वाले क्षेत्र के शीर्ष पर पहुंच गया है डालने के लिए, और थोड़ा पायदान किनारे बह निकला है । सभी हवाई बुलबुले निकालें ।
        नोट: अगर प्लेट सैंडविच लीक है, या पर्याप्त जेल समाधान नहीं है और समाधान प्लेटों के ऊपर नहीं पहुंचता है, तो जेल का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता । रुको जब तक जेल बहुलक है, और तदनुसार साफ ।
      11. प्लेट सैंडविच के लिए अच्छी तरह से कंघी जोड़ें । कंघी पर 4 clamps प्लेस नीचे प्रेस और कुओं के भी वितरण के लिए अनुमति देते हैं ।
      12. जल्दी से धार बोतल में शेष जेल समाधान के निपटान में लेबल polyacrylamide अपशिष्ट । DI पानी 2 के साथ धार बोतल बाहर कुल्ला-& #160; 3 बार, धार नोक के माध्यम से ।
        नोट: यह जल्दी से इस सफाई प्रदर्शन करने के लिए धार बोतल में कॉलेस्ट्रॉल से polyacrylamide को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । यदि भी बहुलकीकरण की एक छोटी राशि नोक के भीतर होता है, अगले जेल भी डाला जाएगा धीरे और सफलतापूर्वक नहीं । धारा निकलना बोतल छोड़ें यदि बहुलकीकरण होती है.
  3. चल acrylamide जेल
    1. जबकि जेल बहुलक किया जा रहा है, 1x TBE चल बफर बनाओ । ultrapure पानी के 1 एल में मिश्रित TBE ठोस के 17 जी भंग । TBE के सभी भंग हो जाता है जब तक बफर हिला.
    2. प्लेट सैंडविच से सभी बांधने की मशीन क्लिप निकालें ।
    3. टेप काटने के लिए एक रेजर का उपयोग करें और प्लेट सैंडविच के सभी किनारों से टेप निकालें ।
    4. कांच सतहों से सभी बहुलक जेल साफ । शेष जेल परिमार्जन करने के लिए किनारों के साथ एक रेजर का प्रयोग करें । कागज तौलिए और पानी के साथ प्लेटें पोंछ के रूप में संभव के रूप में ज्यादा polyacrylamide अवशेषों को दूर । अतिरिक्त acrylamide और/या टेप अक्सर जेल ट्रो.
    5. के दौरान जला कर सकते है
    6. को अच्छी तरह से बाहर धक्का से बाहर समान रूप से दोनों पक्षों पर कंघी निकालें ।
    7. एक उस्तरा का उपयोग करने प्लेट सैंडविच के शीर्ष के साथ अतिरिक्त जेल काट । थाली के पायदान किनारे के साथ स्लाइस ।
    8. कुएं में कुल्ला करने और कुएं में मलबा हटाने के लिए एक सिरिंज और डीआई पानी का इस्तेमाल करते हैं । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक अच्छी तरह से पानी से भरा जा सकता है, और अतिरिक्त बहुलक जेल द्वारा अवरुद्ध नहीं है ।
    9. थाली सैंडविच उपकरण में जगह है, इसलिए है कि अब थाली जावक का सामना करना पड़ रहा है, और पायदान स्थान आवक का सामना करना पड़ रहा है ।
    10. क्लिप जोड़ने के लिए थाली सैंडविच और एल्यूमीनियम प्लेट एक साथ उपकरण के साथ क्लिप । थाली के बाहर करने के लिए जोड़ें को बढ़ावा देने के भी चल रहा है ।
    11. TBE बफर जोड़ने के लिए आधार पायदानों को कवर करने के लिए और बस शीर्ष पर कुओं को कवर करने के लिए पर्याप्त है । TBE बफर फ़िल्टर और लगभग 5 जैल के लिए reused किया जा सकता है ।
    12. ५० डब्ल्यू पर जेल ट्रो चलाकर 20 मिनट के लिए
    13. गर्म प्लेटें प्लेटें वार्मिंग के बाद
    14. , कुएं को साफ करें । एक सिरिंज और स्नान में TBE बफर का प्रयोग करें कुओं से शेष बफर साल्ट धार । यह कई बार साफ कुओं सुनिश्चित करने के लिए करते हैं । अगर कुओं को साफ नहीं कर रहे हैं, बैंड मैदान होगा और छवि व्याख्यात्मक नहीं होगा । हालांकि इस समय लेने जा सकता है, हम यह अच्छा डेटा प्राप्त करने के लिए आवश्यक पाया है ।
    15. दोनों ओर बाहरी लेन को, प्लास्टिक 5 & #181; L के ९५% formamide के साथ bromophenol नीला । यह QBO के रूप में एक ही समाधान है, लेकिन नारंगी जी के स्थान पर bromophenol नीले रंग के साथ । यह जहां इमेजिंग के लिए जेल में कटौती करने पर एक दृश्य प्रदान करेगा, और कितनी दूर नीचे डीएनए चला गया है ।
    16. प्रत्येक नमूने के लिए विश्लेषण किया जा करने के लिए (धारा 2.1.1 में उत्पंन), जेल के एक भी अच्छी तरह से 3 & #181; L जोड़ें । सभी नमूनों को लोड करने के बाद, बसने के लिए नमूनों के लिए 1 मिनट प्रतीक्षा करें
    17. दोनों ऊपर और नीचे प्लास्टिक स्नान पर टोपियां डाल दिया । उपकरण के लिए तार अनुलग्न करें । लाल सकारात्मक विद्युत चार्ज इंगित करता है, इसलिए यह नीचे की ओर होना चाहिए ताकि डीएनए नीचे की ओर चलता है ।
    18. एक शक्ति के स्रोत के लिए तार देते है और ५०-५५ डब्ल्यू के लिए सेट लगभग 3 ज के लिए जेल या जब तक bromophenol नीले रंग डाई मोर्चा जेल नीचे कम से 2/3 चला गया है ।
  4. इमेजिंग जेल
    नोट: इस जेल बेहद पतली है और संभाल करने के लिए मुश्किल हो सकता है । महान सावधानी फट और पूरे जेल के नुकसान को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए ।
    नोट: डीएनए लेबल पर निर्भर करता है, यह अलग जेल imagers का उपयोग की आवश्यकता हो सकती है । इस प्रोटोकॉल के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग करता है और नमूनों की इमेजिंग एक जेल imager पर प्रदर्शन किया गया था (सामग्री के तालिका देखें) । प्रोटोकॉल है कि imager के लिए विशेष रूप से लिखा है ।
    1. जब bromophenol नीले रंग के मोर्चे पर चला गया है कम से 2/3 नीचे जेल (~ 28 सेमी), जेल बंद करने से बंद कर दिया जा सकता है बिजली । तंत्र और कॉर्क के छल्ले पर जगह से जेल निकालें ।
    2. एक छोटी कील प्लेट विभाजक के साथ प्लेटों अलग । विभाजक को खींचने के लिए पायदानों के अंदर के कोने पर रखें. सावधानी बरतें और अत्यधिक बल का प्रयोग न करें; यदि बहुत अधिक दबाव लागू किया जाता है तो पायदान टूट सकता है ।
    3. प्लेटों के बीच एक बार सक्शन जारी कर रहे हैं, ध्यान से शीर्ष प्लेट लिफ्ट और जो थाली जेल पर है निर्धारित करते हैं । अगर जेल के नीचे प्लेट पर चिपक जाती है, ऊपर थाली खींच और कॉर्क अंगूठी पर जगह है । अगर जेल शीर्ष प्लेट पर उठाया जा रहा है, धीरे से ले जाएँ और जेल नीचे की थाली के लिए वापस गिर सकता है । अगर जेल में गिरावट नहीं आती है, तो फिर धीरे से मूव करें और जेल के बचे हुए हिस्से को नीचे की प्लेट से खींचकर रखें, और टॉप प्लेट को अलग काग रिंग पर जेल के साथ लगाएं ।
    4. एक बार प्लेट अलग कर रहे हैं, जहां डाई जेल पर है और ऊपर और जेल के नीचे से अतिरिक्त जेल हटाने देखें । आमतौर पर, हमारे निर्माण के साथ, या तो एक 18 या 23 न्यूक्लियोटाइड प्राइमर और एक ४५ न्यूक्लियोटाइड टेम्पलेट का उपयोग कर, वहाँ bromophenol ब्लू डाई सामने और जेल के नीचे के बीच कोई डीएनए है । डाई से खड़ी जेल के शीर्ष करने के लिए कट । डाई और जेल के किनारों के बीच रिक्त स्थान भी डीएनए नहीं है । अंत में, जेल पर अच्छी तरह से अंतरिक्ष के नीचे एक दो इंच काट । जेल के बिल्कुल ऊपर कोई न्यूक्लिक एसिड नहीं होता ।
      नोट: छोटे आकार संभव में जेल काटने यह काफी आसान इमेजिंग डिवाइस पर स्थानांतरित करने के लिए बनाता है । यदि जेल बहुत बड़ा है, यह अधिक स्थानांतरण के दौरान तेजस्वी के लिए अतिसंवेदनशील है । हम अक्सर इमेजिंग करने से पहले जेल ट्रिम कर दीजिए, जब ध्यान नहीं लिया जाता है, तो हम अनुशंसा करते हैं जब प्रासंगिक डेटा के रूप में ट्रिमिंग अत्यधिक सावधानी का उपयोग कर खो सकते हैं । यह जांचने के लिए कि क्या निकाले गए भागों में अतिरिक्त डेटा है, हम अक्सर यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई डेटा खो गया है, जेल के उत्पाद के भाग के अतिरिक्त स्कैन निष्पादित करेगा ।
    5. कोट पानी के साथ जेल बाहर सुखाने को रोकने के लिए ।
    6. imager सतह को साफ
    7. । टास्क वाइपर का प्रयोग, पानी और इथेनॉल के साथ सतह पोंछ । सतह पर पानी की एक पतली कोट जोड़ें जहां जेल रखा जाएगा ।
    8. ने ली-ï.
    9. की गीली सतह पर जेल के वांछित हिस्से को ट्रांसफर कर
    10. धीरे उंहें जेल से बाहर दबाने से हवा के बुलबुले को हटा दें, और एक टास्क वाइपर के साथ पोंछते । सावधानी का प्रयोग करें क्योंकि यह बहुत कठिन हवा के बुलबुले धक्का द्वारा जेल चीर करने के लिए बहुत आसान है ।
    11. इमेज के अनुसार जेल निर्माता & #39; s चलत है । imager.
    12. के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर जेल का विश्लेषण
    13. जबकि जेल छवि है, अतिरिक्त acrylamide जेल, धोने प्लेटों को हटाने, और TBE बफर को छानने से reused करने के लिए कार्य स्थान साफ ।

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Representative Results

समग्र गतिविधि के एक गुणात्मक लक्षण वर्णन का एक सफल polyacrylamide जेल विश्लेषण (धारा २.१ में वर्णित है, चित्रा 1) और स्थिर-राज्य कैनेटीक्स (धारा २.१ के निष्कर्ष पर नोट में वर्णित है, चित्रा 2) दिखाया जाता है । एक असफल polyacrylamide जेल विश्लेषण भी दिखाया गया है (चित्रा 3) ।

ध्यान दें कि कोई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सीढ़ी या आणविक मार्कर का उपयोग किया जाता है । कभी-कभार, हम एक आणविक मार्कर बनाने के लिए एक ज्ञात पोलीमरेज़-सब्सट्रेट संयोजन का उपयोग करेंगे; तथापि, यह ध्यान दें कि विभिंन संशोधित न्यूक्लियोटाइड बहुत अलग electrophoretic मोबिल है महत्वपूर्ण है, एक ही लंबाई के oligonucleotides की तुलना कर रही है लेकिन न्यूक्लियोटाइड संरचना अनुचित भिंन ।

Figure 1
चित्रा 1: समग्र गतिविधि के एक गुणात्मक लक्षण वर्णन के सफल polyacrylamide जेल विश्लेषण का उदाहरण. ध्यान दें कि व्यक्तिगत बैंड अच्छी तरह से परिभाषित कर रहे है और नियमित रूप से । बैंड भिंन लंबाई के oligonucleotides का प्रतिनिधित्व करते हैं; यह जेल polymerases के बीच आसान तुलना सक्षम बनाता है । कोई एंजाइम नियंत्रण लेन के साथ संकेत दिया है एक "-" । गतिविधि दोनों उत्पादों की लंबाई और लेबल प्राइमर है कि बड़े उत्पादों के लिए बदल जाता है के भाग के द्वारा ंयाय है । इस एनालिसिस से E6 और E5 सबसे ज्यादा एक्टिव हैं । E3 और E2 लगभग गतिविधि में बराबर हैं, लेकिन E6 या E5 से कम है, और E4 और E1 कम से सक्रिय एंजाइमों हैं ।

Figure 2
चित्रा 2: मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सफल जेल का उदाहरण स्थिर राज्य कैनेटीक्स का उपयोग । ध्यान दें कि बैंड अच्छी तरह से हल कर रहे है और अच्छी तरह से परिभाषित । oligonucleotide संश्लेषण में व्यक्तिगत कदम के स्थिर राज्य दर स्थिरांक को मापने के लिए, एक एंजाइम nucleoside ट्राइफॉस्फेट की मात्रा अलग (इस मामले में, dCTP) के साथ मशीन है; ध्यान दें कि केवल एन और (n + 1) उत्पादों विश्लेषित घटना के ठहराव सक्षम करने के लिए कर रहे हैं ।

Figure 3
चित्र 3: समग्र गतिविधि के लिए एक असफल जेल का उदाहरण. जेल से निपटने के दौरान फटे, बैंड में दिखाई अंतराल में जिसके परिणामस्वरूप था । ध्यान दें कि जेल बैंड अनियमित आकार, ठहराव और विश्लेषण मुश्किल बना रहे हैं ।

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Discussion

यहां, हम एक परख के लिए डीएनए पोलीमरेज़-एम डीएनए की मध्यस्थता संश्लेषण विशेषताएं वर्णन किया है । निकट अवरक्त लेबल डीएनए प्राइमर का उपयोग करके, और denaturing polyacrylamide जेल ट्रो का उपयोग करने के लिए अलग आकार oligonucleotides हल, हम न्यूक्लियोटाइड पर एकल oligonucleotides संकल्प प्राप्त कर सकते हैं, संश्लेषण की सटीक माप को सक्षम करने से. इन तरीकों को या तो एंजाइम की समग्र गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (खंड २.१) या Michaelis-मेनटेन मापदंडों के अलग-अलग चरणों के उपाय (चरण २.१ के बाद नोट) । हमारी प्रयोगशाला ने हाल ही में इन दोनों के लिए इस्तेमाल किया गया है पहले से विकसित एंजाइमों9 के रूप में अच्छी तरह से तर्कसंगत इंजीनियर10एंजाइमों ।

हमारे यहां वर्णित परख एक गैर के अपने प्रयोग में पूर्व तरीकों से अलग रेडियोधर्मी डीएनए लेबल । ऐतिहासिक, रेडियोधर्मिता रेडियोधर्मी फास्फोरस लेबल11,18का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि उच्च संवेदनशीलता के कारण डीएनए संश्लेषण को ट्रैक करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. दुर्भाग्य से, निपटान के उच्च लागत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रेडियोधर्मी लेबल के सीमित शेल्फ जीवन रेडियोधर्मी लेबल निषेध का उपयोग कर सकते हैं । यहां, हम डीएनए लेबल के पास अवरक्त fluorophore के उपयोग का वर्णन है, जो इन कमियों से ग्रस्त नहीं है । विशेष रूप से, निकट अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक के साथ हम रेडियोधर्मी लेबल डीएनए (अप्रकाशित परिणाम) के लिए इसी तरह का पता लगाने की सीमा देखते हैं । हालांकि, दृश्यमान रेंज में फ्लोरोसेंट रंगों के साथ, हम इसी तरह का पता लगाने की सीमा (अप्रकाशित परिणाम) का पालन करने में सक्षम नहीं थे । जबकि हमारे समूह आम तौर पर वाणिज्यिक तैयार डीएनए असर के पास-अवरक्त fluorophores का उपयोग करता है, इन रंजक स्थापित पोस्ट-संश्लेषण 5 ' संशोधन chemistries कि इन लेबल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता की एक संख्या के साथ संगत कर रहे हैं.

के पास-अवरक्त फ्लोरोसेंट रंजक भी है कि वहां कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंग है, जो अधिक जटिल प्रयोगों है कि एक ही प्रयोग में दो लेबल oligonucleotides के संश्लेषण की निगरानी सक्षम कर सकते है लाभप्रद हैं । रेडियोधर्मी लेबल के साथ, multicomponent प्रयोगों के इन प्रकार आसानी से क्रियान्वित नहीं कर रहे हैं. यह संभव है कि अधिक जटिल प्रयोगों की एक संख्या, विशेष रूप से ओर्थोगोनल प्रतिकृति प्रयोगों के लिए सक्षम हो जाएगा ।

इस परख, और किसी भी denaturing polyacrylamide जेल ट्रो का उपयोग कर परख, मुख्य रूप से ट्रो को क्रियांवित करने की तकनीकी चुनौती द्वारा सीमित है, इन प्रयोगों का कम प्रवाह, साथ ही सीमित आकार पर्वतमाला है कि पर चौकस है एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प । हमें उंमीद है कि इस विस्तृत प्रोटोकॉल समूहों इन परख की तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने के लिए अनुमति देता है । विशेष रूप से, जबकि परख का प्रवाह सीमित है, निकट अवरक्त फ्लोरोसेंट लेबल के उपयोग का प्रवाह बढ़ा है, क्योंकि यह उपयोगकर्ता के लिए एक autoradiograph विकसित करने की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, जेल अभी भी लगभग 4-6 ज सेट और चलाने के लिए, प्रयोगों की संख्या है कि प्रति दिन चला जा सकता है सीमित लेता है । सीमित रेंज polyacrylamide की electrophoretic क्षमताओं के कारण होता है । व्यावहारिक रूप से बोल रहा हूं, इन सीमाओं का मतलब है कि इन परख ध्यान केंद्रित अनुसंधान सवाल है कि एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प की आवश्यकता के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं ।

हाल ही में, उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण19 निस्र्पक डीएनए polymerases20,21की एक विधि के रूप में तेजी से इस्तेमाल किया गया है । इन परख उनके नाटकीय रूप से वृद्धि हुई प्रवाह, जो व्यापक अनुक्रम पूर्वाग्रहों और त्रुटि स्पेक्ट्रा पर ध्यान केंद्रित सवालों में सक्षम बनाता है के लिए उल्लेखनीय हैं । महत्वपूर्ण बात, उच्च प्रवाह अनुक्रमण कई समानांतर प्रयोगों को सक्षम कर सकते हैं, जबकि यह एक एकल न्यूक्लियोटाइड आधार पर व्याख्या करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. यह एंजाइम polyacrylamide जेल ट्रो रोजगार के लिए उच्च प्रवाह अनुक्रमण में अंतराल में भरने के लिए एक रोमांचक अवसर प्रदान करता है, यह सुनिश्चित करना है कि इस लेख में वर्णित तरीके कई वर्षों के लिए प्रासंगिक है आने के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

इस कार्य को अनुसंधान निगम द्वारा वैज्ञानिक उन्नति (Cottrell कॉलेज विद्वान पुरस्कार #22548) के लिए और TriLink के द्वारा समर्थित किया गया था (ResearchReward अनुदान #G139).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33x42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

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References

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