Analisi di attività della polimerasi del DNA usando il vicino infrarosso fluorescente DNA con etichettato visualizzato tramite elettroforesi su Gel di acrilammide

Biochemistry

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Summary

Questo protocollo descrive la caratterizzazione della sintesi di DNA polimerasi di DNA modificato attraverso l'osservazione dei cambiamenti al DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso mediante elettroforesi su gel e gel di imaging. Gel di acrilammide sono usati per l'imaging ad alta risoluzione della separazione degli acidi nucleici breve, che migrano a velocità diverse a seconda delle dimensioni.

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Lewis, E. L., Leconte, A. M. DNA Polymerase Activity Assay Using Near-infrared Fluorescent Labeled DNA Visualized by Acrylamide Gel Electrophoresis. J. Vis. Exp. (128), e56228, doi:10.3791/56228 (2017).

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Abstract

Per qualsiasi enzima, robusti, quantitativi metodi sono necessari per la caratterizzazione degli enzimi sia nativi che derivati dal. Per le polimerasi del DNA, sintesi del DNA possono essere caratterizzato usando un in vitro del DNA sintesi analisi seguito da elettroforesi in gel di poliacrilammide. L'obiettivo di questo test è quello di quantificare la sintesi di DNA naturale e di DNA modificato (M-DNA). Questi approcci sono particolarmente utili per la risoluzione dei oligonucleotides con risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l'osservazione delle singole fasi durante la sintesi del oligonucleotide enzimatica. Questi metodi sono stati applicati per la valutazione di una matrice di proprietà biochimiche e biofisiche quali la misurazione delle costanti di tasso costante di singoli passaggi della sintesi del DNA, il tasso di errore della sintesi del DNA e affinità di legame del DNA. Utilizzando componenti tra cui, ma non limitatamente a, i trifosfati del nucleoside modificato (NTP), M-DNA, e/o mutante polimerasi del DNA, il relativo programma di utilità di substrato-DNA polimerasi coppie possono essere efficacemente valutate modificati. Qui, abbiamo dettaglio il dosaggio stesso, comprese le modifiche che devono essere fatte per ospitare contrassegno strategie quali DNA fluorescente contrassegnato vicino infrarosso del DNA primer non tradizionali. Inoltre, abbiamo dettagliate passi fondamentali tecnici per colata di gel di acrilammide e in esecuzione, che spesso può essere tecnicamente impegnativo.

Introduction

DNA polimerasi eseguire accurata ed efficiente sintesi di DNA e sono essenziali per mantenere l'integrità genomica. La capacità di sintetizzare centinaia di nucleotidi al secondo senza fare errori fa anche strumenti essenziali di DNA polimerasi in biologia molecolare e biotecnologie. Tuttavia, queste proprietà anche limitano le applicazioni per substrati M-DNA; in linea generale, naturale polimerasi del DNA non possono sintetizzare molti potenzialmente preziosi substrati di M-DNA, probabilmente dovuta alla alta pressione selettiva contro l'uso di substrati non standard in vivo. Molti gruppi hanno sviluppato approcci evoluzione diretto per generare la polimerasi del DNA mutante capace di M-DNA sintesi1a,2,3,4,5; questi sforzi hanno ampliato l'utilità biotecnologica del DNA6,7,8.

Per valutare la capacità della polimerasi del DNA mutante di sintetizzare M-DNA, abbiamo9,10e gli altri11,12,13 in genere utilizzano misurazioni in vitro del DNA attività della polimerasi, che sono descritte in questo manoscritto. In questi esperimenti, la polimerasi del DNA sono co-incubate con un primer con etichettato/modello duplex e nucleosidi trifosfato substrati; i prodotti sono valutati mediante elettroforesi in gel. A seconda della specifica domanda sperimentale, polimerasi del DNA mutante, modificate gli iniettori, modelli modificati, o trifosfati del nucleoside modificato possono essere utilizzato, consentendo la valutazione biochimica sistematica dell'attività dell'enzima mutante.

Storicamente, questi saggi hanno fatto affidamento su un'etichetta radioattiva 5' per tenere traccia di sintesi del DNA; più comunemente, sono stati utilizzati 32P e 33P; tipicamente, etichettatura è realizzato utilizzando T4 polinucleotide chinasi11. Tuttavia, a causa della durata limitata nel tempo e il costo relativamente elevato di etichette radioattive e del loro smaltimento sicuro, il nostro gruppo utilizza invece un fluoroforo vicino infrarosso sintetico 5' DNA contrassegnato. Utilizzando un costo relativamente basso vicino infrarosso gel imager, abbiamo osservato i limiti di rilevazione simile ai precedenti studi utilizzando etichette radioattive (dati non pubblicati). Abbiamo riprodotto con successo passato osservazioni9, e non abbiamo osservato alcuna grande differenza quantitativa con costanti di tasso precedentemente misurato (dati non pubblicati).

Per analizzare la dimensione del DNA e quindi, nella misura della sintesi del DNA, ci basiamo su metodi di elettroforesi del gel di poliacrilammide sviluppati originariamente per di sequenziamento Sanger14 prima dell'avvento di elettroforesi capillare15. La distanza di separazione o di mobilità può essere utilizzata come una misura di peso molecolare; grande formato, i gel di poliacrilammide verticali può raggiungere la risoluzione di singolo nucleotide, consentendo l'osservazione quantitativa di oligonucleotidi di DNA di lunghezza variabile.

Collettivamente, questi esperimenti sono un metodo affidabile per la caratterizzazione della polimerasi. A causa del tempo natura sensibile delle reazioni, la preparazione e la cura è necessaria per ottenere risultati riproducibili. Ulteriormente, mentre il gel dell'acrilamide è un modo molto efficace per misurare la sintesi del DNA, così come numerose altre reazioni modificazione di DNA, con risoluzione di singolo nucleotide, può essere tecnicamente difficile. Il protocollo qui speriamo che consentirà agli utenti di eseguire questi esperimenti, evitando gli errori più comuni.

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Protocol

1. analisi di attività

Nota: ci sono due tipi comuni di saggi che vengono spesso eseguiti per caratterizzare le polimerasi del DNA utilizzando i metodi descritti qui. Essi si differenziano se qualitativamente caratterizzano sintesi complessiva (che comprende numerosi passaggi della sintesi del DNA) o se essi si concentrano quantitativamente su singoli passaggi. Descriviamo qui di seguito i passi necessari per ognuno di questi.
Nota: Poiché l'assemblaggio di materiali è relativamente complessa, per esperimenti di tempo sensibile, è consigliabile che tutti i materiali sono assemblati in anticipo. Le ricette di tutti i componenti critici del dosaggio sono elencate di seguito. Fornitori commerciali per i componenti sono elencati nella Tabella materiali.

  1. 10 x ricetta SF Buffer (10 x SFB)
    Nota: nelle nostre analisi, usiamo tipicamente il troncamento del N-terminale della DNA polimerasi I di Thermus aquaticus, comunemente noto come Stoffel frammento (SF) 16 , 17. La ricetta qui è il buffer preferito per SF 3 , 13. Altri buffer può essere sostituito a seconda della polimerasi di DNA specifica.
    Nota: La concentrazione finale di 10 x componenti del tampone di SF sono 500 mM Tris-HCl pH 8.5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s) e acqua ultrapura. Le misure sono per 1 mL di tampone di SF, che è sufficiente per i dosaggi di 100-200, a seconda della scala. Il tampone può essere conservato a tempo indeterminato a-20 ° C.
    1. Combine 0,5 mL di 1 M tubo di Tris, 65 µ l di 1 M MgCl 2, 50 µ l di 10 mg/mL BSA e 0,0373 g di KCl (s) in un 1,5 mL. 385 µ l di acqua ultrapura per raggiungere un volume finale di 1 mL.
  2. 1 ricetta di Buffer di memoria di x (1 x SB)
    Nota: la concentrazione finale di 1 x componenti buffer sono 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 millimetro DTT, 0,6 mM EDTA e glicerolo al 50%. La ricetta fa 20 mL di 1x SB.
    1. Combinare g 0,012 DTT, 100 µ l di EDTA 0.5 M e riempire una provetta conica da 50 mL con 40 mL di 100 mM Tris (pH 7,5) per rendere 2xSB. Mescolare nel Vortex.
    2. Trasferire 10 mL di 2 x SB nella provetta un nuovo 50 mL conica e diluire con glicerolo con l'aggiunta di glicerolo 10 mL al nuovo conico.
  3. Ricetta tampone arancio (QBO) tempra
    Nota: quando vengono utilizzate etichette radioattive, gli utenti spesso impiegherà blu di bromofenolo e/o xilene cianolo come una tintura di rilevamento per il progresso di elettroforesi. Tuttavia, questi coloranti debolmente darà fluorescenza nella regione del vicino infrarosso, interferisce con il segnale di DNA. Quindi, usiamo l'Orange G al loro posto per tutte le reazioni che contengono campioni. Mentre abbiamo trovato l'Orange G per essere adatto per il monitoraggio di caricamento del gel, abbiamo trovato l'Orange G ad essere meno consistente come una tintura che tiene traccia dei progressi di elettroforesi; così, corriamo corsie vuote contenenti bromofenolo sulle corsie esterne del gel che non contengono campione al fine di tenere traccia dell'avanzamento di gel.
    1. Combinare 950 µ l di 95% formammide con 25 µ l di EDTA 0.5 M e 25 µ l acqua ultrapura. Aggiungere 1 misurino di tintura di arancio G (~ 10 mg). Mescolare nel Vortex.
      Attenzione: Formammide è tossica; indossare dispositivi di protezione individuale (dpi) quali guanti, occhiali e camice da laboratorio e smaltire come rifiuti pericolosi.

2. Esecuzione del test

  1. caratterizzazione qualitativa della attività complessiva
    Nota: per questa analisi, abbiamo in genere mantenere costante concentrazione di M-NTPs e variare il tempo. L'obiettivo è di valutare le caratteristiche complessive della proteina piuttosto che misurare ogni singolo passaggio. Per preparare una reazione, un volume uguale di due componenti separati, il mix duplex (descritto al punto 2.1.1) e la miscela del dNTP (descritto al punto 2.1.2), saranno preparati separatamente e poi combinate per dare il volume finale di 49 µ l. L'aggiunta di 1 µ l 50 x enzimi avvierà la reazione. Punti di tempo variabile possono essere preso; in genere, noi placare a 0, 5, 15 e 60 min.
    1. Preparazione di DNA duplex mix
      Nota: il mix duplex è composto da 10 x buffer di SF, oligonucleotide primer, oligonucleotide di modello e acqua ultrapura. Volume totale aggiunto ad ogni reazione è di 25 µ l. 1 µ l di enzima verrà aggiunto al mix master immediatamente precedente l'inizio dell'esperimento.
      Nota: Per i nostri saggi, usiamo tipicamente un modello 45-mer e un primer 18-mer o 23-mer. Mentre può essere utilizzato un numero di diverse lunghezze, tendiamo ad usare questa lunghezza perché i prodotti (che vanno da 18 nucleotidi a 45 nucleotidi) facilmente risolvibili a livello di singolo nucleotide utilizzando i protocolli di elettroforesi del gel descritto. Come prodotti del oligonucleotide aumentano in lunghezza, può essere difficile risolvere i prodotti alle risoluzioni di singolo nucleotide.
      Nota: Nei nostri esperimenti, usiamo un 5 ' etichetta di tintura fluorescente vicino infrarosso sul filo del primer per osservare i prodotti di primer. Acquistiamo personalizzati oligonucleotidi sintetizzati recanti questa modifica; Tuttavia, questa etichetta può essere incorporata utilizzando un numero qualsiasi di strategie d'etichettatura post-sintetiche. Il oligonucleotide di modello non è etichettato e così non si osserva utilizzando il gel imager. Per entrambi oligonucleotidi, Salviamo gli oligonucleotidi a 100 µM a 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
      Nota: Poiché stiamo osservando solo il primer, un eccesso di duplice di modello viene utilizzato per garantire che tutti i primer (le specie di DNA che viene osservate) vengono ricotti al modello. La concentrazione finale di duplex in questa reazione è di 40 nM.
      Nota: Tinture fluorescenti vicino infrarosso sono spesso un po' fotosensibile; Quando possibile, copriamo il primer (e la soluzione contenente il primer) con un foglio. Questo include il gel di poliacrilammide, mentre è in esecuzione.
      Nota: Di seguito è un esempio rappresentativo di sintesi di 2 ' F M-DNA.
      1. Diluire primer 1 e modello 1 (Vedi Tabella materiali per sequenza) a 1 µM ciascuna in acqua ultrapura.
      2. Per ogni reazione di analisi, in provette separate, combinare 5 µ l di tampone di SF 10x, 2 µ l di primer µM 1 1, 4 µ l di 1 µM modello 1 e 13 µ l di acqua ultrapura in tubi compatibili con un termociclatore.
      3. Tempri il duplex in un termociclatore usando il seguente programma: 98 ° C per 2 min, 70 ° C per 5 min, 50 ° C per 5 min, 40 ° C per 5 min, tenere a 25 ° C. Il programma specifico può variare a seconda della temperatura di annealing del primer/template duplex. In genere, noi preferiamo includere almeno un passo di 5 min alla temperatura di ricottura e poi un altro passaggio di 5 min a temperatura 5-10 gradi sotto la temperatura di annealing.
    2. Preparazione di 2 x dNTP miscela
      Nota: a seconda dell'esperimento, è possibile utilizzare la variabile dNTP e concentrazioni dei dNTP. In genere, usiamo il 50-200 µM nella reazione.
      1. Preparare un 25 µ l di soluzione contenente 100 µM di ogni 2 ' F-NTP. Memorizzare il M-NTPs a 100 mM.
    3. Preparazione della diluizione proteina: 50x
      Nota: per immagazzinaggio a lungo termine, enzimi devono essere mantenuti a-20 ° C in 1xSB. Quando rimosso dal congelatore a-20 ° C, enzimi dovrebbero essere tenuti su ghiaccio in ogni momento prima dell'aggiunta al mix master. Diluizioni di enzima dovrebbero essere fatta fresche dal brodo concentrato ogni giorno. Lo stock di enzima concentrato deve essere restituito nel congelatore a-20 ° C immediatamente dopo l'uso.
      Nota: Perché valutiamo principalmente le polimerasi del DNA mutante, utilizziamo solo gli enzimi che sono state espressi e purificati nel nostro laboratorio utilizzando metodi consolidati 9 , 10. Per polimerasi acquistate in commercio, gli utenti dovrebbero diffidare di buffer ottimale per diverse proteine e la loro compatibilità con i buffer descritto nel presente documento.
      Nota: Le concentrazioni negli enzimi variano per ogni esperimento. Qui, vi mostriamo un esempio rappresentativo per 2 ' sintesi F-DNA.
      1. Per fare una soluzione di enzima nM 10, diluire 1 µ l di enzima into 1 x SB per rendere una concentrazione di enzima finale 50 x. La concentrazione della soluzione 50 x dovrebbe essere 500 nM. Ad esempio, se la concentrazione di enzima stock è 50 µM, aggiungere 1 µ l stock enzima a 99 µ l 1 x SB.
        Nota: Poiché l'enzima è in genere memorizzato in glicerolo al 50%, la soluzione è abbastanza viscosa. Anche se utilizzando pipette altamente accurati, non è consigliabile pipettaggio inferiore a 0,5 µ l, considerando l'importanza di accuratezza e precisione durante la diluizione enzima.
    4. L'inizio del test
      1. impostare la temperatura del bagno asciutto a 50 ° C.
      2. Aggiungere 24 µ l del duplex ricotto mescolare (Vedi punto 2.1.1) a 25 µ l di 2 x dNTPs (Vedi punto 2.1.2).
      3. Rimuovere 9,8 µ l della miscela in fase 2.1.4.2 e aggiungere 20 µ l di QBO (Vedi sezione 1.3 per ricetta). Questa aliquota serve come un " Nessun enzima " di controllo e deve essere ottenuta per ogni esecuzione.
      4. Dell'enzima 50 x 0,8 µ l (vedere punto 2.1.3.1) al duplex/dNTP mix. Pipetta su e giù con una micropipetta di grande volume per mescolare completamente.
      5. Dopo 5, 15 e 60 min, placare la reazione rimuovendo 10 μl di ogni soluzione di reazione e l'aggiunta di un tubo del microcentrifuge contenente 20 µ l QBO (descritto nella sezione 1.3).
      6. Una volta placata, le reazioni possono essere memorizzate in lamina a tempo indeterminato a 4 ° C o -20 ° C.
        Nota: Per la caratterizzazione quantitativa delle singole fasi della sintesi di M-DNA, è possibile eseguire un dosaggio molto simile quantitativamente ottenere parametri di Michaelis-Menten. Questo saggio utilizza tutti i materiali stessi. Parametri di Michaelis-Menten possono essere misurati per i dNTP; in questo caso, la differenza più significativa è che, piuttosto che aggiungere la miscela per duplex dNTP mix, aggiunge il mix duplex con enzima ad una serie di 2 x dNTP soluzioni. Allo stesso modo, i parametri di Michaelis-Menten possono essere misurati per duplex di DNA. Condizioni specifiche devono essere verificate per soddisfare i presupposti necessari per utilizzare l'equazione di Michaelis-Menten. Queste condizioni e la meccanica di base del test, è ben spiegata in un precedente articolo di metodi 11.

3. Elettroforesi su gel

Nota: perché il gel di versamento è ora sensibile, tutti i materiali sono assemblati in anticipo. Le ricette di tutti i componenti critici del dosaggio sono elencate di seguito; fornitori sono elencati nella Tabella materiali.

  1. Prepararsi gel dell'acrilamide 20% di acrilammide.
    Nota: Questa ricetta fa 1 L di miscela di acrilamide; circa 120 mL di questa soluzione viene utilizzata per gel. Conservare questa soluzione a temperatura ambiente sotto foglio fino ad un anno.
    Attenzione: Poliacrilammide è neurotossico. È importante indossare un camice da laboratorio e guanti durante tutte le fasi di colata di gel. Se poliacrilammide ottiene su guanti, sostituire immediatamente i guanti. Se non viene polimerizzato acrilammide, posizionare i materiali contaminati in un sacchetto di rifiuti con etichetta poliacrilammide.
    Nota: Premiscelata 40% di acrilammide contenente 38.67% di acrilammide e 1,33% bis-acrilammide per un monomero rapporto reticolante di 29: 1 è stato utilizzato in questo protocollo.
    1. Pesare 17 g di premiscelati in polvere TBE. Pesare sei porzioni separate di 70 g di urea (totale di 420 g).
      Nota: L'urea deve essere aggiunto in porzioni. Lo troviamo meglio dividerlo in sei porzioni.
    2. Impostare un bicchiere in plastica 2 L su una piastra stir. Aggiungere una singola grande bacchetta Becher. Coprire il becher con un foglio durante la miscelazione per evitare schizzi.
    3. Aggiungere 500 mL di soluzione al 40% acrilammide in Becher. Assicurarsi che la soluzione è mescolando.
    4. Aggiungi precedentemente pesato-out TBE. Aggiungere un'aliquota di urea. Lasciare la soluzione a mescolare. L'urea si dissolve lentamente e può apparire confuso e bianco con l'aggiunta iniziale. Lentamente aggiungere le rimanenti aliquote di urea nell'impasto nell'ora successiva. Lasciare la soluzione a mescolare fino a quando non è completamente chiaro e incolore.
      Nota: In genere, permettere che questo agitazione per una notte. Se la soluzione non è ancora sciolto, aggiungere piccole aliquote di acqua e attendere che l'urea dissolvere.
    5. L'aggiunta di urea aumenterà il volume vicino 1 L. aggiungete dell'acqua per aumentare il volume per esattamente 1 L.
    6. Conservare in una bottiglia da 1 litro vetro colorato o coprire la bottiglia di vetro con carta stagnola.
  2. Versantesi del gel dell'acrilamide.
    Nota: Durante la manipolazione di lastre di vetro, fare attenzione a evitare il contatto tra le lastre di vetro e qualsiasi superficie dura. Ciò è particolarmente importante in quanto trattamento approssimativo può causare piccole crepe nel vetro; Queste crepe potrebbero non essere visibile fino a quando il gel è in esecuzione, che avviene ad una temperatura superiore. Usiamo il sughero anelli per evitare questo contatto indesiderato.
    1. Pulite piastre piastre di gel di
      1. acquisire due 33 x 42 cm, uno dentellato e una piastra senza intaglio. Posizionare le piastre sugli anelli di sughero separato.
      2. Piastre di risciacquare accuratamente con acqua e sapone. Assicurarsi che non ci sono nessun sapone striature o macchie di gel lasciati alle spalle.
      3. Annotare quale lato delle perle piastra meno acqua. Questo lato è il gel di fronte lato.
        Nota: Se il gel viene eseguito su altro lato della piastra, può rendere il trasferimento di gel stimolante.
    2. Asciugare piatti
      1. utilizzare asciugamani di carta per asciugare entrambe le facce di ciascun piatto.
      2. Tergicristalli delicato compito di uso asciugare zone restanti. Prestare particolare attenzione ai bordi delle piastre dove verrà applicato nastro.
      3. Sciacquare le lastre di vetro con circa il 70% di etanolo e pulire con tergicristalli attività.
      4. Assicurarsi che non ci sono nessun fibre di asciugamano di carta o goccioline di acqua. Questi possono causare bolle quando si versa il gel.
    3. Aggiungere distanziali
      1. acquisire distanziali di 0,75 mm. Eseguire le dita guantate sotto DI acqua e bagnare delicatamente i distanziali con le dita guantate.
      2. Piastra
      3. distanziali posto lungo i bordi lunghi del dentellato. Ripulire l'acqua che è spruzzato sul resto delle piastre. Assicurarsi di distanziali sono allineati con la lastra di vetro e non appeso sopra il bordo.
    4. Gel di tenuta
      1. indossare guanti asciutti. Asciugare i bordi del vetro nuovo con tergicristalli delicato compito.
      2. Allineare la piastra senza intaglio superiore sopra la piastra dentellata e lentamente più in basso di premere le piastre contro l'altro. Controllare ancora una volta essere sicuri che i bordi di tutte le piastre sono allineati.
      3. Using nastro gel, posizionare il nastro attraverso tutti i bordi fatta eccezione per la parte superiore. Assicurarsi che il nastro è allineato in modo uniforme e sigillata ermeticamente. Nastro può essere applicato in un unico movimento, o ogni lato può essere fatto individualmente. Tagliare le estremità del nastro con un rasoio.
      4. Aggiungere un ulteriore strato di nastro sul fondo del gel. Il più stretto il nastro, la meno probabile il gel colerà quando si versa.
      5. Clip i lati del vetro sandwich con i morsetti bianchi. Aggiungere 3 clip per ogni lato e 4 clip verso il basso.
    5. Versando il gel
      1. fare 3 mL di soluzione di 10% ammonio persolfato (APS) di persolfato di ammonio 0,3 g di dissoluzione e diluire fino a 3 mL in acqua ultrapura.
        Nota: è necessaria un'1,2 mL di APS per gel. Data del tubo dopo averlo commesso. Soluzione APS scade in 2 settimane e deve essere conservato a 4 ° C.
      2. Trasferire 125 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) ad un tubo del microcentrifuge separato.
        Nota: TEMED è tossico; indossare i dpi come guanti, occhiali e laboratorio cappotto ogni volta che gestione.
      3. Acquisire una spruzzetta e rimuovere l'imbuto appuntito. Misurare 125 mL di acqua in un cilindro graduato e aggiungere alla bottiglia. Segnare il livello dell'acqua all'esterno della bottiglia con un pennarello indelebile. Eliminare l'acqua. Questo spruzzetta modificate può essere riutilizzato all'infinito con una corretta pulizia (Vedi sotto).
      4. Impostare gli anelli tappati accanto al lavandino c'è un posto per mettere il gel una volta si è versato. Posto il panino piatto qui. Mettere un tappo di sughero nel lavandino c'è un posto a sedere le piastre mentre il gel è stato versato. Il gel sarà versato nel panino piatto vetro in un angolo, così basso riposerà sul sughero mentre la parte superiore riposerà sul bordo del lavandino. Assicurarsi che non ci sono pastiglie sotto queste aree nel caso in cui versa il poliacrilammide off.
      5. Bottiglietta a spruzzo soluzione
      6. luogo APS e TEMED soluzione su altro lato del lavandino, con il vuoto. Posizionate il pettine bene con il numero desiderato di pozzetti sul lato del lavandino con le piastre. Mettere 4 morsetti è vicino a.
        Nota: Il passo successivo nella procedura è tempo molto sensibile. Essere pronti a muoversi rapidamente attraverso questi passaggi. C'è una quantità limitata di tempo per ottenere la miscela tra le piastre prima di esso si polimerizza. Tutti i componenti (Micropipette preimpostate a volume corretto, soluzioni, lastre di vetro) sono disposti con cura per versare il gel più velocemente possibile. Se si desidera una polimerizzazione più lento, il APS e TEMED concentrazioni possono essere dimezzate; ciò, tuttavia, richiederà un tempo più lungo di polimerizzazione.
      7. Versare la soluzione di gel di acrilamide di 20% nella bottiglia squirt al punto contrassegnato. Versare un po ' più soluzione di gel sopra la linea tracciata, c'è una soluzione abbastanza nel caso di piccole perdite. Si tratta di circa 120 mL di soluzione di gel.
      8. Aggiungere 120 µ l di TEMED e 600 µ l di APS per la soluzione di gel di poliacrilammide in bottiglia Eiaculazioni femminili allo stesso tempo. Aggiungere rapidamente un ulteriori 600 µ l di APS per la soluzione di gel di poliacrilammide.
      9. Tappo rapidamente la spruzzetta e ricciolo. Posizionare il panino piatto nel lavandino.
      10. Iniziare versando. Questo dovrebbe solo prendere 1-2 min al fine di evitare una polimerizzazione. Lentamente, ma costantemente, aggiungere pressione alla bottiglia squirt così la soluzione di gel esce in modo uniforme. Se la soluzione inizia spattering irregolarmente dalla bottiglia squirt, rilasciare la pressione in modo la bottiglia diventa gonfio e riprendere versando. Orologio per assicurarsi che la soluzione di gel è di tutti i settori, e non perde da uno qualsiasi dei lati. Per rimuovere le bolle d'aria, cambiare l'angolo delle piastre. Le bolle apparirà nella parte superiore e verranno eseguito più velocemente se l'angolo è più ripido. Continuare a versare finché la soluzione ha raggiunto la cima dell'area dentellata e trabocca leggermente il bordo dentellato. Rimuovere tutte le bolle d'aria.
        Nota: Se il panino piatto perdite, o non c'è sufficiente soluzione di gel e la soluzione non raggiunge la cima delle piastre, il gel non può essere utilizzato. Attendere che il gel ha polimerizzato e pulire conseguenza.
      11. Aggiungere il pettine ben il panino piatto. Posto 4 morsetti sul pettine per premere verso il basso e consentire per la distribuzione uniforme dei pozzi.
      12. Rapidamente gettare la soluzione di gel rimanente nella bottiglia squirt con etichetta poliacrilammide rifiuti. Sciacquare la spruzzetta con DI acqua 2 - 3 volte, attraverso l'ugello di squirt.
        Nota: È importante eseguire questa pulizia rapidamente per impedire l'intasamento in bottiglia squirt di poliacrilammide. Se anche una piccola quantità di polimerizzazione avviene entro l'ugello, il gel successivo sarà versato troppo lentamente e non con successo. Scartare la spruzzetta se polimerizzazione avviene.
  3. Esecuzione del gel di acrilamide
    1. mentre gel è essere polimerizzato, fare 1 tampone in esecuzione di x TBE. Sciogliere 17 g di premiscelati TBE tinta in 1 L di acqua ultrapura. Agitare il tampone fino a quando tutti di TBE è dissolto.
    2. Rimuovere tutte le clip del Raccoglitore dal panino piatto.
    3. Utilizzare un rasoio per tagliare il nastro e rimuovere il nastro da tutti i bordi del sandwich plate.
    4. Pulita fuori tutto il gel polimerizzato da superfici di vetro. Utilizzare un rasoio lungo i bordi per togliere il gel rimanente. Pulire le piastre con asciugamani di carta e acqua per rimuovere quanto più residui di poliacrilammide come possibile. Acrilammide in eccesso e/o nastro spesso può bruciare durante l'elettroforesi del gel.
    5. Rimuovere il pettine ben spingendolo in modo uniforme su entrambi i lati.
    6. Utilizzare un rasoio per tagliare fuori il gel in eccesso lungo la parte superiore del panino piatto. Fetta lungo il bordo dentellato del piatto.
    7. Utilizzare una siringa e DI acqua per lavare i pozzetti e rimuovere detriti nei pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzetto può essere riempito con acqua e non è bloccato dal gel polimerizzato in eccesso.
    8. Posto il panino piatto nell'apparecchio, in modo che la piastra più lunga è rivolta verso l'esterno, e lo spazio dentellato è rivolto verso l'interno.
    9. Aggiungere clip per ritagliare la piastra di sandwich e alluminio piatto con l'apparato. Aggiungere all'esterno della piastra per promuovere anche in esecuzione.
    10. Tampone TBE aggiungere per coprire le tacche base e appena sufficiente a coprire i pozzi nella parte superiore. Tampone TBE può essere filtrato e riutilizzato per circa 5 gel.
    11. Piatti caldi per 20 min eseguendo l'elettroforesi in gel a 50 w.
    12. Dopo il riscaldamento le piastre, pulire i pozzetti. Utilizzare una siringa e il buffer TBE nei bagni a schizzare i Sali tampone rimanenti dai pozzi. Fare questo più volte per garantire pulizia pozzi. Se i pozzi non sono puliti, le bande si mischia e l'immagine non sarà interpretabile. Anche se questo può richiedere molto tempo, abbiamo ritenuto indispensabile per ottenere dei buoni dati.
    13. Nella corsia più esterna su entrambi i lati, pipettare 5 µ l di formamide 95% con il blu di bromofenolo. Questa è la soluzione stessa come QBO, ma con bromofenolo al posto di Orange G. Ciò fornirà una visuale su dove tagliare il gel per l'imaging e quanto in fondo il DNA è stato eseguito.
    14. Per ciascun campione da analizzare (generato nella sezione 2.1.1), aggiungere 3 µ l in un singolo pozzetto del gel. Dopo aver caricato tutti i campioni, aspettare 1 min per campioni a stabilirsi.
    15. Put tappi sui bagni di plastica sia in alto e in basso. Collegare i fili all'apparato. Rosso indica la carica elettrica positiva, quindi dovrebbe essere in fondo affinché il DNA viene eseguito verso il basso.
    16. Attach fili a una potenza di origine e impostare su 50-55 W. esecuzione del gel per circa 3 h o fino a quando il bromofenolo anteriore di colorante blu ha eseguito almeno 2/3 verso il basso il gel.
  4. Imaging il gel
    Nota: questo gel è estremamente sottile e può essere difficile da gestire. Prestare grande attenzione per evitare lo strappo e la perdita del gel intero.
    Nota: a seconda dell'etichetta di DNA, esso possono richiedere l'utilizzo di diversi gel Imager. Questo protocollo utilizza coloranti fluorescenti vicino infrarosso e imaging dei campioni è stata eseguita su un gel imager (Vedi Tabella materiali). Il protocollo è scritto specificamente per quel imager.
    1. Quando la parte anteriore della tintura di blu di bromofenolo ha eseguito almeno 2/3 verso il basso il gel (~ 28 cm), il gel può essere fermato da spegnere l'alimentazione. Rimuovere il gel dalla apparecchiatura e posto sugli anelli di sughero.
    2. Separare le piastre con un separatore di piatto piccolo cuneo. Posizionate il separatore all'interno angolo delle tacche per tirare su. Prestare attenzione e non usare una forza eccessiva; le tacche possono rompersi se si applica troppa pressione.
    3. Una volta rilasciati aspirazione tra le piastre, attentamente sollevare la piastra superiore e determinare quale piatto il gel è su. Se il gel si attacca sulla piastra inferiore, togliere la piastra superiore e posizionare su anello di sughero. Se il gel è sulla piastra superiore da sollevare, spostare lentamente e il gel può cadere indietro alla piastra inferiore. Se il gel non rientra, nuovamente si muovono lentamente e tirare la parte rimanente del gel dalla piastra inferiore e posizionare la piastra superiore con il gel su un anello di sughero separato.
    4. Una volta che le piastre sono separate, vedere dove la tintura è sul gel e rimuovere il gel in eccesso dalla parte superiore e inferiore del gel. In genere, con i nostri costrutti, non utilizzando un primer di nucleotide 18 o 23 e un modello di 45 nucleotide, c'è nessun DNA tra la parte anteriore del colorante blu di bromofenolo e la parte inferiore del gel. Tagliare verticalmente da tintura alla parte superiore del gel. Gli spazi tra il colorante e i bordi del gel non hanno anche nessun DNA. Infine, tagliare un paio di pollici sotto lo spazio ben sul gel. Non ci sono nessun acidi nucleici nella parte superiore del gel.
      Nota: Il gel nel più piccolo possibile di dimensioni di taglio rende notevolmente più semplice da trasferire sul dispositivo di imaging. Se il gel è troppo grande, è più suscettibile di ripping durante il trasferimento. Mentre siamo spesso tagliare il gel prima di formazione immagine, si consiglia di utilizzare estrema cautela quando si tagliano come dati pertinenti possono essere persi se non cura. Per verificare se rimosso porzioni contengono dati aggiuntivi, spesso effettueremo un'analisi aggiuntivo delle porzioni asportate del gel per garantire che i dati non sono stati persi.
    5. Cappotto del gel con acqua per evitare l'essiccazione.
    6. Pulire la superficie del dispositivo di imaging. Utilizzando tergicristalli compito, pulire la superficie con acqua ed etanolo. Aggiungere uno strato sottile di acqua alla superficie dove verrà posizionato il gel.
    7. Trasferire la porzione desiderata di gel sulla superficie bagnata del Li-cor
    8. Rimuovi aria bolle delicatamente premendo li fuori dal gel e asciugandosi con un raschiatore di attività. Usare cautela in quanto è molto facile da strappare il gel da spingere troppo le bolle d'aria.
    9. Immagine del gel secondo il produttore ' protocolli di s. Analizzare il gel utilizzando il software disponibile per il dispositivo di imaging.
    10. Mentre il gel è essere imaged, pulire lo spazio di lavoro rimozione gel dell'acrilamide in eccesso, lavaggio piatti, e filtrando il buffer TBE per essere riutilizzato.

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Representative Results

Un'analisi di successo del gel di poliacrilammide di una caratterizzazione qualitativa della attività complessiva (descritto nella sezione 2.1, Figura 1) e della cinetica allo stato stazionario (descritto nella nota in conclusione del punto 2.1, Figura 2) sono mostrati. Un'analisi di infruttuoso del gel di poliacrilammide è anche mostrata (Figura 3).

Si noti che nessuna scala disponibile in commercio o marcatore molecolare viene utilizzato. Occasionalmente, useremo una combinazione di note della polimerasi-substrato per creare un marcatore molecolare; Tuttavia, è importante notare che diversi nucleotidi modificati hanno molto diversa mobilità elettroforetica, facendo il confronto di oligonucleotidi della stessa lunghezza ma diversa struttura del nucleotide inappropriato.

Figure 1
Figura 1: esempio di analisi di successo del gel di poliacrilammide di una caratterizzazione qualitativa della complessiva attività. Si noti che le singole bande sono ben definiti e regolari. Le bande rappresentano oligonucleotidi di lunghezza differente; Questo gel consente facile confronto tra polimerasi. La corsia di controllo Nessun enzima è indicata con un "-". Attività è giudicata da entrambi la lunghezza dei prodotti e la parte del primer con etichetta che è convertito in prodotti più grandi. Da questa analisi, E6 ed E5 sono i più attivi. E3 ed E2 sono circa uguali in attività, ma meno di E6 o E5 ed E4 ed E1 sono gli enzimi meno attivi.

Figure 2
Figura 2: esempio di successo gel per analisi qualitativa con cinetica allo steady-state. Si noti che le bande sono ben risolto e ben definite. Per misurare le costanti di tasso costante di singoli passaggi in sintesi del oligonucleotide, un enzima viene incubato con quantità variabili di trifosfato del nucleosidico (in questo caso, dCTP); Si noti che solo la n e (n + 1) i prodotti sono sintetizzati consentendo la quantificazione dell'evento singolare.

Figure 3
Figura 3: esempio di un gel infruttuoso per la complessiva attività. Il gel è stato strappato durante la movimentazione, con conseguente visibile lacune nelle bande. Si noti che le bande di gel sono di forma irregolare, rendendo difficile la quantificazione e l'analisi.

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Discussion

Qui, abbiamo descritto un test per caratterizzare la sintesi di DNA polimerasi-mediata di M-DNA. Utilizzando primer di DNA con etichetta vicino infrarosso, e utilizzando l'elettroforesi del gel di poliacrilammide denaturante per risolvere diverse dimensioni oligonucleotidi, possiamo ottenere risoluzione di singolo nucleotide su oligonucleotidi, consentendo la misurazione precisa di sintesi. Questi approcci possono essere usati per misurare l'attività complessiva dell'enzima (sezione 2.1) o per misurare i parametri di Michaelis-Menten delle singole fasi (Nota che segue passo 2.1). Il nostro laboratorio ha recentemente usato questi per entrambi caratterizzano gli enzimi precedentemente evoluta9 come pure progettati razionalmente gli enzimi10.

Nostri saggi qui descritti differiscono dai metodi precedenti nel loro uso di un'etichetta di DNA non radioattivo. Storicamente, la radioattività è stato utilizzato per tenere traccia di sintesi del DNA dovuto l'alta sensibilità che può essere ottenuta utilizzando etichette di fosforo radioattivo11,18. Purtroppo, gli elevati costi di smaltimento, nonché la durata limitata delle etichette radioattive può rendere l'uso di etichette radioattive proibitivo. Qui, descriviamo l'uso del vicino infrarosso fluoroforo etichettato DNA, che non soffre di questi inconvenienti. In particolare, con le tinture fluorescenti vicino infrarosso vediamo i limiti di rilevazione simile al DNA radioattivo etichettato (dati non pubblicati). Tuttavia, con le tinture fluorescenti nella gamma visibile, non eravamo in grado di rispettare i limiti di rilevazione simile (dati non pubblicati). Mentre il nostro gruppo utilizza in genere preparato commercialmente DNA cuscinetto vicino infrarosso fluorofori, questi coloranti sono compatibili con una serie di affermati post-sintesi 5' chimiche di modificazione che può essere utilizzato per installare queste etichette.

Coloranti fluorescenti vicino infrarosso sono anche vantaggiosi in quanto ci sono più colori disponibili in commercio, che possono consentire esperimenti più complessi che controllano la sintesi di due oligonucleotidi con etichettate in un singolo esperimento. Con etichette radioattive, questi tipi di esperimenti multicomponenti non vengono eseguiti facilmente. Ciò consentirà probabilmente una serie di esperimenti più complessi, specialmente per gli esperimenti replica ortogonale.

Questo test e qualsiasi analisi usando elettroforesi su gel di poliacrilammide denaturante è limitata principalmente dalla sfida tecnica di eseguire l'elettroforesi, la bassa velocità effettiva di questi esperimenti, come pure gli intervalli di dimensioni limitate che sono osservabili al risoluzione di singolo nucleotide. Ci auguriamo che questo protocollo dettagliato consente ai gruppi di superare le sfide tecniche di queste analisi. In particolare, mentre la velocità effettiva del dosaggio è limitante, l'uso di etichette fluorescenti vicino infrarosso aumentare il throughput, come non richiede all'utente di sviluppare un autoradiograph. Tuttavia, il gel ancora prende circa 4-6 h per impostare ed eseguire, limitando il numero di esperimenti che possono essere eseguiti al giorno. La gamma limitata è causata dalle funzionalità elettroforetica di poliacrilammide. Praticamente parlando, queste limitazioni significano che queste analisi sono migliori per le domande di ricerca mirata che richiedono la risoluzione di singoli nucleotidi.

Recentemente, elevato throughput di sequenziamento del DNA19 è stato utilizzato sempre più come un metodo di caratterizzazione del DNA polimerasi20,21. Queste analisi sono degni di nota per loro drammaticamente aumentare il throughput, che permette più ampie questioni focalizzate sulla sequenza pregiudizi e spettri di errore. D'importanza, mentre il sequenziamento ad alta può attivare molti esperimenti paralleli, può essere difficile interpretare su una base di singolo nucleotide. Questo fornisce un'opportunità interessante per le analisi dell'enzima che impiegano l'elettroforesi del gel di poliacrilammide per colmare le lacune nel sequenziamento di alte prestazioni, assicurando che i metodi descritti in questo articolo sono rilevanti per molti anni a venire.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da Research Corporation per l'avanzamento scientifico (Cottrell College Scholar Award n. 22548) e da TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris HCl Promega H5123
Tris Base Promega H5131
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
Acetylated BSA Promega PR-R3961
KCl Sigma P4504
Dithiothreitol (i.e. DTT) Research Products International D11000
Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) Sigma 03690-100mL
Glycerol Sigma G5516
Formamide Acros AC42374-5000
Orange G Sigma Aldrich O3756
Bromophenol blue Fisher Scientific 50-701-6973
dNTPs Fisher Scientific FERR0191
M-dNTPs (riboNTPs) Fisher Scientific 45-001-341 (343, 345, 347)
M-dNTPs (all other modified NTPs) TriLink Biotechnologies assorted
primer 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA
template 1 IDT DNA / TriLink Biotechnologies Custom Syntheses We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA
Acrylamide Research Products International A11405 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide
Tris/Borate/EDTA (TBE) solid Research Products International T22020
Urea ultrapure Research Products International U20200
Gel tape CBS Scientific GT-72-10
Large white spring clamp polypropylene CBS Scientific GPC-0001
Ammonium persulfate (APS) Fisher Scientific BP179
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Fisher Scientific BP15020
0.75 mm spacers CBS Scientific SGS-20-0740A
33x42 Notched Glass Plate Set CBS Scientific SGP33-040A
Wedge plate separator CBS Scientific WPS-100
Comb for gel electrophoresis CBS Scientific SG33-0734
Gel electrophoresis rig CBS Scientific SG-400-33
ultrapure water we use a Milli-Q system from Millipore
DNA polymerases we prepare these in our laboratory using published protocols.

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References

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