In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones

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Summary

Mitofagia, el proceso de claro dañaado las mitocondrias, es necesario para el mantenimiento de la homeostasis y salud mitocondrial. Este artículo presenta algunas de la mitofagia últimos métodos de detección en células humanas, Caenorhabditis elegansy los ratones.

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Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

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Abstract

Las mitocondrias son las centrales de las células y producen energía celular en forma de ATP. La disfunción mitocondrial contribuye al envejecimiento biológico y una amplia variedad de enfermedades incluyendo enfermedades metabólicas, síndromes de envejecimiento prematuro y las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA) y enfermedad de Parkinson (EP). Mantenimiento de la salud mitocondrial depende de la Biogénesis mitocondrial y la liquidación eficiente de las mitocondrias disfuncionales a través de mitofagia. Métodos experimentales para detectar con precisión la autofagia/mitofagia, especialmente en modelos animales, han sido un desafío para desarrollar. Recientes avances hacia la comprensión de los mecanismos moleculares de la mitofagia ha permitido el desarrollo de técnicas de detección de mitofagia novela. Aquí, presentamos varias técnicas versátiles para monitorear la mitofagia en células humanas, Caenorhabditis elegans (p. ej., Rosella y DCT-1 / IgG-1) y ratones (mt-Keima). Una combinación de estas técnicas de detección de mitofagia, incluyendo la evaluación de la especie, mejorará la precisión de las mediciones de la mitofagia y conducir a una mejor comprensión del papel de la mitofagia en salud y enfermedad.

Introduction

Mitofagia es esencial para el mantenimiento mitocondrial. Las mitocondrias entrecruzan múltiples vías de señalización de la célula y son organelos subcelular universales responsables de la producción de energía celular, metabolismo celular y calcio homeostasis1,2,3, 4. las mitocondrias constantemente enfrentan desafíos de fuentes endógenas y exógenas, como las especies reactivas del oxígeno (ROS) y tóxicos mitocondriales, respectivamente, que conducen a la generación de las mitocondrias disfuncionales y "envejecidas". Acumulación de mitocondrias dañadas disminuye la eficiencia de la producción de ATP mientras que aumenta la cantidad de ROS nocivos y se ha relacionado con enfermedades relacionadas con la edad, como enfermedades metabólicas, AD y PD1,5,6 . Para evitar que las mitocondrias inducido por la disfunción celular, las células necesidad reconocer específicamente dañan las mitocondrias y eliminarlos eficientemente a través de un proceso celular denominado autofagia mitocondrial (mitofagia). Esto demuestra la importancia de la mitofagia en salud y la enfermedad ilustra la necesidad de métodos precisos y eficaces para detectar mitofagia in vitro e in vivo.

Mitofagia es un proceso de varios pasos en muchas proteínas y proteínas complejos5,7,8. En Resumen, una mitocondria dañada primero reconocido y envuelto por una doble membrana phagophore, que puede originar de la membrana plasmática, retículo endoplasmático, aparato de Golgi, núcleo o mitocondria sí mismo9,10. El phagophore esférico se alarga y finalmente sella las mitocondrias en el interior, constituyendo la autophagosome mitocondrial (mitophagosome). El mitophagosome entonces se fusiona con los lisosomas para su degradación, formando un autolysosome en el que la mitocondria dañada es degradada y reciclado7,8. Principales proteínas autofagia también implicadas en la mitofagia incluyen: autofagia relacionados 7 (ATG7) y Beclin1 (iniciación), proteína de Microtubule-Associated 1A/1B-luz cadena 3 LC3-II (IgG-1 C. elegans) y p62 (componentes de phagophore), y glicoproteína de membrana lisosomal asociado 2 (LAMP2)6,7. Además, hay varias proteínas esenciales exclusivo de mitofagia, incluyendo PTEN-inducida supuesta Kinase 1 (color de rosa-1), proteína Nuclear del punto 52 kDa (NDP52), Parkin1, optineurin, BCL2 interacción proteína 3 como (NIX/BNIP3L) (DCT-1 en C. elegans), entre otros5,6,11.

Un método común para detectar cambios en los niveles de la autofagia es la relación de LC3-II/LC3-I o LC3-II/actina. Sin embargo, este método es inespecífico, como un aumento en esta proporción puede reflejar una iniciación mayor o una alteración fusión de mitophagosome a lisosoma12. Otro método es evaluar la colocalización entre un marcador de la autofagia (p. ej., LC3) y una proteína mitocondrial (p. ej., Translocasa de exterior mitocondrial membrana 20 (TOMM20, que podrían ser degradados por proteasomas)). Sin embargo, esto sólo puede indicar cambios en los niveles de la mitofagia total y no puede distinguir los pasos en que bloqueo ocurre. Esto puede aclararse utilizando lysosomal inhibidores (por ejemplo, A E64d + Pepstatin, denominada EP) en paralelo para causar la acumulación de mitophagosomes. La diferencia entre el número de mitophagosomes al inicio del estudio y el número de mitophagosomes después del tratamiento con EP puede indicar mitofagia. Estas limitaciones han impulsado el desarrollo de técnicas de detección de mitofagia novela. Teniendo en cuenta la importancia creciente de la mitofagia en un amplio espectro de enfermedades humanas, presentamos varias técnicas de detección de mitofagia robusto que pueden ser útiles para los investigadores. Cubren técnicas tanto in vitro e in vivo y recomendar la combinación de múltiples técnicas para verificar cambios de mitofagia.

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Protocol

Animales (ratones machos y hembras) fueron nacidos y criados en un Animalario acreditado, en conformidad y aprobación del Comité de uso y cuidado de animales de NIH. Métodos de eutanasia deben ser coherentes con las regulaciones nacionales e institucionales.

1. detección de la mitofagia en células humanas

  1. Detección de mitofagia usando mt-Keima plásmido
    Nota: La proteína de Keima, fusionada a una señal de destino de las mitocondrias, simplificada como mt-Keima, ha demostrado ser útil para la detección de mitofagia en vivo . MT-Keima es una proteína fluorescente sensible al pH radiométrica que exhibe fluorescencia verde (excitación 458 nm) en condiciones neutras o básicas y fluorescencia roja (excitación 561 nm) en condiciones ácidas. Las mitocondrias sanas prosperan en condiciones básicas o neutro (pH 7-8) y se indican mediante fluorescencia verde cuando transfected con mt-Keima. Cuando las mitocondrias sufren mitofagia y se fusionan con lisosomas ácidas, el pH disminuye a 4.5 y mitocondrias que contienen mt-Keima exhiben fluorescencia roja6,13,14. Lo importante, mt-Keima es resistente a las proteasas lisosomales, que permite la evaluación de la mitofagia durante períodos más prolongados. El protocolo a continuación está diseñado para placas de 6 pocillos.
    1. Día 1: Utilizar células humanas primarias (por ejemplo, fibroblastos) o células humanas inmortalizadas (p. ej., células Células Hela o U2OS). Semillas aproximadamente 0.3-1 × 106 células/pozo (dependiendo de la tasa de crecimiento de la célula para permitir que las células llegar a la confluencia de 70% en el día siguiente) en una placa de 6 pozos. Mantener las células en el medio de cultivo celular completa (modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado de Dulbecco con 10% FBS y 1% mezclan solución de penicilina-estreptomicina) e incubar en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Añadir 1 mL medio de cultivo de célula completa/bien en una placa de 6 pozos.
      Nota: Gen sobreexpresión/caída o drogas tratamientos se pueden hacer en esta etapa6.
    2. Día 2: Mezcla de ADN de plásmido de Keima mt6 y reactivo de transfección de DNA (la mezcla para un pozo de una placa de 6 pozos).
      1. Diluir 15 μl de un reactivo de transfección de DNA con 150 μL de medio sin suero según protocolo del fabricante.
      2. Diluir 2-5 μg de ADN del plásmido de Keima mt con 150 μL de medio sin suero.
      3. Añada plásmido diluido mt-Keima al reactivo de transfección de ADN diluido, vortex por 10 s e incubar 10 min a temperatura ambiente.
        Nota: Optimización de las condiciones de la transfección de ADN puede ser necesario dependiendo del tamaño de la placa (ver protocolos de los fabricantes para más detalles).
      4. Añadir gota a gota mezcla de reactivo de transfección/ADN a las células, luego agitar las placas suavemente durante 5-10 s hasta que la solución se mezcla completamente.
    3. Día 3: Cambiar los medios de comunicación, sustituyendo el medio que contiene el reactivo de transfección de ADN por medio de cultivo fresco de la célula completa (1 mL/pocillo).
    4. Día 4: Imagen de las células mediante microscopía confocal6. Utilizar dos canales de imagen: canal verde (excitación 458 nm, emisión 695 570 nm) para visualizar las mitocondrias normales y el canal rojo (excitación 561 nm, emisión 695 570 nm) para visualizar las mitocondrias en el proceso de mitofagia. Imagen al azar de 20 zonas con 40 aumentos para cubrir un total de 100-200 células en cada pozo.
    5. Realizar análisis de datos. Calcular el "índice de mitofagia" (porcentaje de mitocondrias en la mitofagia), utilizando software de análisis de imagen para cuantificar la cantidad de fluorescencia en los canales rojo y verdes: tomar la razón de fluorescencia roja a fluorescencia rojo + verde, y multiplique por 1006.
      Nota: Alternativas a la transfección incluyen el uso de TA-Keima estable expresado de la célula HeLa líneas14. Puesto que las células HeLa no expresan Parkin, Parkin debe expresarse estable para estudiar Parkin-dependiente de la mitofagia en esta línea celular.
  2. Detección de mitofagia usando la colocalización entre citocromo C Oxidasa subunidad II (COXII) y LAMP2
    Nota: COXII es una proteína de membrana interna mitocondrial codificada por el genoma. El 'índice de mitofagia' es igual a la proporción de COXII colocalized con LAMP2 expresado como un porcentaje de la cantidad total de COXII.
    1. Las células HeLa (u otras células de interés mencionado en el paso 1.1.1) de la semilla en una diapositiva de cámara 4-well (1-5 × 104 células en 1 mL medio de cultivo de célula completa/pozo) en una celda de la incubadora a 37 ° C (20% O2, 5% CO2) de la cultura durante la noche.
    2. Añadir 3.0 μL de carbonilo de 10 mM - 4-(de trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), cianuro e incubar en la incubadora de la cultura de célula (paso 1.2.1) durante 3 horas.
      Nota: Pueden utilizarse otros fármacos que afectan a la mitofagia.
    3. Retire el medio de cultivo utilizando una pipeta de 1 mL, lavan las células dos veces con 1 mL/pozo de frío (0-4 ° C) 1 x PBS. Deje que la solución repose durante 10-30 s antes del siguiente lavado. Luego añadir paraformaldehido de 3,7% 0,5 mL (PFA) de 1 x PBS a cada pocillo e incubar por 10 min en hielo para fijar las células.
      PRECAUCIÓN: El PFA es la toxina. Trabajar en una campana de humos cuando se utiliza PFA.
    4. Deseche la solución PFA con una pipeta de 1 mL, lavan las células dos veces con frío 1 X PBS (1 mL/pozo; deje que la solución repose durante 10 s antes del siguiente lavado) y permeabilizar las células con 1 mL o bien de la 0.25% detergente (1 x PBS) durante 10 min en hielo.
    5. Desechar el tampón permeabilizing, lave suavemente las células dos veces con frío 1 x PBS y descarte (deje la solución reposar por 10 s entre lavados). Bloquear las células con 1 mL o de 5% FBS en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C. Cubierta de las cámaras para evitar la pérdida de humedad.
    6. Preparar 0,5 mL/pozo de una solución de anticuerpos mixtos con COXII (ratón, dilución de 1: 250) y el anticuerpo LAMP2 (conejo, dilución 1:20-1:50) en PBS 1 x con 5% FBS y tienda en el hielo de 0.5-1 h.
    7. Sacar el portaobjetos de la cámara de 4 pozos de la cámara fría y deseche la solución de bloqueo con una pipeta de 1 mL. Lave suavemente las células dos veces con 1 mL/pozo de frío 1 x PBS y descarte (deje la solución reposar por 10 s entre lavados), luego añada 0,5 mL/pozo de solución de anticuerpos mixtos. Incubar a 37 ° C por 1 h en un agitador a baja velocidad.
    8. Deseche la primera solución de anticuerpo utilizando una pipeta de 1 mL y suavemente lavar las células 3 veces con 1 mL/pozo de PBS 1 x frío y deseche. Deje que la solución se encuentra por 10 s antes del siguiente lavado. Añadir 1 mL/pocillo de anticuerpos secundarios fluorescentes (p. ej., cabra anti-conejo nm de longitud de onda 568 de proteína fluorescente roja (RFP) para LAMP2; y cabra anti-ratón con longitud de onda 488 nanómetro de la proteína verde fluorescente (GFP) para COXII) en dilución 1: 250 con 5% FBS en PBS 1 x. Cubrir el portaobjetos de la cámara de 4 pozos con papel de aluminio e incubar a 37 ° C por 1 h en un agitador a baja velocidad.
    9. Descartar la segunda solución de anticuerpo con una pipeta de 1 mL. Lave suavemente las células seis veces con 1 mL/pozo de PBS 1 x fría. Deje la solución reposar durante 1 minuto antes del siguiente lavado.
    10. Monte las células con 50 μL/pocillo antifade de medio de montaje con DAPI y añadir el cubreobjetos.
    11. Imagen de las células bajo un microscopio confocal con 66 x aumentos con aceite de inmersión (azulejo escanea / mosaicos se pueden usar para aumentar el número de células reflejada por el software). Utilizar la misma configuración como el tiempo de exposición de la canal, ganancia digital, offset digital, etc. a lo largo de la proyección de imagen de todo los procesos (ver instrucciones de software para más detalles)15.
    12. Software de análisis de colocalización de uso analizar cuantitativamente al menos 20 imágenes aleatorias de 100 células15. Utilice la función "Curva cerrada" para seleccionar todas células individuales. Comparar el coeficiente de colocalización de Pearson de GFP RFP, ponderada o sin ponderación, para determinar los niveles de la mitofagia en las células analizadas. Mantener valores de punto de mira horizontal y vertical de lo software de análisis de colocalización en todo análisis. Para ajustar con precisión estos cruces, preparar dos juegos adicionales de las células y la etiqueta uno COXII y el otro LAMP2. A continuación, establezca el punto de mira directamente encima de la distribución de píxeles para cada canal15 (ver instrucciones de software para más detalles).
  3. Un alto rendimiento de medición para la detección de la mitofagia
    Nota: Realizar pantallas de alto rendimiento de mitofagia inducir o inhibir la mitofagia compuestos de grandes bibliotecas compuestas es técnicamente exigente. Una técnica de imagen basada en la colocalización de mitocondrias con autophagosomes es una alternativa más simple, pero muy sensible para mitofagia detección16.
    1. Día 1: Semilla de células (por ejemplo, fibroblastos humanos primarios en 5.000 células/100 mL célula medios de cultivo/pozo) en una placa de 96 pocillos (ver paso 1.1.1).
    2. Día 2: Tratamiento de las células desde el segundo día con FCCP u otros compuestos de interés para el tiempo de incubación designado (ver paso 1.2.2).
    3. Siga los pasos 1.2.2-1.2.9 con los anticuerpos primarios para COXII (ratón, dilución de 1: 250 con 5% FBS en PBS 1 x) y LC3B (conejo, 1: 100-dilución 1: 200 con 5% FBS en PBS 1 x). Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos primarios para COXII y LAMP2.
    4. Imagen de las células usando un lector fluorescente16. Recoger imágenes en áreas colocadas al azar y con un mínimo 500 células/pozo.
    5. Analizar los datos usando una célula analizador personalizado protocolo16.

2. detección de la mitofagia en C. elegans

Nota: El nematodo C. elegans proporciona una plataforma para ensayo mitofagia nivel organismal. Dos cepas pueden utilizarse para monitorizar la mitofagia: Rosella (1) dirigidos a las mitocondrias (mtRosella) o (2) mitofagia receptor DCT-1 fusionada con GFP junto con marcador de autophagosomal IgG-1 fusionado con Discosoma SP. proteína fluorescente roja (DsRed)5, 17.

  1. Mitofagia monitoreo utilizando biosensores de Rosella
    Nota: Rosella es un biosensor molecular que combina un pH insensible DsRed fusionado a una variante de la GFP de pH-sensibles. El biosensor de Rosella aprovecha las diferencias de pH entre el lisosoma ácido (pH ~ 4.5) y otros compartimentos celulares. Este biosensor se ha utilizado para controlar con éxito la mitofagia en Saccharomyces cerevisiae y varias líneas de células de mamífero, como HeLa, HEK293 y HCT11618,19. Hemos adaptado este reportero versátil de doble fluorescente y genera transgénicos C. elegans nematodos expresando Rosella orientada a las mitocondrias (mtRosella) en células de músculo de la pared del cuerpo. Inducción de mitofagia está indicada por una reducida proporción GFP/DsRed de fluorescencia mtRosella.
    1. Día 1: Recoger las larvas L4 de gusanos expresando Rosella orientada a las mitocondrias (mtRosella) en las células de músculo de la pared del cuerpo sobre una placa de Media de crecimiento de nematodos (NGM) con e. coli (OP50) utilizando un microscopio de disección5. Coloque 10-20 gusanos/placa en al menos tres placas de 3,5 cm. Incubar los nematodos a la temperatura estándar de 20 ° C5.
      Nota: Consulte la referencia de la anatomía de la lombriz, incluyendo la identificación de las larvas L420, y la manera de hacer una selección que se utiliza para transferir gusanos de un lugar a otro de21.
    2. Día 5: Sincronizar nematodos mediante la selección de 15-20 larvas transgénicas de L4 y transferir en fresco OP50 sembrado placa de NGM. Utilice por lo menos cinco placas por condición experimental.
    3. Día 7: Prepare placas de vehículo para drogas que afectan la mitofagia de interés o controles positivos.
      1. Mata a las bacterias e. coli (OP50) sembradas por exponer planchas NGM durante 15 min con 222 μW/cm2 (intensidad) de la luz UV para asegurar que los compuestos inductores de mitofagia no son metabolizados por las bacterias. Las placas deben ser expuestas con 2.000 J/m2.
        Nota: Segundos de exposición necesaria = 2.000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Añadir establecidos de interés a la parte superior de las placas sembradas de NGM. Agregar una cantidad equivalente de vehículo compuesto (disolvente usado para disolver compuestos, como el dimetilsulfóxido (DMSO)) a las placas del vehículo como un control negativo. Para el control positivo de la mitofagia inducción, un tóxicos mitocondriales, se utilizó paraquat (concentración final de 8 mM). Agregar una solución que contiene 10 μl del stock de paraquat de 8 M con 190 μl de ddH2O en la parte superior de la placa de agar para el grupo de tratamiento. Para el grupo de vehículo, añadir una solución que contiene 10 μl de DMSO con 190 μl de ddH2O en la parte superior de la placa de agar.
        Nota: La solución de trabajo de paraquat puede conservarse durante 1 mes a 4 ° C.
      3. Agite suavemente las placas hasta la droga o vehículo cubre toda la superficie. Permita que las placas se seque con los párpados cerrados a temperatura ambiente durante al menos 1 h antes de transferir los gusanos.
        Nota: Las placas de drogas también pueden prepararse mediante la adición de fármacos en la NGM líquido antes de que se solidifica.
    4. Día 7: Traslado 10-20 de 2 días de edad adultos animales transgénicos preparados en el paso 2.1.2 a las placas que contienen ya sea paraquat, del interés, o vehículo (DMSO) establecidos. Incubar los animales transgénicos a 20 ° C durante 2 días.
    5. Día 9: Preparar pastillas de agarosa al 2% (véase el Material suplementario). Añada una gota (10 μl) de 20 mM levamisol en M9 por el cojín. Inmovilizar los animales transgénicos para la proyección de imagen, colocándolos en la caída de la M9-levamisol. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre la parte superior.
    6. Capturar animales transgénicos solo mediante una cámara acoplada a un microscopio de epifluorescencia. Adquisición de imágenes fluorescentes de nematodos toda transgénicas expresando mtRosella en las células musculares de pared de cuerpo de aumento de 10 X5. Guardar las imágenes recogidas.
    7. Procesar las imágenes adquiridas con el software ImageJ. Analizar las células del músculo de pared del cuerpo situadas en la cabeza del gusano para evitar autofluorescencia en el tejido intestinal. Medir el área pixel media intensidad valor y total para cada imagen fluorescente sólo de la región de la cabeza de cada animal. Analizar el área específica de interés:
      1. Seleccione 'split canal' en el menú desplegable 'imagen' y 'color' para convertir imágenes.
      2. Utilizar la herramienta 'selección a mano alzada' para capturar la zona fluorescente de interés.
      3. Seleccione el comando 'medición' en el menú desplegable 'analizar' y realizar análisis de intensidad del píxel.
      4. Intensidad del píxel debe normalizarse dividiendo la intensidad por el área total analizado. Sobre normalización, calcular la GFP a DsRed cociente22.
    8. Utilizar análisis estadístico software a cualquiera realizar estudiante t-pruebas (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con p < 0,05 como significativo5,17 .
  2. Evaluación de mitofagia usando colocalización entre DCT-1 y la IgG-1
    Nota: DCT-1 es una proteína de la membrana mitocondrial externa que actúa como un receptor de la mitofagia en respuesta al estrés condiciones, similares a su supuesta orthologues BNIP3 y NIX/BNIP3L en mamíferos5. Así, iniciación de mitofagia es evaluado por colocalización entre DCT-1 mitofagia receptor y autophagosomal la membrana proteína IgG-1 (homólogo de los mamíferos LC3).
    1. Día 1: Larvas L4 Pick de los animales transgénicos expresando DCT-1::GFP y DsRed::LGG-1 en la pared del cuerpo muscular células5 en un OP50 sembradas placa de NGM. Coloque 5-10 gusanos/3.5 cm placa y utilizar al menos tres platos. Incubar los nematodos a 20 ° C.
      Nota: Los transgenes se encuentran en plásmidos separados y no están integrados en el genoma. Recoger los nematodos llevar marcadores de contransformation rol-6(su1006) y p2 de myo GFP. Sólo gusanos transgénicos con ambos marcadores contransformation expresan DCT-1::GFP y DsRed::LGG-1 en células de músculo de la pared del cuerpo.
    2. Siga los pasos de 2.1.2-2.1.5.
    3. Imagen solo pared del cuerpo las células musculares mediante una cámara acoplada a un microscopio confocal5,23. Detectar los bordes de las células musculares de pared de cuerpo entero y z-pila de tomar imágenes bajo 63 aumentos. También pueden utilizar aumentos mayores.
    4. Abrir y procesar imágenes adquiridas con el confocal software. Iniciación de mitofagia está indicado por la localización de los receptores de la mitofagia (DCT-1::GFP) para el marcador autophagosomal (DsRed::LGG-1). Medir manualmente eventos de co-localización de cada pila de la pared del cuerpo muscular celular5. Es esencial para mantener todos los ajustes microscopio y cámara (lente y lupa, los filtros, el tiempo de exposición, resolución, intensidad de láser, ganancia, etc.) constante a lo largo de los experimentos. Señalar todos los ajustes.
    5. Utilizar análisis estadístico software a cualquiera realizar estudiante t-pruebas (comparación entre dos grupos) o ANOVA (comparación entre varios grupos) para el análisis estadístico con p < 0,05 como significativo5,17 . Para comparaciones de dos vías de la Student t-test (p < 0,05 se considera significativa). Para comparaciones múltiples, utilice el análisis de varianza de un factor (ANOVA), corregido por la prueba post hoc de Bonferroni. Se recomienda analizar por lo menos 50-70 animales o células del músculo de pared corporal 30-50 para cada condición experimental. Repetir el experimento por lo menos tres veces.

3. detección de la mitofagia en ratones

Nota: Los métodos anteriores para detectar la mitofagia en ratones eran engorrosos, insensible y difíciles de cuantificar. Un modelo de ratón transgénico expresa la forma mitocondrial dirigida del reportero fluorescente Keima (mt-Keima) ahora puede ser utilizado para evaluar los niveles de la mitofagia en una amplia gama de condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.

  1. Eutanasia a ratones utilizando un protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal14.
  2. Asegure el ratón (ventral hacia arriba) a la plataforma de trabajo usando las clavijas en las extremidades. Hacer una incisión en la parte inferior del abdomen usando microcirugía tijeras y fórceps para exponer el hígado24. Cortar un trozo de hígado (p. ej., un trozo de lóbulo derecho en 1 × 1 × 1 cm) utilizando tijeras de microcirugía y pinzas.
    Nota: Detección de la mitofagia en ratones es complicada y requiere conocimientos sobre anatomía del ratón y ratón muy hábil manipulación y cirugía de ratón. Este protocolo proporciona los pasos básicos, claves en este método, y un método más detallado está disponible las24.
  3. Coloque la muestra de hígado en una placa de metal en el hielo para enfriar rápidamente el tejido. Mantener el tejido en la placa de metal frío y procesar lo antes posible. Óptimo, use dentro de 1 h de la disección.
  4. Levante el hígado muestra con unas pinzas curvas y lavar con 5 mL de helado de 1 x PBS.
  5. Transferir el hígado a una placa Petri (Ø 100 mm) de hielo usando el extremo de la cuchara de una espátula.
  6. Cortar la muestra de hígado a mano en 0.5-1 secciones de espesor mm con las láminas single-edge.
  7. Cuidadosamente transfiera las secciones de tejido a un plato de fondo de cristal con unas pinzas de microcirugía.
  8. Ajuste cuidadosamente la sección de hígado con pinzas para aplanar en la parte inferior.
  9. Cubrir el hígado rebanado con 3-5 gotas de PBS 1 x fría.
    Nota: Tinción DAPI se recomienda identificar la región de interés en ciertos tejidos (p. ej., cerebro)24. Para validar la localización de la señal de red mt-Keima con el lisosoma, tintes lisosomales, como cascada azul de dextrano y el lysosensor, pueden ser usado24.
  10. Imágenes de las secciones de tejido bajo microscopia confocal mediante dos excitaciones secuenciales24. Establecer dos canales de imagen: "verde" mt-Keima canal (excitación 458 nm, emisión 570-695 nm rango) y mt-Keima "rojo" (excitación 561 nm, rango de emisión 695 570 nm). Mantener la proyección de imagen ajustes entre las condiciones experimentales. Para la proyección de imagen más eficiente, analizar dos animales a la vez.

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Representative Results

Detección de la mitofagia en células humanas:

Utilizando el procedimiento presentado aquí, las células humanas HeLa fueron transfectadas con mt-Keima plásmido. Las células sanas demostraron una bien organizada red mitocondrial (GFP, 488 nm) con pocas incidencias de mitofagia (RFP, 561 nm). Sin embargo, las células pretratados con un uncoupler mitocondrial FCCP (30 μm por 3 h) exhibió un profundo aumento en incidencia de mitofagia (figura 1A). Mitofagia también se midió usando la colocalización entre LAMP2 y COXII (figura 1B).

Detección de la mitofagia en C. Elegans

Examinamos el músculo de la pared del cuerpo células de transgénicos nemátodos expresan DsRed fusionado con LGG-1 mtRosella o DCT-1 fusionadas con GFP bajo condiciones normales y mitofagia induce estrés oxidativo. Animales transgénicos fueron expuestos al paraquat (8 mM para 2 días). Inducción de mitofagia está indicada por el cociente GFP/DsRed disminución de mtRosella fluorescencia (figura 2A). Además, el elevado número de eventos de colocalización entre DCT-1::GFP y DsRed::LGG-1 señales significa estimulación de la mitofagia en respuesta a estrés oxidativo (figura 2B).

Detección de mitofagia usando los ratones mt-Keima:

Análisis de la mitofagia en vivo la proyección de imagen proporciona una idea de la mitofagia en condiciones normales y fisiopatológicas. Utilizando el protocolo descrito, ocurrencia de la mitofagia en tejidos de diferentes órganos, como hígado y cerebelo (figura 3), puede ser visualizado con mitofagia confocal.

Figure 1
Figura 1. Diferentes métodos para evaluar la mitofagia en células humanas. (A) humano HeLa células fueron transfectados con mt-Keima plásmido durante tres días, seguido de la proyección de imagen en ambos 488 nm y 561 nm. Como control positivo, ceflls fueron tratados con antes del FCCP (30 μm) 3 h a la proyección de imagen. (B) imágenes de fibroblastos primarios humanos manchados con LAMP2 (RFP) y COXII (GFP). (C) imágenes de fibroblastos humanos, teñidas con anti-TOM20 (rojo) y los anticuerpos anti-LC3 (verde). Las barras de la derecha muestran la lectura de la mitocondria co localización con autophagosomes. Co-localización es aumentado por el estrés energético (media libre de glucosa galactosa) y la adición de inhibidores lisosomales E64d y Pepstatin A (EP) para las barras de escala representativo de 24 h. para (A), (B) y (C) están marcados en el último figura de cada panel, de forma independiente. Datos cuantitativos se presentan en media ± SEM ***p < 0.001; t-test. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Detección en vivo de la mitofagia en C. elegans. (A) nematodos transgénicos expresando mtRosella en células de músculo de la pared del cuerpo fueron tratados con paraquat de 8 mM. Estimulación de mitofagia está representada por la disminución relación GFP pH-sensibles a pH-insensible DsRed (n = 50; ***p < 0.001; t-test). Puntas de flecha señalan autofluorescence intestinal. Barras de escala denotan 20 μm. detalles de adquisición: tiempo de exposición, 200 ms; Contraste medio. Imágenes fueron adquiridas con un objetivo de 10 X. Datos cuantitativos se presentan en valores de media ± SEM. (B) nematodos transgénicos expresando co receptor mitofagia que DCT-1 fusionado con GFP junto con la proteína de autophagosomal que IgG-1 fusionados con la DsRed en células de músculo de la pared del cuerpo fueron expuestos al paraquat de 8 mM. Inducción de mitofagia está representada por co-localización de GFP y DsRed señales (para cada grupo de imágenes DCT-1 se muestra en verde, autophagosomes en rojo abajo, y una imagen combinada en la parte inferior; n = 30; ***p < 0.001; t-test). Bares venta denotan 20 μm. detalles de adquisición: resolución 1.024 X 1.024; Amo ganar, Track1: 562 y Track2: 730; Filtros de emisión, Track1 canal1: 639 nm y Track2 CANAL2: 519 nm; Láser de intensidad, Track1 (543 nm): 12,9% y el Track2 (488 nm): 39.4%. Imágenes fueron adquiridas con un objetivo de X 40. Datos cuantitativos se presentan en media ± SEM haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Detección en vivo de la mitofagia en ratones transgénicos Keima mt. Imágenes representativas de las señales mt-Keima en el hígado (superior) y cerebelo (incluyendo las células de Purkinje, panel inferior) de un ratón mt-Keima (458 nm, verde; 561 nm, rojo). Barra de escala indica 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Medición precisa de mitofagia técnicamente es exigente. Aquí, hemos presentado varias técnicas robustas que permiten ambos detección cualitativa de mitofagia y cuantificación de los niveles de la mitofagia en los modelos experimentales de laboratorio más comunes.

Para obtener datos reproducibles, es necesario un diseño experimental con al menos tres repeticiones biológicas. Todos los investigadores involucrados en la experimentación y análisis deben ser cegados a identidades de grupo experimental. Además, campos de imagen debe ser elegido al azar durante la adquisición de la imagen. Para cultivo de células y estudios de C. elegans , se deben realizar al menos tres repeticiones biológicas. Para Keima mt estudios con ratones, se recomienda utilizar un número suficiente de ratones para alcanzar significación estadística. Para células de mamífero, analizar 30-100 células para cada experimento y ejecutar por lo menos 3 diferentes experimentos. Control de calidad en estos pasos permite resultados reproducibles. Detección de la mitofagia en levadura ha sido recientemente resumida en otra parte25.

Hay varios pasos críticos en las técnicas de detección en vitro mitofagia. Eficiencia de la transfección, que depende de la calidad de los reactivos y el ADN utilizado, es de vital importancia durante la transfección de la proteína mt-Keima. Así, la optimización de la eficiencia de transfección en diferentes condiciones (por ejemplo, utilizando líneas celulares diferentes) es necesario. Para el método LAMP2/COXII, especificidad de anticuerpo y doblez de dilución óptima del anticuerpo primario afectan la calidad de las imágenes y deben probarse antes de comenzar los experimentos. Lo mismo ocurre con el método de imagen de alto contenido, donde la calidad del anticuerpo y la dilución son cruciales. El sistema de microscopía automatizada y el protocolo de análisis modificado para requisitos particulares permite la proyección de imagen y análisis de por lo menos 1.500 células/condición, lo que hace que los resultados extremadamente robustos en comparación con otros en vivo basado en métodos de imagen. Además, el protocolo de análisis proporciona datos más mitocondrial parámetros como longitud y total área sobre una base de la celda por celda, que es altamente útil en la investigación de la mitofagia.

En algunos casos, no se recomienda analizar la colocalización de LAMP2 con proteínas de la membrana externa mitocondrial como TOMM20. Las primeras etapas de la mitofagia implican Parkin mediada por la ubiquitinación de proteínas de membrana externa mitocondrial, incluyendo TOMM20 y Mitofusina 1 (MFN1). Parkin conjuga múltiples vínculos de cadena de ubiquitina diferentes en estas proteínas incluyendo las cadenas de ubiquitina K48-ligado, que promueven la degradación de las proteínas por el proteosoma 26S. Por lo tanto, estas proteínas de membrana externa mitocondrial ubiquitinated todavía pueden ser degradadas a pesar de mitofagia es bloqueado6. Esto puede sesgar los datos, dando lugar a falsos positivos en la interpretación de los datos generales. Además, la eliminación de la DNA mitocondrial (mtDNA nucleoids) es un segundo indicador de la mitofagia y puede ser cuantificada por inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-ADN del6.

Algunos pasos críticos para el seguimiento en vivo de la mitofagia en C. elegans se enumeran a continuación:

1. traslado de animales transgénicos a nuevas placas que cada 24-48 h se recomienda para evitar la consecuencia de progenie, que conduce a una población mixta o inanición, que sí mismo puede desencadenar mitofagia. Por lo tanto, deben utilizarse nematodos no muerto de hambre.

2. levamisol es un anestésico suave que se utiliza para inmovilizar nematodos. Evitar anestésicos que puedan afectar la actividad mitocondrial, como la azida de sodio. Azida de sodio bloquea los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial y perturba la generación de energía, conduce a estrés oxidativo y mitocondrial. Así, azida sódica suele desencadenar mitofagia.

3. las muestras no deben secarse durante la examinación microscópica. Por lo tanto, se recomienda el uso de buffer M9 en lugar de agua para asegurar condiciones favorables de osmóticas.

4. intestinal autofluorescence aumenta con la edad en C. elegans. Así, las células de músculo de la pared del cuerpo cerca del intestino deben ser evitadas durante la examinación microscópica.

5. Si el paraquat no inducir mitofagia: a. aumentar el tiempo de exposición de paraquat en gusanos, b. aumento de la concentración de paraquat, o c. preparar una nueva solución de trabajo de paraquat ya que su eficacia disminuye con el tiempo.

6. Si aumenta la eclosión matricidal observa en gusanos expuestos al paraquat, ya sea: a. reducir el período de tratamiento de paraquat, b. reducir la concentración de paraquat, c. suplemento placas con fluorodeoxyuridine (FUdR) (final concentración de 100-400 μM), un inhibidor de la síntesis de ADN que impide la eclosión del huevo, o d. realizar el experimento en gusanos mayores (por ejemplo, gusanos de 4 días de edad).

Este procedimiento describe los pasos para la proyección de imagen mitofagia en el hígado con los mt-Keima ratones transgénicos, como se muestra en la figura 3. Los tejidos excepto el cerebro y el hígado han sido analizados mediante el sistema de Keima mt14. Proyección de imagen de doble excitación relación en tejidos del hígado se obtiene mediante dos excitaciones secuenciales. Todas las imágenes deben obtenerse de órganos recién suprimidos. Los tejidos examinados deben mantenerse frías y procesadas lo antes posible. Rebanadas de hígado pueden obtenerse a cualquier edad. Cuando la proyección de imagen mitofagia, optimizar tiempos de poderes y la exposición de láser para cada órgano durante análisis microscópico. Energía del laser se fijase en la salida más baja que permite la clara visualización de la señal de Keima mt14. Sin embargo, existen algunas limitaciones para los ratones transgénicos mt-Keima. Debido a la inestabilidad de Keima, así como la pérdida de un gradiente de pH a través de la membrana lisosomal en fijación, este modelo de ratón no es apto para seccionamiento crio e inmunohistoquímica. Otra limitación es que mt-Keima, o agregados de la matriz de esta proteína pueden afectar funciones mitocondriales o celulares desconocidas, aunque no cambia de tarifa de consumo de oxígeno mitocondrial14. Además, el tiempo y costo asociados con TA-Keima ratones hacen menos deseable para el análisis de alto rendimiento que el cultivo celular mencionado y métodos de C. elegans . Además de los métodos mencionados aquí, otras maneras de estudiar cuantitativamente la mitofagia en mt-Keima ratones incluyen Western blot o FACS. Tener en cuenta, además de los ratones transgénicos mt-Keima, hay otro modelo de ratón de la mitofagia, el "mito- control de calidad", un modelo de ratón transgénico con una señal mitocondrial fluorescente sensible al pH26. Debido a la complejidad y dinámica de la mitofagia, recomendamos la combinación de los métodos de fluorescencia antes mencionados con otros métodos de detección de mitofagia comunes, tales como la microscopia electrónica y de Western Blot, para fortalecer los resultados.

El desarrollo de nuevas técnicas de detección de mitofagia como los aquí mencionados tendrán amplias aplicaciones, desde estudios mecanísticos de la mitofagia en pantallas de drogas de alto rendimiento. Cabe señalar que mitofagia se ve afectado por las fluctuaciones endógenas y exógenas (por ejemplo, las condiciones de cultivo celular como densidad celular, hambre, hipoxia, etcetera.) 1 , 5 , 8. por lo tanto, es fundamental que se mantengan las mismas condiciones experimentales para todos los experimentos. Es importante utilizar una combinación de métodos de detección distintos mitofagia en estudios tanto in vitro e in vivo para verificar la correcta interpretación del estado de mitofagia. Mayor comprensión de los mecanismos de la mitofagia, logrado a través de técnicas mencionadas, permitirá el desarrollo de métodos nuevos y más precisos de detección mitofagia.

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Disclosures

El laboratorio de Bohr tiene acuerdos CRADA con ChromaDex y GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Atsushi Miyawaki y Dr. Richard J. Youle para compartir el plásmido de Keima mt y mt-Keima integrado las células Hela. Agradecemos Raghavendra A. Shamanna y Dr. Deborah L. Croteau para la lectura crítica del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramuros de la NIH (VAB), Instituto Nacional sobre el envejecimiento, así como un 2014-2015 y 2016-2017 NIA intra-laboratorio conceden (EFF, VAB). EFF fue apoyado por HELSE SOR-OST RHF (proyecto n: 2017056) y el Consejo de investigación de Noruega (proyecto Nº: 262175).

CONTRIBUCIONES DEL AUTOR:

EFF diseñado el manuscrito y preparó el proyecto; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH y ED escribieron diversas secciones del libro; NT, JP, HN y VAB revisaron el manuscrito y proporcionan conocimientos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar
#CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

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References

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