In Vitro og In Vivo påvisning af Mitophagy i humane celler, C. Elegansog mus

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mitophagy, processen med clearing beskadiget mitokondrier, er nødvendige for mitokondrie homøostase og sundhed vedligeholdelse. Denne artikel præsenterer nogle af de nyeste mitophagy detektionsmetoder i humane celler, Caenorhabditis elegansog mus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fang, E. F., Palikaras, K., Sun, N., Fivenson, E. M., Spangler, R. D., Kerr, J. S., Cordonnier, S. A., Hou, Y., Dombi, E., Kassahun, H., Tavernarakis, N., Poulton, J., Nilsen, H., Bohr, V. A. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (129), e56301, doi:10.3791/56301 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mitokondrier er kraftcentre af celler og producerer cellulære energi i form af ATP. Mitokondriel dysfunktion bidrager til biologiske aldring og en bred vifte af lidelser, herunder metaboliske sygdomme, for tidlig aldring syndromer og neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom (AD) og Parkinsons sygdom (PD). Vedligeholdelse af mitokondrie sundhed afhænger af mitokondriel Biogenese og effektiv regnskabsafslutning af dysfunktionelle mitochondrier gennem mitophagy. Eksperimentelle metoder til præcist afsløre autophagy/mitophagy, især i dyremodeller, har udfordrende for at udvikle. De seneste fremskridt i retning af forståelse for de molekylære mekanismer af mitophagy har muliggjort udviklingen af roman mitophagy detektionsteknikker. Her, vi introducere flere alsidig teknikker til at overvåge mitophagy i humane celler, Caenorhabditis elegans (fxRosella og DCT-1 / LGG-1 stammer), og mus (mt-Keima). En kombination af disse mitophagy detektionsteknikker, herunder cross-arter evaluering, vil forbedre nøjagtigheden af mitophagy målinger og føre til en bedre forståelse af rollen, som mitophagy i sundhed og sygdom.

Introduction

Mitophagy er afgørende for mitokondrie vedligeholdelse. Mitokondrier gennemskære flere celle signalering veje og er universel subcellulære organeller ansvarlig for produktion af cellulære energi, cellestofskiftet og calcium homeostase1,2,3, 4. mitokondrier konstant opleve udfordringer fra endogene og eksogene kilder, såsom reaktive ilt arter (ROS) og mitokondriel giftstoffer, henholdsvis, der føre til generation af "alderen" og dysfunktionelle mitochondrier. Ophobning af beskadigede mitokondrier formindsker effektiviteten af ATP produktionen samtidig øge mængden af skadelige ROS, og har været forbundet med aldersrelaterede sygdomme som metaboliske sygdomme, annonce, og PD1,5,6 . For at forhindre mitokondrier induceret cellulære dysfunktion, betegnes celler skal specifikt genkender beskadiget mitokondrier og effektivt fjerne dem gennem en cellulær proces mitokondrie autophagy (mitophagy). Det demonstrerede betydningen af mitophagy i sundhed og sygdom illustrerer behovet for præcise og effektive metoder til at opdage mitophagy både in vitro- og in vivo.

Mitophagy er en flertrins proces, der involverer mange proteiner og protein komplekser5,7,8. Kort sagt, er en beskadiget mitochondriet først anerkendt og opslugt af en dobbelt-membraned phagophore, som kan stamme fra plasma membran, endoplasmatiske reticulum, Golgi kompleks, kernen eller mitokondriet selv9,10. Den sfæriske phagophore elongates og til sidst sæler mitokondrier inde, der udgør den mitokondrielle autophagosome (mitophagosome). Mitophagosome derefter sikringer med lysosomet for nedbrydning, danner en autolysosome, hvori den beskadigede mitochondriet er nedbrudt og genanvendt7,8. Store autophagic proteiner også involveret i mitophagy omfatter: Autophagy relaterede 7 (ATG7) og Beclin1 (indledning), Microtubule-Associated Protein 1A/1B-lys kæde 3 (LC3-II) (LGG-1 i C. elegans) og p62 (komponenter i phagophore), og lysosomale-associerede membran glycoprotein 2 (LAMP2)6,7. Derudover er der flere væsentlige proteiner unikke til mitophagy, herunder PT-induceret formodede Kinase 1 (PINK-1), Parkin1, nukleare Dot Protein 52 kDa (NDP52), optineurin, BCL2 interagere Protein 3 som (NIX/BNIP3L) (DCT-1 i C. elegans), blandt andre5,6,11.

En fælles metode til at registrere ændringer i niveauet af autophagy er af forholdet mellem LC3-II/LC3-jeg eller LC3-II/aktin. Men denne metode er uspecifikke, som en forøgelse af dette forhold kan afspejle enten en øget indledning eller en nedsat fusion af mitophagosome at lysosomet12. En anden metode er at vurdere colocalization mellem en autophagy markør (fxLC3) og en mitokondrie protein (f.eks.Translocase af ydre mitokondrielle membran 20 (TOMM20, som kunne blive forringet af proteasomes)). Men dette kan kun angive ændringer i samlede mitophagy niveauer og ikke kan skelne trin på hvilke blokering opstår. Dette kan afklares ved hjælp af lysosomale hæmmere (f.eks.E64d + Pepstatin A, kaldt EP) i parallel til at forårsage en ophobning af mitophagosomes. Forskellen mellem antallet af mitophagosomes ved baseline og antallet af mitophagosomes efter behandling med EP kan angive mitophagy. Disse begrænsninger har bedt om udviklingen af roman mitophagy detektionsteknikker. I betragtning af den stigende betydning af mitophagy i et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker præsenterer vi flere robuste mitophagy detektionsteknikker, som kan være nyttige for forskere. Vi dækker både in vitro- og i vivo teknikker og anbefaler at kombinere flere teknikker for at kontrollere ændringer af mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyr (mandlige og kvindelige mus) blev født og opdrættet i et akkrediteret Dyrefacilitet i overensstemmelse og godkendelse af NIH Animal Care og brug udvalget. Dødshjælp metoder skal være i overensstemmelse med alle nationale og institutionelle bestemmelser.

1. påvisning af Mitophagy i humane celler

  1. Påvisning af mitophagy ved hjælp af mt-Keima plasmid
    Bemærk: Keima protein, smeltet til en mitokondrier target signal, forenklet som mt-Keima, har vist sig nyttige for i vivo mitophagy opdagelse. MT-Keima er en ratiometric pH-følsom fluorescerende proteiner, der udstiller grønne fluorescens (excitation 458 nm) i grundlæggende eller neutral betingelser og røde fluorescens (excitation 561 nm) i sure betingelser. Sund mitokondrier trives under grundlæggende eller neutral (pH 7-8) og angives ved hjælp af grønne fluorescens når transfekteret med mt-Keima. Når mitokondrier gennemgå mitophagy og smelter med sure lysosomer, pH falder til 4,5 og mitokondrier indeholdende mt-Keima udviser rød fluorescens6,13,14. Vigtigere, er mt-Keima resistente over for lysosomale proteaser, gør det muligt for evaluering af mitophagy over længere perioder. Protokollen nedenfor er designet til 6-godt plader.
    1. Dag 1: Brug enten primære menneskelige celler (fx, fibroblaster) eller udødeliggjort menneskelige celler (fx, Hela celler eller U2OS celler). Frø ca. 0,3-1 × 106 celler/brønd (afhængigt af den celle vækst tillade celler at nå 70% confluency den næste dag) i en 6-godt plade. Opretholde cellerne i komplet cellekulturmedium (Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) medium suppleret med 10% FBS, og 1% blandet opløsning af penicillin-streptomycin), og der inkuberes i en celle kultur inkubator ved 37 ° C (20% O2, 5% CO2 ). Tilføj 1 mL komplet celle næringssubstratet/hul i en 6-godt plade.
      Bemærk: Gen overekspression/knockdown eller medicin behandlinger kan gøres på denne etape6.
    2. Dag 2: Bland mt-Keima plasmid DNA6 og DNA Transfektion reagens (blanding for et godt af en 6-godt plade).
      1. Fortynd 15 µL af en DNA Transfektion reagens med 150 µL af serumfrit medium efter producentens protokol.
      2. Fortyndes 2-5 µg af mt-Keima plasmid DNA med 150 µL i serumfrit medium.
      3. Tilføje fortyndet mt-Keima plasmid til fortyndede DNA Transfektion reagens, vortex for 10 s, og der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur.
        Bemærk: Optimering af DNA Transfektion betingelser kan være nødvendige afhængigt af plade størrelse (Se producentens protokoller for detaljer).
      4. Føje DNA/Transfektion reagens blanding dråbevis til celler og derefter ryste plader forsigtigt i 5-10 s indtil løsningen er helt blandet.
    3. Dag 3: Ændre medierne ved at erstatte DNA Transfektion reagens-holdige medium med friske komplet cellekulturmedium (1 mL/hul).
    4. Dag 4: Image celler ved hjælp af konfokalmikroskopi6. Bruge to billeddiagnostiske kanaler: grøn kanal (excitation 458 nm, emission 570-695 nm) til at visualisere normale mitokondrier og røde kanal (excitation 561 nm, emission 570-695 nm) til at visualisere mitokondrier, som gennemgår mitophagy. Tilfældigt billede 20 områder under 40 x forstørrelse til dækning af en i alt 100-200 celler i hver brønd.
    5. Udføre dataanalyse. Beregne "mitophagy index" (procentdel af mitokondrier gennemgår mitophagy), ved hjælp af billede analyse software for at kvantificere mængden af fluorescens i både røde og grønne kanaler: tage forholdet mellem rød fluorescens til rød + grøn fluorescens, og ganges med 1006.
      Bemærk: Alternativer til Transfektion omfatter brug af mt-Keima stabilt udtrykt HeLa celler linjer14. Da HeLa celler ikke udtryk Parkin, skal Parkin udtrykkes stabilt for at studere Parkin-afhængige mitophagy i denne cellelinje.
  2. Påvisning af mitophagy ved hjælp af colocalization mellem cytokrom C oxidase subunit II (COXII) og LAMP2
    Bemærk: COXII er et protein, genom-kodet indre membran. 'Mitophagy indeks' er lig med forholdet mellem COXII colocalized med LAMP2 udtrykt som en procentdel af den samlede COXII.
    1. Seed HeLa celler (eller andre celler af interesse er nævnt i trin 1.1.1) i en 4-godt kammer dias (1-5 × 104 celler i 1 mL komplet celle kultur medium/brønd) i en celle kultur inkubator ved 37 ° C (20% O2, 5% CO2) natten over.
    2. Tilføje 3,0 µL af 10 mM carbonyl cyanid - 4-(trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), og der inkuberes i celle kultur inkubator (trin 1.2.1) til 3 h.
      Bemærk: Andre lægemidler, der påvirker mitophagy kan bruges.
    3. Fjern dyrkningsmediet ved hjælp af 1 mL pipette, vaske cellerne to gange med 1 mL/godt af kolde (0-4 ° C) 1 x PBS. Lad løsningen sidde i 10-30 s før den næste vask. Derefter tilsættes 0,5 mL 3,7% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS til hver brønd og Inkuber i 10 min på is til at fastsætte cellerne.
      Forsigtig: PFA er toksin. Arbejde i et stinkskab, når du bruger PFA.
    4. Kassér den PFA løsning ved hjælp af 1 mL pipette, cellerne vaskes to gange med koldt 1 X PBS (1 mL/hul; Lad løsning sidde i 10 s før den næste vask), og permeabilize celler med 1 mL/godt af 0,25% vaskemiddel (i 1 x PBS) i 10 min på is.
    5. Kassér den permeabilizing buffer, forsigtigt cellerne vaskes to gange med koldt 1 x PBS og udsmid (Lad løsningen sidde i 10 s mellem vasker). Blokere cellerne med 1 mL/godt på 5% FBS i 1 x PBS natten over ved 4 ° C. Dække afdelingerne for at forhindre vandtab.
    6. Forberede 0,5-1 0,5 mL/godt i et blandet antistof løsning med COXII antistof (mus, 1:250 fortynding) og LAMP2 antistof (kanin, 1:20-1:50 fortynding) i 1 x PBS med 5% FBS, og opbevares på is h.
    7. Tag 4-godt kammer dias fra det kolde værelse og kassér den blokerende løsning med 1 mL pipette. Forsigtigt vaske cellerne to gange med 1 mL/godt af kolde 1 x PBS og udsmid (Lad løsningen sidde i 10 s mellem vasker), derefter tilsættes 0,5 mL/godt blandet antistof løsning. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 time på en shaker på lav hastighed.
    8. Kassér den første antistof løsning ved hjælp af 1 mL pipette og forsigtigt vaske cellerne tre gange med 1 mL/godt af kolde 1 x PBS og kassér. Lad løsningen sidder for 10 s før den næste vask. Tilføj 1 mL/brønd af fluorescerende sekundære antistoffer (f.eks., ged anti-kanin med bølgelængde 568 nm af rødt fluorescerende proteiner (RFP) for LAMP2; og ged anti-mus med bølgelængde 488 nm af grøn fluorescerende proteiner (NGL) for COXII) i 1:250 fortynding med 5% FBS i 1 x PBS. Dække 4-godt kammer dias med aluminiumsfolie og inkuberes ved 37 ° C i 1 time på en shaker på lav hastighed.
    9. Kassér den anden antistof løsning med 1 mL pipette. Forsigtigt vaske cellerne seks gange med 1 mL/godt af kolde 1 x PBS. Lad løsningen sidde i 1 minut før næste vask.
    10. Montere cellerne med 50 µL/hul for antifade montering medium med DAPI, og tilføje dæksel glider.
    11. Billede celler under en Konfokal mikroskop med 66 x forstørrelse og nedsænkning olie (flise scanner / mosaikker kan bruges til at øge antallet af celler afbildet af softwaren). Bruge de samme indstillinger som kanal eksponeringstid, digital gevinst, digital offset, osv i hele alle imaging processer (Se software instruktioner for detaljer)15.
    12. Brug colocalization analyse software til at analysere kvantitativt mindst 20 tilfældige billeder af 100 celler15. Brug funktionen "Lukket Bezier" til at vælge hele individuelle celler. Sammenlign Pearson's colocalization koefficient for normal god landbrugspraksis til RFP, enten vægtes eller oejeblikkelige, til at bestemme mitophagy niveauer i analyseret celler. Fastholde værdier for vandrette og lodrette sigtekornet af colocalization analyse software i hele analysen. At præcist indstille disse sigtekorn, forberede to ekstra sæt af celler og mærke en COXII og de andre LAMP2. Derefter skal du indstille sigtekorn direkte ovenfor pixel fordelingen for hver kanal15 (Se software vejledningen for detaljer).
  3. En høj produktivitet, billedbehandling målingen for mitophagy screening
    Bemærk: Udfører høj overførselshastighed skærme af mitophagy-fremkaldende eller mitophagy-hæmmende forbindelser fra store sammensatte biblioteker teknisk krævende. En billeddannelse teknik baseret på colocalization af mitochondrier med autophagosomes er en mere forenklet, men meget følsomme alternativ til mitophagy screening16.
    1. Dag 1: Seed celler (fx, menneskelig primær fibroblaster på 5.000 celler/100 mL celle kultur medier/brønd) i en 96-brønd plade (Se trin 1.1.1).
    2. Dag 2: Behandle cellerne fra den anden dag med FCCP eller andre forbindelser af interesse for udpegede Inkubationstiden (Se trin 1.2.2).
    3. Følg trin 1.2.2-1.2.9 ved hjælp af de primære antistoffer for COXII (mus, 1:250 fortynding med 5% FBS i 1 x PBS) og LC3B (kanin, 1: 100-1:200 fortynding med 5% FBS i 1 x PBS). Alternativt, primære antistoffer for COXII og LAMP2 kan bruges.
    4. Image celler ved hjælp af en fluorescerende læser16. Indsamle billeder i tilfældigt placerede felter og med en minimum 500 celler/brønd.
    5. Analysere data ved hjælp af en celle analyzer tilpasset protokol16.

2. påvisning af Mitophagy i C. elegans

Bemærk: Nematode C. elegans giver en platform til at assay mitophagy på kropsligt niveau. To stammer kan bruges til at overvåge mitophagy: (1) mitokondrier-målrettet Rosella (mtRosella) eller (2) mitophagy receptor DCT-1 sammenvokset med normal god landbrugspraksis samt autophagosomal markør LGG-1 sammenvoksede med Discosoma sp. rød fluorescerende proteiner (DsRed)5, 17.

  1. Mitophagy overvågning ved hjælp af Rosella biosensor
    Bemærk: Rosella er en molekylær biosensor, der kombinerer en pH-ufølsom DsRed sammenvoksede til en pH-følsom normal god landbrugspraksis variant. Rosella biosensor udnytter pH forskelle mellem den sure lysosomet (pH ~ 4,5) og andre cellulære rum. Denne biosensor har været anvendt med held overvåge mitophagy i Saccharomyces cerevisiae og flere pattedyr cellelinjer, såsom HeLa, HEK293 og HCT11618,19. Vi tilpasset denne alsidige dual-fluorescerende reporter og genereret transgene C. elegans nematoder udtrykker mitokondrier-målrettet Rosella (mtRosella) i kroppen-væg muskelceller. Mitophagy induktion er angivet med en reduceret normal god landbrugspraksis/DsRed forholdet mellem mtRosella fluorescens.
    1. Dag 1: Pluk L4 larver af orme at udtrykke mitokondrier-målrettet Rosella (mtRosella) i kroppen-væg muskelceller på en Nematode vækst medier (NGM) tallerken med E. coli (OP50) ved hjælp af en dissektion mikroskop5. Sted 10-20 orme/plade på mindst tre 3,5 cm plader. Inkuber kartoffelcystenematoder ved den standard temperatur på 20 ° C5.
      Bemærk: Se reference for orm anatomi, herunder identifikation af L4 larver20, og den måde at lave en hakke, som bruges til at overføre orme fra én placering til en anden21.
    2. Dag 5: Synkronisere nematoder ved at vælge 15-20 L4 transgene larver og overføre dem på frisk OP50 seedet NGM plade. Brug mindst fem plader pr. eksperimentelle tilstand.
    3. Dag 7: Forberede mitophagy-påvirker narkotika af interesse eller positive kontroller køretøj plader.
      1. Dræbe E. coli (OP50) bakterier seedede ved at udsætte NGM plader i 15 min. med 222 µW/cm2 (intensiteten) af UV-lys til at sikre, at mitophagy-fremkaldende stoffer ikke metaboliseres af bakterier. Pladerne skal blive udsat 2.000 J/m2.
        Bemærk: Sekunder af eksponering behov = 2.000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. Tilføje forbindelser af interesse til toppen af seedede NGM plader. Tilføje et tilsvarende beløb af sammensatte køretøj (opløsningsmiddel anvendes til at opløse sammensatte, såsom dimethylsulfoxid (DMSO)) til køretøjet plader som en negativ kontrol. Til positiv kontrol af mitophagy induktion, en mitokondrie giftstoffet, blev paraquat (8 mM slutkoncentration) brugt. Tilføje en opløsning indeholdende 10 µL af 8 M paraquat lager med 190 µL af Hedeselskabet2O øverst på agar plade for gruppen behandling. Tilføje en opløsning indeholdende 10 µL af DMSO med 190 µL af Hedeselskabet2O øverst på agar plade for gruppen køretøj.
        Bemærk: Paraquat-brugsopløsning kan opbevares 1 måned ved 4 ° C.
      3. Swirl forsigtigt pladerne indtil stoffet eller køretøjet frakker hele overfladen. Tillad pladerne tørre med låg lukket ved stuetemperatur i mindst 1 time før du overfører orme.
        Bemærk: Drug plader kan også tilberedes ved at tilføje narkotika i den flydende NGM før det størkner.
    4. Dag 7: Overfør 10-20 af 2 dage gamle voksne transgene dyr forberedt i trin 2.1.2 plader der indeholder paraquat, forbindelser af interesse, eller køretøjet (DMSO). Inkuber de transgene dyr ved 20 ° C i 2 dage.
    5. Dag 9: Udarbejde 2% Agarosen puder (Se Supplerende materiale). Derefter tilsættes en dråbe (10 µL) af 20 mM levamisol i M9 pr pad. Immobilisere de transgene dyr til billedbehandling, ved at placere dem i M9-levamisol drop. Anbring forsigtigt en coverslip på toppen.
    6. Fange enkelt transgene dyr ved hjælp af et kamera, der er knyttet til et epifluorescensmikroskop. Erhverve fluorescerende billeder af hele transgene nematoder udtryk for mtRosella i kroppen-væg muskelceller på 10 X forstørrelse5. Gemme de indsamlede billeder.
    7. Behandle de erhvervede billeder med ImageJ software. Analysere kroppen væggen muskelceller beliggende i spidsen for ormen til at undgå autofluorescence i tarmens væv. Mål den gennemsnitlige pixel intensitet værdi og alt område for hver fluorescerende billedet kun i regionen hoved af hvert dyr. Til at analysere det specifikke område af interesse:
      1. Vælg 'split kanal' under 'image' og 'farve' drop-down menuen til at konvertere billeder.
      2. Bruge værktøjet frihånd markering for at fange den fluorescerende område af interesse.
      3. Vælg kommandoen 'måling' under 'analysere' drop-down menuen og udføre pixel intensitet analyse.
      4. Pixel intensitet skal normaliseres ved at dividere intensitet af det samlede areal analyseret. Ved normalisering, beregne normal god landbrugspraksis til DsRed ratio22.
    8. Brug statistiske analyse software til enten foretage student t-test (sammenligning mellem to grupper) eller ANOVA (sammenligning mellem flere grupper) for statistisk analyse med p < 0,05 som betydelige5,17 .
  2. Vurdering af mitophagy ved hjælp af co lokalisering mellem DCT-1 og LGG-1
    Bemærk: DCT-1 er en ydre membran proteiner, der fungerer som en mitophagy receptor som reaktion på stress vilkår, svarende til dens formodede orthologues BNIP3 og NIX/BNIP3L i pattedyr5. Således vurderes mitophagy indledning af co lokalisering mellem DCT-1 mitophagy receptor og autophagosomal membran protein LGG-1 (homolog af de pattedyr LC3).
    1. Dag 1: Pluk L4 larver af transgene dyr udtrykker både DCT-1::GFP og DsRed::LGG-1 i kroppen-væg muskel celler5 på en OP50 seedet NGM plade. Sted 5-10 orme/3.5 cm plade, og bruge mindst tre plader. Inkuber nematoder ved 20 ° C.
      Bemærk: Transgener er placeret på separate plasmider og de er ikke integreret i genomet. Afhente nematoder bærer både rol-6(su1006) og pmyo-2 NGL contransformation markører. Kun udtrykke transgene orme med begge contransformation markører både DCT-1::GFP og DsRed::LGG-1 i kroppen-væg muskelceller.
    2. Følg trinene fra 2.1.2-2.1.5.
    3. Billede enkelt organ-væg muskelceller ved hjælp af et kamera, der er knyttet til en Konfokal mikroskop5,23. Opdage grænser af hele kroppen-væg muskelceller og tage z-stak billeder under 63 x forstørrelse. Højere forstørrelse kan også bruges.
    4. Åbne og behandle billeder erhvervet med Konfokal software. Indledning af mitophagy angives af co lokalisering af mitophagy receptoren (DCT-1::GFP) til autophagosomal markøren (DsRed::LGG-1). Manuelt måle Co lokalisering begivenheder i hver stak af kroppen-væg muskel celle5. Det er vigtigt at holde alle mikroskop og kamera indstillinger (linse og forstørrelsesglas, filtre, eksponeringstid, opløsning, laser intensitet, gevinst, etc.) konsekvent i hele eksperimenter. Alle indstillinger skal bemærkes.
    5. Brug statistiske analyse software til enten foretage student t-test (sammenligning mellem to grupper) eller ANOVA (sammenligning mellem flere grupper) for statistisk analyse med p < 0,05 som betydelige5,17 . For tovejs Sammenligninger bruge Student's t-test (p < 0,05 anses betydelige). Bruge variansanalyser enkelt faktor (ANOVA), korrigeret af post hoc Bonferroni test for flere sammenligninger. Vi anbefaler, at analysere mindst 50-70 dyr eller 30-50 krop-væg muskelceller for hver eksperimentelle betingelse. Gentage forsøget mindst tre gange.

3. påvisning af Mitophagy i mus

Bemærk: Tidligere metoder til at opdage mitophagy i mus var besværlige, ufølsom, og vanskeligt at kvantificere. Transgene musemodel udtrykker mitokondrie-målrettede form af fluorescerende reporter Keima kan (mt-Keima) nu udnyttes for at vurdere niveauet af mitophagy i en lang række fysiologiske og patofysiologiske forhold.

  1. Aflive mus ved hjælp af en protokol, der er godkendt af den institutionelle Animal Care og brug Udvalget14.
  2. Sikre musen (ventrale side op) til at arbejde platform ved hjælp af stifter i arme og ben. Gøre et snit i underlivet ved hjælp af mikrokirurgi saks og pincet til at afsløre de lever24. Skær et stykke af leveren (fx, et stykke af højre lap på 1 × 1 × 1 cm) ved hjælp af mikrokirurgi saks og pincet.
    Bemærk: Påvisning af mitophagy i mus er kompliceret og kræver viden på musen anatomi og meget dygtige mus håndtering og musen operation. Denne protokol indeholder grundlæggende, vigtige skridt i denne metode, og en mere detaljeret metode er tilgængelig24.
  3. Leveren prøven anbringes på en metalplade på isen hurtigt køle vævet. Holde væv på den kolde metal plade og behandle så hurtigt som muligt. Optimalt, brug inden for 1 h af dissektion.
  4. Løft den lever prøve buet pincet og skylles med 5 mL iskold 1 x PBS.
  5. Overføre leveren til en petriskål (Ø 100 mm) på is ved hjælp af skeen slutningen af en spatel.
  6. Skær leveren prøven i hånden i 0,5-1 mm tyk sektioner ved hjælp af single-edge vinger.
  7. Omhyggeligt overføre afsnittene væv til et glas bund fad ved hjælp af mikrokirurgi pincet.
  8. Omhyggeligt sæt afsnittet lever med pincet til at flade i bunden.
  9. Dække de skivede leveren med 3-5 dråber koldt 1 x PBS.
    Bemærk: DAPI farvning anbefales til at identificere det pågældende område i visse væv (f.eks, hjernen)24. For at validere Co lokalisering af røde mt-Keima signal med lysosomet, kan lysosomale farvestoffer, såsom dextran cascade blå og lysosensor, være brugt24.
  10. Image afsnittene væv under konfokalmikroskopi via to sekventielle excitationer24. Sæt to billeddiagnostiske kanaler: "grøn" mt-Keima kanal (excitation 458 nm, emission 570-695 nm rækkevidde) og "røde" mt-Keima (excitation 561 nm, emission 570-695 nm rækkevidde). Vedligehold indstillinger mellem forsøgsbetingelser. For mere effektiv imaging, analysere to dyr på én gang.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Påvisning af Mitophagy i humane celler:

Ved hjælp af den procedure, der præsenteres her, blev menneskelige HeLa celler transfekteret med mt-Keima plasmid. Raske celler viste et velorganiseret mitokondrie netværk (normal god landbrugspraksis, 488 nm) med få forekomster af mitophagy (RFP, 561 nm). Dog celler forbehandlet med en mitokondrie uncoupler FCCP (30 µM til 3 h) udstillede en dyb stigning i mitophagy forekomst (figur 1A). Mitophagy blev også målt ved hjælp af fælles lokalisering mellem LAMP2 og COXII (figur 1B).

Påvisning af Mitophagy i C. Elegans

Vi undersøgte krop-væg muskel celler af transgene nematoder udtrykker DsRed sammenvokset med LGG-1 og enten mtRosella eller DCT-1 sammensmeltet med normal god landbrugspraksis på normale og mitophagy-inducerende betingelser såsom oxidativt stress. Transgene dyr blev udsat for paraquat (8 mM til 2 dage). Mitophagy induktion er indiceret ved nedsat normal god landbrugspraksis/DsRed forholdet mellem mtRosella fluorescens (figur 2A). Desuden betyder forhøjet antal Co lokalisering hændelser mellem DCT-1::GFP og DsRed::LGG-1 signaler mitophagy stimulation i svar til oxidativt stress (figur 2B).

Påvisning af Mitophagy ved hjælp af mt-Keima mus:

Imaging analyse af i vivo mitophagy giver indblik i mitophagy under normale og patofysiologiske forhold. Ved hjælp af protokollen, der er beskrevet ovenfor, kan mitophagy forekomst i forskellige organ væv, såsom leveren og lillehjernen (figur 3), visualiseres med Konfokal mitophagy.

Figure 1
Figur 1. Forskellige metoder til at vurdere mitophagy i menneskeceller. (A) menneskelige HeLa celler blev transfekteret med mt-Keima plasmid for tre dage, efterfulgt af imaging på begge 488 nm og 561 nm. Som positiv kontrol, blev ceflls behandlet med FCCP (30 µM) 3 h forud for billeddannelse. (B) billeder af menneskers primære fibroblaster farves med LAMP2 (RFP) og COXII (NGL). (C) billeder af humane fibroblaster farves med anti-TOM20 (rød) og anti-LC3 (grøn) antistoffer. Barer på ret Vis udlæsning af mitochondrier Co lokalisering med autophagosomes. Co lokalisering er steget med energiske stress (glukose-fri galaktose medier) og tilføjelsen af lysosomale hæmmere E64d og Pepstatin A (EP) til 24 h. repræsentative skala barer for (A), (B), og (C) er mærket på sidst figur af hvert panel, uafhængigt af hinanden. Kvantitative data er vist i gennemsnit ± S.E.M. ***p < 0,001; t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. In vivo påvisning af mitophagy i C. elegans. (A) transgene nematoder udtryk for mtRosella i kroppen-væg muskelceller blev behandlet med 8 mM paraquat. Mitophagy stimulation er tilkendegivet ved nedsat forholdet mellem pH-følsom NGL til pH-ufølsom DsRed (n = 50; ***p < 0,001; t-test). Pilespidser påpege tarm autofluorescence. Skala barer betegne 20 µm. erhvervelse detaljer: eksponeringstid, 200 ms; Kontrast, medium. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en 10 X mål linse. Kvantitative data er vist i gennemsnit ± S.E.M. værdier. (B) transgene nematoder Co udtrykker mitophagy receptor DCT-1 sammensmeltet med normal god landbrugspraksis samt autophagosomal protein LGG-1 sammenvoksede med DsRed i krop-væg muskelceller blev udsat til 8 mM paraquat. Mitophagy induktion er tilkendegivet ved co lokalisering af normal god landbrugspraksis og DsRed signaler (for hver gruppe af billeder DCT-1 er vist med grønt på toppen, autophagosomes med rødt nedenfor og en flettede billede nederst; n = 30; ***p < 0,001; t-test). Salg barer betegne 20 µm. erhvervelse detaljer: opløsning, 1.024 X 1.024; Master få, Track1: 562 og Track2: 730; Emission filtre, Track1 kanal1: 639 nm og Track2 Channel2: 519 nm; Laser intensitet, Track1 (543 nm): 12,9% og Track2 (488 nm): 39,4%. Billeder blev erhvervet ved hjælp af en 40 X mål linse. Kvantitative data er vist i gennemsnit ± S.E.M. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. In vivo påvisning af mitophagy i mt-Keima Transgene mus. Repræsentative billeder af mt-Keima signaler i leveren (øverste) og lillehjernen område (herunder Purkinje celler, nederste panel) af et mt-Keima mus (458 nm, grøn; 561 nm, red). Skalalinjen betegner 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nøjagtig måling af mitophagy teknisk krævende. Her har vi præsenteret flere robust teknikker, som giver mulighed for både kvalitativ påvisning af mitophagy og kvantificering af mitophagy niveauer i de mest almindelige laboratorium eksperimentelle modeller.

At erhverve replikerbare data, en eksperimenterende design med mindst tre biologiske gentagelser er nødvendige. Alle forskere er involveret i forsøg og analyser skal være blændet eksperimentelle gruppe identiteter. Derudover skal imaging felter være tilfældigt valgt under image erhvervelse. For cellekultur og C. elegans undersøgelser, skal der foretages mindst tre biologiske gentagelser. Mt-Keima musen undersøgelser anbefales det at bruge et tilstrækkeligt antal mus for at opnå Statistisk signifikans. Analysere 30-100 celler til hvert eksperiment pattedyrceller, og køre mindst 3 forskellige eksperimenter. Kvalitetskontrol på disse trin giver reproducerbare resultater. Påvisning af mitophagy i gær er for nylig blevet sammenfattet andetsteds25.

Der er flere kritiske trin i in vitro- mitophagy opdagelse teknikker. Transfektion effektivitet, som afhænger af kvaliteten af reagenser og DNA anvendes, er af afgørende betydning under Transfektion af mt-Keima protein. Optimering af Transfektion effektivitet under forskellige forhold (f.eks.ved hjælp af forskellige cellelinier) er således nødvendige. Metoden LAMP2/COXII antistof specificitet og optimal primære antistof fortynding fold påvirker kvaliteten af billederne og bør testes, før du begynder eksperimenter. Det samme gælder den høj-indhold billedbehandling metode, hvor antistof kvalitet og fortynding er afgørende. Automatiseret mikroskopi system og tilpassede analyse-protokollen giver mulighed for billedbehandling og analyse af mindst 1.500 celler/tilstand, hvilket gør resultaterne meget robust i forhold til andre i vivo billeddannelse baseret metoder. Derudover indeholder analyse protokol data om yderligere mitokondrie parametre såsom længde og total område på grundlag af celle ved celle, som er meget nyttig i mitophagy forskning.

I nogle tilfælde er det ikke anbefales at assay colocalization af LAMP2 med ydre Membranproteiner som TOMM20. De meget tidlige stadier af mitophagy involverer Parkin-medieret ubiquitination ydre membran proteiner, herunder TOMM20 og Mitofusin 1 (MFN1). Parkin konjugater flere forskellige ubiquitin kæde forbindelser på disse proteiner, herunder K48-linked ubiquitin kæder, der fremmer nedbrydningen af protein af 26S proteasom. Disse ubiquitinated ydre Membranproteiner kan derfor stadig være forringet, selvom mitophagy er blokeret6. Dette kan forvrænge data, hvilket resulterer i falske positiver i samlede data fortolkning. Desuden, afskaffelse af mitokondrie-DNA (mtDNA Xanthophyta) er en anden indikator for mitophagy, og det kan kvantificeres ved immunfluorescens ved hjælp af en anti-DNA antistof6.

Nogle kritiske trin til overvågning i vivo mitophagy i C. elegans er listet nedenfor:

1. overførsel af transgene dyr til nye plader hver 24 – 48 h anbefales at undgå udkommet af afkom, hvilket fører til en blandet befolkning eller sult, hvilket i sig selv kan udløse mitophagy. Derfor, ikke-hungrende nematoder bør anvendes.

2. levamisol er et mildt bedøvelsesmiddel, der bruges til at immobilisere nematoder. Undgå anæstetika, der kunne påvirke mitokondrie-aktivitet, såsom natriumazid. Natriumazid blokerer komponenter af mitokondrie respiratorisk kæden og perturbs energiproduktion, fører til mitokondrie og oxidativ stress. Således er natriumazid tilbøjelige til at udløse mitophagy.

3. prøver må ikke tørre ud under mikroskopisk undersøgelse. Derfor anbefales brug af M9 buffer i stedet for vand at sikre gunstige osmotisk betingelser.

4. tarm autofluorescence stiger med alderen i C. elegans. Således, kroppen-væg muskelceller tæt på tarmen bør undgås under mikroskopisk undersøgelse.

5. Hvis paraquat undlader at fremkalde mitophagy: a. øge paraquat eksponeringstid på orme, b. stigning paraquat koncentration eller c. forberede en frisk brugsopløsning af paraquat, da dens effektivitet falder over tid.

6. Hvis steg matricidal rugeæg er observeret i orme udsættes for paraquat, enten: a. reducere perioden af paraquat behandling, b. reducere paraquat koncentration, c. supplement plader med fluorodeoxyuridine (FUdR) (endelig koncentration på 100-400 μM), en hæmmer af DNA-syntese, der forhindrer ægget udrugning eller d. foretage eksperiment i ældre orme (fx, 4 dage gamle orme).

Denne procedure beskriver trin for imaging mitophagy i leveren ved hjælp af mt-Keima Transgene mus, som vist i figur 3. Væv end hjernen og leveren er blevet analyseret ved hjælp af mt-Keima system14. Dual-excitation forholdet imaging i leveren væv er opnået via to sekventielle excitationer. Alle billeder skal være fremstillet af frisk skåret organer. Væv undersøges bør holdes koldt og forarbejdet så hurtigt som muligt. Leveren skiver kan fås på alle alderstrin. Når imaging mitophagy, optimere laser beføjelser og eksponering gange for hvert organ under mikroskopisk analyse. Laser power bør fastsættes ved den laveste effekt, der giver mulighed for klart visualisering af mt-Keima signal14. Der er dog nogle begrænsninger for mt-Keima Transgene mus. På grund af ustabilitet i Keima samt tab af et pH forløb på tværs af den lysosomale membran under fiksering er denne musemodel ikke egnet til cryo-skæring og Immunhistokemi. En anden begrænsning er, at mt-Keima eller matrix aggregater af dette protein, kan påvirke ukendt mitokondrie eller cellulære funktioner, selv om det ikke ændrer mitokondrie ilt forbrug sats14. Desuden, tid og omkostninger forbundet med mt-Keima mus gøre det mindre ønskeligt for høj overførselshastighed analyse end de førnævnte cellekultur og C. elegans metoder. Udover de metoder, der er nævnt her, omfatter andre måder at kvantitativt studere mitophagy i mt-Keima mus vestlige skamplet eller FACS. At bemærke, udover mt-Keima Transgene mus, der er en anden mitophagy musen model, den "mito-QC", en transgene musemodel med en pH-følsom fluorescerende mitokondrie signal26. På grund af den kompleksitet og dynamik af mitophagy, anbefaler vi at kombinere de førnævnte fluorescens metoder med andre almindelige mitophagy påvisningsmetoder, såsom elektronmikroskopi og Western blotting, for at styrke resultaterne.

Udvikling af ny mitophagy opdagelse teknikker som dem nævnt her vil have bred applikationer, fra Mekanistiske undersøgelser af mitophagy til høj overførselshastighed drug skærme. Det skal bemærkes, at mitophagy er nemt påvirkes af endogene og eksogene svingninger (fx, celle kultur betingelser såsom celle tæthed, sult, hypoxi, osv.) 1 , 5 , 8. det er derfor altafgørende, at de samme forsøgsbetingelser opretholdes for alle eksperimenter. Det er vigtigt at bruge en kombination af forskellige mitophagy registreringsmetoder i både in vitro- og i vivo undersøgelser til at kontrollere den korrekte fortolkning af mitophagy status. Yderligere forståelse af mekanismerne i mitophagy, opnået gennem teknikker nævnt heri, vil give mulighed for udvikling af nye, mere præcise metoder til registrering af mitophagy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bohr laboratorium har CRADA ordninger med ChromaDex og GlaxoSmithKline.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Atsushi Miyawaki og Dr. Richard J. Youle til deling af mt-Keima plasmid og mt-Keima integreret Hela celler. Vi takke Raghavendra A. Shamanna og Dr. Deborah L. Croteau for kritisk læsning af håndskriftet. Denne forskning blev støttet af murene forskningsprogrammet NIH (VAB), tilskud National Institute on aldring, såvel som en 2014-2015 og en 2016-2017 NIA intra-laboratorium (EFF, VAB). EFF blev støttet af HELSE SOR-OST RHF (projekt nr: 2017056) og Norges forskning Rådet (projekt nr: 262175).

FORFATTER BIDRAG:

EFF designet håndskriftet og udarbejdede udkast til; KP, NS, EMF, RDS, JSK, SAC, YH og ED skrev forskellige sektioner af papir; NT, JP, HN og VAB revideret håndskriftet og forudsat ekspertise.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mt-Keima mouse Jackson Laboratory
Lipofectamine 2000 DNA transfection reagent Thermofisher #11668027
Opti-MEM medium (Gibco) Thermofisher #31985062 serum-free medium
mtKemia plasmid: pCHAC-mt-mKeima addgene #72342
COXII antibody (mouse) abcam #ab110258
LAMP2 antibody (rabbit) NOVUS #CD107b
goat-anti-rabbit with wavelength 568 nm of red fluorescent protein (RFP) Thermofisher #Z25306 Alexa Fluor 568 dye
goat-anti-mouse with wavelength 488 nm of green fluorescent protein (GFP) Thermofisher #Z25002 Alexa Fluor 488 dye
prolong gold antifade with DAPI Invitrogen #P36931
6-well plate SIGMA
Corning Costar
#CLS3516
4-well chamber slide THermofisher, Nunc Lab-Tek #171080
Nunc F 96-well plate Thermofisher #152038
LC3B antibody rabbit NOVUS #NB100-2220
DNA antibody Progen Biotechnik #anti-DNA mouse monoclonal, AC-30-10
DAPI Thermofisher #D1306 antifade mounting medium with DAPI
IN Cell analyzer (fluorescent reader ) GE Healthcare Life Sciences #IN Cell analyzer 2200
Eclipse TE-2000e confocal microscope Nikon #TE-2000e
Colocalization software Volocity #Volocity 6.3 alternative Zeiss ZEN 2012 software
IN Cell Investigator Software GE Healthcare Life Sciences #28408974
cell culture medium Thermofisher #DMEM–Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermofisher #15140122
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich #12003C-1000ML
Cell culture Incubator Thermofisher #Thermo Forma 3110 CO2 Water Jacketed Incubator
epifluorescence microscope Zeiss Zeiss Axio Imager Z2
camera Olympus Olympus DP71
confocal microscope Zeiss Zeiss Axio Observer Z1
confocal software Zeiss ZEN 2012
image analysis software Image J colocalization analysis, etc https://imagej.nih.gov/ij/
statistical analysis software GraphPad Software Inc., San Diego, USA GraphPad Prism software package
material to make a worm pick Surepure Chemetals #4655 The pick is made of 30 gauge 90% platinum 10% iridium wire
IR: N2;Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios Maintain transgenic animals at 20 °C
IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 TOMM-20::Rosella Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pdct-1 DCT-1::GFP Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
pmyo-3 DsRed::LGG-1 Material inquiry to Tavernarakis Nektarios
Paraquat solution see supplementary data for preparation
M9 buffer see supplementary data for preparation
M9-levamisole buffer see supplementary data for preparation
Glass Microscope Slides and Coverslips Fisher Scientific #B9992000
Surgical forceps STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
Surgical scissors STERIS Animal Health 19 Piece Canine Spay Pack Economy
1x PBS Thermofisher #AM9625 10x PBS needs to be diluted to 1x PBS by using ddH2O
shaker Fisher Scientific #11-676-178 Thermo Scientific MaxQ HP Tabletop Orbital Small Open Air Platform Shaker Package A
2% agarose pad see supplementary data for preparation
Vibroslice blades World precision instruments #BLADES-2 single-edge blade
metal plate MSC #78803988 0.012 in thick x 6 in wide x 12 in long, 430 Stainless Steel Sheet
Triton X-100 detergent
Methyl viologen dichloride hydrate Sigma-Aldrich #856177 paraquat
Incubator for nematodes AQUALYTIC Incubator to maintain 20 °C
Dissecting stereomicroscope Olympus SMZ645
Confocal microscope Zeiss AxioObserver Z1 For nematodes (step 2)
epifluorescence microscope Zeiss AxioImager Z2 For nematodes (step 2)
UV crosslinker Vilber Lourmat BIO-LINK – BLX-E365 UV light source; 356 nm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61, (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163, (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521, (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524, (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40, (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16, (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22, (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40, (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 15, Unit 15 16 (2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18, (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60, (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157, (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25, (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4, (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397 (2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7, (7), e2215 (2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12, (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214, (3), 333-345 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics