デジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM) を用いた低濃度で微生物の定量化

Bioengineering

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Summary

デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM) は、50 〜 100 倍焦点と明視野顕微鏡に匹敵する解像度よりも厚い実行画像サンプルを後処理により体積手法です。ここで DHM はカウントの識別に使用する、および低密度と光学密度計測、プレート カウント、直接カウントと比較して非常に微生物を追跡します。

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Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).

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Abstract

正確に検出し、まばらな細菌のサンプルを数える医療診断、他の惑星や太陽系の衛星にロボット ミッションによる生体検出、食品、飲料、医薬品加工業の多くのアプリケーションには。現在、文化のめっきや落射蛍光顕微鏡によるスパース細菌サンプルがカウントされます。培養皿を必要とする長いインキュベーション時間 (数日数週間から)、および広範な染色とサンプルの濃度、落射蛍光顕微鏡が必要です。ここでは、軸外デジタル ホログラフィー顕微鏡法 (DHM) を使用して、非常に希薄文化 (100 104セル/mL) 中の細菌を列挙する方法を示します。まず、カスタムの DHM の建設は、建物の低コスト計測器についての詳細と一緒に議論されています。ホログラフィーの原理は、説明、およびビデオにする必要がありますどのくらいの時間を推定する統計モデルを使用計測器の光学特性と (表 2) の細菌の溶液の濃度を基にセルを検出します。.10 セルのビデオ検出5104103、および 100 細胞/mL、非再建されたホログラムを使用してリアルタイムに示されて。振幅と位相像の再構成は、オープン ソースのソフトウェア パッケージを使用して示されています。

Introduction

非常に希薄サンプルで正確な細菌数の決定は多くのアプリケーションで重要である: 少数の例は水と食品品質解析1,2,3;血液、髄液、または喀痰4,5で病原体の検出滅菌水6; を含む医薬品の生産オープン海堆積物7,8,9などの低栄養環境で環境社会分析。木星や土星、特にヨーロッパ1011エンケラドス12,13,の氷衛星における現存する微生物生命の検出に対する興味も高まっています14、地下の液体の海を持っている知られています。別の惑星で現存する生命を発見する 1978 年バイキング以来ミッションがないので、技術と細菌の同定と宇宙ミッション15時にカウントの楽器の開発を制限されています。

プレート カウントの伝統的な方法は、時々 環境系統種の少数を表すことができます、人為的セルのみを検索 < 116。プレートは、ひずみに応じて最大の成功のため数日あるいは数週間の培養が必要です。落射蛍光顕微鏡は、主として迅速かつ正確な生菌のためのゴールド スタンダードとしてプレート カウントを交換してください。核酸ラベリング酸蛍光染料 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI)、SYBR グリーン アクリジン オレンジなど核酸に結合する、典型的な染料17,18,19、多くの研究を使用してグラムの蛍光インジケーター サイン20,21,22,23,24。1 mL あたり 10 ~5セルの検出 (Lod) の制限につながる前濃度ステップなしのこれらのメソッドを使用しています。LoD の改善がろ過を使用して可能です。液体試料は真空フィルター、膜、通常ポリカーボネートと理想的に黒背景を減らすために。低バック グラウンド染料のような上記の DNA 汚れはフィルター25に直接適用することがあります。正確な目でカウント、10 ~5セルがフィルターは、試料 1 mL あたり 10 ~5セルよりもさらに希釈を意味ごとに必要な重要なサンプル ボリュームを収集およびフィルタ リングする必要があります。レーザー スキャン デバイスは、フィルターのすべての領域を体系的に調査し、mL26あたり 10 ~2セルに至るまでの検出限界を迫り、カウントに必要なセルの数を減らすために開発されています。しかし、これらはほとんどの研究室で利用いただけません、高度なハードウェアだけでなくソフトウェア粒子を観察専門家の確認を許可するが細菌および残骸ではない必要があります。

参考のため敗血症大人通常開始で症状を示す < 100 細胞/mL の血とで乳児の < 10 セル/mL。大人からの血液は 10 mL と乳児、1 mL から。PCR 法が PCR 阻害成分血液27,28人間と非病原性植物 DNA の存在によって抑制されます。新興技術のさまざまな、にもかかわらず文化より農村地域や発展途上国を中心に血流感染症の診断のゴールド スタンダードのまま。他の惑星上の生命の検出、熱力学的計算は生命およびこうして予想可能なバイオマスのエネルギー予算を見積もることができます。1-100 細胞/mL は、ヨーロッパ29熱力学的に合理的であると予想されます。それは容易に水溶液の大量の細胞の非常に小さい数字の検出が重要な未解決問題であることこれらの数字から見ることができます。

本稿で示す 10 の濃度でセラチアシェワネラ oneidensis (野生型および非運動性変異) の検出5104103、および軸オフを使用して 100 細胞/mLデジタル ホログラフィー顕微鏡 (DHM)。DHM の利点は従来の光学顕微鏡では高解像度での厚いサンプル ボリュームの同時イメージング-この実装では試料室は 0.8 mm 厚。これらのサンプル室に ± 50 μ m の公差の精密加工アルミ金型からポリジメチルシロキサン (PDMS) のソフト リソグラフィーにより建設されました。これは高倍率びきょわたってフィールドの深さの約 100 倍改善を表します。DHM はまた、光路長 (屈折率と膜厚の製品) の測定を可能にする定量的な位相情報を提供します。細菌や酵母の細胞周期および細菌乾燥質量30,31,32; の計算を監視するために使用されている DHM と類似の技術散乱の違いは、菌株33を区別するためにも使用する可能性があります。

使用楽器は具体的には以前に発行された34,35微生物で使用するため、その設計と建設を示したし、説明。水溶液は絶えずシリンジ ポンプを介して 0.25 μ L のボリュームのサンプル室に供給されます。流量は、サンプル全体のボリュームのイメージを確保するために、カメラのフレーム レートによって決まります。統計の計算は、特定の濃度で細胞のかなりの数を検出するためにイメージを作成する必要がありますサンプル ボリュームの数を予測します。

セル検出用ホログラムの振幅と位相の画像に再構築不要であった。生のホログラムの解析を行った。これは膨大な計算リソースとディスク領域を節約できます: 500 Mb のホログラム映像 1-2 Tb 再建されたときになります。ただし、深さ、ホログラムが希望の種を表すことを確認するためのサンプルの再構築に関する説明を行います。DHM の重要な機能は、強度と画像の位相の両方を監視する機能です。(ほとんどの生物細胞) など強度のほぼ透明な生物は、フェーズで明確に表示されます。ラベル無料テクニック、染料を使用していません。これは、可能な宇宙飛行用、染料はミッションの条件を生き残ることはできませんので dvantage と -さらに重要な-エンコードするため DNA または RNA を使用可能性があります地球外生物を操作するを想定できません。また、北極や南極、染料がリモートの場所に持参することは困難かもしれないし、収納時が低下するなど極端な環境での作業のための利点です。GitHub (シャンプー) を利用したオープン ソース ソフトウェア パッケージを使用してまたは ImageJ を用いた画像の位相と振幅に再構築が実行されます。

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Protocol

1。 成長と列挙体の細菌

注: これは、ほぼすべての菌株の適切な媒体 36 で栽培に適用。例では、我々 は 3 系統を使用: 一般的な簡単な個人ラボひずみ; として セラチアより小さく、高運動性環境負担、シェワネラ oneidensis 氏 1。検出を比較するには、対非運動性細胞、変異体 シェワネラ 非運動性、Δ 運動 FlgM、また使用されます比較 37。ホストゲノム スープ (LB) ですべての株が栽培されています

  1. 準備滅菌 LB 培地 (蒸留水 1 リットルあたり: バクト トリプトンを 10 g、5 g バクト酵母、10 g 塩化ナトリウム; フィルターまたはオートクレーブ)。標準 100 mm 径 LB 寒天培地プレート (同じ培地を加えて 1 リットル当たり 15 グラムの寒天レシピ; オートクレーブ (121 ° C、20 分) を殺菌し、注ぐときに処理するために十分に涼しい) を準備します。冷蔵庫の中、板を格納します
  2. 実験前日シード 5 6 mL の " マスター " 培地から新鮮な細菌のコロニーは、正しい滅菌とバイオ技術を使用して。〜 12 h. インキュベーション時間はひずみと成長率に依存するため、30 ° C でシェーカー (120 rpm) で孵化させなさい。実験では、12 時間孵化する シェワネラ 系統ただし、セラチア 8 時間後に文化は半ば対数増殖に展示されるように収穫が
  3. 実験の日かかる細菌の吸光光度読書 (外径 600) 0.6 〜 0.7 の範囲内であると予想される文化をマスターします。それは (前に確認した)、対数増殖期のはずです。場合 5 mL の培地には、サブカルチャー 100 μ L 中間ログ フェーズに細胞の成長を許可するとします
  4. マスターのサンプルを取る文化し、アクアマリーン Hausser のカウントを使用して直接商工会議所のセルをカウントします。生きていると死んでいるセルが列挙されます
    1. マイクロ ピペットと転送室に原液文化の 10 μ L のサンプルを抽出します
    2. (40 X 63 X、NA 0.7 - 0.8) 高ドライ客観的顕微鏡下の画像相コントラストを使用して
    3. は、少なくとも 20 の正方形と平均の細菌をカウントします
      。 注: は、正方形とだけそれらを越え、上部と左境界 (または下と右場合) 内に完全にある細菌だけをカウントします。正方形はいくつかの行で区切られた、境界としていずれかを選択します
    4. 。 希釈係数 x
    5. 20 の平均として計算濃度の正方形。数濃度のためによく働かない直接注 < 10 7/mL
  5. コロニー形成のカウントの文化のシリアル希薄を作るユニット (CFU)。生きた細胞のみが列挙されます
    1. 0.9% 生理食塩水と選択した細菌性のサンプルのそれぞれのシリアル希薄を作るソリューションです。細菌溶液 20 μ L を転送し、180 μ L の生理食塩水で希釈します。最低濃度が 10 〜 3 セル/mL になるまでを繰り返します
    2. 希薄示唆された少なくとも 2 つを取る 100 μ L が 10 3 と 10 の 4/mL — と適切な固体媒体プレートのプレート。滅菌スプレッダーで拡散します。各希釈の少なくとも 3 の複製を実行します
    3. コロニーの成長まで、または一晩あなたの細菌のための適切な温度で孵化させなさい
    4. のコロニーをカウントし、コロニー形成単位 (CFU) (x の希釈倍率のコロニー数) によるとを計算するボリューム メッキ/CFU/mL を =。平均 CFU 複製します

2。DHM の高希釈試料の調製

  1. マスターのシリアル希薄を作る文化 DHM とポスト DHM カウントの LB メディア プレートのコロニー形成単位 (1.4.4 1.4.1 - 参照)。録音を行っている人は各測定サンプルの濃度を認識せずに実行するには、この二重盲
    1. は、実験中に細胞の濃度がかなり変更されませんので、10-15 mL 最小媒体を (必要に応じて) 運動を奨励するが、細胞分裂を阻害するのに細菌を希釈します。0.9% 生理食塩水またはより具体的運動媒体があります。たとえば、大腸菌 を使用している場合、運動中は EDTA 38 を含める必要があります。これらの例では 0.9% 生理食塩水を使用します

3。DHM 動画の記録

  1. 関心の希薄化の約 10 mL 滅菌注射器を使用すると、プルします
  2. は、DHM 試料室滅菌器具を使用し、チューブに注射器を接続します
    。 注: カスタムメイド流体チャンバーが計測器の光学パスを通して試料の一貫した流れを許可するために竣工しました。詳細については、結果 を参照してください。実験前に試料室のすべてのコンポーネントは、オートクレーブによる滅菌する必要があります
  3. フロー継続的にシリンジ ポンプを使用して試料室を通して注射器からサンプル
    。 注: 適切な流量が異なります路寸法、目的のスループットとデータ取得制限します
  4. は、サンプルは、サンプル室に流れるとは、適切なフレーム レートで連続してホログラムを取得します。どのログ データ分析 (プロトコル セクション 4) 中に後で使用する各画像の時間をキャプチャ時刻スタンプ ファイルが作成されます。常温 (23 ° C) すべてのホログラムを取得します。カメラの製造元によって提供される事前に C++ 実行可能ファイルを実行してホログラムを記録します
    。 注: 適切なフレーム レートは、流量を選択によって異なります。この実験のため細菌が視覚化されるようにフレーム レートを使用することは勧め > 楽器を越えた 2 倍 ' s 視野
  5. DHM を通じてフローするサンプルの全体の 10 mL の十分な時間を許可します
  6. 。 細菌が育っていない予防接種実験の間に死んでいることを確認して
  7. 豊かに過ごしたメディア ポスト DHM イメージ キャプチャの 100 μ L でメディア プレート。滅菌スプレッダーと広がり、適切な温度で 24 時間インキュベート現在のコロニーをカウントします

4。細胞密度および検出限界の計算

  1. 取得したホログラムの動画と細菌の存在のデータを分析します
    1. は、ホログラムの時系列の中央のピクセル値を計算し、ホログラムで固定アーティファクトを除去するために、各画素からこの平均値を減算します。これが ImageJ で次の手順を実行することによって行われる場合があります:
      1. 32 ビット (イメージ型 32 ビット) に変換する
      2. 計算する中央値 (画像スタック Zproject メディアン)
      3. スタック (の残りの部分から中央値を減算Process-ImageCalculator-Subtract)
    2. 目に見える風通しの良いリングとフォーカスでセルの数をカウント手動で。これは、ImageJ でポイント ツールでオブジェクトを指して、
    3. ホログラムの各シリーズ (ホログラム取得時に記録されて) タイムスタンプ ファイル伴われます。使用イメージ時点で励起されたサンプルの合計金額を計算するタイム スタンプ ファイルをキャプチャーした
  2. イメージ サンプルの総量で検出されたセルの合計数で割って細胞密度を計算します。正確な統計量のための 5 から 10 フレームを平均します

5。画像の振幅と位相を再構成

  1. 選択代表ビデオ フレームごと 10 200 セルを持つ。生 (減算、中央) ホログラムを読み込む復元ソフトウェア (例: 伝搬 ImageJ 数値 39;シャンプー [GitHub]).
    1. を用いた ImageJ、OD 数値伝搬数値回折へ
    2. プロンプトで実際または仮想イメージを選択し、正弦波騒音機能にフーリエ マスクを描画します
    3. 復興距離を入力して振幅と位相での適切な z 手順を再構築します
  2. 中央 4.1.1 のようにノイズを低減する振幅データを減算します
  3. 3 d プロット データ キューブまたは投影。プラグインに移動 — ボリューム ビューアーします

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Representative Results

結果は、DHM によって、非常に低いレベルでの生活、死んで細菌を検出する能力を示す必要があります。細菌カウント数はピープル ハウザー カウント室とプレート カウントを使用して得られた結果と一致してはずです。標準的な統計的手法は、様々 な細菌濃度の異なる検出法の精度についての情報を提供します。

図 1は、細胞の直接列挙体で使用されるカウントの商工会議所の組織だけでなく、使用されるピープル Hausser カウント商工会議所を示しています。図 2 aは、十分な許可された典型的な濃縮培養プレートを示していますs. の marcescensコロニー (室温で 16 時間) を成長するための時間。図 2 bは、使用されるすべての系統の成長曲線を示しています。外径600とコロニー数の関係を分光光度計; 信頼できる範囲内で線形にする必要があります正確な分光光度計の測定値は異なりますが、測定した ~ OD600 = 0.1 〜 108/mL として。直接ピープル Hausser のカウントし、コロニー カウントする必要がありますセルまで 10% 以内死ぬ成長曲線の売り上げ高で見られるようにするのには同意します。

図 3は、カスタム サンプル室の設計を示します。カスタム マイクロ流体チャンバーは、ホログラフィック顕微鏡の視野を通して試料の連続的なフローを許可するこの実験で使用されました。標準的なマイクロ流体技術と素材は、サンプル室の建設に使用されました。鈍い男性ルアーロック金具を使用した針は、サンプル室に入口および出口ポートを提供するマイクロ流体デバイスに挿入されたステンレス鋼の先端。マイクロ チャネル形状はポリジメチルシロキサン (PDMS) アルミ削り出しのマスター型は、アルミ フレームで圧縮されたを使用して 2 つの光学的品質のガラス窓の間の柔らかい石版印刷によって設立されました。PDMS フロー チャネル形状を確立するだけでなく、流体輸送し、流路から注射針を固定しています。これらのサンプル室は、単にチャネルされた流路形状を確立し、計測器の光路に PDMS 従って含まない PDMS を使用します。オフアクシス ホログラフィック顕微鏡の光学的な性質、ため 2 つのマイクロ チャネルが成形したに注意してください。 サンプル室で互いに平行。これは干渉計 ('体' と '参照' 腕と呼ばれる) の両方の腕の間の光パスの長さに一致するものです。参照チャネル滅菌メディアを含める必要がありますのみ、流れの影響を受けない。

図 4は、研究所実装で回路図とデジタル ホログラフィー顕微鏡のイメージを示します。それは、カメラに付属するソフトウェアによって運営されています。細菌の列挙とビューのフィールドごとにセルの数が予測とその対応の代表的な DHM データを図 5に示します。復興せず、生のホログラムから見るし、中央値減算と手動追跡による細胞をカウントすることが可能です。これは、生ホログラム表示、溜まりの深さ中の細胞は、すべての z 平面を再構築と比較計算の負担を大幅に減少します。濃度の異なるプレート カウントとアクアマリーン ハウザー カウントとその対応で文化の外観が表示されます。総細胞数は、イメージのボリュームの合計数に各サンプルの量に見える細胞の数を平均することによって決定されます。検出限界は、イメージ サンプル ボリュームの合計数によって決定されます。この実験では、この値は、0.25 μ L ずつ (合計 40,000 枚サンプル) イメージ サンプルの 10 mL の合計は、最大の最大制限を設定します。細胞が各フレームに 20 フレームのシリーズで明らかに認められた場合、最大の容量を実現する前に、録音が停止します。前稿では、我々 は 1 105セル/mL (表 1) に至る濃度 50% の信頼水準での細菌の検出に必要なサンプル ボリュームの数を推定する式を報告しました。この見積もりに基づき、すべての 40,000 骨組の検討では、この計算はコンピューターに負荷が 1/mL で細胞の検出ように。

図 6は、復興ソフトウェア (フィジー)39の使用を示します。1 枚のホログラムが開かれ、ソフトウェア「伝搬数値回折 OD 数値」を実行します。撮像パラメーター] ダイアログ ボックスにあります。振幅、強さ、および段階すべてを再建することがあります。単一の z 平面を選択可能性があります、またはバッチ復元を使用深度全体を再構築することがあります。

図 7は、選択したサンプルの異なる深さで振幅と位相画像の復元を示します。再構成を生成に使用するフーリエ マスクは、強度のスタックのボリューム投影、相スタックを介して最大投影位相画像中央減算強度画像とともに表示されます。

Figure 1
図 1: 直接細菌のセルをカウントします。商工会議所を数えるとアクアマリーン ハウザー チャンバーにはのみ 20 が含まれているという事実のためその数会計をスケーリングの細菌の総数をカウントすることによって細胞/ml の細菌濃度を計算サンプルの nL。(A)「アクアマリーン Hausser カウント部屋。カウントの (B) イメージは、異なるサイズのセルを列挙するに役に立つさまざまなサイズのボックスを表示位相コントラスト X 10 の下で組織を商工会議所します。S. marcescensカウント商工会議所最小ボックス内の (C) 外観位相コントラスト x 40。それをカウントするため (D) メソッドは、セルの上と右の端 (N) が下側と左側端ではなく (Y) に落下を除外します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 植民地成長と光学密度によってセルをカウントします。(A) s. の marcescens 16 時間室温でインキュベートします。適切な希釈培養皿べき正確なカウントと統計 20 200 コロニーがあります。表示板は多少信頼性の高いカウントも混雑しています。(B) 成長曲線 3 系統使用のため。~ 108セル/ml、0.1 の光学密度が対応しますが、正確な値は計測器によって異なります。直接ピープル ハウザー カウントは線形成長の範囲内で 10% 以内にプレート カウントに同意します。誤差範囲は、5 つの独立したサンプルの標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: サンプル室デザインします。(A) マイクロ流体回路 (供試体およびリファレンス マイクロ ラベル)。(B) 試料室が完成。(C) 爆発した CAD 表示サンプル室の構成要素を表示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 回路図やデジタル ホログラフィー顕微鏡の画像。(A) 図 4 つの主な要素: ソース、サンプル (標本のパス仕様のラベルは、参照パスの参照ラベルは) 顕微鏡とセンサー。(B) ハードウェアのソリッド モデル。繊維供給元のアセンブリが、下部と撮像カメラが一番。2 つの非球面レンズ、リレーレンズ-成る-顕微鏡の光学系は、300 ミリメートル長いレンズ チューブ内含まれています。ソース間の 3 軸ステージ顕微鏡光学系は、研究試験片の簡単な手動操作を提供します。(C) 実験室の器械の写真。画像の下の部分でスケール バーは、1 インチを表します。回路図はウォレスから再描画されます。34.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 成長曲線と代表の DHM データ。(A) 予想は 365 μ x 365 μ m の試料体積に基づいて視野あたりセル × 1 mm。DHM 列挙体の最適な範囲が四角形に表示され、実際のサンプルは (B) として示されます (C)。シェワネラの DHM (B) ホログラム文化 8 x 105セル/mL ピープル ・ ハウザーによって測定し、7.7 × 10 で5セル/mL プレート カウントによって測定されます。この画像は、110 のセル、予測に抜群のフィット感を示しています。2.0 ± 0.1 x 105セル/ml ピープル ハウザーと 2.0 ± 0.3 x 105セル/mL プレート カウントによって測定される測定シェワネラ文化の DHM (C) ホログラムこの画像は、27 セルを示します。スケール バー = 35 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 復元を実行します。(A) オープン フィジーのホログラム。(B) 実行数値伝搬波長と画像のサイズを入力します。開始を 0 に近い z 距離を選択します。(C) 描画フーリエ マスク実際または仮想イメージを選択するメッセージが表示されたら。(D) バスの処理は、ボリューム全体の復元。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 再構成の外観。10 〜6セル/mL でセラチア文化のイメージ。(A) 生ホログラム。(B) フーリエ変換です。円の内側の領域が使用される領域です。残りの部分はマスクされます。(C) 1 つの z 平面で振幅復興。(D) 1 つの z 平面; 復興相スケール バーは、度の位相のずれを示しています。(E) 最大強度投影相スタックのすべての z 平面を。(F) ボリュームは、完全な振幅スタック (800 μ m × 365 × 365) の表示します。スケール バー = 35 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

濃度 [mL ごとのセル数] 必要なフレーム
1.00E + 00 6,686
1.00E + 01 669
1.00E 秒 02 67
1.00E + 03 7
1.00E + 04 1
1.00E + 05 1

表 1:DHM (50% の検出の信頼) による細菌の検出に必要なサンプル ボリュームの最小数です

プロパティ ユニット
波長で動作 405 nm
客観的数値の絞り 0.3 -
システム倍率 20 -
横方向分解能 0.7 Μ m
サンプル画像ボリューム 360 x 360 x 800 Μ m x μm x μm
楽器の長さ 400 mm

表 2:デジタル ホログラフィー顕微鏡の光、パフォーマンスに関する仕様

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Discussion

ホログラムの数値復元: ホログラムの数値復元、角度スペクトル法 (ASM) が使用されます。DHM のグリーン関数とホログラムの畳み込みが含まれます。特定焦点面での映像の複雑な波面は、次のようにフーリエ畳み込み定理を用いて計算できます。

Equation 2(1)

どこEquation 3フーリエ変換演算子は、Equation 4ホログラム行列とEquation 5として定義されている DHM の緑の機能です。

Equation 6(2)

どこEquation 7再建されるべき目的焦点平面の光軸の距離は、Equation 8は、照明の波長Equation 9Equation 10x のピクセル数は、y 方向それぞれとEquation 11Equation 12(検出器平面) のピクセル サイズは、x と y 方向、それぞれ40

乗の大きさによって、複雑な波の前部から強度を計算できますEquation 13、商の虚部と実の部分の間のアーク タンジェントによって位相を得ることができますEquation 13

変更とトラブルシューティング
スパース細菌濃度の列挙を含む実験は非常に汚染、偽陽性と偽陰性受けます。この理由は、成長と細菌の列挙、DHM の高い希薄試料の準備だけでなく、この実験で重要な手順はします。環境細菌が栽培されて、列挙を慎重に制御することによりこの実験の汚染を避けるために注意する必要があります。偽陽性と同様、汚染に対して適切な消毒法、オートクレーブを含むを防ぐ。さらに偽陽性を防ぐために、細菌は比較的ユニークな特性 (例えば、s. の marcescensは、培養した場合非常に明瞭な赤い色を持っている) を示すこの実験に選ばれました。偽陰性を防ぐために、その形状や運動パターン DHM を介して識別することを持っているし、同様に濃縮培養皿上に成長することができることこの実験に選ばれた細菌が選ばれました。めっきサンプル プレート カウントによって細菌を定量化して汚染および/または予期しない細胞の成長を定期的にテストすることが重要です。

この実験では、サンプルの 1 ミリリットルあたり約 2.4 GB のデータのサイズが期待できます。この数はもちろん、使用されるカメラとファイル形式に依存です。報告されるデータのサイズは、4 Mpx 検出器と標準の TIFF ファイル形式の使用です。データの後処理には、サンプルの 1 ミリリットルあたり計算の約 6 分が必要です。この処理時間は 3.5 GHz と 32 GB の RAM でインテル i7 の 8 コア プロセッサを使用している間観察されました。非常に処理時間の削減がないここで行われていたために、GPU にこれらの計算を並列化できます。

技術の限界
DHM を使用して細菌の非常に低い集中を検出することは可能ですが、この方法は非特異的です。形態だけでは細菌を識別する決定的な手段ではありません。診断アプリケーションは非標的細胞と凝集体の存在のために特定の課題を提示します。ただし、ここで示したデュアル ビーム計測器の利点は、比較的濁ったサンプルで細菌をイメージすることだです。臨床サンプル、および、必要なサンプルの前処理の程度の細菌を検出する能力は未定に残る。

プロトコルの重要なステップ
手順 2:正確な希釈を取得は、定量的に測定に不可欠です。プレート カウントによって作られた任意の希釈をバックアップしてをください。手順 3: すべてのセルが表示されるようにする流量と対応するフレーム レートの選択を慎重に行う必要があります。ポンプのパラメーターの調整は、検出実験の制限を実行する前に慎重に調整する必要があります。ステップ 4: 非常に低い細菌濃度の検出を保証する十分なデータをキャプチャすることが重要です。セル、およびない破片が見られていることを特定するいくつかのデータを再構築する必要があります。極端な場合、溶液 10 mL 以上必要があります。非運動系統は運動系統よりもあいまいになりやすいです。ステップ 5: 復興がホログラムが細胞とない破片を表す説明を助けることができるデータのあいまいさがある場合。運動は運動系統のトラックではっきり見ることが、高解像度の再建は古典的な細胞の形態が表示されます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

著者は、この作業を資金調達のためカリフォルニア工科大学に 4038 とベティ ・ ムーア財団助成金 4037 ゴードンを認めます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast BD Biosciences 212750
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7710 Many options for purchase
Bacto Agar BD Biosciences 214010
10 cm Petri dishes VWR 10053-704
15 mL culture tubes Falcon (Corning Life Sciences) 352002 Loose-capped
Petroff-Hauser chamber Electron Microscopy Sciences 3920
10 mL syringes BD Biosciences 309604 Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting McMaster-Carr 51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow Nalgene 8000-0004 Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Sample Chamber Custom n/a See Materials Section
Holographic Microscope Custom n/a See Wallace et al.
Open-source software Custom https://github.com/bmorris3/shampoo

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References

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