Quantificare i microrganismi alle concentrazioni basse usando microscopia digitale oleografica (DHM)

Bioengineering

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Summary

Microscopia digitale oleografica (DHM) è una tecnica volumetrica che permette immagini campioni che 50-100 X più spessa di microscopia in campo chiaro a risoluzione paragonabile, con messa a fuoco eseguita post-elaborazione. Qui DHM viene utilizzato per l'identificazione, conteggio e microrganismi di rilevamento molto bassa densità e confrontato con misurazioni di densità ottica, germi e diretto.

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Bedrossian, M., Barr, C., Lindensmith, C. A., Nealson, K., Nadeau, J. L. Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM). J. Vis. Exp. (129), e56343, doi:10.3791/56343 (2017).

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Abstract

Con precisione rilevando e contando sparsi campioni batterici ha molte applicazioni nel cibo, bevanda e le industrie di trasformazione farmaceutica, nella diagnostica medica e per il rilevamento di vita tramite missioni robotiche di altri pianeti e lune del sistema solare. Attualmente, radi campioni batterici sono contati da microscopia di placcatura o epifluorescenza di cultura. Piastre di coltura richiedono lunghi tempi di incubazione (giorni o settimane), ed epifluorescenza richiede vasta macchiatura e concentrazione del campione. Qui, noi dimostrare come utilizzare fuori asse microscopia digitale oleografica (DHM) per enumerare i batteri nelle colture molto diluite (100-104 cellule/mL). In primo luogo, la costruzione del DHM personalizzato è discussa, insieme a istruzioni dettagliate sulla creazione di uno strumento di basso costo. I principi dell'olografia sono discussi, e viene utilizzato un modello statistico per stimare quanto tempo video dovrebbe essere quello di individuare le cellule, basate sulle caratteristiche prestazioni ottiche dello strumento e la concentrazione della soluzione batterica (tabella 2) . Video di rilevamento delle cellule alle 105, 104, 103e 100 cellule/mL è dimostrato in tempo reale utilizzando gli ologrammi non ricostruiti. Ricostruzione di immagini di ampiezza e fase è dimostrata utilizzando un pacchetto di software open-source.

Introduction

Determinazione delle conte batteriche accurate in campioni molto diluite è cruciale in molte applicazioni: alcuni esempi sono acqua e cibo qualità analisi1,2,3; rilevamento di agenti patogeni nel sangue, liquido cerebrospinale o espettorato4,5; produzione di prodotti farmaceutici, tra cui acqua sterile6; e l'analisi di comunità ambientale in ambienti oligotrofici come le aperto oceano e sedimenti7,8,9. C'è anche un crescente interesse nell'individuazione di possibile esistente vita microbica sulle lune ghiacciate di Giove e Saturno, particolarmente Europa10,11 ed Encelado12,13, 14, che sono noti per avere oceani liquidi sotto la superficie. Perché nessuna missione dal Viking nel 1978 ha tentato di trovare la vita ancora esistente su un altro pianeta, c'è stato limitato sviluppo di tecnologie e strumenti per identificazione batterica ed il conteggio durante spazio missioni15.

I metodi tradizionali di germi trovano solo le celle coltivabili, che possono rappresentare una minoranza di specie in ceppi ambientali, a volte < 1%16. Piatti richiedono giorni o settimane di incubazione per il massimo successo, dipendendo il ceppo. Epifluorescenza in gran parte ha sostituito conta su piastra come il gold standard per l'enumerazione microbica rapida e accurata. Contrassegno dell'acido nucleico--coloranti fluorescenti quali 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI), SYBR Green o arancio di acridina che si legano agli acidi nucleici sono il tipico coloranti utilizzati17,18,19 , anche se molti studi utilizzano indicatori fluorescenti di grammo Iscriviti20,21,22,23,24. Utilizzando questi metodi senza passaggi di pre-concentrazione conduce ai limiti di rilevabilità (LOD) di ~ 105 cellule per mL. Miglioramenti in LoD sono possibili mediante filtrazione. Un campione liquido è vuoto-filtrata su una membrana, solitamente in policarbonato e idealmente nero per ridurre di fondo. Basso-sfondo coloranti come le macchie di DNA cui sopra possono essere applicate direttamente al filtro25. Per conteggio preciso dall'occhio, cellule5 ~ 10 sono necessari per ciascun filtro, che significa che per i campioni più diluiti rispetto alle cellule di5 ~ 10 millilitri, volumi di campione significativo devono essere raccolto e filtrati. Dispositivi di scansione laser sono stati sviluppati al fine di esplorare sistematicamente tutte le regioni del filtro e quindi ridurre il numero di cellule necessarie per il conteggio, spingendo i limiti di rilevazione fino a ~ 102 cellule per mL26. Tuttavia, questi non sono disponibili nella maggior parte dei laboratori e richiedono hardware sofisticato così come software che consentono esperta conferma che osservate particelle è batteri e non residui.

Per riferimento, adulti con sepsi solitamente cominciano a mostrare sintomi alle < 100 cellule/mL di sangue e neonati a < 10 cellule/mL. Un prelievo di sangue da un adulto prende 10 mL e da un infante, 1 mL. Metodi basati sulla PCR sono inibiti dalla presenza della flora umana e non patogeni del DNA e di componenti d'inibizione PCR nel sangue27,28. Nonostante una varietà di tecniche emergenti, culture rimangano il gold standard per la diagnosi di infezioni del torrente sanguigno, soprattutto nelle zone più rurali o nazioni in via di sviluppo. Per la rilevazione della vita su altri pianeti, calcoli termodinamici possono stimare il bilancio di energia per la vita e, quindi, la biomassa possibile prevista. 1 - 100 cellule/mL devono essere termodinamicamente ragionevole su Europa29. Può essere facilmente visto da questi numeri che la rilevazione di molto piccolo numero di cellule in grandi quantità di soluzione acquosa è un importante problema irrisolto.

In questa carta, dimostriamo rilevamento dei marcescens del Serratia e Shewanella oneidensis (wild-type e non motili mutante) alle concentrazioni di 105, 104, 103e 100 cellule/mL utilizzando un fuori-asse microscopio digitale olografica (DHM). Il vantaggio chiave di DHM su microscopia tradizionale è la formazione immagine simultanea di un volume di campione di spessore ad alta risoluzione — in questa implementazione, la camera del campione era 0,8 mm di spessore. Queste camere di campioni sono state costruite dal soft-Litografia di polidimetilsilossano (PDMS) da uno stampo di alluminio lavorati di precisione con una tolleranza di ± 50 µm. Questo rappresenta un miglioramento di circa 100 volte in profondità di campo nel corso di microscopia ad alta potenza. DHM fornisce anche informazioni di fase quantitativa, consentendo per le misure di lunghezza del cammino ottico (prodotto di indice di rifrazione e spessore). DHM e tecniche simili sono stati utilizzati per il monitoraggio batterico e ciclo delle cellule di lievito e calcolo di batterica in massa secca30,31,32; differenze di dispersione possono anche essere usate per differenziare ceppi batterici33.

Lo strumento che usiamo è costruito su misura specificamente per l'utilizzo con microrganismi, come precedentemente pubblicati34,35, e la costruzione e sono dimostrati e discussi. Soluzioni acquose sono continuamente fornite a un 0,25 µ l volume pozzetto di misurazione tramite pompa a siringa; la portata è determinata dalla frequenza di fotogrammi fotocamera al fine di garantire la formazione immagine del volume intero campione. Un calcolo statistico predice il numero di volumi di campione che deve essere imaged al fine di rilevare un numero significativo di cellule ad una determinata concentrazione.

Per applicazioni di rilevamento delle cellule, ricostruzione di ologrammi in ampiezza e fase di immagini non è stato richiesto; analisi è stata eseguita sull'ologramma crudo. Ciò consente di risparmiare spazio su disco e risorse computazionali significative: un ologramma di 500 Mb video sarà 1-2 Tb quando ricostruito. Tuttavia, discutiamo la ricostruzione attraverso la profondità del campione per confermare che gli ologrammi rappresentano la specie desiderata. Una caratteristica importante del DHM è la sua capacità di monitorare l'intensità e la fase delle immagini. Organismi che sono quasi trasparenti in intensità (come la maggior parte delle cellule biologica) appaiono chiaramente in fase. Come è una tecnica privo di etichetta, coloranti non vengono utilizzati. Si tratta di un undvantage per applicazioni di volo spaziale possibile, dato che coloranti potrebbero non sopravvivere le condizioni di una missione e — soprattutto — non può essere assunto a lavorare con organismi extraterrestri, che non possono utilizzare DNA o RNA per la codifica. È anche un vantaggio per il lavoro in ambienti estremi come l'Artico e Antartico, dove coloranti possono essere difficili da portare nella posizione remota e possono peggiorare durante la conservazione. Ricostruzione di immagini in fase e in ampiezza viene eseguita utilizzando un pacchetto di software open-source che abbiamo reso disponibile su GitHub (SHAMPOO) o ImageJ.

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Protocol

1. crescita e l'enumerazione dei batteri

Nota: questo è applicabile a quasi qualsiasi ceppo batterico cresciuto nel medio appropriato 36. Nel nostro esempio, usiamo tre ceppi: i marcescens del Serratia come un ceppo comune, facile laboratorio identificabili; e un più piccolo ceppo ambientale altamente motile, Shewanella oneidensis MR-1. Per confrontare il rilevamento di motili vs cellule non motili, non motili Shewanella mutante, Δ FlgM, è anche utilizzato per confronto 37. Tutti i ceppi sono coltivati in brodo (LB) di Lisogenesi.

  1. Preparare mezzo LB sterile (per litro di acqua distillata: 10 g bacto triptone, 5 g di lievito bacto, 10 g NaCl; filtro o autoclave). Preparare standard 100 mm piastre diametro LB-agar (stessa ricetta come media più agar 15 g per litro; autoclave (121 ° C, 20 min) per sterilizzare e versare quando abbastanza fresco da gestire). Conservare medium e piastre in frigorifero.
  2. Il giorno prima dell'esperimento semi 5-6 mL di " Master " terreno di coltura da una colonia batterica fresca, utilizzando la tecnica sterile e biosicurezza corretta. Incubare su un agitatore (120 giri/min) a 30 ° C per il tempo di incubazione ~ 12 h. sarà dipendono il tasso di deformazione e crescita. Nei nostri esperimenti, i ceppi di Shewanella vengono incubati per 12 ore; Tuttavia, Serratia è raccolto dopo 8 ore, per garantire la cultura sarà presente crescita metà-logaritmica.
  3. Il giorno dell'esperimento, prendere una lettura spettrofotometrica (OD 600) del batterico Master cultura, che dovrebbe essere nel range di 0,6 a 0,7. Dovrebbe essere in fase di crescita logaritmica (come determinato in precedenza). Se non, sottocultura 100 µ l in 5 mL di terreno e consentire la crescita delle cellule alla fase di Mid-log.
  4. Prendere un campione del maestro di cultura e contare le celle direttamente utilizzando un conteggio di Petroff-Hausser dell'alloggiamento. Questo verrà enumerare le cellule sia dal vivere che morte.
    1. Estrarre un campione di 10 µ l della coltura non diluito con una micropipetta e trasferimento nella camera.
    2. Immagine al microscopio obiettivo alta-a secco (40 X o 63 X, NA 0,7 - 0,8) con contrasto di fase.
    3. Contare i batteri in almeno 20 piazze e media.
      Nota: Il conteggio solo quei batteri che sono interamente all'interno di un quadrato solo quelli incrocio sopra la parte superiore e i limiti sinistro (o fondo e diritto, se si preferisce). Se piazze sono separati da linee diverse, scegliere uno come un contorno.
    4. Concentrazione calcola la media di 20 piazze x fattore di diluizione. Si noti che diretto conteggi non funzionano bene per le concentrazioni < 10 7 / mL.
  5. Effettuare diluizioni seriali della cultura per il conteggio di formazione di colonie (CFU) unità. Questo enumererà cellule vive solo. Soluzione
    1. fare una diluizione seriale di ciascuno dei campioni batterici selezionati con soluzione fisiologica 0,9% sterile. Trasferire 20 µ l della soluzione batterica e diluirla con soluzione fisiologica 180 µ l. Ripetere fino a quando la concentrazione minima è 3 ~ 10 cellule/mL.
    2. Prendere 100 µ l di almeno due diluizioni-suggerito sono 10 3 e 10 4/ml — e la piastra su una piastra di supporto solido appropriato. Stendere con una spatola sterile. Eseguire almeno 3 repliche di ogni diluizione.
    3. Incubare a una temperatura adeguata per il tuo batteri durante la notte o fino a quando le colonie si sviluppano.
    4. Colonie di contare e calcolare unità formanti colonia (UFC) secondo (# delle colonie x fattore di diluizione) / volume placcato = CFU/mL. Medio di CFU in replicati.

2. Preparazione di campioni altamente diluire per DHM

  1. fare diluizioni seriali del Maestro della coltura per DHM e post-DHM conteggio delle unità formanti colonie su piastre di LB media (Vedi 1.4.1 - 1.4.4). Eseguire questa prova alla cieca, in modo che la persona che fa le registrazioni non è a conoscenza della concentrazione in ogni campione misurato.
    1. Diluire i batteri in 10-15 mL di un medium minimo che incoraggiare la motilità (a seconda dei casi), ma inibiscono la divisione cellulare, in modo che la concentrazione di cellule non cambia sensibilmente durante l'esperimento. Questo può essere un supporto più specifico di motilità o soluzione fisiologica 0,9%. Ad esempio, se utilizzando Escherichia coli, medie di motilità devono contenere EDTA 38. Per questi esempi, utilizziamo la soluzione fisiologica allo 0,9%.

3. La registrazione di video DHM

  1. utilizzando una siringa sterile, tirare in circa 10 mL della diluizione di interesse.
  2. Collegare la siringa al pozzetto di misurazione DHM utilizzando sterile raccordi e tubi.
    Nota: Una camera microfluidica su misura è stata costruita al fine di consentire il flusso costante del campione attraverso il percorso ottico dello strumento. Vedere la sezione risultati per maggiori dettagli. Prima dell'esperimento, tutti i componenti della camera del campione devono essere sterilizzati in autoclave.
  3. Flow il campione dalla siringa attraverso la camera di campionamento continuamente utilizzando una pompa a siringa.
    Nota: Portate appropriato variano a seconda di dimensioni canale fluidico, velocità effettiva desiderata, nonché limitazioni di acquisizione dati.
  4. Come il campione viene propagato attraverso la camera del campione, acquisire ologrammi consecutivamente ad un tasso di frame appropriato. Verrà creato un file di timestamp che registri il tempo di ogni immagine acquisire per essere usato più tardi durante l'analisi dei dati (protocollo sezione 4). Ottenere tutti gli ologrammi a temperatura ambiente (23° C). L'esecuzione di un pre-scritto file eseguibile C++ fornito dal produttore della fotocamera per registrare gli ologrammi.
    Nota: Frame appropriato variano a seconda del tasso di flusso scelto. Per questo esperimento, si raccomanda di utilizzare un frame rate in modo tale che un batterio sarebbe essere imaged > 2 volte come ha viaggiato attraverso lo strumento ' campo visivo s.
  5. Consentire tempo sufficiente per l'intero 10 mL di campione per essere propagata attraverso il DHM.
  6. Per garantire che i batteri non crescono o morire durante gli esperimenti, inoculare arricchita piastre media con 100 µ l della cattura dell'immagine post-DHM speso media. Stendere con una spatola sterile e incubare a temperatura appropriata per 24 ore; contare le colonie presenti.

4. Calcolo della densità delle cellule e limiti di rilevabilità

  1. con i video acquisiti ologramma, analizzare i dati per la presenza di batteri.
    1. Calcolare il valore mediano pixel per una serie temporale di ologrammi quindi sottrarre questo valore mediano da ogni pixel rispettivi per eliminare gli artefatti stazionari nell'ologramma. Questo può essere fatto in ImageJ attenendosi alla procedura seguente:
      1. convertire a 32-bit (immagine-tipo - 32bit)
      2. Calcola la mediana (immagine-Stack-Zproject-mediana)
      3. sottrarre la mediana dal resto della pila ( Process-ImageCalculator-Subtract)
    2. contare il numero di anelli ariosi visibili e cellule di messa a fuoco manualmente. In ImageJ, questo è fatto puntando verso gli oggetti con lo strumento punto.
    3. Ogni serie di ologrammi si affiancherà un file timestamp (registrato al momento dell'acquisizione di ologramma). Uso il file timestamp per calcolare l'importo totale del campione pompato al momento l'immagine è stato catturato.
  2. Calcolare la densità delle cellule dividendo il numero totale di celle rilevate dal volume totale del campione imaged. Media 5-10 fotogrammi per statistiche accurate.

5. Ricostruzione di ampiezza e fase di immagine

  1. Scegli video rappresentativi con le cellule di 10-200 per ogni frame. Caricare il software di ricostruzione crudi (non mediana-sottratto) ologrammi (esempi: propagazione numerica ImageJ 39; SHAMPOO [GitHub]).
    1. Usando ImageJ, vai alla diffrazione di propagazione-numerica numerica OD.
    2. Al prompt, disegnare una maschera di Fourier per scegliere i reali o immagine virtuale ed eliminare tutte le funzioni sinusoidali rumore.
    3. Ricostruire ampiezza e fase z-procedura appropriata inserendo la distanza ricostruzione.
  2. Mediana sottrarre i dati di ampiezza per ridurre il rumore come in 4.1.1.
  3. Dati di trama come un 3D cubo o proiezione. Vai al plugin — Volume Viewer.

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Representative Results

I risultati dovrebbero indicare la capacità di rilevare batteri vivi e morti a livelli molto bassi di DHM. Il numero di batteri contati deve essere coerenza con i risultati ottenuti con i conteggi di camera e piastra conteggio Petroff-Hauser. Metodi statistici standard forniscono informazioni circa la precisione dei metodi di rilevazione diverse a varie concentrazioni batteriche.

La figura 1 Mostra la camera di Petroff-Hausser conteggio utilizzata così come la microstruttura della camera del conteggio utilizzato nell'enumerazione diretto delle cellule. La Figura 2A Mostra un piatto di tipica cultura arricchita che è stato permesso sufficiente tempo per i marcescens dello S. a crescere colonie (16 ore a temperatura ambiente). Figura 2B Mostra le curve di crescita per tutti i ceppi utilizzati. Mentre le misure esatte spettrofotometro variano, il rapporto tra conteggio600 e Colonia OD dovrebbe essere lineare all'interno della gamma affidabile dello spettrofotometro; Abbiamo misurato ~ OD600 = 0.1 come ~ 108/ml. Conta il diretto Petroff-Hausser e conteggi di Colonia dovrebbero accettare entro il 10% fino a quando le cellule cominciano a morire come si è visto in termini di fatturato nella curva di crescita.

La figura 3 Mostra il design delle camere a campione su ordinazione. Microfluidica personalizzato chambers sono stati utilizzati per questo esperimento per consentire il flusso continuo del campione che attraversa il campo visivo del microscopio olografico. Materiali e tecniche di microfluidica standard sono stati utilizzati nella costruzione degli alloggiamenti del campione. Blunt con punta in acciaio inox aghi con raccordi Luer-Lok maschi sono stati inseriti nel dispositivo microfluidico per fornire le porte di ingresso e di uscita per la camera del campione. La geometria di canali microfluidici nasce dalla litografia soft di polidimetilsilossano (PDMS) utilizzando uno stampo master in alluminio lavorato, che è stato compresso, tramite telai in alluminio, tra due finestre di vetro di qualità ottica. Il PDMS stabilisce le geometrie del canale di flusso così come protegge i aghi ipodermici, che forniscono il trasporto di fluidi da e per i canali di flusso. Queste camere di campioni utilizzano PDMS unicamente per stabilire la geometria del canale di flusso e quindi non contenere nessun PDMS nel cammino ottico dello strumento. Si noti che a causa della natura ottica di un microscopio olografica fuori asse, due micro-canali sono stati modellati parallelo a vicenda nel pozzetto di misurazione. Questo è destinato a una partita di lunghezze di cammino ottico tra entrambi i bracci dell'interferometro (denominate le braccia 'esemplare' e 'riferimento'). Il canale di riferimento deve contenere solo il terreno sterile e non dovrebbe essere soggetto a flusso.

La figura 4 Mostra un disegno schematico e le immagini del microscopio digitale olografico nella relativa implementazione di laboratorio. È gestito dal software fornito con la fotocamera. La figura 5 Mostra dati rappresentativi DHM per enumerazione batterica e la loro corrispondenza con i numeri previsti di cellule per campo di vista. Dagli ologrammi crudi, senza ricostruzione, è possibile vedere e contare le celle da sottrazione mediano e inseguimento manuale. Questo riduce notevolmente l'onere computazionale rispetto a ricostruire tutte le z-aerei, come gli ologrammi crudi mostrano le cellule per tutta la profondità della camera. L'aspetto delle culture alle concentrazioni differenti e la loro corrispondenza con germi e Petroff-Hauser sono indicati. Conta delle cellule totali è determinati calcolando il numero di cellule visto in ogni volume di campione rispetto al numero totale dei volumi stampati. Il limite di rilevazione è determinato dal numero totale di volumi di campione imaged. In questo esperimento, abbiamo impostato un limite massimo su questo valore, con un totale massimo di 10 mL di campione imaged in incrementi di 0,25 µ l (un totale di 40.000 immagini per campione). Le registrazioni vengono fermate prima che il volume totale massimo è raggiunto se le cellule sono chiaramente osservate in ogni fotogramma sopra una serie di 20 fotogrammi. In un precedente articolo, abbiamo segnalato una formula per stimare il numero di volumi di campione necessari per rilevare batteri ad un livello di confidenza del 50% alle concentrazioni che variano da 1-105 cellule/mL (tabella 1). Sulla base di questa stima, un esame di tutti i 40.000 frames dovrebbe consentire la rilevazione delle cellule 1/ml, anche se questo calcolo è computazionalmente intensivo.

Nella figura 6 viene illustrato l'utilizzo di ricostruzione software (Fiji)39. Un ologramma singolo viene aperto e il software che viene eseguito "Diffrazione propagazione-numerico OD-numerica". I parametri di imaging sono riportati nella finestra di dialogo; fase, intensità e ampiezza possono essere ricostruiti. Un piano singolo z può essere scelti, o ricostruzioni di batch possono essere utilizzati per ricostruire tutta la profondità.

La figura 7 Mostra ricostruzioni di ampiezza e fase immagini a diverse profondità in un campione selezionato. Insieme a un'immagine di intensità mediana-sottratto, un'immagine di fase, una proiezione massima attraverso lo stack di fase e una proiezione di volume dello stack di intensità, viene visualizzata la maschera di Fourier utilizzata per generare le ricostruzioni.

Figure 1
Figura 1: dirigere il conteggio delle cellule batteriche. Concentrazione batterica in cellule/mL viene calcolato contando il numero totale di batteri nella camera di conteggio e ridimensionamento quel numero contabili per il fatto che la camera di Petroff-Hauser contiene solo 20 nL del campione. (A) The Petroff-Hausser camera di conteggio. (B) immagine di conteggio dell'alloggiamento della microstruttura sotto 10 X contrasto di fase, risultati utili per l'enumerazione delle cellule di dimensioni diverse scatole di dimensioni diverse. (C) aspetto dei marcescens dello S. all'interno di conteggio più piccole scatole di camera; Contrasto di fase 40x. (D) metodo per il conteggio che esclude le celle che rientrano i bordi superiori e destro (N), ma non i bordi inferiore e sinistro (Y). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: contando le cellule di sviluppo della Colonia e densità ottica. (A) i marcescens dello S. incubati a temperatura ambiente per 16 ore. Con la corretta diluizione, piastre di coltura dovrebbehanno 20-200 colonie per conteggio accurato e statistiche. La piastra mostrata è un po' troppo affollata per il conteggio affidabile. Curve di crescita (B) per i 3 ceppi utilizzati. Una densità ottica di 0.1 corrisponde a ~ 108 cellule/mL, ma i valori esatti variano da strumento. Diretto Petroff-Hauser conteggi sono d'accordo con conta su piastra a entro il 10% all'interno della gamma di crescita lineare. Barre di errore rappresentano la deviazione standard di 5 campioni indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: esempio di disegno della camera di. (A) microfluidica schematico (campione e riferimento microcanali etichettato). (B) completamente assemblato pozzetto di misurazione. (C) Esploso CAD Mostra risultati elementi costitutivi della camera del campione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: schema elettrico e immagini del microscopio digitale olografico. Schema (A) mostrando quattro elementi principali: la fonte, il campione (percorso esemplare è denominata spec. e percorso di riferimento Ref.), il microscopio e il sensore. (B) modello solido dell'hardware. L'assembly di origine fibra-Federazione è nella parte inferiore, e la termocamera è in cima. L'ottica del microscopio – composto da due lenti asferiche e la lente di relè – sono contenute all'interno del tubo di obiettivo a lungo 300 mm. La fase tre assi tra l'origine e l'ottica del microscopio fornisce facile manipolazione manuale del campione in studio. (C) fotografia dello strumento in laboratorio. La barra della scala nella parte inferiore dell'immagine rappresenta 1 pollice. Gli schemi sono ri-disegnati da Wallace et al. 34. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: curve di crescita e dati rappresentativi DHM. Previsto (A) cellule per campo visivo basato su un volume di campione di 365 µm x 365 µm x 1 mm. La gamma ottimale per enumerazione DHM è mostrata nel rettangolo, e campioni reali sono indicati come (B) e (C). (B) DHM ologramma di un Shewanella cultura a 8 x 105 cellule/mL misurati di Petroff-Hauser e 7,7 x 105 cellule/mL come misurato dal conteggio di piatto; Questa immagine mostra 110 cellule, un'ottima vestibilità alla previsione. (C) DHM ologramma di una cultura di Shewanella a 2,0 ± 0.1 x 105 cellule/mL misurata Petroff-Hauser e 2,0 ± 0.3 x 105 cellule/mL come misurato dal conteggio di piatto; Questa immagine mostra 27 celle. Barra della scala = 35 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: esecuzione di ricostruzioni. (A) Apri un ologramma in Fiji. (B) eseguire numerica propagazione e immettere la dimensione di lunghezza d'onda e immagine. Scegliete una distanza z vicino a 0 per iniziare. (C) disegnare una maschera di Fourier quando viene richiesto di selezionare il reale o l'immagine virtuale. Vasca (D) l'elaborazione consente per ricostruzioni in tutto il volume. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: aspetto di ricostruzioni. Immagini della cultura di Serratia a ~ 106 cellule/mL. (A) Raw ologramma. (B) trasformata di Fourier. L'area all'interno del cerchio è l'area utilizzabile; il resto è mascherato. (C) ricostruzione di ampiezza a singolo piano z. (D) fase di ricostruzione a singolo piano z; la barra della scala Mostra lo sfasamento in gradi. (E) massima proiezione intensità attraverso tutte le z-piani nello stack di fase. (F) Volume Mostra dello stack piena ampiezza (365 x 365 x 800 µm). Barra della scala = 35 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Concentrazione [cellule / mL] Fotogrammi necessari
1.00 E + 00 6.686
1.00 E + 01 669
1.00 E + 02 67
1.00 E + 03 7
1.00 E + 04 1
1.00 E + 05 1

Tabella 1: Minimo numero di volumi di campione richiesto per rilevare batteri di DHM (fiducia di rilevamento del 50%).

Proprietà. Valore Unità
Lunghezza d'onda di funzionamento 405 Nm
Apertura numerica dell'obiettivo 0.3 -
Sistema di ingrandimento 20 -
Risoluzione laterale 0,7 Μm
Volume di campione Imaging 360 x 360 x 800 X μm x μm μm
Lunghezza dello strumento 400 mm

Tabella 2: Ottica e prestazioni specifiche per il microscopio digitale olografica.

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Discussion

Ricostruzione digitale di ologrammi: per la ricostruzione numerica degli ologrammi, viene utilizzato il metodo di spettro angolare (ASM). Ciò comporta la convoluzione dell'ologramma con funzione di Green per DHM. Il fronte d'onda complesso dell'immagine a un particolare piano focale può essere calcolato utilizzando il teorema di convoluzione di Fourier come segue:

Equation 2(1)

Dove Equation 3 è l'operatore di trasformata di Fourier, Equation 4 è la matrice di ologramma, e Equation 5 è funzione di Green del DHM, che è definito come:

Equation 6(2)

Dove Equation 7 è la distanza, lungo l'asse ottico, del piano focale desiderato deve essere ricostruito, Equation 8 è la lunghezza d'onda di illuminazione, Equation 9 e Equation 10 sono il numero di pixel in x e y direzioni, rispettivamente, e Equation 11 e Equation 12 sono le dimensioni dei pixel (presso l'aereo detector) in x e y direzioni, rispettivamente40.

Dal fronte d'onda complesso, l'intensità può essere calcolato dalla grandezza al quadrato di Equation 13 , e la fase può essere ottenuta l'arcotangente del quoziente tra le parti reali e immaginarie del Equation 13 .

Le modifiche e la risoluzione dei problemi
Gli esperimenti che coinvolgono l'enumerazione delle concentrazioni batteriche sparse sono altamente suscettibili di contaminazione, falsi positivi e falsi negativi. Per questo motivo, la crescita e l'enumerazione dei batteri, così come la preparazione di campioni altamente diluite per DHM sono passaggi critici in questo esperimento. Deve usare cautela per evitare la contaminazione in questo esperimento controllando attentamente l'ambiente in cui i batteri vengono coltivati ed enumerati. Tecniche di sterilizzazione adeguata, compresa la sterilizzazione in autoclave, aiutano a prevenire contro contaminazione così come falsi positivi. Per prevenire ulteriori contro i falsi positivi, i batteri sono stati selezionati per questo esperimento che presentano caratteristiche relativamente uniche (ad es., marcescens dello S. ha un colore rosso molto distinto quando coltivate). Per evitare contro falsi negativi, i batteri scelti per questo esperimento sono stati selezionati tale che essi sarebbero in grado di crescere sui piatti di cultura arricchita, così come hanno forme caratteristiche e/o modelli di motilità di essere identificato tramite DHM. È importante verificare periodicamente per contaminazione e/o crescita cellulare inaspettato di placcatura i campioni e quantificare i batteri dai germi.

In questo esperimento, è previsto un formato di dati di circa 2,4 GB per 1 mL di campione. Questo numero, naturalmente, è dipendono il fotocamera e il formato file utilizzato. La dimensione dei dati riportata è tramite l'uso di un rilevatore di Mpx 4 e un formato di file TIFF standard. Il post-processing dei dati richiede circa 6 min di calcolo per 1 mL di campione. Questo tempo di elaborazione è stato osservato durante l'utilizzo di un processore Intel i7 8-core a 3,5 GHz e 32 GB di RAM. Questi calcoli possono essere parallelizzati alla GPU per notevolmente ridotto i tempi di elaborazione, ma non è stato fatto qui.

Limiti della tecnica
Mentre usando DHM per rilevare le concentrazioni molto basse di batteri è possibile, questo metodo è non specifica. Morfologia da solo non è un mezzo conclusivo di identificare ceppi batterici. Applicazioni diagnostiche presenterà sfide specifiche a causa della presenza di cellule non-bersaglio e aggregati. Tuttavia, il vantaggio dello strumento dual beam presentato qui è che è in grado di batteri di immagine nei campioni relativamente torbidi. La capacità di rilevare batteri nei campioni clinici e il grado di pre-elaborazione dei campioni necessari, restano determinare.

Fasi critiche nel protocollo
Passo 2: Ottenere diluizioni accurate è essenziale all'enumerazione quantitativa. Eventuali diluizioni fatti dovrebbero essere sostenute da germi. Passaggio 3: la scelta della portata e frequenza fotogrammi corrispondente deve essere fatta attentamente per garantire che tutte le celle sono visti. Regolazione dei parametri della pompa deve essere ottimizzata con attenzione prima di eseguire un limite dell'esperimento di rilevamento. Passaggio 4: per bassissime concentrazioni batteriche, è fondamentale acquisire dati sufficienti per essere sicuri di rilevazione. Può essere necessario ricostruire alcuni dati per essere certi che le cellule e non i detriti, stanno vedendi. In casi estremi, potrebbe richiedere più di 10 mL di soluzione. Ceppi non-motile sono più probabili essere ambiguo rispetto ai ceppi motili. Passaggio 5: se c'è qualsiasi ambiguità nei dati, ricostruzione può aiutare a dimostrare che gli ologrammi rappresentano le cellule e i detriti non. Alta risoluzione ricostruzioni mostrerà morfologie classico cellulare e motilità può essere visto chiaramente nelle tracce dei ceppi motili.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono la Gordon e Betty Moore Foundation sovvenzioni 4037 e 4038 al California Institute of Technology per il finanziamento di questo lavoro.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacto Yeast BD Biosciences 212750
Bacto Tryptone BD Biosciences 211705
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7710 Many options for purchase
Bacto Agar BD Biosciences 214010
10 cm Petri dishes VWR 10053-704
15 mL culture tubes Falcon (Corning Life Sciences) 352002 Loose-capped
Petroff-Hauser chamber Electron Microscopy Sciences 3920
10 mL syringes BD Biosciences 309604 Luer-Lok tip not necessary
Male Luer to 1/16” barbed fitting McMaster-Carr 51525K291
Autoclavable 1/16” ID PVC tubing for flow Nalgene 8000-0004 Sold by length, purchase accordingly
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000
Sample Chamber Custom n/a See Materials Section
Holographic Microscope Custom n/a See Wallace et al.
Open-source software Custom https://github.com/bmorris3/shampoo

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