השני דור הרמונית אותות ב הארנב בסקלרה ככלי להערכה של רקמות טיפולית cross-linking של קוצר ראייה (TXL)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת cross-linking כימי בסקלרה ארנב באמצעות הדור השני הרמונית הדמיה ודיפרנציאלי סריקה calorimetry.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שיטות לחיזוק הרקמה על ידי החדרת קשרים כימיים (שאינם אנזימטי cross-linking) לחלבונים מבניים (fibrillar collagens) לטיפול כוללות cross-linking פוטו אטמוספרי ורקמות cross-linking שיטות (TXL). שיטות כאלה עבור גרימת שינויים במאפייני רקמה מכנית להיות מועסקים בקרנית הקרנית דליל (נחלש באופן מכני) הפרעות כגון קרטוקונוס, כמו גם את sclera ב קוצר ראייה מתקדמת, בו דליל ואת היחלשות של הצד האחורי בסקלרה מתרחשת ותורם סביר כדי התארכות צירית. החלבונים המטרה העיקרית לחיזוק רקמות כאלה הם collagens fibrillar, המהווים את הרוב הגדול של חלבונים משקל יבש קרנית, sclera. הצלחתנו, fibrillar collagens הן המקור העיקרי של אותות הרמונית הדור השני בחלל חוץ-תאית ברקמות. לכן, השינויים של החלבונים קולגן, כגון אלה המושרה דרך cross-linking טיפולים, יכול באופן פוטנציאלי ועוזרת quantitated באמצעות מיקרוסקופ הרמונית הדור השני (SHGM). ניטור SHGM אותות באמצעות לייזר למערכת מיקרוסקופ בשילוב עם אור אינפרא-אדום עירור סריקת מקור הוא שיטת ההדמיה מודרני מרגש את נהנית השימוש הנרחב במדעים ביו. לפיכך, המחקר הנוכחי נערך על מנת להעריך את השימוש במיקרוסקופ SHGM כמו אמצעי למדידת המושרה cross-linking אפקטים ב- ex-vivo ארנב בסקלרה, בעקבות זריקה של חומר כימי cross-linking הסוכן לחלל תת-לגלף קוצים של (sT), הזרקת הגישה כי הוא מנהג לגרימת הרדמה עינית במהלך הליכי קליניים ophthalmologic. החומר הכימי cross-linking הסוכן, נתרן hydroxymethylglycinate (SMG), נמצא במרחק של מחלקה של קוסמטיים משמרים המכונה פורמלדהיד שחרור סוכנים (פארס). שינויים scleral בעקבות התגובה עם SMG, גרמו העלאות SHG אותות, בקורלציה עם שינויי טמפרטורה דנטורציה תרמי, שיטה סטנדרטית להערכת המושרה רקמות cross-linking אפקטים.

Introduction

. קוצר ראייה מתקדמת היא שמהווה יהיה ניתן לטיפול באמצעות אי-אנזימטי scleral cross-linking (פוטו אטמוספרי ו/או כימית), זה הגיוני בהתחשב בכך חסימת קולגן cross אנזימטי-linking יכול להגדיל טופס ניסיוני קיפוח (FD)-induced קוצר ראייה1. Elsheikh ו פיליפס2 שנדונו לאחרונה את היתכנות ופוטנציאל השימוש הקרנה רגיל אולטרה סגול-A (UVA)-ריבופלבין מתווכת פוטו אטמוספרי cross-linking (הידוע גם בשם דרזדן לפרוטוקול), מקוצר כאן בתור (ריבופלבין CXL) לייצוב scleral האחורי לעצור את התארכות צירית, קוצר ראייה. שיטה זו פוטו אטמוספרי שימש בהצלחה לטיפול הקשורה של המשטח הקדמי גלוב (קרי, הקרנית בולטות) ראיתי קרטוקונוס, פוסט-לאסיק keratectasia. עם זאת, יישום של הפרוטוקול CXL עבור בסקלרה מתעכבת על ידי נושאים הקשורים קשיים בגישה sclera האחורי עם מקור אור אולטרה סגול (UV), כמו גם את הצורך לשינוי הרבה יותר רקמת פני שטח. כי נאמר, הגישה CXL שימש לעצירת התארכות צירית בצורה ויזואלית, שללה ארנבים (על-ידי tarsorrhaphy), למרות מספר מחוזות בסקלרה האחורי נדרש אזורי הקרנה נפרדים מרובים באותו מחקר3. לעומת זאת, הזרקה של ייצוב סוכן כימי (קרי, הסוכן cross-linking) דרך המרחב הקדוש יכול לייצג דרך פשוטה יותר כדי לשנות את sclera האחורי, נמנע הצורך היכרות עם מקור אור UV. טכניקת ההזרקה הזו מוכרת היטב דרך שימושית של גרימת הרדמה עינית במהלך הליכי ophthalmologic כגון קטרקט כירורגיה4,5,6. Wollensak7 תיאר בעבר השימוש זריקה sT באמצעות גליצראלדהיד (cross-linking סוכן כימי דומה ברעיון פורמלדהיד שחרור סוכנים (פארס) המתוארים במחקר זה) להתקשות את sclera ארנב ואת genipin יש הוכח כדי להגביל את אורך צירית ב- FD שרקנים8,9. חוקרים אלה הראו יתרון ברור של שימוש סוכן כימי מסיסים על הטכניקה CXL פוטו אטמוספרי. לפיכך, scleral cross-linking באמצעות סוכן כימי זריקות מסוג כלשהו, כולל את פארס (קרי, TXL)10, יכול לספק שיטת טיפול אפשרי לעצור את ההתקדמות של התארכות scleral ראיתי קוצר ראייה.

ב הפרוטוקולים המובאת כאן, אנו משתמשים פתרון cross-linking כימית של נתרן hydroxymethylglycinate (SMG), באמצעות הזרקת sT לסקלרה של ארנב cadaveric עיניים. יישמנו פרוטוקולים דומה בעבר עבור אקטואלי כימי cross-linking הקרנית. ובמיוחד במחקרים שדווחה בעבר האלה, ריכוז התלויים cross-linking אפקטים היתה אפשרות להשיג באמצעות SMG, עם מגוון אפקט הנמשכים מעל זה השגה עם פוטו אטמוספרי CXL כפי שנקבע על ידי ניתוח דנטורציה התרמי11 .

כאן נתאר פרוטוקולים כדי להעריך את השפעת SMG מועברת באמצעות זריקות sT רקמת scleral, דנטורציה תרמי באמצעות Calorimetry סריקה דיפרנציאלית (DSC), ואת השנייה הרמונית דור מיקרוסקופ (SHGM) cross-linking.

שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה (DSC), הידוע גם בשם אנליזה תרמית, מעבר דנטורציה תרמי נמדד, בשביל לרקמות scleral זה יוכפל לאחר המרתו מודרכת על ידי תכונות collagens fibrillar, מאז הם מהווים את הרוב בצובר של חלבון. שיטה זו מוערך יציבותו של המבנה המולקולרי של קולגן, חוב צולבים לייצב את הסיבים קולגן, מבנה שלישוני מקור החלבון העיקרי. במהלך חימום DSC, טמפרטורה קריטית המעבר מושגת שתוצאתו דנטורציה של מולקולת הקולגן, וכתוצאה מכך שהשתחרר של סליל משולש, תהליך המהווה מה הידוע בכינויו ג'לטין. דנטורציה תרמית זה משבש קשרי מימן לאורך מולקולת הקולגן, יכול להיות מוזז שהטמפרטורות עד המושרה cross-linking שיטות12,13. בשיטה זו נעשה שימוש במשך עשורים רבים, במיוחד בענף biomaterials ועל תהליכים הכוללים הכנת עור. אולם, שיטה זו דורש מיצוי של הרקמה בסקלרה, ולכן יכול להיות רק שימושי כמו טכניקה ex-vivo .

הדור השני-הרמוני מיקרוסקופ (SHGM) מבוססת על מאפיינים אופטיים ליניארי של חומר מסוים, עם סביבות מולקולרית הלא-centrosymmetric. חומרים כאלה, אור אינטנסיבי, לדוגמה אור המיוצר על ידי לייזרים, מחולל אותות SHG, שבו התקרית אור מוכפל בתדר. חומרים ביולוגיים ידועים כדי ליצור SHG אותות הם קולגן, microtubules, שרירים צולבות הקישור חוטים שרירן. לדוגמה, קולגן מתלהבים עם אור אינפרא-אדום של גל nm 860 יפלוט אות SHG בטווח גלוי עם 430 ננומטר אורך הגל. השני הרמונית דור (SHG) אות הדמיה היא שיטה מבטיחה להערכת cross-linking קולגן טיפולית. זה ידוע כבר יותר מ-30 שנה כי הסיבים קולגן ברקמות פולטים אותות SHG14. עם זאת, רק לאחרונה יכול תמונות ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג15 במגוון של רקמות, כולל גיד16, עור, סחוס17, כלי הדם18, ו קולגן ג'לים19.

בהתבסס על הידע הזה, מחקר זה מעריך את השינויים אות SHG המושרה בסקלרה דרך SMG כימית המושרה cross-linking של קולגן. התוצאות מצביעות על כי השינוי SMG בסקלרה מגביר את אותות SHG המופק רקמת קולגן סיבים חבילות (גבוה יותר סדר רבעוני המבנה המורכב קולגן הסיבים), מייצרת גם בשינוי מורפולוגיות מבני הקולגן רשת סיבים, משתקפת סיבים צרור "מיישר."

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בוצעו באמצעות ארנב cadaveric העיניים בתוך ראשי ארנב outbred ללא פגע. הנחיות גופים מוסדיים וכל הלאומי טיפול ושימוש של חיות מעבדה עקבו אחריך

1. הכנת פתרונות

  1. SMG הכנה TXL:
    1. להכין 1 מ"ל של 0.2 מ' ריכוז נתרן ביקרבונט פתרון (NaHCO3) הפתרון באמצעות 0.0165 גר' אבקה NaHCO3 מומס 1 מ"ל של מים מזוקקים.
    2. להמיס 0.1016 מ"ג נתרן אבקת hydroxymethylglycinate (SMG) 1 מ"ל של מים מזוקקים להגיע לריכוז סופי של 800 מ מ SMG. להתאים את הפתרון סודיום ביקרבונט ריכוז סופי של 0.1 M NaHCO3 ו- 400 מ SMG. ריכוזי SMG בהתאם cross-linking לאפקט הרצוי. בפרוטוקול המתוארים כאן השתמשנו 40, 100 ו- 400 מ SMG.

2. subTenon של הזריקה עבור TXL באמצעות SMG

  1. למלא מזרקים אינסולין 1 מ"ל שני (25 גרם מחטים) עם שליטה µL 400 והפתרון SMG, בהתאמה.
  2. מקום הראש של הארנב מטוס פרופיל בעזרת כרית. קלקר או מחסנית הנייר ניתן לתקן את הראש במצב אופטימלי.
  3. תמשוך את העפעפיים עם מפשק רחם רפואת עיניים.
  4. למדוד את ראשוני לחץ תוך-עיני (IOP) באמצעות מכשיר tonometry applanation.
  5. לסמן באתר של הזרקת המיועד על החלק האמצעי העליון של לימבוס עם סמן רקמות.
  6. . משכי לחמית סביב האתר של הזרקת עם מלקחיים conjunctival (או כל מלקחיים עם קצה עגול משונן) והכנס את המחט דרך הלחמית, הזנת הכמוסה של לגלף קוצים רק מעט מעבר האתר מסומן limbal (כלומר, 2-3 מ מ לימבוס). ניתן גם לבצע חתך קטן בלחמית עם מספריים איריס כדי להקל את המעבר של המחט דרך הכמוסה של לגלף קוצים.
  7. פעם אחת בתוך הכמוסה של לגלף קוצים, ודא כי המחט הוא נייד בחופשיות על-ידי הזזתה צד אל צד. במהלך תקופה זו, העולם לא צריכים לזוז זה מאשר השמה נכונה של המחט מעל sclera ב תת-לגלף קוצים של (רח') שטח.
  8. להזריק את הפתרון של המזרק וזורקים את המחט. מייד לאחר ההזרקה, יצטברו הנוזל בחלל sT יצירה של בליטה קדמית ראה דרך הלחמית (קרי, chemosis).
  9. חזור על המדידה IOP כדי לאשר כי היא לא שינתה עקב ניקוב בהיסח הדעת של כדור הארץ.
  10. להסיר את המכסה קצ ת, ולבצע עיסוי דיגיטלי דרך העפעפיים סגורות למשך כ 2-3 דקות.
  11. . תשאיר את הראש עבור תקופת דגירה של 3.5 h (בטמפרטורת החדר = 18 ° C) הנידון להתקדם לשלב הבא.

3. רקמות הכנה

  1. תמשוך את העפעפיים בעזרת קצ ת העפעף כדי למטב גישה אל העולם. בחר בגודל אופטימלי קצ ת בהתאם לגודל העין.
  2. להפריד לחמית המקיפים את לימבוס. אם זה כבר חרות ליד האתר של הזרקת, circumferentially להרחיב את הגבולות אז זה יכיל גודל של inoculum של 1 x 1 ס מ.
  3. חותכים את שרירי העינית במיוחד באתרים שלהם של הכניסה scleral.
  4. לרומם את גלגל העין עם מלקחיים, דחיפתו מהצד האחורי. זה מספק גישה אל העולם האחורי, יקל על חיתוך של עצב הראייה עם אופטלמולוגיות עורק, וריד הממוקמים בעמוד האחורי של כדור הארץ.
  5. לגזור את corneoscleral מורכבים, עם הגבול החיצוני כולל ההזרקה מסומן. הכתם עדיין צריך להיות גלוי על החלק הנותר sclera.
  6. הסר את קורפוס vitreus ואת כל השכבות מחוברת בצד הפנימי של בסקלרה על-ידי החלת המתיחה עם מלקחיים רקמות.
    הערה: צעדים נוספים תלויים ההליכים הבאים המבוצעת: 4. - ניתוח DSC, 5. - מיקרוסקופ SHG.

4. לצורך ניתוח DSC אזוריים

  1. לעין שטופלו: לגזור ארבע סקטורים scleral מגביע scleral הנותרים עם המספריים כך באתר של הזריקה הוא בגזרה העליונה מיושרת מרכזי. לחתוך 3 המגזרים הנותרים של הצדדים לרוחב (קרי, האף ואת זמני), והן התחתון.
    הערה: המספור של המגזרים (1-4) אשר מחולקות ריבועים (1-16) הוא הפגינו איור 1A.
  2. חותכים מהמגזרים scleral (1-4) לריבועים קטנים (1-16) של 4 x 4 מ מ כל אחד. סקטור 1 צריך להיות מחולק 9 ריבועים (להפוך את האתר המדויק של הזרקת משבצת יחידה [ריבוע 2]). לחלק מגזרים 2 ו- 3 2 ריבועים (ריבועים 10-11 ו- 12-13) והמגזר 4 3 ריבועים (ריבועים 14-16).
  3. להקצות מספר כל ריבוע, כפי שמוצג באיור 1 א', כדי להתאים את המרחק של הרקמה שנותחה מהמיקום של האזור מוזרק.
  4. לעין שליטה: לאחר חלוקת הרקמה ארבע סקטורים scleral (בדומה לרקמת שטופלו) לגזור ריבוע חתיכות רקמה מהמיקומים הבאים: 3 ריבועים מהמגזר העליון (סקטור 1), 1 מ בכל צד (מגזרים 2 ו- 3), ו- 1 מ מגזר התחתון (מגזר 4).
  5. לגרד את הרבדים הנותרים רשתית, חיבור, לשטוף פעמיים עם PBS טריים בכל פעם, עוזב את החלקים בתוך פתרון עבור 10 s בכל פעם.

5. עבור הדמיה SHG

  1. חותכים את החלק העליון של sclera באמצעות מספריים כדי ליצור אזור 1 x 1 ס מ עם האתר של הזרקת מיושר מרכזי.
  2. לגרד את הרבדים הנותרים רשתית ו מקלעת דמית העין ולשטוף פעמיים עם PBS טריים בכל פעם עוזב את החלקים בפתרון במשך כ 10 s.
  3. המקום הרקמה 1 מ"ל צינורות מלאים PBS פתרון תחבורה כדי מתקן הדמיה. כל ההליכים, בעקבות זמן הדגירה, החל הקרע של גלגל העין צריכה להתבצע תוך שעה.

6. מיקרוסקופ פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה לאות הדמיה מפוזרים בחזרה SHG של קולגן רקמת בסקלרה המותאם במיוחד עבור הלייזר מיקרוסקופ סורק.

  1. מיקרוסקופ להגדיר
    1. כדי למקסם האות והרזולוציה כאשר ביצוע מיקרוסקופ SHG משתמש של העדשה המטרה מטב לצורך שידור אינפרא-אדום אור ועם מפתח נומרי גבוהה (NA). המטרה שלנו היא Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 מים טבילה.
    2. התאם את הקולר תיקון של העדשה כדי להתאים את עומק הדגימה, במקרה הזה זה העובי של coverslip, 0.17 מילימטרים.
    3. הר העדשה המטרה 25 x ומוסיפים כמות נדיבה של שימון ג'ל על בסיס מים כדי לכסות את המשטח הדמיה לפני הרכבה המדגם. הג'ל על בסיס מים לא יתפוגג במהלך הניסוי, ומכאן ישמרו על איכות התמונה.
    4. מקום הרקמה scleral של צינורית 1 מ"ל עם PBS ללא ייבוש בין שני coverslips עגול 25 מ מ (בצד episcleral למטה) מתן קשר מקסימלי בין episclera את פני השטח coverslip.
      הערה: הרקמה ניתן גם להניח חשפו על coverslip. כמות טובה של PBS צריך לשמור על הרקמה להתייבש במהלך דימות. במקרה זה, הוסף את פיסת רקמה של PBS לאחר הרכבת את cellchamber.
    5. להרכיב את התא תא על-ידי הצבת של 25-ממ עגול coverslip, יחיד או בטכניקה של סנדוויץ ', בחלק התחתון של התא, בורג את החלק העליון למטה על מנת ליצור של אטום עגול קאמרית. . אל תהרוס מטה בחוזקה כאשר coverslip העליון משמש, על מנת להימנע באופן מלאכותי שיטוח, נזק הרקמה.
    6. הר תא תא עם דגימת הרקמות על הבמה מיקרוסקופ.
    7. הגדר המיקרוסקופ לתצוגה העין באור המשודרת.
    8. למקם את הבמה ולהתאים את הגובה של המטרה כך המשטח התחתון של המדגם נמצא בפוקוס, כפי שנקבע על ידי ביקורת בשטח בהיר דרך היצירה העין.
    9. כבו אורות מלבד צג המחשב, לחסום כמה שיותר אור מהצג ככל האפשר עם סדינים רדיד אלומיניום עטוף על הבמה מיקרוסקופ. מזעור כל אור תועה להגיע את גלאי יבטיח הרכישה נמוך-רעש, כמו גלאי חאספ NDD יש רגישות גבוהה.
    10. בחלונית ' Ti Pad של התוכנה, בדוק ההגדרה עדשה שהפרטים נכונים.
    11. בחלונית ' GUI קומפקטי A1, לבחור את לייזר אינפרא-אדום עבור הדמיה, בחרו את גלאי NDD ובחרו את ערוץ דאפי מצוידת במסנן bandpass 400-450 ננומטר.
    12. בחלונית ' A1 MP GUI, להגדיר את אורך הגל של הלייזר האינפרא-אדום 860 ננומטר, פתח התריס.
    13. הגדר סריקת תנאים בחלונית GUI קומפקטי A1 כדלקמן לייזר. בחר: (א) Galvano סורק לסריקת חד-כיוונית (ב), (ג) פיקסל להתעכב זמן 6.2 µs, (ד) מסגרת בגודל 1,024 x 1,024 פיקסלים, (ה) קו ממוצע של 2 x
      הערה: Galvano והסורק סריקה חד-כיוונית מבטיחה יישור מדויק של נקודה אחרי נקודה. גודל של 1,024 x 1,024 עבור שדה הראייה מלא מיתרגם בגודל בפיקסלים של 0.5 μm /pixel. קו בממוצע יקטין את רעש שוט בתמונה.
    14. הגדר הדמיה תנאים בחלונית GUI קומפקטי A1 על-ידי התאמת רווח כוח, גלאי לייזר. פתח בהרכב תראה את הטבלה (LUTs) הצגת היסטוגרמה של ערכי העוצמה פיקסל בתמונה הנוכחית. הדמיה חיה במצב "למצוא" וקביעת להגדיל את טווח ערכי הפיקסלים שזוהו על-ידי התאמת רווח כוח, גלאי לייזר. הימנע רוויה. ערכים אופייניים הם כוח לייזר 2.5%, סך של 2.35 W-860 nm, 100 HV (גלאי רווח).
    15. הערה: עבור התקנה זו, עוצמת הלייזר נמדד עם מד הכוח הפנימי הוא 5.2 mW. בכל פעם ניסוי מבוצע, מחדש להתאים את האחוז לייזר כזה המדידה חשמל פנימית היא קבועה ב- 5.2 mW בין ההפעלות הדמיה. כדאי לשים לב בעת הגדרת עוצמת הלייזר. הלייזר זיקית II הוא לייזר W 3-800 nm, 10% או כוח עליון יכול העלול לגרום נזק לרקמות.
  2. ייבוא תמונות
    1. במצב תצוגה מקדימה, לסרוק אזור הרקמה באמצעות הכלי סקירה XYZ.
    2. הגדר את הדימות ברזולוציה נמוכה יותר (256x256 פיקסלים, אין קו בממוצע) כדי להאיץ את רכישת תמונות במצב זה.
    3. לכידת 5 x 5, 3 x 3 או תצוגה יחידה של שדות כדי לכסות את המשטח כולו של הרקמה. בכל מקום, לפני הלכידה סקירה, להפעיל את מצב "סרוק" חיים ולהביא את הרקמה להתמקד. שימו לב כי אזורים שונים של רקמת יהיה שונה מעט עמדות לכיוון צירית.
    4. למצוא אזור שטוח שבו סיבי הקולגן נראים בתחום התצוגה כולו ולחץ פעמיים את העמדה בכלי סקירה כדי לעבור את השלב למיקום מסוים זה.
    5. הפעלת מצב "סרוק" בשידור חי, להתאים את מיקום Z המטרה כך המטוס התחתון נמצא בפוקוס ולהשתמש, בלוח Ti, הכונן Z להזזת המישור אופטי 10-15 μm מעל שכבה תחתונה זו.
    6. רוכשים תמונה ברזולוציה גבוהה עם 1,024 x 1,024 פיקסלים ו- 2 x קו בממוצע, באמצעות לחצן "ללכוד".
    7. לשמור את המיקום סקירה XYZ באמצעות לחצן "+". פעולה זו מבטיחה כי באותו האזור של רקמה לא הלכידה מחדש.
    8. עבור כל פיסת רקמה ללכוד 10 תמונות של המבט של שדות שאינם חופפים.

7. DSC פרוטוקול

הערה: המשך לשלב הזה ברגע השלמת רקמות הכנה, לניתוח DSC אזורית, או לאחר רקמת הדמיה בעת ביצוע SHGM.

  1. להכין DSC מחבתות, שקל ותויגו.
    הערה: שלב זה צריך להיעשות לפני ניתוח רקמה כדי למזער רקמות לייבוש.
  2. יבש כל ריבוע scleral ברקמות ספיגה ושים אותה על החלק התחתון של הסיר DSC באמצעות מלקחיים במיתולגיות.
  3. שוקל את המחבת עם רקמות בתוך ואת המכסה crimped ורטוב מכוסה כדי להשיג את הרקמה משקל (מסה של הדגימות צריך להיות בטווח של 5 עד 11 מ ג).
    הערה: חותם כל הפאן-שימוש של צובטן לפני שימשיך דגימת הרקמות הבאה. המחבתות הן באופן הרמטי, מניעת אובדן מים לפני ניתוח תרמי.
  4. ברגע המדגם הוא מסולסל, במקום זה על מיקומה המיועד על המגש DSC. צריך להיות 6 דוגמאות עבור הפקד ו-16 לעין שטופלו.
  5. ליצור שיטה באמצעות כלי ניהול תוכנה, המציין את המשקל של הרקמה, ולהפעיל את הניתוח התרמי באמצעות הפרמטרים הבאים: טווח טמפרטורה של 40 עד 80 ° C, קצב חימום: 1 ° C/min, זרימת חום: 17.37 mW, זרימת גז (N2): 19.8 mL/min. גז בלחץ: בר 2.2.
  6. עם סיום, לנתח את הנתונים עבור כל דגימה על-ידי חילוץ הפסגה טמפרטורת המעבר-דנטורציה תרמית אשר מתרחשת באמצעות כלי ניהול התוכנה.

8. ניתוח תמונות

  1. אות SHG
    1. בחר לפחות 5-10 התמונות קנאס מתוך כל טיפול ואת השליטה שלה, כך האזור של התמונה מאוכלס בעיקר סיבי קולגן.
    2. להעלות כל תמונה בתוכנת ImageJ, למדוד את עוצמת הפיקסלים הממוצע על-ידי בחירה נתח > מדד לתמונה הפעילה.
    3. ערכי שחולצו מדווחים כמו עוצמת פיקסל רשע לבין יכול גם תוצג על-ידי ההיסטוגרמה של עוצמות על-ידי בחירה מתוך התפריט נתח > היסטוגרמה.
    4. באמצעות גיליון Excel, ליצור טבלה כדי לתעד את כל הנתונים נמדד בהתאם לזהות הדגימה
    5. לחשב את וסטיית בעוצמה פיקסל עבור כל תנאי הטיפול ושליטה.
    6. באמצעות של התלמיד במבחן t, להשוות הבדלים להשוואות pairwise כל של ריכוזים (כלומר, 40 מ מ SMG לעומת 0 ו- 400 מ מ SMG לעומת 0). [P≤0.05].
  2. Waviness
    1. בחר תמונה המציגה סיבי קולגן. צריך להיות מנותח לפחות 10 תמונות לכל דגימה (כולל דגימת בקרה לריכוז כל - לפחות 40 בסה כ).
    2. פתח ImageJ > תוספים > NeuronJ. NeuronJ דורש התקנה מוקדמת.
    3. להעלות imagesby כל גרירה לתוך חלון שנפתח NeuronJ .
    4. ליצור עקיבה קווים לאורך הסיבים, בעקבות קו המתאר של fibril עם העכבר (עט ציור טבליות יכול לשמש), לחץ על M כדי למדוד את המרחק של אורך סיבים הכולל.
    5. בחר "אפשרות" לצייר קו ישר וצורניים ולחבר את ההתחלה ואת הסוף מתאר סיבים מצוירות בעבר. כעת לחץ על M כדי למדוד את אורך מקצה-לקצה.
    6. חזור על הפעולות אותו על הסיבים לפחות 10 לכל תמונה.
    7. לאסוף את שתי מדידות מכל הסיבים 10, קלט את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני של excel, המבטאת אורך סיבים הכולל (מתאר) ואורך end-to-end (או מתחבר ישר קו) כמו אורך [עיקול] והאורך [ליניאריים], בהתאמה.
    8. חישוב מדד waviness (W) תוך שימוש בנוסחה: W = אורך [עיקול] / אורך [ליניאריים].
    9. לחשב את אחוז waviness השוואת נתוני התמונות של samples(SMG) שטופלו עם תמונות מדגימות שליטה באמצעות הנוסחה: (W [SMG] - 1) / (W [שליטה] - 1)
    10. לבצע מבחן t pairwise עבור אינדקס waviness (W) על מנת לקבוע את ההבדלים סטטיסטית (p-ערכים) מורפולוגיה סיבי הקולגן של בין טיפול שונה תנאים ושליטה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טמפרטורה דנטורציה תרמי (Tm) כמו שיטת assay להעריך TXL cross-linking אפקט: סכום כולל של 16 זוגות עיניים ארנב שימשו בניסויים אלה ההליך TXL. כחלק הראשונית של מחקר זה, הוערך הלוקליזציה של אפקט cross-linking, המושרה על ידי זריקה אחת של SMG cross-linking סוכן דרך סנט החלל בראש ארנב cadaveric. זה סוג של ניסוי יש רלוונטיות לטיפול קליני של חולים, שכן זריקות במיקום אחד או יותר יכול להיות צורך לייצב את אזור הרצוי של sclera.

כפי היה ניתן לחזות מבוססת על עקרונות בסיסיים diffusivity, האפקט היה הגדול ביותר באתר של הזרקת עם אפקטים המושרה באזורים סמוכים, בהתאם הריכוז של הפתרונות. איור 1A מייצג את המיקום סכמטי של scleral מגזרים (1-4 בגופן אדום מספר חלול) (עוד יותר לחלק לריבועים (1-16 בגופן מספר דק שחור)) שעברו ניתוח נפרד דנטורציה תרמי בעקבות זריקת סנט בודד עם אינדקס הצבעים מיפוי. טבלה 1 מציגה את השינוי בערכי Tm בכל מגזר ממוספרות לעומת שליטתה המתאימים. ערכים הינם כלולים לזריקות 40 מ מ והן 400 מ וכוללים שגיאת התקן של הממוצע מחושב עבור מינימום של שלושה האישושים עצמאית.

דמויות 1B-C מייצגים את התוצאות תוך שימוש בשני ריכוזים שונים של SMG, 40 מ מ (איור 1B) ו- 400 מ מ (איור 1C). ב- איור 1B, ריכוז נמוך 40 מ מ מדגם הראה שינוי מתון Tm אשר צוין בכיכר 2 (ההזרקה). משמרות דומים נראו המשבצות הסמוכות 1 ו- 3 (כחול בהיר). משמרות שולית נראים ריבועים 4-6 ו- 7 עד 9 ללא הבדלים משמעותיים סטטיסטית מן הכיכר מוזרק. Shift Tm לא נראתה הריבועים התחתון 14 עד 16, אשר ייצג את הסקטור הכי רחוקות מן האתר הזרקה.

כפי שמוצג באיור 1C, ריכוז גבוה יותר (400 מ מ) הייתה השפעה cross-linking משמעותית ביותר מבחינה סטטיסטית (מסומן כמו גוונים של כתום). שינוי גדול ב Tm עם סטיית תקן קטנה המשויך ו p < 0.05 נצפו, משקף הבדל גדול ההשפעה של 400 מ לעומת ריכוז 40 מ מ נמוך יותר. ההשפעות הדרמטיות ביותר נרשמו במגזר 1 ב העולם העליון. לגבי המגזרים הנותרים, השפעה פחותה נצפתה המשבצות 10 ו- 14 (אשר יכול להיות שהיה בשל מספר מעקב של נוזל cross-linking posteriorly), אין השפעה נצפתה המשבצות 11, 12, 13, 15 ו 16. בסך הכל, ההשפעות cross-linking היו שוליים במגזרים 2 ו- 3 עם השפעה שנצפה במגזר 4 (כלומר, המיקום הכי רחוקות מן האתר הזרקה), הדומה המדגם 40 מ מ. תוצאות אלו ציינו שהיה שם אזור ' אפקט ', כי סוג זה של תבנית שניתן היה לצפות בעקבות זריקת הקדוש של cross-linking הסוכן. זה יכול להצביע על הצורך הזרקת במספר מקומות בתערובות לזירוז אפקטים על פני אזור נרחב של רקמות.

לימוד ההשפעה cross-linking המושרה בעיניים ללא פגע, הערכת TXL עם שני ריכוזים של SMG בוצעה גם. ניתוח דנטורציה תרמי של רקמות שעברו כזה scleral cross-linking בוצעה. Cross-linking הזמן היה ה 3.5 עבור TXL באמצעות שלושה ריכוזים שונים, 40 (Tm = 1.11 + /-1.2), 100 (Tm = 5.12 + /-2.9), ל- 400 (Tm = 14.34 + /-1.1) מ מ SMG. התוצאות הראו כי קיים אפקט התלויים ריכוז ראיתי ברקמת צולבים SMG.

שנית הרמונית דור (SHG) הדמיה כשיטה להעריך TXL cross-linking אפקט:

מיקרוסקופ SHG היו תמונות ניתח הן עבור עוצמת פיקסל SHG אות ו סיבים צרור waviness. טווח רחב של cross-linking ריכוזי (מתוך 40 עד 400 מ"מ) שימשה על מנת לחקור את השינויים אות SHG שעלולות להתרחש בטווח רחב של cross-linking אפקטים. באמצעות יכולת ניתוח ההיסטוגרמה כללו בתמונה פיג'י עיבוד תוכנית20, ניתן היה quantitate את האות SHG המיוצר ברקמות scleral על ידי הזרקת sT, משווה את ההשפעות על 40 מ מ לאלו הנוצרות על ידי שימוש 400 מ. ההבדל הממוצע פיקסל רשע intesities-40 מ מ היו ± 66.3 27.7 בהשוואה 361.4 ± 28.3 על הדגימות 400 מ מ, עלייה כמעט 6-fold. זה תואם עם גידול רקמות cross-linking, מאז עליות המתאימים Tm גם נרשמו בתנאים אלה. איור 2 מציג תמונות SHG הנציגה של בסקלרה שנלקחו שליטה (איור 2 א), 40 מ מ (איור 2B) ו- 400 מ מ (איור 2C). גם מוצג ניתוח ההיסטוגרמה הנלווה, כולל בהירות רשע (או עוצמת פיקסל). המספר הכולל של תמונות ניתח היה: 120 עבור 40 מ מ ו- 98 לשליטה שלה; 121 עבור 400 מ ו- 94 לבקרת משלו. העומק של רקמות הדמיה היה 10 עד 15 מיקרומטר מפני השטח episcleral. התוצאות של הבדיקות היסטוגרמה, שבו מעורבים בממוצע של שדות תמונה רבות, יצוין כי ריכוז גבוה של cross-linking אפקט (איור 3) המיוצר עוצמות פיקסלים גדול יותר.

כפי שמוצג באיור4, ניתוח התמונה בוצעה גם עם שיטות מאומצים מכל כלי דם וכלי דם בספרות, באמצעות תוסף ImageJ 'נוירון J'21. אנחנו מעריכים את הגורם waviness W = אורך [עיקול] / אורך [ליניאריים] ואנחנו ציין כי cross-linking הביא מיישר חבילות סיבים כפי שמצוין על ידי % waviness ירד ב- 40 מ מ, 400 מ צולבים בסקלרה לעומת שליטה שאינו מטופל בסקלרה (W % = (W [ SMG]-1)/(W[control]-1), בטבלה 2). ההבדל waviness בין 40 ל- 400 מ מ SMG מטופלים דוגמאות לא היה משמעותי סטטיסטית.

Figure 1
איור 1 : לוקליזציה של אפקט TXL דרך רח' הזרקת באמצעות 40 ל- 400 מ מ SMG.
(א)
ייצוג סכמטי של מגזרים scleral 4 (מספרים 1-4 בגופן גדול חלול אדום), עם בסקלרה ומחולק לריבועים [מספרים 1-16 הקטן גופן דק שחור] (לא נמשכת אל קנה מידה) שעברו ניתוח תרמי. ההזרקה תאמו הכיכר במיקום מרכזי (ריבוע 2) במגזר 1. דנטורציה תרמי cross-linking אפקט TXL עם (1B) 40 מ מ SMG ו (1 ג) 400 מ SMG. (ד) צבע מוצפנים מקרא סולם טמפרטורה (B) ו- (ג). איור זה השתנה מ Zyablitskaya et al. . עם הרשאה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : להחליפן בתמונות של העלאות התלויים ריכוז SHG אות רמות הבהירות הופק בעקבות TXL באמצעות SMG באמצעות הזרקת sT בסקלרה ex-vivo . ריכוזי SMG מוצגים (B) 40 מ מ ו- (ג) 400 מ. כל תמונה כוללת של 50 מיקרומטר סולם בר (בפינה הימנית התחתונה) ערך הפיקסל הממוצע בעוצמה (בפינה הימנית) - הערכים המוחלטים. איור זה השתנה מ Zyablitskaya et al. . עם הרשאה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : תרשים של השינוי (Δ) SHG אות עוצמת פיקסל (לעומת פקד לזווג אותו מהראש ארנב) ב גלובס ללא פגע scleral קישורים צולבים באמצעות הזרקת sT (TXL) עם פתרונות SMG 40 ל- 400 מ מ. ממוצע של ערכים עם שגיאת התקן של הממוצע היו: 66 ± 27.7 40 מ מ, 361 ± 28.3 עבור 400 מ. איור זה השתנה מ Zyablitskaya et al. . עם הרשאה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : דוגמה של ניתוח waviness סיבים (כפי שביטאו ליניאריות). תמונה של דגימת בקרה לריכוז SMG 40 מ מ עם קנה מידה 50 מיקרומטר בר (בפינה הימנית התחתונה). איור זה השתנה מ Zyablitskaya et al. עם הרשאה22. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : ייצוג סכמטי של הזרקת sT. אזורים ממוספרים 1-3 להתאים לאזורים ייצג את איור 1A. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

±Δ Tm
אזור 40 מ מ 400 מ
1 3.4 ±2.8 20.5 ±0.6
2 3.4 ±0.53 19.58 ±1.5
3 2.5 ±2.47 ±3.06 ב- 17.99
4 0.72 ±0.9 20.36 ±0.19
5 0.85 ±0.55 19.11 ±1.33
6 0.52 ±1.35 18.66 ±4.1
7 0.78 ±1.6 18.44 ±2.8
8 0.56 ±0.9 17.77 ±2.69
9 0.22 ±0.6 18.92 ±2.6
10 0.46 ±0 8.75 ±10.56
11 0.47 ±0.18 0.63 ±1.84
12 0.11 ±0.08 0.66 ±1.52
13 0.08 ±0.05 0.71 ±2.17
14 0.22 ±0.7 ±0.29: 5.71
15 0.32 ±0.2 0.29 ±0.7
16 0.24 ±0.73 0.26 ±0.79

טבלה 1: DSC תוצאות עבור לוקליזציה של מחקר אפקט TXL. שינוי טמפרטורות ההיתוך תרמיים (ΔTm) עם תקן שגיאות עבור כל מגזר שנדגם הוא כפי שהיא מתוארת איור 1A. כל ערך מתבטא כהפרש ב Tm ascompared לשלוט לזווג שלה והוא ממוצע של מינימום של 3 האישושים עצמאית.

SMG, מ מ Waviness Waviness-% מבחן t לעומת [0 מ מ SMG]
0 1.106 ± 0.044 100
40 1.067 ± 0.017 63 p < 0.02
400 1.059 ± 0.009 55 0.003 < p
סיבי ליניארי 1.000 0
(תיאורטי)

בטבלה 2. התוצאות של ניתוח waviness סיבים. תמונות SHG מהאזור של הזרקת TXL נותחו עבור דרגת waviness סיבים באמצעות תוכנה נוירון J. עשר סיבי נבחרו מתוך כל תמונה, סכום כולל של-100 סיבי נותחו עבור דרגת waviness. ממוצע של ערכים עם שגיאת התקן של הממוצע הינם כלולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מתנהל ניסויים הראו עדויות לשימוש של מיקרוסקופיית אות SHG כמו שיטה להערכה של קולגן cross-linking אפקטים ב בסקלרה, מעלים את האפשרות העתידית של שימוש בטכניקה זו כלי ניטור עבור cross-linking טיפולים זה יעד קולגן חלבונים. ראוי לציין, כלי נגינה כבר נמצא בשימוש קליני זה יכול שעלולים ללכוד את האות SHG. למרות הכלי הזה נועד בעיקר עבור הדמיה העור הדרמיס אנושי, זה שימש בהצלחה קרנית וה בסקלרה תמונה23.

זה הכרחי לשמור על זהות ודימות תנאים בהשוואת שליטה וטיפל דגימות. דור הרמונית מיקרוסקופיה של קולגן ברקמות בסקלרה דורש מיקרוסקופ פלורסצנטיות תואם הדמיה פוטון מרובה, אינפרא-אדום פעמו לייזר tunable טווח אורך גל של 800-900 ננומטר, גלאי רגישים כגון חאספ גלאים descanned (NDD). קווים מנחים, תיאר כתב יד זה הם נקודת מוצא. התנאים צריך להיקבע באופן ספציפי עבור הניסויים חדש או עבור מערכות שונות.

הקרנית ואת בסקלרה גם הוערכו במקביל מחקרים באמצעות זו טכניקה24,25,26,27. בידיעה כי האות SHG מפיצה הכיוונים קדימה ואחורה, מספר מחקרים בחנו רקמת הקרנית בצורה עצמאית את המדינה יליד28,29,30,31, 32,33,34 ו- קרטוקונוס35,36 וכן בעקבות CXL (כמפורט להלן). התוצאות של מחקרים אלה מציינים כי האות הקרנית ממוטבת בכיוון פזורים קדימה, זה הגיוני בהתחשב השקיפות של הקרנית ואת העובדה כי אור עובר דרך הרקמה להכות צג במערכות מפוזרות קדימה. בדרך כלל, האות SHG נמצא בטווח הנראה כחול, יקטן באופן משמעותי בעת מעבר דרך מאוד פיזור רקמה כמו sclera העין. כתוצאה מכך, זיהוי של SHG פזורים קדימה ידרוש מקטע דק של רקמות 50 μm או עובי בתוך פחות, כמו גם מלכודת אופטי מיוחד. לעומת זאת, האות מפוזרים האחורי ניתן ללכוד דרך הנתיב אור רגיל של מיקרוסקופ פלורסצנטיות ללא רקמה חלוקתה, ולכן מצב זה הוא המועדף כאשר הדמיה הקולגן ברקמת בסקלרה שלם עד לעומק של 30-40 μm. במחקר זה, ציינו עלייה בריכוז התלויים בצפיפות אות. לא מן הנמנע, עם זאת, כי TXL. אולי היה ואפקטים נוספים דומים בשכבות עמוקות יותר בסקלרה, כי האפקט יכול להיות יותר מבוטא ומתחו לשכבות העמוקות במיוחד עם ריכוז גבוה יותר. עם זאת, בשל מוגבל SHG אות החדירה בסקלרה, למטרות מחקר ראשוני זה, בחרנו לעבוד עם התמונות באיכות הטובה ביותר, אשר התקבלו sclera השטחית ביותר (15 עומק מיקרומטר). בעתיד מחקרים, נשקול התלויים תופעות בעקבות TXL שיטות כמו זה עשוי לספק מידע חשוב נוסף בנוגע למה אפילו הבדלים גדולים לא היו שנצפה בין 40 ל- 400 דגימות שטופלו מ מ עומק.

יתר על כן, בנוגע לשימוש SHG להערכת הריבופלאווין CXL המושרה רקמות cross-linking, SHG מיקרוסקופ ההדמיה הבאה הריבופלאווין CXL של הקרנית דווחו על ידי מספר קבוצות37,38,39 , 40 , 41. במחקר של סטיבן. et al. 37, ייצוב הקרנית בטכניקה CXL כתוצאה 'המגון ' אות ואובדן של רקמות "מתקפל" או "undulations" ראיתי בדגימות שאינם מקושרים קרוס. סוגים אלה של שינויים, עם זאת, גם נרשמו במסגרת מחקר להערכת ההשפעות של שינויים ב- IOP על הקרנית אותות SHG, מעלים את האפשרות של חפצי אמנות טכני. תיפגענה מן את fibril, כמו גם נקודת גבוה יותר סדר סיבים צרור/מחליפי הארגון המבט, sclera ואת הקרנית שונה לגמרי, הרבה ידוע על השונויות ממחקרים מיקרוסקופ אלקטרונים. הרקמות שני שקיימים הבדלים בין fibril אריזה, הכוללת fibril קוטר הפצה (קטן הסיבים אחיד עבור הסיבים קוטר הקרנית, משתנה עבור sclera), הבין-fibril מרווח (אחיד קרנית, משתנה עבור sclera). כמו כן, ארגון סדר גבוהה יותר לתוך מחליפי גיליונות (הקרנית) לעומת חבילות סיבים (sclera) שונה לגמרי. הבדלים מבניים כאלה משתקפים את אותות SHG המיוצר על ידי רקמות שני אלה. לפיכך, שינויים המושרה על ידי cross-linking עשוי לשנות את האות SHG בדרכים שונות, אבל במקביל. במילים אחרות, 'יישור ' סיבים בסקלרה שנצפתה במחקר זה, 'המגון ' אות הקרנית שדווחו בספרות, היו התוצאה של קולגן cross-linking השינוי. לפיכך, האפקט ' המגון"הקרנית בדרך כלשהי יהיה מקביל השפעת ' יישור ' sclera שדווחה כאן.

המנגנונים שתוצאתה אפקט יישור זה המיוצר על ידי TXL אינם ברורים בהתבסס על המחקר הנוכחי. אפשרות אחת יכול להיות כי הרקמה היה איכשהו 'קבוע ' במצב מכני "טעון". זה יתמוך התפישה המושרה "מייצב fibril וסיבים" שהתרחש. שינויים בלחץ תוך-עיני סביר לא תורמות את האפקט הזה מאז IOP היתה במעקב לפני כן, בעקבות הזריקה sT נשארה יציבה. בסך הכל, המשמעות של תצפיות אלה אינם ברורים, מחקרים נוספים יהיה הכרחי. ראוי לציין, נפרד הדמיה טכניקות כגון מיקרוסקופ ברילואן42, אשר הוכח לספק אמצעי כמותי של cross-linking (כפי שנקבע על ידי מודולוס גזירה) בעקבות CXL פוטוכימיה עשוי להיות שימושי המאשרת את הממצאים עם SHG הדמיה במחקר זה. עם זאת, יש לציין כי השימוש עם מאוד פיזור רקמות כגון בסקלרה43, דורש שינויים טכניים, לא אומתה עם רקמת scleral צולבים.

לייזר קיטוב מיקרוסקופ SHG הוא נושא חשוב. אור הלייזר הוא מקוטב לינארית, מונחה בניצב לכיוון של הפצת אות SHG, בזווית קצת במישור xy-אל כל סיבי קולגן. לפיכך, הסיבים במישור xy-הינם מסודרים היטב בדיוק בניצב אור הלייזר מקוטב יהיה לייצר אות SHG גבוה יותר מאשר אלו בזוויות אחרות, כולל אלה במקביל התקרית אור (קרי, מטוס ה-z), אשר יפיקו אות SHG הנמוך (עקב התאבכות הורסת). ביחס בסקלרה רקמות, קולגן סיבים הם שכיוונו בזוויות שונות ברמה מיקרוסקופית, למרות סיבים אנטומיים המועדפת אוריינטציות ידועים להתקיים בהתבסס על מיקום גלובוס. לפיכך, מאז האות SHG המיוצר ישתנו בהתאם זווית מישור xy כל סיב, הכוללת האות יהיה פחות מזה, אשר יהיה מיוצר, אם כל סיבי הקולגן היו מיושרת בדיוק באותה הזווית (בממחטת כגון גיד לדוגמה). לפיכך, במחקר זה, בשל אופיו של המדגם להיות עם תמונה, הכיוון של קיטוב לא נקבע במכוון אבל נשאר עקבי לאורך כל תקופת המחקר. יתר על כן, דאגנו להשיג רקמות מן לטפל ולשלוט גלובס מאזורים scleral זהה, מזעור כל ההבדלים בכיוון סיבים בין דגימות. לבסוף, ניתחנו מעל 100 תמונות לכל דגימה על מנת לקבל ערכי העוצמה. הערכה מקיפה זו צריך נרמלו כל אותות SHG סוטה ייתכן נרשמו. נאמר כי, זה ייתכן כתוצאה "יישור סיבים" שהבחנו הדגימות צולבים (המתוארים לעיל), חלק גדול יותר של "בתוך מטוס מוקד" סיבי יכול תרמה לעלייה SHG האות, כמו גם גדל אותות SHG רבתי יישור מישור xy. שתי האפשרויות הללו יהיה גילויי אפקטים cross-linking המושרה.

ניתוח האזורי של cross-linking שינויים (על-ידי Tm) הנגרמת על ידי זריקה הקדוש של SMG בוצעה. כצפוי, הרמה של cross-linking אפקט היה מרוכז באזור ההזרקה. השפעה cross-linking קטנה או לא צוין באזור ישירות מול (לרחוק) הזריקה, בקנה אחד עם מה שידוע לגבי לוקליזציה של אפקט בעקבות הזרקת sT כפי שמוצג על ידי אולטרסאונד לוקליזציה44, 45 , שחושב טומוגרפיה46.

לבסוף, לגבי טיפול cross-linking, קוצר ראייה, קולגן cross-linking של הקרנית הוא מציאת שימוש נרחב בטיפול של הקרנית הקשורה כולל קרטוקונוס, פוסט לאסיק keratectasias, ניוון שולית pellucid (בדיכאון פסיכוטי), וכן תיאור על ניתוחים לתיקון הראייה בלייזר47. ההצלחה של טיפול במחלה הקרנית cross-linking הוביל החיפושים של החלת גישה טיפולית זו לחלק האחורי של העין, ובעיקר, sclera, הגבלת התארכות צירית קוצר ראייה גבוה2, רעיון זה חוזר בשלבים המוקדמים מאוד של טיפולי cross-linking קונספט48,49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה Tongalp Tezel, MD, יעוץ לגבי הזרקת הקדוש; תרזה Swayne, PhD, להתייעצות בנוגע מיקרוסקופ SHG; ג'ימי Duong העיצוב ואת המשאבים ביוסטטיסטיקה המתקן ליבה ביוסטטיסטיים של מכון אירווינג-המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה.

נתמך בחלקה על ידי מחקר כדי למנוע עיוורון על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 ו- NEI R01EY020495 (DCP). אוניברסיטת קולומביה בעל הקניין קשורים: ארה ב הוציא פטנט לא: 8,466,203 ולא: 9,125,856. הגשנו בקשה לפטנט בינלאומי: PCT/US2015/020276.

תמונות שנאספו ב Confocal ולהעניק התמחה מיקרוסקופ לשתף משאבים של הרברט אירווינג מקיף במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת קולומביה, נתמך על ידי NIH #P30 CA013696 (המכון הלאומי לסרטן). מיקרוסקופ קונפוקלי נרכש עם NIH להעניק #S10 RR025686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59, (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33, (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90, (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196, (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27, (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91, (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89 (2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35, (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42, (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11, (2), 94 (1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21, (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88, (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215, (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10, (83), 20121004 (2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92, (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58, (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58, (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14, (6), 064040 (2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13, (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238, (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34, (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32, (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36, (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33, (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24, (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17, (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25, (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17, (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33, (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30, (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87, (3), 279-285 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics