架橋 (TXL) 近視治療の組織の評価ツールとしてウサギの強膜の第 2 高調波発生信号

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Summary

このプロトコルでは、第二高調波発生のイメージングおよび示差走査熱量測定を使用してウサギの強膜の化学架橋を評価するための手法について説明します。

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Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

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Abstract

光化学架橋と組織 (TXL) メソッドを架橋構造蛋白質 (フィブリル型コラーゲン) 療法のために (非酵素的架橋) の化学結合を導入して組織を強化するためのメソッドが含まれます。機械的組織プロパティの変更を誘導するためこのような方法採用されている角膜に進歩的な近視で強膜と同様、円錐角膜などの角膜を薄く (機械的に弱体化) 障害の間伐と後部の弱体化強膜が発生し、体軸の伸長に寄与します。このような組織を強化するための主なターゲット蛋白質は、角膜と強膜の乾燥重量タンパク質の大多数を占めるフィブリル型コラーゲンです。偶然、フィブリル型コラーゲン組織の細胞外スペースの第 2 高調波発生信号の主な源であります。したがって、治療法、架橋により誘起されたものなど、コラーゲン蛋白質の変更可能性があります潜在的検出され、第 2 高調波発生顕微鏡 (SHGM) を使用して量的に表わされます。ソースは、生物医学の広まった使用法を楽しんでいる刺激的な現代のイメージング手法レーザー スキャン顕微鏡システム赤外線励起光結合を使用して信号 SHGM を監視します。したがって、本研究の測定する手段によるサブほぞの空間 (sT) に架橋剤の化学物質の注入、ウサギ強、 ex vivo架橋効果 SHGM 顕微鏡の使用を評価するために行われた、射出はアプローチは眼科臨床プロシージャ中に眼麻酔を引き起こすための標準的な方法です。化学架橋剤、ナトリウム hydroxymethylglycinate (SMG) は、エージェント (Far) を放出するホルムアルデヒドとして知られている化粧品の防腐剤のクラスからです。SMG との反応を伴う強膜の変化した SHG 信号の増加、熱変性温度の変化と相関を評価するための標準的な方法による架橋効果組織です。

Introduction

近視の進行は仮定することが (光化学および化学)、非酵素的に強膜架橋を通じて治療実験フォーム剥奪 (FD) を増やすことができますコラーゲン酵素架橋ブロックことを考えれば理にかなっている-誘導近視1。Elsheikh とフィリップスの2は最近可能性と標準的な紫外線照射 (UVA) の使用の可能性を議論-リボフラビンを介した光化学架橋 (ドレスデン プロトコル) 省略 (リボフラビン CXL) として近視で軸の伸長を停止する後部強膜安定化。この光化学メソッドは、正常に円錐角膜とレーシックの記事 keratectasia に見られる前部グローブ サーフェス (すなわち、膨らんだ角膜) の不安定化を治療するために使用されています。ただし、強膜のこの CXL プロトコルのアプリケーションが多く大きい組織表面領域を変更する必要性と同様、紫外線 (UV) 光源と後部強膜へのアクセスの難しさに関連する問題によって妨げられています。言われて、CXL アプローチに使用されている視覚的にフォームで体軸の伸長を停止奪わウサギ (瞼板縫合)、後部強膜の複数の領域は、研究3で複数の独立した照射ゾーンが必須。対照的に、聖空間を介して化学安定剤 (すなわち、架橋剤) 注入は、後部強膜、紫外線光源を導入することの必要性を回避するを変更する簡単な方法を表すことができます。この注入法白内障手術4,5,6など眼科処置中に眼麻酔を誘導する便利な方法として知られています。ウォレン サック7は以前グリセルアルデヒド (化学架橋剤ホルムアルデヒド エージェント (Far) 本を解放する概念と似ています) を使用して sT インジェクションの使い方を説明してウサギ強膜と genipin を固くにはFD モルモット8,9の軸方向の長さを制限するために示されています。これらの調査官は、光化学 CXL 法上可溶性化学薬品を使用しての明確な利点を示しています。強膜の架橋 (すなわちTXL) ファールスを含むいくつかのタイプの注射薬剤を使用して10近視で強膜の伸長の進行を食い止めるための可能な治療法を提供できます。

ここで紹介するプロトコル、死体の家兎眼の強膜に sT インジェクションを介して配信されるナトリウム hydroxymethylglycinate (SMG) の化学架橋のソリューションを使用します。我々 は、角膜局所化学架橋以前に類似したプロトコルを実装しています。これらの報告された調査で特に依存効果を架橋濃度は熱変性解析11 によって決定される光化学 CXL の達成もまたがる効果範囲を持つ SMG を使用して得ることができた.

ここで我々 は強膜組織、差動スキャン熱量測定 (DSC)、および第 2 高調波発生顕微鏡 (SHGM) を使用して熱変性する sT 注射を介して配信 SMG の架橋効果を評価するためにプロトコルを説明します。

差分走査熱量測定 (DSC)、熱分析とも呼ばれますを使用して熱変性転移測定、強膜組織は主にそれらはバルクの大部分を構成するので、フィブリル型コラーゲンの性質によって導かれてタンパク質。このメソッドには、コラーゲン分子構造の安定性とコラーゲン線維、主要タンパク質立体構造の安定化架橋結合が評価されます。DSC で加熱中に臨界転移温度は三重らせん、ゼラチンと呼ばれる一般的形成プロセスの上体で、コラーゲン分子の変性の結果が達成されます。この熱変性コラーゲン分子に水素結合を中断され、誘導架橋方法12,13を通して高温にシフトすることができます。このメソッドは、革の意思を含むプロセス、特に生体材料業界で長年にわたり使用されています。ただし、このメソッドは強膜組織の抽出を必要とし、したがって前のヴィヴォ手法として有用することができますのみ。

第二高調波発生顕微鏡 (SHGM) は、非中心対称性分子環境に、特定の物質の非線型光学特性に基づいています。そのような材料は、強烈な光でたとえば光レーザーによって生成される、SHG 信号、周波数 2 倍は入射光を生成します。コラーゲン、微小管、筋ミオシン、SHG 信号を作成する知られている生物学的材料。たとえば、コラーゲン 860 nm の波長の赤外光と興奮は 430 nm の波長の可視範囲の SHG 信号を出力します。第二高調波発生 (SHG) 信号のイメージング、治療コラーゲン架橋を評価するための有望な方法です。それは、組織のコラーゲン線維を放出 SHG 信号1430 年以上知られています。しかし、ごく最近高解像度の画像を取得でした15といったさまざまな組織、腱16皮膚、軟骨1718血管とコラーゲン ゲル19

この知識に基づいて、本研究は、SMG は化学的に誘導されるコラーゲンの架橋を通じて強膜で SHG 信号の変化を評価します。強膜の SMG 変更組織コラーゲン線維束 (高次第四紀構造コラーゲン線維から成る) から生成された SHG 信号を増加させるし、もコラーゲンの構造の形態学的変化を生成を示唆します。ファイバー網繊維束」矯正」に反映

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Protocol

そのままザイモグラム ウサギ頭内の死体の家兎眼を使用してすべての手順を行った。ケアと実験動物の使用のためのすべての公共機関や国立のガイドラインが続いていた。

1. 溶液の調製

  1. TXL の SMG の準備:
    1. 0.0165 g nahco 3 粉末 1 mL の蒸留水に溶解したを使用して炭酸水素ナトリウム ソリューション (NaHCO3) 水溶液 0.2 M 濃度の 1 mL を準備します。
    2. 0.1016 mg ナトリウム粉末 hydroxymethylglycinate (SMG) を 800 mM SMG の最終的な集中を取得する蒸留水 1 mL に溶かしてください。最終濃度 0.1 M NaHCO3および 400 mM SMG に重炭酸ナトリウム溶液を調整します。希望の架橋効果に応じて SMG の濃度。ここで説明したプロトコルでは、40、100、および 400 ミリメートル SMG を使用しました。

2. TXL SMG を使用テノン嚢下の注入

  1. それぞれ 400 μ L コントロールと SMG ソリューション 1 mL インスリン注射器 2 (25 G 針) を入力します。
  2. クッションの助けを借りてプロファイル平面にウサギの頭を配置します。発泡スチロールや紙のスタックは、最適な位置で頭を修正する使用できます。
  3. 小児眼科鏡でまぶたを撤回します。
  4. 球面収差トノメトリ デバイスを使用して初期眼内圧 (眼圧) を測定します。
  5. 組織マーカーと角膜の上部中央部分に目的の注入のサイトをマークします。
  6. 結膜結膜鉗子 (または鋸歯状の丸い先端の鉗子) 注射部位を周囲を撤回して、ほぞのカプセル マークの輪部サイト (すなわち2-3 を越えてわずかに入る結膜を通して針を挿入角膜輪部から mm)。結膜小切開は、ほぞのカプセルに針を刺しての通過を促進するためにアイリス ハサミで行うことが。
  7. 一度ほぞのカプセル内で左右に移動することによって針を自由自在に移動がであることを確認します。この時間の間に世界中を移動しないでください。これは、サブ-ほぞの (sT) で強膜上針の適切な配置を確認するスペース。
  8. 注射器から溶液を注入し、針を破棄します。注入直後流体は、結膜 (すなわち、結膜浮腫) を通して見た前部の膨らみを作成する sT 領域に蓄積されます。
  9. 世界中の不注意による穿孔による変わらなかったことを確認するためには、眼圧測定を繰り返します。
  10. 蓋鏡を削除し、約 2-3 分の閉じたまぶたを通じてデジタル マッサージを実行します。
  11. 3.5 時間の潜伏期間の頭を残す (部屋の温度 18 ° C を =)、次のステップに移動する前に。

3. ティッシュの準備

  1. 世界へのアクセスを最適化するためにまぶたの鏡を使用してまぶたを撤回します。目の大きさに応じて最適なサイズの鏡を選択します。
  2. 周辺角膜輪部結膜を区切ります。注射部位近く切開されている, は約 1 × 1 cm の接種量が含まれますのでに円周方向の境界線を拡大します。
  3. 強膜挿入のサイトで外眼筋をカットします。
  4. 鉗子、後方から押すと眼球を昇格させます。これは後部の世界へのアクセスを提供し、眼動脈と静脈の世界中の後極の近くにある視神経の切断を容易に。
  5. カットして角膜を複雑なマークの注射部位を含む外側の境界線と。汚れは、強膜の残りの部分に表示されているはずです。
  6. コーパス硝子体とティッシュ鉗子でトラクションを適用することで、強膜の内側に接続されているすべてのレイヤーを削除します。
    注: 以降の手順によって異なります次術: 4. - DSC 分析、5 - SHG 顕微鏡。

4. 地域の DSC 分析のため

  1. 処理の目:はさみでの残りの強膜のカップから 4 強膜分野をカットし、そのように、注射部位は上部のセクターに位置し、中心部に配置。(すなわち、鼻と時間)、側面と下部の両方から残りの 3 セクターをカットします。
    注: は正方形 (1-16) に更に分けられる部門 (1-4) の番号図 1 aに示されています。
  2. 4 x 4 mm 程度の小さな正方形 (1-16) に強膜のセクター (1-4) をカットします。セクター 1 は分割 9 の正方形 (正確な注射部位個々 の四角形の「角 2」を作る) 必要があります。2 と 3 に 2 の正方形 (正方形 10-11 と 12-13) のセクターとセクター 4 3 正方形 (14-16 の正方形) に分割できます。
  3. 注入された領域の位置から分析された組織の距離をローカライズするために図 1 aで示すように、それぞれの正方形に番号を割り当てます。
  4. コントロールの目:次の場所から組織の四角い部分をカット 4 強セクター (扱われたティッシュに類似) に組織を分割後: 3 トップ部門 (部門 1) から正方形の各側面 (セクター 2 と 3) とから 1 から 1、下のセクター (セクター 4)。
  5. 残りの網膜と脈絡膜の層をこすり落とすし、約 10 のためのソリューションに浸漬部分を残して毎回新鮮な PBS で 2 回洗う時に s。

5. SHG イメージング用

  1. はさみを使用して中心部に配置する注射部位に 1 × 1 cm の領域を作成する強膜の上の部分をカットします。
  2. 残りの網膜と脈絡膜の層をこすり落とすし、新鮮な PBS で 2 回洗うたびに約 10 のためのソリューションの作品を残して s。
  3. 場所 1 mL 管組織イメージング施設への輸送のための PBS ソリューションでいっぱい。次の培養時間と眼球の解剖で始まるすべての手続きは、1 時間以内に行わなければなりません。

6. 顕微鏡検査のプロトコル

注: 強膜組織のコラーゲンからイメージングの後方散乱 SHG 信号をこのプロトコルはレーザー顕微鏡用にカスタマイズします。

  1. 顕微鏡のセットアップ
    1. 最大化するには、光と高開口数 (NA) は、赤外線を送信する信号と SHG 顕微鏡を実行する対物レンズを使用するときの解像度を最適化します。私達の目的はニコン Apo LWD 25 x/NA1.1 水浸漬。
    2. カバーガラス、0.17 ミリの厚さであるこの場合、サンプルの深さに合わせてレンズの補正カラーを調整します。
    3. 25 x 対物レンズをマウントし、サンプルをマウントする前に画像の表面をカバーするためのゲルの水ベースの潤滑油の寛大な量を追加します。水ベースのジェルは実験中に蒸発しないとそれ故に画像の品質を維持します。
    4. 上と coverslip 表面間の最大接触を提供する 2 つの 25 mm ラウンド coverslips (ダウン上強膜側) の間を乾燥させず PBS で 1 mL 管から強膜組織を配置します。
      注: 組織も配置できます覆いを取られた上。PBS の良い量は、画像の中に水和組織を保つ必要があります。この場合、cellchamber を組立後組織片と PBS を追加します。
    5. 25 mm ラウンド coverslip、単一を置くことによってまたは商工会議所の下の部分に、サンドイッチ法で細胞チャンバーを組み立てるし、商工会議所丸シールを作成するために上部のスクリュー ダウン。しっかりとトップ coverslip 使用する場合、人為的に平坦化を避けるために、組織を損傷するためにダウンを台無ししていません。
    6. 顕微鏡ステージ上細胞チャンバー内に組織サンプルをマウントします。
    7. 透過光と目ビュー顕微鏡を設定します。
    8. ステージを置き、目的の高さを調整して、サンプルの下面は、フォーカス、目の部分を明視野検査によって決定されます。
    9. コンピューター モニター以外のすべてのライトをオフにし、顕微鏡ステージ上にドレープ アルミ箔シートで、できるだけモニターからできるだけ多くの光をブロックします。GaAsP NDD 探知機は高い感度を持っていると検出器に到達する任意の迷光を最小限に抑える低騒音取得いたします。
    10. ソフトウェアの Ti パッド パネルでレンズの定義が正しいことを確認します。
    11. A1 コンパクトな GUI パネルでイメージング用 IR レーザーを選択し、NDD 探知機 400-450 nm のバンドパス フィルターを装備した DAPI チャネルを選択します。
    12. A1 MP GUI パネルで 860 nm とオープンに赤外線レーザーの波長を設定シャッター。
    13. レーザー スキャン A1 コンパクトな GUI パネルで条件を次のように設定します。選択: (a) ガルバノスキャナー、(b) 単方向スキャン、(c) ピクセル ドウェル時間 6.2 μ s、(d) フレーム サイズ 1,024 x 1,024 ピクセル、(e) 2 x の平均線
      注: ガルバノスキャナーと一方向のスキャン ポイントの正確なアライメントを保証します。1,024 x 1,024 の全視野の大きさは 0.5 μ m/pixel のピクセル サイズに変換します。ラインの平均はイメージでショット ノイズを低減します。
    14. レーザー パワーと検出器ゲインを調整することによってイメージング A1 コンパクトな GUI パネルで条件を設定します。現在のイメージのピクセルの輝度のヒストグラムが表示されますテーブル ・ ルックアップ テーブル パネル (Lut) を開きます。"Find"モードでライブ イメージングをオンにし、レーザー パワーと検出器ゲインを調整することによりピクセル値の検出の範囲を最大化します。飽和を避けるため。典型的な値は、2.5% のレーザー出力を 2.35 860 W の合計から nm と 100 HV (検出器ゲイン)。
    15. 注: このセットアップでは、内部の電力計で測定したレーザー パワーは 5.2 mW。5.2 内部電力が一定レーザー割合を再調整実験を行うたびにイメージング セッション間 mW。レーザー パワーを設定するときに注意が必要があります。カメレオン II レーザーが 800 で 3 W レーザー nm、10% またはより高い電力組織の損傷を引き起こすことができる可能性があります。
  2. 画像の取得
    1. プレビュー モードで XYZ 概要ツールを使用して組織の領域をスキャンします。
    2. このモードでは画像の取得を高速化する低解像度 (256 x 256 ピクセルおよびラインの平均) に画像を設定します。
    3. 5 x 5、3 x 3、または組織の表面全体をカバーする単一のフィールドの表示をキャプチャします。概要キャプチャする前に、それぞれの場所でライブ「スキャン」モードをオン焦点組織を持って来る。組織のさまざまな地域が軸方向にわずかに異なる位置にあることに注意してください。
    4. コラーゲン線維が視野全体で見られるし、概要ツールの特定の場所にステージを移動することでその位置をダブルクリックして、平坦な領域を見つけます。
    5. ライブ「スキャン」モードをオン目的の Z 位置を調整して底面は、フォーカスし、Ti パッドこの下部層上の 10-15 μ m 光の平面を移動する Z ドライブを使用。
    6. 1,024 x 1,024 ピクセルと 2 x ラインの平均、「キャプチャ」ボタンを使用して高解像度で画像を取り込みます。
    7. 「+」ボタンを使って XYZ 概要内の場所を保存します。これにより、組織の同じ領域を奪還しないこと。
    8. 組織の各部分の非重複するビューのフィールドの 10 の画像をキャプチャします。

7. DSC プロトコル

注: は、ティッシュの準備が完了したら、地域の DSC 分析または組織イメージング SHGM が実行される後すぐにこの手順に進みます。

  1. DSC 鍋、秤量し、ラベルを準備します。
    注: この手順は、組織の乾燥を最小限に抑えるため組織切離前に提示されるべきであります。
  2. 吸収性組織とそれぞれの強膜の正方形を乾燥し、歯の鉗子を用いた DSC 鍋の底にそれを置きます。
  3. 内部組織と圧着蓋を鍋の重さし、濡れている重量、組織を取得するカバー (サンプルの質量は 5 に 11 mg の範囲でする必要があります)。
    注: 各シールは、次の組織サンプルに進む前にクリンパを使用してパンします。鍋密閉され、熱分析の前に任意の水損失を防ぐします。
  4. 一度サンプルを圧着すると、DSC トレイ上の指定された場所に配置します。コントロールの 6 サンプルと扱われた目の 16 があるはずです。
  5. ソフトウェアの管理、組織の重量を指定する器具を使用してメソッドを作成し、次のパラメーターを使用して熱伝導解析を実行: 加熱速度 40 に 80 ° C の温度範囲: 1 ° C/分、熱流: 17.37 mW、気流 (N2): 19.8 mL/分ガス圧力: 2.2 バー。
  6. 完了すると、どの熱変性の遷移温度ピークが発生するソフトウェアの管理計測器を使用して抽出することにより各サンプルのデータを分析します。

8. 画像解析

  1. SHG 信号
    1. イメージの領域は、ほとんど膠原線維で占められているように少なくとも 5-10 のそれぞれの治療のコントロールから最も代表的な画像を選択します。
    2. ImageJ ソフトウェア内の各画像をアップロードし、選択して平均輝度を測定分析 > メジャーアクティブなイメージに。
    3. 抽出した値平均輝度として報告され、メニューから選択することによって強度のヒストグラムをプロットすることによって表示することも分析 > ヒストグラム
    4. それに応じてすべての測定データを記録するテーブルを作成する Excel シートを使用してサンプル ID に
    5. 平均と治療と制御条件ごとにピクセル強度の標準偏差を計算します。
    6. 使用して学生の t テスト、(すなわち、対 0 と 400 ミリメートル SMG 0 対 40 mM SMG) 濃度のすべての対比較のための違いを比較します。[P≤0.05]。
  2. うねり
    1. コラーゲン線維を表示するイメージを選択します。サンプルあたりの少なくとも 10 の画像は、(それぞれの濃度 - 合計 40 少なくともコントロールのサンプルを含む) 分析必要があります。
    2. オープンImageJ > プラグイン > NeuronJNeuronJには、以前のインストールが必要です。
    3. 開かれたNeuronJウィンドウにドラッグするすべての imagesby をアップロードします。
    4. マウスで線維の輪郭をたどる線維に沿ってトレース行を作成 (描画タブレット ペンが使用することができる)、総繊維長の距離を測定する M をクリックします。
    5. 接線方向直線を描画し、開始以前に描いた繊維輪郭の端に接続する「オプション」を選択します。エンド ツー エンドの長さを測定する M をクリックします。
    6. 画像ごとに少なくとも 10 の線維に同じ手順を繰り返します。
    7. 10 線維のそれぞれからこれら 2 つの測定値を収集し、それぞれ長 [曲線]、[リニア] 長として総繊維長さ (輪郭) と (ストレート ラインを接続する) エンド ツー エンドの長さを表現する、excel スプレッドシートにデータを入力します。
    8. 計算式を使用して波打ち指数 (W): W = [曲線] の長さ/長さ [リニア]。
    9. 式を使用してコントロールのサンプルからイメージで扱われる samples(SMG) の画像からデータを比較のうねりの % の計算: (W [SMG] - 1)/(W [制御] - 1)
    10. さまざまな治療条件とコントロールのコラーゲン繊維形態の統計的違い (p 値) を決定するために波打ち指数 (W) のペアワイズ t 検定を実行します。

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Representative Results

TXL 架橋効果を評価するための測定法として熱変性温度 (Tm):16 組のウサギの目の合計は、TXL プロシージャのこれらの実験で使用されました。この研究の最初の部分、として死体のウサギの頭の中の sT 領域を通じて SMG 架橋剤の単回投与による架橋効果のローカリゼーションを行った。このタイプの実験は患者の臨床治療との関連性を以来、1 つ以上の場所に注射は強膜の目的の領域を安定させるために必要かもしれない。

基本的な拡散の原則に基づいて予測される効果だった最大注入のサイトで同様に、隣接する領域で、液の濃度によって効果が図 1 aは強膜分野 (赤い中空番号フォントで 1-4) (正方形 (1-16 黒の薄い番号フォントで) にさらに分割) 別の熱変性解析と単一セント注入を施行したの概略位置を表しますカラー マッピングのインデックス。表 1は、その対応するコントロールと比較して各セクター番号の Tm 値の変化を示します。値は、3 つの独立した決定の最小値の計算の平均の標準誤差を含む 40 ミリメートルと 400 ミリメートルの両方の注射のため含まれます。

図 1 bC SMG、40 ミリメートル (図 1 b) と 400 ミリメートル (図 1) の 2 つの異なる濃度を使用して結果を表します。図 1 b、低濃度 40 mM サンプルはスクエア 2 (注射部位) で指摘された Tm の穏やかなシフトを示した。同様のシフトは、隣接する正方形 1 と 3 (明るい青) で見られました。限界のシフトは 4 と 6 および 7 に 9 の挿入された広場から有意差なしの正方形で見られます。注射部位から最も遠いセクターを表されるより低い広場 14 に 16 Tm シフトが認められなかった。

図 1のように、高濃度 (400 mM) は (オレンジの色合いとして示される) 統計的に非常に有意な架橋効果を持っていた。40 mM の低濃度と比較して 400 ミリメートルの効果に大きな差を反映して、関連する小さい標準偏差と p < 0.05 Tm の大きなシフトが観察されました。上のグローブでセクター 1 で最も劇的な効果が認められました。残りの分野について 10 および 14 (した架橋流体のいくつかのトラッキング現象による後方) の正方形の低い効果が認められ, 11、12、13、15、および 16 の正方形で効果が見られない。全体的にみて、架橋効果が 2、3 部門 (すなわち、注射部位から最も遠い場所)、4 で観測された効果のない部門の限界 40 mM サンプルのような。効果の「ゾーン」があったことと架橋剤の sT 注入この種のパターンが期待できることが示唆されました。広域組織の効果を引き起こすためにいくつかの場所で注入の必要性がある可能性があります。

TXL の SMG の 2 つの濃度評価そのまま目で架橋効果の研究も行った。このような強膜の架橋を受けた組織の熱変性解析を行った。TXL の 3 つの異なる濃度 40 を使用して 3.5 h をした時間を架橋 (Tm = 1.2 ± 1.11)、100 (Tm = 2.9 ± 5.12)、400 (Tm = 1.1 ± 14.34) mM SMG。SMG 架橋組織に見られる濃度依存効果があることがわかった。

第二高調波発生 (SHG) TXL 架橋効果を評価する方法としてイメージング:

SHG 顕微鏡画像解析 SHG 信号および繊維束のうねりの画素値の両方です。架橋 (400 mm 40) から濃度の広い範囲は、架橋効果の広い範囲にわたって生じる SHG 信号変化を探検するために使用されました。処理プログラム20フィジー イメージに含まれるヒストグラム解析機能を使用すると、強膜組織で sT インジェクション、40 ミリメートルに 400 ミリメートルを使用して誘導されるもので効果を比較することによって生成される SHG 信号を量的に可能だった。40 mM で平均ピクセル intesities の平均した違いは 66.3 ± 27.7 361.4 ± 28.3 400 mM のサンプル、ほぼ 6 増加と比較していた。これは Tm の対応する増加はまたこれらの条件下で認められたので、組織が相互リンクの増加に対応します。40 mM (図 2 b) と 400 mM (図 2) コントロール (図 2 a) から取得した強膜の代表的な SHG のイメージを図 2に示します。平均の明るさ (輝度) を含む付属のヒストグラム分析も表示されます。分析画像総数: 40 mM およびそのコントロールの 98 用 120400 mM と独自の制御のための 94 の 121。組織イメージング法の深さは、上強膜表面から 10 に 15 μ m だった。多数のイメージ フィールドの平均化に関与して、ヒストグラム解析の結果、架橋効果(図 3)の高い濃度の大きいピクセル強度を制作します。

図 4のように、画像解析も ImageJ プラグイン「ニューロン J''21を使用して、心血管の血管文学から採用する方法で行った。うねり係数 W を推定した [曲線] の長さを = [リニア] 長さと我々 が無処理強対 40 ミリメートルと 400 ミリメートルの架橋強膜減少うねり % によって示されるように線維束の矯正の結果架橋をみ (W % = (W [SMG]-1)/(W[control]-1)、表 2)。40 と 400 ミリメートルの SMG 処理サンプルのうねりの違いは統計的に有意でした。

Figure 1
図 1: ST インジェクション使用 40 と 400 mM SMG を介して TXL 効果のローカリゼーション。
(A)
4 強セクター (番号 1-4 大きい赤中空フォントで)、強膜の模式図正方形に分割 [小さい黒の細いフォントの番号 1-16] (スケール描画されない) 熱分析を施行しました。注射部位は、セクター 1 で中心部にある広場 (広場 2) に対応しました。熱変性架橋 400 mM SMG (1 b) 40 mM SMG と TXL と(1 C)の効果。色分け(D)(B)(C)の温度スケール伝説を。この図は、アクセス許可22Zyablitskayaから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: SHG の濃度依存の増加の代表的な画像信号の明るさレベル TXL 強膜の sT インジェクションで SMG を使用して次の生産前のヴィヴォ.SMG の濃度は 40 mM (B)(C) 400 mM として表示されます。各画像には、50 μ m スケール (右下隅) バーと平均画素の輝度値 (右隅) の絶対値が含まれています。この図は、アクセス許可22Zyablitskayaから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 40 400 mM SMG ソリューションと sT インジェクション (TXL) を介して架橋強そのまま地球儀 (同じウサギの頭から対コントロール) と比較すると SHG 信号ピクセル強度の変化 (Δ) のバー グラフ。平均値の標準誤差で平均値: 66 ± 27.7 40 ミリメートルと 400 ミリメートルのための 361 ± 28.3。この図は、アクセス許可22Zyablitskayaから変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 繊維うねり解析 (直線によって表される) の例です。50 μ m スケール (右下隅) バーと 40 mM SMG 濃度コントロール サンプルの画像です。この図は、Zyablitskayaから変更されています。許可22この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: ST インジェクションの略図。エリア番号の 1-3 は、図 1 aに表示される領域に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

±Δ Tm
エリア 40 mM 400 mM
1 3.4 ±2.8 20.5 ± 0.6
2 3.4 ±0.53 19.58 ± 1.5
3 2.5 ±2.47 17.99 ±3.06
4 0.72 ± 0.9 20.36 ±0.19
5 0.85 ±0.55 れた 19.11 ±1.33
6 0.52 ±1.35 18.66 ±4.1
7 0.78 ハーフブリッジコンバーター 18.44 ±2.8
8 0.56 発熱量 17.77 ±2.69
9 0.22 ± 0.6 18.92 ±2.6
10 0.46 ± 0 8.75 ±10.56
11 0.47 0.18 0.63 ±1.84
12 0.11 ± 0.08 0.66 ±1.52
13 0.08 0.05 0.71 ±2.17
14 0.22 ±0.7 5.71 ±0.29
15 0.32 ± 0.2 0.29 ±0.7
16 0.24 ±0.73 0.26 ±0.79

表 1:DSC は TXL 効果研究の局在化を結果します。サンプリングしたセクターごとに標準誤差を熱溶融温度 (ΔTm) の変化は、図 1 aに示されています。各値は対コントロール Tm ascompared の相違として表現されるが、3 の独立した決定の最小値の平均であります。

SMG、mM うねり うねり % [0 mM SMG] 対 t 検定
0 1.106 ± 0.044 100
40 1.067 ± 0.017 63 p < 0.02
400 1.059 ± 0.009 55 p < 0.003
非線形光ファイバー 1.000 0
(理論値)

表 2.繊維うねり解析の結果。ニューロン J ソフトウェアを使用して繊維のうねりの度の TXL 注入部から SHG 画像を行った。10 繊維はそれぞれのイメージから選ばれ、合計約 100 繊維うねり度分析を行った。平均値平均値の標準誤差に含まれます。

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Discussion

コラーゲン架橋強、トリートメントを架橋用監視ツールとしてこのテクニックを使用しての将来の可能性を高める効果の評価方法として SHG 信号顕微鏡の使用を支持する証拠が示されている実験を行ったコラーゲン蛋白質をターゲットします。注記のうち、楽器は既にこの SHG 信号をキャプチャすることができます潜在的臨床使用中です。この楽器がイメージングの皮膚皮膚の真皮用では主に、イメージ角膜と強膜23に正常にそれ使用されています。

同一スキャンおよびコントロールを比較するときの条件を画像処理を維持するために必要なサンプルを扱います。強膜組織におけるコラーゲンの顕微鏡は蛍光顕微鏡多光子イメージングとの互換性を必要とする第 2 高調波発生パルス赤外レーザー 800-900 nm の波長範囲と、GaAsP など高感度検出器で可変非 descanned (NDD) 検出器。本稿で説明するガイドラインは、開始地点です。新しい実験用または別のシステム条件を決定する必要があります。

角膜と強膜も評価されています同時にこの技術24,25,26,27を用いた研究で。前方と後方の両方の方向で SHG 信号を反映することを知って、いくつかの研究は単独でその本来の状態28,29,30,31、角膜組織を検討しています。 32,33,34と円錐角膜35,36同様 CXL (後述) として続いています。これらの研究の結果は、角膜の透明性と前方散乱システムのモニターをストライクに組織を光が通過するという事実を与えられた理にかなって前方の散乱方向の角膜の信号を最適化することを示します。通常、SHG 信号青の目に見える範囲では、目の強膜のような散乱組織を通過するとき大幅削減されます。結果として、前方散乱 SHG の検出は、50 μ m またはで厚みを薄くし、特殊な光のセットアップと同様の組織の薄いセクションを必要でしょう。対照的に、ティッシュなし蛍光顕微鏡の通常の光パスを後方散乱信号を取り込むことができます、したがってこのモードでは、30-40 μ m の深さまでそのまま強膜組織におけるコラーゲンをイメージングするとき、最寄り。本研究では信号密度濃度依存増加を指摘しました。それは、かなり可能、ただし、TXL は強膜のより深い層の追加と同様の効果を持っていたかもしれない発音効果の詳細にできるし、特に高濃度でより深い層に拡張します。ただし、穿、限られた SHG 信号強膜で、この初期の研究の目的のため、最も表面的な強膜 (15 μ m の深さ) から得られた最高の品質の画像で動作するように選びました。将来的に研究、なぜでも大きな違いがない重要な追加情報を提供することがありますこれ以下の TXL メソッド依存効果観察 40 と 400 mM 扱われたサンプルの間の深さを検討いたします。

さらに、リボフラビン誘導 CXL 組織架橋の評価の SHG の利用に関してに、SHG 顕微鏡イメージング次リボフラビン角膜の CXL をいくつかのグループ37,38,39によって報告されています。,40,41. スティーブンによる調査37CXL 法を用いた角膜の安定化は、「均質化」信号の損失組織「ひだ '' か '' 波動 '' の非架橋のサンプルで見られる結果になったこれらの種類の変更、ただしも認めた技術工芸品の可能性を高める角膜の SHG 信号に眼圧の変化の影響評価研究高い順序繊維束/ラメラ組織立場と同様、線維、組織的から強膜、角膜はかなり異なっているし、電子顕微鏡を用いた研究からその違いについてはあまり知られています。2 つの組織は、線維の直径分布 (強膜、角膜と変数径線維の小さな均一線維) と (角膜と強膜の変数で統一) の間隔間の線維が含まれていますパッキング、線維について異なります。同様に、ラメラ シート (角膜) 対のファイバー ・ バンドル (強) により高い順序構成は全く異なるです。このような構造的な違いは、これら 2 つの組織によって生成される SHG 信号に反映されます。したがって、架橋による変化は異なる平行方法で SHG 信号を変更可能性があります。つまり、「矯正」強膜線維のこの研究と文献等で報告された角膜における信号の「均質化」において変更を架橋コラーゲンの両方結果だった。したがって、角膜に「均質化」効果のいくつかの方法かもしれないここで報告されている強膜の「矯正」の効果に似ています。

TXL によって生成されるこの矯正効果、メカニズムは、現在の調査に基づく明確です。1 つの可能性は機械的に「ロード」位置には組織修正されたこと何らかの形 '' '' かもしれない。誘導の概念をサポートすると「線維と繊維の安定化」が発生していますいた。IOP だった前および次の sT インジェクションを監視し、安定しているので可能性が高い眼圧の変化はこの効果に貢献しなかった。全体的に、これらの観察の意義が明確でないと、さらなる研究が必要になります。注記のうち、独立したイメージング技術のブリルアン顕微鏡42などが示されている定量的な対策を提供する (せん断弾性係数によって決まります)、架橋の CXL 光化学を次に有用かもしれない SHG との調査結果を確認します。本研究ではイメージング。しかし、43強膜など高散乱組織とその使用技術的な修正を必要とし、架橋の強膜組織で検証されていない注意する必要があります。

レーザーの偏光 SHG 顕微鏡は、重要な課題。レーザー光は直線偏光し、各コラーゲン繊維を xy 平面上にいくつかの角度で SHG 信号伝播の方向に垂直の指向します。したがって、xy 平面で繊維も合わせ、偏光レーザー光に直角に交わりますが生成されます (すなわち、z 平面)、入射光に平行を含め、他の角度でそれらより高い SHG 信号になります、最低 SHG 信号 (破壊的な干渉)。強膜組織に関してコラーゲン繊維は、微細なレベルで様々 な角度で配向最寄りの解剖学的線維方向の存在が知られているは、世界中の場所に基づいています。したがって、以来、生産された SHG 信号は、各ファイバーの xy 平面の角度によって異なりますが、全体的な信号よりより少しであるすべてのコラーゲン線維が (腱などの組織で同じ角度に正確に合わせる場合に生成されること、たとえば)。したがって、イメージング対象サンプルの性質のため、この研究では偏波の方向は意図的に特定できませんでしたが研究全体で一貫した保たれました。さらに、我々 は組織を取得するために世話から扱われ、繊維方向のサンプル間の相違点を最小限に抑えることと同一の強膜領域から地球儀を制御します。最後に、強度の値を得るために以上 100 枚サンプルを分析しました。この広範な評価は登録されている可能性があります任意の異常な SHG 信号が正規化する必要があります。という、可能です「繊維矯正」の結果として我々 が"の焦点面の"繊維は、SHG の増加に貢献したかもしれないより大きい割合 (上記) 架橋のサンプルで観察した信号だけでなく、増加大きく xy 平面配置から SHG 信号。両方の可能性は架橋の誘導効果の現れでしょう。

SMG の sT 注入 (Tm) による変化を架橋の地域分析を行った。予想通り、架橋効果のレベルは注入の領域に集中していた。架橋の影響はほとんどありませんが注射、超音波局在44,で示すように、次の sT インジェクション効果の局在について知られているものと一致してから (最も遠い距離) の真向かいの地域に認められた45と計算された断層レントゲン写真撮影46

最後に、架橋治療や近視、角膜のコラーゲンが架橋結合を見つけることです普及鱗片の縁変性 (PMD)、ポスト LASIK keratectasias、円錐角膜など角膜の不安定化としての治療で、屈折矯正手術47への補助。架橋の角膜疾患の治療の成功は、目と、特に、強、高度近視で2までさかのぼるコンセプトの軸方向の伸びを制限するためにこの処置のアプローチを適用した探査につながっている、治療の架橋概念48,49の非常に初期の段階。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

著者はありがとう sT インジェクション; 相談 Tongalp Tezel、MD は、テレサ Swayne、PhD、SHG 顕微鏡に関する相談デザインと生物統計学のリソースとコロンビア大学医療センターでアーヴィングの研究所の統計中核施設からジミー ビンズオン。

失明を防ぐために研究や健康補助金傘下 UL1RR024156 の国家機関、ネイ P30 EY019007、NCI P30 CA013696、ネイ R01EY020495 (DCP) 部分的にサポートされています。コロンビア大学関連の知的財産を所有している: 米国発行特許 no: 8,466,203 および no: 9,125,856。国際特許出願中: PCT/US2015/020276。

画像を集めた、共焦点、およびコロンビア大学、NIH 支えのハーバート ・ アーヴィング総合がんセンターの専門顕微鏡共有リソースに付与 #P30 CA013696 (国立癌研究所)。NIH で共焦点顕微鏡を購入した #S10 RR025686 を与えます。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

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