Deuxième génération d’harmoniques signaux dans la sclérotique de lapin comme un outil pour l’évaluation des thérapeutiques tissulaires réticulation (TXL) pour la myopie

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Summary

Ce protocole décrit les techniques d’évaluation de réticulation chimique de la sclérotique de lapin à l’aide de l’imagerie de la génération de seconde harmonique et calorimétrie différentielle à balayage.

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Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

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Abstract

Méthodes pour renforcer le tissu en introduisant des liaisons chimiques (réticulation non enzymatique) dans des protéines structurales (collagènes fibrillaires) pour la thérapie incluent la réticulation photochimique et tissus réticulation méthodes (TXL). Ces méthodes pour induire des changements de propriété tissu mécanique sont utilisées pour la cornée en amincissement cornéen (mécaniquement affaibli) troubles comme le kératocône, mais aussi la sclère dans la myopie progressive, où éclaircie et affaiblissement de la partie postérieure sclère se produit et contribue probablement à élongation axiale. Les protéines de la cible principale pour le renforcement de ces tissus sont des collagènes fibrillaires qui constituent la grande majorité des protéines de poids sec dans la cornée et la sclérotique. Fortuitement, collagènes fibrillaires constituent la principale source de deuxième génération harmonique de signaux dans l’espace extracellulaire du tissu. Donc, modifications des protéines de collagène, telles que celles induites par le biais de thérapies, la réticulation pourraient potentiellement être détectées et quantifiées par l’utilisation de la microscopie de génération d’harmoniques deuxième (SHGM). Surveillance SHGM signaux grâce à l’utilisation d’un laser à balayage système de microscopie couplée à une excitation infrarouge lumière source est une méthode d’imagerie moderne excitante qui jouit d’un usage répandu dans les sciences biomédicales. Par conséquent, la présente étude a été entreprise afin d’évaluer l’utilisation de la microscopie SHGM comme un moyen de mesurer a provoqué des effets réticulation dans ex vivo de sclère lapin, après une injection d’un produit chimique, agent de réticulation dans l’espace de la sub-Tenon (sT), un injection l’approche c’est une pratique courante pour causer d’anesthésie oculaire lors de procédures cliniques ophtalmologiques. Le produit chimique, agent de réticulation, hydroxyméthylglycinate de sodium (SMG), provient d’une classe de conservateurs cosmétiques appelée formaldéhyde libérant des agents (FAR). Sclérales changements après réaction avec SMG a entraîné une augmentation dans les signaux de la SHG et en corrélation avec des changements dans la température de dénaturation thermique, une méthode standard pour évaluer induite tissu effets de réticulation.

Introduction

Myopie progressive est postulée pour être traitable par réticulation sclérale non enzymatique (photochimique et/ou chimiques), ce qui est logique étant donné que le blocage enzymatique réticulation de collagène peut augmenter la privation (FD) de forme expérimentale-induite 1de myopie. Elsheikh et Phillips2 a récemment examiné la faisabilité et le potentiel d’utilisation standard irradiation ultraviolets A (UVA)-riboflavine médiée par réticulation photochimique (également connu sous le nom du protocole de Dresde), en abrégé ici comme (riboflavine CXL) pour une stabilisation sclérale postérieure stopper une élongation axiale dans la myopie. Cette méthode photochimique a été utilisée avec succès pour traiter la déstabilisation de la surface antérieure de globe (c.-à-d., la cornée bombée) vue dans keratectasia kératocône et post-LASIK. Cependant, application du présent protocole CXL pour la sclère est entravée par questions liées aux difficultés d’accès à la sclère postérieure avec une source de lumière ultraviolette (UV), ainsi que la nécessité de modifier une beaucoup plus grande tissu surface. Qu’étant dit, l’approche CXL a été utilisé pour stopper l’élongation axiale sous forme visuellement privé lapins (par tarsorrhaphy), bien que plusieurs régions de la sclère postérieure tenu plusieurs zones distinctes de l’irradiation dans cette étude3. En revanche, l’injection d’un agent stabilisant chimique (p. ex., agent de réticulation) par l’intermédiaire de l’espace sT pourrait représenter un moyen plus simple de modifier la sclère postérieure, évitant la nécessité d’introduire une source de lumière UV. Cette technique d’injection est bien connue comme un moyen utile d’induire une anesthésie oculaire durant les interventions ophtalmologiques tels que cataracte chirurgie4,5,6. Wollensak7 a décrit précédemment l’utilisation d’une injection de sT à l’aide de glycéraldéhyde (un réticulation agent chimique semblable au concept de la formaldéhyde libérant des agents (FARs) décrites dans la présente étude) pour raidir le lapin sclérotique et la genipin a été montré pour limiter la longueur axiale en FD cobayes8,9. Ces chercheurs ont démontré un net avantage de l’utilisation d’un agent chimique soluble sur la technique CXL photochimique. Ainsi, sclérale réticulation à l’aide d’un agent chimique injectable d’un certain type, y compris le FARs (c.-à-d., TXL)10, pourrait fournir une méthode de traitement possible pour stopper la progression de l’élongation sclérale vue dans la myopie.

Dans les protocoles présentés ici, nous utilisons la solution réticulation chimique de sodium hydroxyméthylglycinate (SMG), administrée par injection de sT à la sclérotique des yeux de lapin provenant de cadavres. Nous avons mis en place des protocoles similaires précédemment pour la réticulation chimique topique dans la cornée. Notamment dans les études rapportées antérieurement, dépendante de réticulation des effets de la concentration pourrait être obtenue en utilisant des SMG, avec une gamme d’effet couvrant bien supérieure à celle possible avec des procédés photochimique CXL tel que déterminé par l’analyse de la dénaturation thermique11 .

Nous décrivons ici les protocoles visant à évaluer l’effet de réticulation de SMG envoyée via des injections de sT au tissu scléral, dénaturation thermique à l’aide de la calorimétrie à balayage différentielle (DSC) et deuxième de microscopie du génération harmonique (SHGM).

À l’aide d’analyse calorimétrique différentielle (DSC), également connu sous le nom de l’analyse thermique, une transition de dénaturation thermique est mesurée, qui pour tissu scléral est principalement guidé par les propriétés des collagènes fibrillaires, car ils constituent la majorité de vrac de la protéine. Cette méthode évalue la stabilité de la structure moléculaire de collagène et des liaisons réticulés qui stabilisent les fibrilles de collagène, la structure de la principale protéine tertiaire. Durant le chauffage dans le DSC, une température de transition critique est atteint qui entraîne la dénaturation de la molécule de collagène, entraînant dans le déroulement de la triple hélice, un processus qui se forme à ce qui est communément appelé gélatine. Cette dénaturation thermique perturbe les liaisons hydrogène le long de la molécule de collagène et peut être déplacée à des températures plus élevées par le biais de méthodes de réticulation induit12,13. Cette méthode a été utilisée pendant de nombreuses décennies, particulièrement dans l’industrie des biomatériaux et des processus qui incluent la fabrication de cuir. Toutefois, cette méthode nécessite l’extraction du tissu sclérotique et ne peut donc être utile comme technique d’ex vivo .

Microscopie (SHGM) de la génération de seconde harmonique est basée sur les propriétés optiques non linéaires des matériaux particuliers, avec des environnements moléculaires non-centrosymétriques. Dans ces matières, lumière intense, par exemple lumière produit par laser, génère des signaux SHG, dans laquelle la lumière incidente est doublée en fréquence. Matières biologiques qui sont connus pour créer des signaux SHG sont le collagène, microtubules et myosine du muscle. Par exemple, le collagène excités par une lumière infrarouge de longueur d’onde de 860 nm émet un signal SHG dans le domaine du visible avec la longueur d’onde de 430 nm. Génération de seconde harmonique (SHG) signal imagerie est une méthode prometteuse pour l’évaluation de réticulation du collagène thérapeutique. On sait depuis plus de 30 ans que les fibrilles de collagène dans les tissus émettent SHG signaux14. Cependant, seulement récemment des images haute résolution pu15 dans une variété de tissus, y compris le tendon16, peau, cartilage,17,18de vaisseaux sanguins et collagène gels19.

Basé sur cette connaissance, cette étude évalue les changements de signal SHG induits dans la sclérotique par SMG induite chimiquement la réticulation du collagène. Les résultats indiquent que la modification de SMG de la sclère augmente les signaux SHG produites à partir de faisceaux de fibres de collagène des tissus (la plus haut ordre structure quaternaire composée de fibrilles de collagène) et produit également un changement structurel morphologique dans le collagène réseau de fibres optiques, reflété dans la fibre bundle « redressement. »

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées à l’aide des yeux de lapin provenant de cadavres dans les têtes de lapin non consanguins intact. Tous les institutionnels et National des directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire ont été suivies.

1. préparation des Solutions

  1. Préparation de SMG pour TXL :
    1. Préparer 1 mL de concentration de 0,2 M de solution (NaHCO3) de bicarbonate de sodium solution à l’aide de 0,0165 g de NaHCO3 poudre dissous dans 1 mL de l’eau distillée.
    2. Dissoudre 0,1016 mg de hydroxyméthylglycinate de sodium en poudre (SMG) dans 1 mL de l’eau distillée pour obtenir une concentration finale de 800 mM SMG. Ajuster la solution de bicarbonate de sodium à une concentration finale de 0,1 M NaHCO3 et 400 mM SMG. Concentration de SMG selon la réticulation effet désiré. Dans le protocole décrit ici, nous avons utilisé 40, 100 et 400 mM SMG.

2. Injection de subTenon pour TXL utilisant SMG

  1. Remplir deux seringues à insuline 1 mL (aiguilles 25G) de 400 µL contrôle et solution SMG, respectivement.
  2. Placez la tête du lapin dans un plan de profil à l’aide d’un coussin. Mousse de polystyrène ou une pile de papier peut servir à fixer la tête dans une position optimale.
  3. Rétraction des paupières avec un spéculum oeil pédiatrique.
  4. Mesurer la première pression intraoculaire (PIO) à l’aide d’un dispositif de tonométrie d’aplanation.
  5. Marquer l’endroit de l’injection prévue sur la partie médiane supérieure de la limbe avec un marqueur de tissus.
  6. Rétracter la conjonctive entourant le site d’injection avec une pince conjonctivale (ou n’importe quel pince bout rond dentelé) et insérer l’aiguille à travers la conjonctive, entrant dans la capsule de Tenon à peine au-delà du site limbique marqué (c'est-à-dire, 2-3 mm de la limbe). Une petite incision dans la conjonctive peut aussi faire avec des ciseaux iris afin de faciliter le passage de l’aiguille dans la capsule de Tenon.
  7. Une fois au sein de la capsule de Tenon, s’assurer que l’aiguille est librement mobile en le déplaçant à côté. Pendant ce temps, le monde ne doit pas bouger. Cela confirme le positionnement correct de l’aiguille au-dessus de la sclère en de sub-Tenon (sT) espace.
  8. Injecter la solution de la seringue et jeter l’aiguille. Immédiatement après l’injection, le liquide s’accumule dans l’espace de sT créant un renflement antérieur vu à travers la conjonctive (c.-à-d., chémosis).
  9. Recommencez la mesure de la PIO afin de confirmer qu’il n’a pas changé en raison d’une perforation accidentelle de la planète.
  10. Retirer le spéculum de couvercle et effectuer un massage digital à travers les paupières fermées pendant environ 2-3 min.
  11. Laissez la tête pendant une période d’incubation de 3,5 h (température ambiante = 18 ° C), avant de passer à l’étape suivante.

3. préparation du tissu

  1. Rétraction des paupières à l’aide du spéculum paupière afin d’optimiser l’accès au monde entier. Sélectionnez le spéculum de façon optimale de taille selon la taille de le œil.
  2. Séparer la conjonctive entourant le limbe. Si elle a déjà été l’objet d’une incision près du site d’injection, sur sa circonférence élargir les frontières alors il contiendrait une taille de l’inoculum de 1 x 1 cm environ.
  3. Couper les muscles extra oculaires à leurs sites d’insertion sclérale.
  4. Élever le globe oculaire avec une pince, en le poussant du côté postérieur. Cela permet d’accéder au globe postérieur et facilitera la découpe du nerf optique avec l’artère ophtalmique et veine située près du pôle postérieur du globe.
  5. Découper le corneoscleral complexe, avec la bordure extérieure, y compris la point marqué d’injection. La tache doit être toujours visible sur la partie restante de la sclère.
  6. Retirez le corpus vitreus et toutes les couches, attachés à la face interne de la sclère en appliquant la traction avec une pince de tissu.
    Remarque : D’autres mesures dépendent les procédures suivantes sont effectuées : 4. - analyse de la DSC, 5. - microscopie SHG.

4. pour l’analyse régionale de DSC

  1. Pour les yeux traité : découpée dans quatre secteurs de décentrer la coupe sclérale restante avec les ciseaux afin que le site de l’injection est situé dans le secteur supérieur et aligné au centre. Couper les 3 autres secteurs latéraux (c.-à-d., nasale et temporelle), et le fond.
    NOTE : la numérotation des secteurs (1-4) qui sont encore divisés en carrés (1-16) est illustrée dans la Figure 1 a.
  2. Couper les secteurs sclérales (1-4) en petits carrés (1-16) d’environ 4 x 4 mm. Secteur 1 devrait être divisé en 9 carrés (faire le point exact d’injection une individuelle place [2]). Diviser les secteurs 2 et 3 en 2 carrés de chaque (carrés 10-11 et 12-13) et 4 en 3 carrés (14-16 places).
  3. Attribuer un numéro à chaque carré, tel qu’illustré à la Figure 1 a, afin de localiser la distance du tissu analysé depuis l’emplacement de la zone injectée.
  4. Pour les yeux de contrôle : après divisant le tissu en quatre secteurs sclérales (semblables à du tissu traité) découpe morceaux carrés de tissus aux endroits suivants : 3 places depuis le haut de la page (secteur 1), 1 de chaque côté (secteurs 2 et 3) et 1 de la bas (secteur 4).
  5. Gratter les couches rétiniennes et choroïdienne restants et laver deux fois avec du PBS frais chaque fois, laissant les pièces immergées dans la solution pendant environ 10 s à la fois.

5. pour l’imagerie de la SHG

  1. Couper la partie supérieure de la sclérotique à l’aide de ciseaux pour créer une zone de 1 x 1 cm avec le point d’injection, alignée au centre.
  2. Gratter les couches restantes de la rétiniens et la choroïdes et laver deux fois avec du PBS frais chaque fois laisser les morceaux dans la solution pendant environ 10 s.
  3. Placez le tissu en tubes de 1 mL remplis de solution de PBS pour le transport jusqu'à l’établissement d’imagerie. Toutes les procédures, suivant le temps d’incubation et commençant par la dissection du globe oculaire doivent être effectuées moins d’une heure.

6. Protocole de microscopie

Remarque : Ce protocole d’imagerie éparpillés à l’arrière du signal du SHG du collagène du tissu sclérotique est adapté pour le laser, microscope à balayage.

  1. Mettre en place la microscopie
    1. Afin de maximiser le signal et la résolution lorsque effectuant la microscopie SHG utilisez une lentille d’objectif optimisent pour la transmission infrarouge lumière et avec une grande ouverture numérique (NA). Notre objectif est de Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 de l’eau d’immersion.
    2. Ajustez le collier de correction de l’objectif pour correspondre à la profondeur de l’échantillon, dans ce cas c’est l’épaisseur de la lamelle, 0,17 millimètres.
    3. Monter l’objectif 25 x et ajouter une quantité généreuse de gel à base d’eau pour couvrir la surface d’imagerie avant de monter l’échantillon lubrifiant. Le gel à base d’eau ne s’évapore pas pendant l’expérience et par conséquent maintiendra une qualité d’image.
    4. Placez le tissu scléral d’un tube de 1 mL avec du PBS sans sécher entre deux lamelles de rond de 25 mm (épiscléral vers le bas) fournissant maximale un contact entre l’episclera et la surface de la lamelle couvre-objet.
      NOTE : Le tissu peut également être placé découvert sur la lamelle couvre-objet. Une bonne quantité de PBS devrait garder le tissu hydraté pendant la formation image. Dans ce cas, ajouter le morceau de tissu et les PBS après avoir assemblé la cellchamber.
    5. Assembler la chambre de la cellule, en plaçant une lamelle ronde 25 mm, seule ou dans une technique de "sandwich", sur la partie inférieure de la chambre et vissez la partie supérieure afin de créer un scellé autour de chambre. Ne vissez pas vers le bas fermement quand une lamelle supérieure est utilisée, afin d’éviter l’aplatissement artificiellement et endommager les tissus.
    6. Monter la chambre de cellule avec l’échantillon de tissu sur la platine du microscope.
    7. Sur la valeur du microscope pour vue avec lumière transmise.
    8. Positionnez la platine et régler la hauteur de l’objectif tel que la surface inférieure de l’échantillon est au point, tel que déterminé par l’inspection sur pied lumineux à travers l’oculaire.
    9. Éteindre toutes les lumières sauf l’écran d’ordinateur et bloquer autant de lumière du moniteur que possible avec des feuilles de papier aluminium drapés sur la platine du microscope. Minimiser toute lumière parasite atteignant les détecteurs assurera acquisition faible bruit, comme les détecteurs GaAsP NDD ont une sensibilité élevée.
    10. Dans le panneau de garniture de Ti du logiciel, vérifiez que la définition de la lentille est correcte.
    11. Dans le panneau A1 GUI Compact, choisissez le laser IR pour l’imagerie, sélectionnez les détecteurs de NDD et choisissez le canal DAPI qui est équipé d’un filtre passe-bande de 400 à 450 nm.
    12. Dans le panneau de A1 MP GUI, définissez la longueur d’onde du laser infrarouge à 860 nm et ouvrir l’obturateur.
    13. Définir comme suit les conditions dans le panneau A1 GUI Compact à balayage laser. Sélectionnez : b Galvano scanner, numérisation (b) unidirectionnel, (c) Pixel dwell time 6.2 µs, d cadre taille 1 024 x 1 024 pixels, ligne e, avec une moyenne de 2 x
      NOTE : Galvano scanneur et un balayage unidirectionnel garantit un alignement précis point par point. Une taille de 1 024 x 1 024 pour la totalité du champ de vision se traduit par une taille de pixel de 0,5 μm /pixel. Ligne moyenne permettra de réduire le bruit de grenaille dans l’image.
    14. Conditions d’imagerie réglées dans panneau A1 GUI Compact en ajustant la puissance du laser et détecteur de gain. Ouvrez le panneau de Look Up Table (LUT) qui affiche un histogramme des valeurs d’intensité de pixel de l’image actuelle. Tourner sur l’imagerie live en mode « Rechercher » et maximiser la plage détectée des valeurs de pixel en ajustant gain de puissance et détecteur laser. Éviter la saturation. Valeurs typiques sont la puissance de laser de 2,5 %, passant de 2,35 W à 860 nm et 100 HV (gain de détecteur).
    15. Remarque : Pour cette configuration, la puissance de laser mesurée avec un wattmètre interne est 5,2 mW. Chaque fois qu’une expérience est menée, ré-ajuster le pourcentage de laser telle que la mesure de la puissance interne est constante à 5,2 mW entre séances d’imagerie. Être prudent lors du réglage de puissance du laser. Le laser Chameleon II est un laser de 3 W à 800 nm et un 10 % ou une puissance plus élevée pourrait potentiellement induire des lésions tissulaires.
  2. Acquisition d’images
    1. En mode aperçu, scannez la zone de tissu à l’aide de l’outil aperçu de XYZ.
    2. La valeur de l’imagerie à basse résolution (256 x 256 pixels et aucune ligne en moyenne) afin d’accélérer l’acquisition d’images dans ce mode.
    3. Capture de 5 x 5, 3 x 3 ou champs de vue unique pour couvrir toute la surface du tissu. À chaque endroit, avant la prise de vue d’ensemble, activer le mode « Scan » direct et mettre le tissu au point. Notez que les différentes régions du tissu aura des positions légèrement différentes dans le sens axial.
    4. Trouver un endroit plat où les fibres de collagène sont visibles dans le champ de vision complet et double-cliquez sur ce poste dans l’outil d’aperçu pour déplacer l’étape vers cet emplacement particulier.
    5. Activer mode « Scan » live, ajuster la position Z de l’objectif tel que le plan inférieur est mise au point et, dans le pavé de la Ti, utilisez le lecteur Z pour déplacer le plan optique 10 à 15 μm au-dessus de cette couche de fond.
    6. Acquérir une image à haute résolution de 1 024 x 1 024 pixels et 2 x ligne moyenne, en utilisant le bouton « Capture ».
    7. L’emplacement d’enregistrement dans la vue d’ensemble de XYZ en utilisant le bouton « + ». Cela garantit que la même zone du tissu n’est pas reprise.
    8. Pour chaque morceau de tissu capturer 10 images de non-cumul champs de vision.

7. Protocole de DSC

Remarque : Passez à cette étape, dès la préparation du tissu est terminée, pour l’analyse régionale de DSC, ou après tissue imaging lorsque SHGM est effectuée.

  1. Préparer les casseroles de DSC, pesé et étiqueté.
    Remarque : Cette étape devrait être faite avant la dissection des tissus afin de minimiser la dessiccation des tissus.
  2. Sécher chaque carré sclérale avec un tissu absorbant et posez-le à plat sur le fond d’un moule de DSC à l’aide de la pince crantée.
  3. Peser le moule avec le tissu à l’intérieur et le couvercle serti et couverts pour obtenir les tissus poids humide (masse des échantillons doit être de l’ordre de 5 à 11 mg).
    Remarque : Le joint chaque pan à l’aide de la pince avant de passer à l’échantillon de tissu suivant. Les casseroles sont hermétiquement fermés, empêchant toute perte d’eau avant l’analyse thermique.
  4. Une fois que l’échantillon est serti, placez-le sur l’emplacement désigné sur le plateau de DSC. Il devrait y avoir 6 échantillons pour le contrôle et 16 pour les yeux traité.
  5. Créez une méthode à l’aide d’instrument de gestion des logiciels, en précisant le poids du tissu, et exécutez l’analyse thermique en utilisant les paramètres suivants : température ambiante de 40 à 80 ° C, vitesse de chauffage : 1 ° C/min, le flux thermique : 17,37 mW, débit de gaz (N2) : 19,8 mL/min, Pression gaz : 2,2 bar.
  6. Une fois terminé, analyser les données pour chaque échantillon en extrayant le pic de température de transition à laquelle dénaturation thermique se produit à l’aide de l’instrument de gestion des logiciels.

8. image Analysis

  1. Signal SHG
    1. Sélectionnez au moins 5-10 des images plus représentatives de chaque traitement et son contrôle, tels que la zone de l’image occupe principalement des fibres de collagène.
    2. Télécharger chaque image dans le logiciel ImageJ et mesurer l’intensité moyenne de pixel en sélectionnant Analyze > mesure pour l’image active.
    3. Les valeurs extraites sont signalés comme l’intensité moyenne des pixels et peut également être indiquées en traçant l’histogramme des intensités en sélectionnant dans le menu Analyze > histogramme.
    4. À l’aide d’une feuille Excel, créer une table pour documenter toutes les données mesurées en conséquence à l’ID d’échantillon.
    5. Calculer la moyenne et l’écart d’intensité pixel pour chaque condition de traitement et de contrôle.
    6. T-test de l’utilisation de l’étudiant, comparer les différences pour toutes les comparaisons par paires des concentrations (c'est-à-dire40 mM SMG vs 0 et 400 mM SMG vs 0). [P ≤ 0,05].
  2. Ondulation
    1. Sélectionnez une image qui affiche des fibres de collagène. Il faudrait analyser au moins 10 images par échantillon (y compris un échantillon de contrôle pour chaque concentration - au moins 40 au total).
    2. Ouvert ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ nécessite l’installation préalable.
    3. Télécharger imagesby tous les faire glisser dans une fenêtre ouverte de la NeuronJ .
    4. Créer de tracer des lignes le long des fibres, suivant la courbure de la fibrille avec la souris (dessin comprimés pourrait servir), cliquez sur M pour mesurer la distance de la longueur des fibres totales.
    5. Sélectionnez « Option » pour dessiner une ligne droite tangentielle et connecter le début et la fin du contour fibre déjà dessinés. Maintenant cliquez sur M pour mesurer la longueur de bout en bout.
    6. Répétez la même procédure au moins 10 fibrilles par image.
    7. Recueillir ces deux mesures de chacun des 10 fibrilles et entrer les données dans un tableur excel, exprimant la longueur des fibres totales (contour) et longueur de bout à bout (ligne de raccordement tout droit) comme longueur [courbe] et [linéaire], respectivement.
    8. Calculer l’indice d’ondulation (W) selon la formule suivante : W = longueur [courbe] / [linéaire] de longueur.
    9. Calculer le % d’ondulation en comparant les données à partir des images de samples(SMG) traités avec les images provenant d’échantillons de contrôle à l’aide de la formule : (W [SMG] - 1) / (W [commande] - 1)
    10. Effectuer un test t par paires pour index ondulation (W) afin de déterminer les différences statistiques (p-valeurs) de la morphologie de fibre de collagène entre des conditions différentes de traitement et de contrôle.

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Representative Results

Température de dénaturation thermique (Tm) comme une méthode d’essai pour évaluer TXL réticulation effet : Un total de 16 paires d’yeux de lapin ont été utilisées dans ces expériences pour la procédure TXL. Dans une première partie de cette étude, la localisation de réticulation effet induit par une seule injection de l’agent de réticulation SMG via sT espace dans la tête de lapin provenant de cadavres a été évaluée. Ce type d’expérience depuis présentant un intérêt pour le traitement clinique des patients, des injections dans plus d’un endroit pourraient s’avérer nécessaires pour stabiliser une zone souhaitée de la sclère.

Comme serait être prédit basé sur les principes de base de diffusivité, l’effet était plus grande au point d’injection avec effets induits dans les régions adjacentes ainsi, selon la concentration des solutions. Figure 1 a représente l’emplacement schématique sclérale secteurs (1-4 numéro en rouge creux) (divisés en carrés (1 à 16 en police numéro fine noire)) qui a subi une analyse distincte de la dénaturation thermique après une injection unique sT avec index de couleur de cartographie. Le tableau 1 illustre la variation dans les valeurs Tm pour chacun des secteurs numérotés par rapport à son contrôle correspondant. Les valeurs sont incluses pour les injections de 40 mM et de 400 mM et comprennent l’erreur type de la moyenne calculée pour un minimum de trois déterminations indépendantes.

Figures 1 b-C représentent les résultats à l’aide de deux concentrations différentes de SMG, 40 mM (Figure 1 b) et 400 mM (Figure 1). L' Figure 1 b, l’échantillon de 40 mM plus faible concentration montre un déplacement doux en Tm qui a été noté sur place 2 (site de l’injection). Des changements similaires ont été observés dans les cases adjacentes 1 et 3 (bleu plus clair). Des changements marginaux sont visibles dans les places 4 à 6 et 7 à 9 sans différence statistiquement significative de la place injectée. Aucune Maj Tm a été observée dans les places inférieures 14 à 16, qui représentait le secteur plus éloigné loin du site d’injection.

Comme le montre la Figure 1, la concentration la plus élevée (400 mM) a eu un effet de réticulation statistiquement hautement significatif (indiqué nuances d’orange). Un grand changement dans Tm avec écart-type associé à petit et p < 0,05 ont été observées, ce qui reflète une grande différence dans l’effet de la 400 mM par rapport à la plus faible concentration en 40 mM. L’effet plus spectaculaire a été relevé en secteur 1 dans le monde supérieur. En ce qui concerne les autres secteurs, a observé un effet moindre dans les cases 10 et 14 (qui peut-être due à certains suivi de réticulation fluide vers l’arrière) et aucun effet a été observé sur les places, 11, 12, 13, 15 et 16. Dans l’ensemble, les effets de réticulation étaient marginaux dans les secteurs 2 et 3 sans effet observé dans le secteur 4 (c'est-à-dire, l’emplacement le plus éloigné au site d’injection), semblable à l’exemple de 40 mM. Ces résultats indiquent qu’il y avait une '' zone de prise d’effet '' et que ce type de modèle pourrait s’attendre après une injection de sT de l’agent de réticulation. Cela pourrait indiquer la nécessité d’injection en plusieurs endroits afin d’induire des effets sur une large zone du tissu.

Étude des réticulation effets induits des yeux intacts evaluating TXL avec deux concentrations de SMG a également été effectuée. Analyse de la dénaturation thermique du tissu qui a subi cette réticulation sclérale a été réalisée. Temps de réticulation est de 3,5 h pour TXL en utilisant trois concentrations différentes, 40 (Tm = 1,11 +/-1,2), 100 (Tm = 5,12 +/-2,9) et 400 (Tm = 14,34 +/-1,1) mM SMG. Les résultats ont montré qu’il y a un effet de concentration dépendante vu dans le tissu réticulé SMG.

Deuxième génération d’harmoniques (SHG) imagerie comme une méthode d’évaluation TXL effet de réticulation :

Microscopie SHG images ont été analysées tant pour l’intensité des pixels de l’ondulation de bundle SHG signal et fibre. Une vaste gamme de réticulation des concentrations (de 40 à 400 mM) a été utilisée afin d’étudier les modifications de signal SHG qui peuvent survenir sur un large éventail d’effets de réticulation. En utilisant les capacités d’analyse histogramme incluses dans le programme20de traitement d’image de Fidji, il a été possible de quantifier le signal SHG produit dans le tissu scléral par injection de sT, comparant les effets à 40 mM à ceux induits par l’utilisation de 400 mM. La différence moyenne de pixel moyenne employant à 40 mM étaient 66,3 ± 27,7 comparativement à ± 361.4 28,3 pour les échantillons de 400 mM, une augmentation de près de 6 fois. Ceci correspond à une augmentation des tissus rétification, puisque des hausses correspondantes dans Tm ont également notées dans ces conditions. La figure 2 montre les images SHG représentatives de la sclère, prises de contrôle (Figure 2 a), 40 mM (Figure 2 b) et 400 mM (Figure 2). L’analyse histogramme qui l’accompagne, y compris la luminosité moyenne (ou intensité pixel) est également montré. Le nombre total d’images analysé était : 120 pour 40 mM et 98 pour la contrôler ; 121 pour 400 mM et 94 pour son propre contrôle. La profondeur de l’imagerie des tissus était 10 à 15 µm de la surface d’épiscléral. Les résultats de l’analyse de l’histogramme, qui portait sur le calcul de la moyenne de nombreux domaines de l’image, a indiqué que des concentrations plus élevées de réticulation effet (Figure 3) produisent une plus grande intensité de pixel.

Comme illustré à la Figure 4, une analyse de l’image a également été effectuée avec des méthodes adoptées dans la littérature cardiovasculaire des vaisseaux sanguins, en utilisant le plugin ImageJ ''Neurone J''21. Nous avons estimé le facteur d’ondulation W = longueur [courbe] / longueur [linéaire] et nous avons observé que la réticulation entraîné redressage des faisceaux de fibres comme indiqué par un % ondulation réduite de 40 mM et 400 mM réticulée sclère versus la sclère témoins non traitées (% P = ([W SMG]-1)/(W[Control]-1), tableau 2). La différence de l’ondulation entre 40 et 400 mM SMG traité échantillons n’était pas statistiquement significative.

Figure 1
Figure 1 : Localisation de prise d’effet TXL via sT injection en utilisant 40 à 400 mM SMG.
(A)
représentation schématique des 4 secteurs sclérales (numéros 1-4 en grand creux rouge), avec la sclère divisée en carrés [chiffres 1-16 en plus petits caractères mince noir] (ne pas dessinés à l’échelle) qui a subi une analyse thermique. Le site d’injection a correspondu à la situé place (2) dans le secteur 1. La dénaturation thermique, effet de TXL avec (1 b) 40 mM SMG et (1c) 400 mM SMG de réticulation. (D) code couleur légende échelle de température (B) et (C). Ce chiffre a été modifié par Zyablitskaya et al. , avec la permission de22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Des images représentatives des augmentations concentration dépendante SHG signalent des niveaux de luminosité produites suite TXL utilisant SMG par injection de sT de sclère ex vivo . Concentrations de SMG sont illustrées en (B) 40 mM et (C) 400 mM. Chaque image contient un 50 µm échelle bar (coin inférieur droit) et la valeur d’intensité moyenne pixel (coin supérieur droit) - valeurs absolues. Ce chiffre a été modifié par Zyablitskaya et al. , avec la permission de22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Histogramme du changement d’intensité du pixel signal SHG (par rapport à un contrôle apparié de la même tête de lapin) dans sclérales globes intacts réticulé par sT injection (TXL) avec des solutions SMG mM 40 et 400 (Δ). Les valeurs moyennes et écart-type de la moyenne étaient : 66 ± 27,7 pour 40 mM et 361 ± 28,3 pour 400 mM. Ce chiffre a été modifié par Zyablitskaya et al. , avec la permission de22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Exemple d’analyse de l’ondulation de fibre (tel qu’exprimé par linéarité). Image de l’échantillon de contrôle pour la concentration de SMG de 40 mM avec une échelle de 50 µm bar (coin inférieur droit). Ce chiffre a été modifié par Zyablitskaya et al. avec permission22. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Représentation schématique de l’injection sT. Les zones numérotées de 1 à 3 correspondent aux régions représentées dans la Figure 1 a. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

±Δ Tm
zone 40mM 400mM
1 3.4 ±2, 8 20.5 ± 0,6
2 3,4 ±0.53 ±1, 5 19.58
3 ±2.47 2,5 ±3.06 17.99
4 0,72 ±0.9 20.36 ±0.19
5 0.85 ±0.55 19.11 ±1.33
6 0,52 ±1.35 18,66 ± 4,1
7 0.78 1,6 18,44 ±2, 8
8 ±0.9 0.56 17.77 ±2.69
9 0.22 ± 0,6 ±2.6 18.92
10 ±0 0.46 8.75 ±10.56
11 ±0.18 0,47 ±1.84 0.63
12 ±0.08 0,11 ±1.52 0.66
13 ± 0,05 0,08 ±2.17 0.71
14 ±0.7 0.22 ±0.29 5,71
15 0.32 ± 0,2 0.29 ±0.7
16 ±0.73 0.24 ±0.79 0.26

Tableau 1 : Résultats de DSC pour la localisation de l’étude effet TXL. Variation des températures de fusion thermiques (ΔTm) avec une erreur standard pour chacun des secteurs échantillonnés est tel que représenté dans la Figure 1 a. Chaque valeur est exprimé comme la différence dans Tm ascompared son contrôle apparié et correspond à une moyenne d’au moins 3 déterminations indépendantes.

SMG, mM Ondulation Ondulation-% t-test vs [0 mM SMG]
0 1.106 ± 0,044 100
40 1.067 ± 0,017 63 p < 0,02
400 1.059 ± 0,009 55 p < 0,003
Fibres linéaires 1.000 0
(Théorique)

Le tableau 2. Résultats de l’analyse de l’ondulation de fibre. Des images de la zone d’injection TXL SHG ont été analysés pour degré d’ondulation de fibre à l’aide de logiciels de neurone J. Fibres de dix ont été sélectionnés dans chaque image, et un total d’environ 100 fibres ont été analysés pour degré d’ondulation. Les valeurs moyennes et écart-type de la moyenne sont inclus.

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Discussion

Expériences ont montré des preuves à l’appui de l’utilisation de la microscopie de signal SHG comme une méthode d’évaluation de collagène réticulation des effets dans la sclérotique, évoquant la possibilité future d’utiliser cette technique comme un outil de suivi pour les traitements de réticulation qui cible les protéines de collagène. À noter, un instrument est déjà en usage clinique pouvant potentiellement capturer ce signal SHG. Bien que cet instrument a été conçu principalement pour l’imagerie derme de la peau, il a été utilisé avec succès pour image cornée et sclérotique23.

Il est nécessaire de maintenir identiques de numérisation et d’imagerie conditions lorsqu’on compare le contrôle et échantillons traités. Deuxième génération harmonique, microscopie de collagène dans les tissus de la sclère nécessite un microscope à fluorescence compatible avec l’imagerie multiphotonique, un infrarouge pulsée laser accordable dans les longueurs d’onde de 800-900 nm et un détecteur très sensible comme le GaAsP non-descanned des détecteurs (NDD). Lignes directrices décrites dans ce manuscrit sont un point de départ. Les conditions devraient être étudiées spécialement pour les nouvelles expériences ou pour les différents systèmes.

La cornée et la sclérotique également ont été évaluées simultanément dans les études utilisant cette technique24,25,26,27. Sachant que le signal de la SHG se propage dans les directions avance et arrière, plusieurs études ont examiné le tissu cornéen indépendamment dans son état natif28,29,30,31, 32,33,34 et dans le kératocône35,36 , ainsi que la suite CXL (tel que discuté ci-dessous). Les résultats de ces études indiquent que le signal de la cornée est optimisé dans l’épars vers le bas, ce qui est logique compte tenu de la transparence de la cornée et le fait que la lumière passe à travers le tissu de grève un moniteur dans les systèmes dispersés vers l’avant. En général, le signal de la SHG est dans le domaine du visible bleu et sera grandement réduit lors du passage à travers un tissu hautement diffusion comme la sclérotique de le œil. En conséquence, détection de la SHG épars avant nécessiterait une lame mince de tissu de 50 μm ou moins d’épaisseur, mais aussi un montage optique spécial. En revanche, le signal éparpillés à l’arrière peut être capturé par le chemin de lumière régulière d’un microscope à fluorescence sans découpe du tissu et par conséquent ce mode est préférable lorsque l’imagerie de collagène dans les tissus de la sclère intact jusqu'à une profondeur de 30-40 μm. Dans cette étude, nous avons noté une augmentation dépendant de la concentration en densité de signal. Il est tout à fait possible, cependant, que le TXL aurait pu avoir des effets complémentaires et similaires sur des couches plus profondes de la sclérotique, et que l’effet pourrait être plus prononcé et s’étendre aux couches les plus profondes en particulier avec la plus forte concentration. Toutefois, en raison de la SHG signal pénétration limitée dans la sclérotique et aux fins de cette première étude, nous avons choisi de travailler avec les meilleures images de qualité, qui proviennent de la sclère plus superficielle (15 µm de profondeur). À l’avenir des études, nous considérerons profondeur effets reliés à la suite des méthodes TXL que cela pourrait fournir des informations importantes quant à pourquoi même des plus grandes différences n’était pas observés entre 40 et 400 échantillons mM traités.

Par ailleurs, concernant l’utilisation de SHG pour évaluer la riboflavine CXL induite par réticulation de tissu, riboflavine suivant d’imagerie de la microscopie SHG CXL de la cornée ont été rapportés par plusieurs groupes37,38,39 , 40 , 41. dans une étude réalisée par Steven et al. 37, stabilisation cornée en utilisant la technique CXL a entraîné une '' homogénéisation '' du signal et la perte de tissu '' plis '' ou '' ondulations '' observée dans des échantillons non réticulé. Ces types de changements, cependant, également ont été constatés dans une étude visant à évaluer les effets des changements dans l’IOP sur la cornée SHG signaux, ce qui soulève la possibilité d’artefacts techniques. Sur le plan organisationnel de la fibrille ainsi que le plus élevé ordre fibre bundle/lamellaire organisation point de vue, la sclérotique et la cornée sont très différentes et on sait sur ces différences d’études au microscope électronique. Les deux tissus diffèrent en ce qui concerne les fibrilles d’emballage, qui comprend la distribution des diamètres fibrille (petites fibrilles uniformes pour les fibrilles de diamètre variable et de la cornée pour la sclère) et inter-fibrilles espacement (uniforme pour la cornée et variable pour la sclère). Ainsi, l’organisation d’ordre supérieure en feuilles lamellaires (cornée) par rapport à des faisceaux de fibres (sclérotique) est tout à fait différente. Ces différences structurelles sont consignées dans les signaux SHG produites par ces deux tissus. Ainsi, les changements induits par la réticulation peuvent modifier le signal de la SHG de manières différentes, mais parallèle. En d’autres termes, le '' redressement '' des fibres dans la sclérotique observée dans cette étude et la '' homogénéisation '' du signal dans la cornée rapportée dans la littérature, ont été les deux le résultat du collagène modification de réticulation. Ainsi, l’effet de '' homogénéisation '' dans la cornée pourrait en quelque sorte être analogue à l’effet de '' redressement '' de la sclérotique qui a été rapportée ici.

Les mécanismes qui permettent cet effet lissante produit par TXL ne sont pas claires basées sur l’étude en cours. Une possibilité pourrait être que le tissu a été en quelque sorte '' fixé '' en position mécaniquement '' chargée ''. Cela appuierait l’idée selon laquelle induit '' stabilisation des fibrilles et fibre '' avait eu lieu. Changements dans la pression intraoculaire susceptible n’a pas contribué à cet effet puisque IOP a été contrôlé avant et après l’injection de sT et est resté stable. Dans l’ensemble, la signification de ces observations ne sont pas claires et d’autres études seront nécessaires. À noter, séparée d’imagerie techniques telles que la microscopie de Brillouin42, qui a été démontré pour fournir des mesures quantitatives de réticulation (tel que déterminé par le module de cisaillement) suite de photochimie CXL peut être utile pour confirmer les conclusions des SHG imagerie dans cette étude. Toutefois, il est à noter que son utilisation avec très des tissus de diffusion comme la sclère43, nécessite des modifications techniques et n’a pas été validé avec tissu scléral réticulé.

Polarisation au laser et la microscopie SHG est une question importante. La lumière laser est polarisée linéairement et orienté perpendiculairement à la direction de propagation du signal SHG et à un certain angle dans le plan xy à chaque fibre de collagène. Ainsi, les fibres dans le plan xy qui sont bien alignés et exactement perpendiculaire à la lumière de laser polarisé produira un signal SHG plus élevé que les autres angles, y compris ceux qui est parallèle à la lumière incidente (c.-à-d., z-plane), qui produira le signal SHG plus bas (en raison de l’interférence destructive). En ce qui concerne le tissu sclérotique, collagène fibres sont orientés à des angles différents sur une échelle microscopique, bien que les orientations privilégiées fibre anatomique sont connues pour exister basé sur endroit du globe. Ainsi, étant donné que le signal SHG produit varient selon l’angle du plan xy de chaque fibre, le signal global sera inférieure à celle qui serait produite si toutes les fibres de collagène correspondaient exactement au même angle (dans un tissu comme un tendon par exemple). Ainsi, dans cette étude, en raison de la nature de l’échantillon étant imagé, la direction de polarisation n’a pas été déterminée intentionnellement mais resta cohérente tout au long de l’étude. En outre, nous avons pris soin d’obtenir des tissus de traités et témoins des globes d’identiques régions sclérales, minimisant les différences dans l’orientation des fibres entre les échantillons. Enfin, nous avons analysé plus de 100 images par échantillon afin d’obtenir les valeurs d’intensité. Cette évaluation approfondie doit avoir normalisé tous les signaux SHG aberrants qui peuvent avoir été enregistrées. Cela étant dit, il est possible qu’à la suite du redressement « fibre » que nous avons observé dans les échantillons réticulés (décrits ci-dessus), une plus grande proportion de « au plan focal » fibres auraient pu contribuer à l’augmentation de la SHG signal ainsi que l’augmentation SHG les signaux d’une plus grande harmonisation du plan xy. Les deux de ces possibilités seraient des manifestations des effets induits de réticulation.

Une analyse régionale de réticulation (par Tm), les changements induits par une injection de sT de SMG a été réalisée. Comme prévu, le niveau de réticulation effet était concentré dans le domaine de l’injection. Peu ou pas d’effet réticulation a été noté dans la région, juste en face (plus loin), de l’injection, conforme à ce qui est connu au sujet de la localisation de l’effet après injection de sT comme indiqué par ultrasons localisation44, 45 et computed tomography46.

Enfin, au sujet de la thérapie de réticulation et la myopie, la réticulation de collagène de la cornée est de trouver utilisation généralisée dans le traitement de déstabilisation de la cornée dont le kératocône, post LASIK keratectasias, dégénérescence marginale pellucide (PMD) et comme un avenant aux chirurgies réfractives47. Le succès du traitement d’une maladie cornéenne avec réticulation a conduit à l’exploration de l’application de cette approche de traitement à l’arrière de le œil et, en particulier, la sclère, pour limiter l’élongation axiale à la myopie forte2, un concept qui remonte à la tout premiers stades des thérapeutiques réticulation concept48,49.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Les auteurs remercient Tongalp Tezel, MD, pour consultation publique concernant l’injection de sT ; Theresa Swayne, PhD, pour consultation au sujet de la SHG microscopie ; et Jimmy Duong de la conception et de ressources de biostatistique et de l’installation de base de biostatistiques de l’Institut d’Irving à Columbia University Medical Center.

Prise en charge en partie par la recherche pour prévenir la cécité et par les instituts nationaux de santé subventions RRRNC UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 et NEI R01EY020495 (DCP). Columbia University possède une propriété intellectuelle connexe : US délivré des brevets no : 8 466 203 et aucun : 9 125 856. En attente de brevet international : PCT/US2015/020276.

Des images ont été recueillies dans le Confocal et spécialisé de ressources partagées de microscopie de l’Herbert Irving Comprehensive Cancer Center à l’Université de Columbia, pris en charge par les NIH grant #P30 CA013696 (National Cancer Institute). La microscopie confocale a été achetée avec les NIH accorder #S10 RR025686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

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