Segunda generación armónica las señales en esclera de conejo como una herramienta para la evaluación del tejido terapéutico Cross-linking (TXL) para la miopía

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Summary

Este protocolo describe técnicas para la evaluación química del cross-linking de la esclera de conejo usando proyección de imagen de segunda harmónica y calorimetría diferencial.

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Zyablitskaya, M., Munteanu, E. L., Nagasaki, T., Paik, D. C. Second Harmonic Generation Signals in Rabbit Sclera As a Tool for Evaluation of Therapeutic Tissue Cross-linking (TXL) for Myopia. J. Vis. Exp. (131), e56385, doi:10.3791/56385 (2018).

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Abstract

Métodos para fortalecer el tejido mediante la introducción de enlaces químicos (cross-linking no enzimática) en proteínas estructurales (colágenos fibrilares) para la terapia incluyen tejido Cross-linking métodos (TXL) y fotoquímica del cross-linking. Tales métodos para inducir cambios de propiedad mecánica del tejido se están empleando a la córnea en enfermedades adelgazamiento corneal (mecánicamente debilitado) queratocono así como la esclerótica en la miopía progresiva, donde el adelgazamiento y debilitamiento de la parte posterior esclera ocurre y probablemente contribuye a la elongación axial. Las proteínas de la blanco principal para tal fortalecimiento de tejido son colágenos fibrilares que constituyen la gran mayoría de proteínas de peso seco de la córnea y la esclerótica. Fortuitamente, colágenos fibrilares son la fuente principal de segunda generación armónica señales en el espacio extracelular del tejido. Por lo tanto, modificaciones de las proteínas de colágeno, como las inducida a través de cross-linking terapias, potencialmente podrían ser detectados y cuantificados mediante el uso de la microscopia de segunda generación armónica (SHGM). Monitoreo SHGM señales mediante el uso de un láser escáner sistema de microscopía juntada con una excitación infrarrojo luz de fuente es un método de proyección de imagen moderna emocionante que goza de uso extenso en las ciencias biomédicas. Así, el actual estudio fue emprendido para evaluar el uso de la microscopia SHGM como un medio para medir efectos Cross-linking en vivo ex esclerótica de conejo, después de una inyección de un producto químico agente del cross-linking en el espacio de la sub-Tenon (sT), causados por un inyección de acercarse es práctica estándar para causar anestesia ocular durante procedimientos clínicos oftalmológicos. El químico agente del cross-linking, sodio hydroxymethylglycinate (SMG), es de una clase de conservantes cosméticos conocida como formaldehído liberando agentes (FARs). Cambios esclerales tras reacción con SMG resultaron en un aumento en las señales de la SHG y correlacionados con cambios en la temperatura de desnaturalización térmica, un método estándar para evaluar inducida tejido efectos del cross-linking.

Introduction

Miopía progresiva se postula para ser tratable a través de no-enzimáticos escleral del cross-linking (fotoquímico o química), que tiene sentido dado que el bloqueo de reticulación enzimática de colágeno puede aumentar la privación de forma experimental (FD)-inducida miopía de1. Venimos y Phillips2 recientemente discutida la viabilidad y el potencial de utilizar estándar irradiación ultravioleta-A (UVA)-riboflavina mediada fotoquímica del cross-linking (también conocido como el protocolo de Dresden), abreviado aquí como (riboflavina CXL) para la estabilización escleral posterior detener la elongación axial en miopía. Este método fotoquímico se ha utilizado con éxito para tratar la desestabilización de la superficie anterior del globo (es decir, la córnea abultada) vista en keratectasia queratocono y post-LASIK. Sin embargo, aplicación de este protocolo CXL de la esclera es obstaculizado por problemas relacionados con dificultades en el acceso a la esclera posterior con una fuente de luz ultravioleta (UV), así como la necesidad de modificar un mucho mayor superficie área de tejido. Que dicho, el enfoque CXL se ha utilizado para detener la elongación axial en forma visualmente priva conejos (tarsorrhaphy), aunque las regiones múltiples de la esclera posterior requieren varias zonas separadas de la irradiación en eso estudio3. Por el contrario, la inyección de un agente químico estabilizador (es decir, agente Cross-linking) vía el espacio sT podría representar una manera más simple de modificar la esclera posterior, evitando la necesidad de introducir una fuente de luz UV. Esta técnica de inyección es conocida como una forma útil de inducir anestesia ocular durante procedimientos oftalmológicos como cirugía de catarata4,5,6. WOLLENSAK7 ha descrito anteriormente el uso de una inyección de sT con gliceraldehído (un cross-linking agente químico similar en concepto al formaldehído liberando agentes (FARs) descritos en este estudio) rigidizar el conejo sclera y genipin ha ha demostrado que limitar la longitud axial en FD conejillos de Indias8,9. Estos investigadores han demostrado una clara ventaja de la utilización de un agente químico soluble sobre la fotoquímica técnica CXL. Por lo tanto, escleral del cross-linking utilizando un agente químico inyectable de algún tipo, incluyendo el FARs (es decir, TXL)10, podría proporcionar un método de tratamiento viable para detener la progresión de la elongación escleral en miopía.

En los protocolos aquí presentados, se usa una solución química de cross-linking de sodio hydroxymethylglycinate (SMG), entregada vía la inyección de sT a la esclera de los ojos de conejo cadavérico. Hemos implementado protocolos similares para reticulación química tópica de la córnea. En particular en los estudios previamente divulgados, Cross-linking efectos dependientes de la concentración podría obtenerse utilizando SMG, con un rango de efecto que abarca bien superior a la alcanzable con CXL fotoquímica según lo determinado por análisis de desnaturalización térmica11 .

Aquí se describen los protocolos para evaluar el efecto Cross-linking de SMG suministra a través de inyecciones de sT al tejido escleral, desnaturalización térmica utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC) y microscopía de segunda de generación armónica (SHGM).

Mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC), también conocido como análisis térmico, una transición de desnaturalización térmica se mide, que para el tejido escleral es predominantemente guiado por las propiedades de los colágenos fibrilares, ya que constituyen la mayoría a granel de la proteína. Este método evalúa la estabilidad de la estructura molecular del colágeno y los bonos reticulados que estabilizan las fibrillas de colágeno, la estructura principal proteína terciario. Durante el calentamiento en el DSC, se alcanza una temperatura crítica de transición que da lugar a la desnaturalización de la molécula de colágeno, dando como resultado el desenrollar de la triple hélice, un proceso que constituye lo que comúnmente se conoce como gelatina. Esta desnaturalización térmica interrumpe enlaces del hidrógeno a lo largo de la molécula de colágeno y puede ser cambiado de puesto a temperaturas más altas a través de métodos reticulación inducida12,13. Este método se ha utilizado durante muchas décadas, particularmente en la industria de biomateriales y de procesos que incluyen la fabricación de cuero. Sin embargo, este método requiere la extracción del tejido de la esclerótica y por lo tanto sólo puede ser útil como una técnica ex vivo .

Microscopia de la generación de segundo armónico (SHGM) se basa en las propiedades ópticas no lineales de materiales particulares, con entornos moleculares no centrosimétricas. En tales materiales, luz intensa, por ejemplo luz producida por el láser, genera señales de SHG, en el que la luz del incidente se dobla en frecuencia. Materiales biológicos que se conocen para crear señales SHG son colágeno, microtúbulos y miosina del músculo. Por ejemplo, colágeno excitada con una luz infrarroja de longitud de onda de 860 nm emite una señal de la SHG en la gama visible con longitud de onda de 430 nm. Segunda generación armónico (SHG) proyección de imagen de señales es un método prometedor para la evaluación de cross-linking del colágeno terapéutica. Ha sido conocido por más de 30 años que las fibrillas del colágeno en los tejidos emiten señales SHG14. Sin embargo, sólo recientemente imágenes de alta resolución se obtendría15 en una variedad de tejidos, incluyendo el tendón16, piel, cartílago17,18de los vasos sanguíneos y en los geles de colágeno19.

Basándose en este conocimiento, este estudio evalúa los cambios de señal SHG inducidos en la esclera a través de SMG químicamente inducida por Cross-linking del colágeno. Los resultados indican que la modificación de SMG de la esclera aumenta las señales SHG producidas a partir de haces de fibras de tejido colágeno (el más alto orden estructura cuaternaria formada por fibrillas de colágeno) y también produce un cambio morfológico estructural en el colágeno red de fibra, refleja en fibra paquete el "enderezando."

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Protocol

Todos los procedimientos se realizaron con ojos de conejo cadavérico en cabezas de conejo exogámica intacto. Se siguieron las guías todo institucional y nacional para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. preparación de soluciones

  1. Preparación de SMG para TXL:
    1. Preparar 1 mL de concentración de 0,2 M de bicarbonato de sodio (NaHCO3) solución usando 0,0165 g de NaHCO3 en polvo disuelto en 1 mL de agua destilada.
    2. 0,1016 mg de sodio en polvo hydroxymethylglycinate (SMG) se disuelven en 1 mL de agua destilada para obtener una concentración final de 800 m m SMG. Ajustar la solución de bicarbonato de sodio a una concentración final de 0,1 M NaHCO3 y 400 mM SMG. Concentraciones de SMG según el cross-linking efecto deseado. En el protocolo descrito aquí hemos utilizado 40, 100 y 400 mM SMG.

2. la inyección de subTenon para TXL con SMG

  1. Se llenan dos jeringas de insulina de 1 mL (agujas de 25G) 400 μL control y solución SMG, respectivamente.
  2. Coloque la cabeza del conejo en un plano de perfil con la ayuda de un cojín. Espuma de poliestireno o una pila de papel puede utilizarse para fijar la cabeza en una posición óptima.
  3. Retraer los párpados con un espéculo ocular pediátrica.
  4. Medir la inicial la presión intraocular (PIO) mediante un dispositivo de la tonometría de aplanación.
  5. Marque el sitio de inyección previsto en la parte media superior del limbus con un marcador de tejido.
  6. Retracción de la conjuntiva que rodea el sitio de inyección con un fórceps conjuntival (o cualquier pinza de punta redonda dentada) e inserte la aguja a través de la conjuntiva, entrar en la cápsula de Tenon un poco más allá el sitio limbal marcado (es decir, 2-3 mm desde el limbo). Una pequeña incisión en la conjuntiva también puede hacerse con tijeras de iris para facilitar el paso de la aguja a través de la cápsula de Tenon.
  7. Una vez dentro de la cápsula de Tenon, asegúrese de que la aguja es libremente móvil moviendo de lado a lado. Durante este tiempo, no debe mover el mundo. Esto confirma la colocación correcta de la aguja sobre la esclera del sub-Tenon (sT) espacio.
  8. Inyectar la solución de la jeringa y deseche la aguja. Inmediatamente después de la inyección, el líquido se acumulará en el espacio de sT creando un abultamiento anterior a través de la conjuntiva (es decir, quemosis).
  9. Repita la medición de la PIO con el fin de confirmar que no se cambió debido a una perforación inadvertida del globo.
  10. Retire el espéculo de la tapa y realizar masaje digital a través de los párpados cerrados durante unos 2-3 min.
  11. Deje la cabeza por un período de incubación de 3,5 h (temperatura ambiente = 18 ° C), antes de mover al siguiente paso.

3. tejido preparación

  1. Retraer los párpados utilizando el espéculo del párpado con el fin de optimizar el acceso al mundo. Seleccionar el espéculo óptimo tamaño según el tamaño del ojo.
  2. Separar la conjuntiva que rodea al limbo. Si ya ha sido incidida cerca del sitio de inyección, circunferencial expanda las fronteras por lo que tendría un tamaño de inóculo de aproximadamente 1 x 1 cm.
  3. Cortar los músculos extraoculares en sus sitios de inserción escleral.
  4. Elevar el globo ocular con pinzas, empujando desde la parte posterior. Esto proporciona acceso a globo posterior y facilita el corte del nervio óptico con la arteria oftálmica y la vena localizado cerca del polo posterior del globo.
  5. Corte el corneoscleral complejo, con borde exterior incluido el sitio de la inyección marcada. La mancha debe estar visible en la parte restante de la esclera.
  6. Retire el corpus vitreus y Unidas a la cara interna de la esclerótica mediante la aplicación de tracción con el fórceps de tejido todas las capas.
    Nota: Otras medidas dependen de los siguientes procedimientos se realiza: 4. - Análisis de DSC, 5 - microscopía SHG.

4. para el análisis Regional de DSC

  1. Para el ojo tratado: cortado cuatro sectores esclerales de la Copa escleral restantes con las tijeras para que el sitio de la inyección se encuentra en el sector superior y alineado centralmente. Corte los 3 restantes sectores laterales (por ejemplo, nasal y temporal), tanto de la parte inferior.
    Nota: la numeración de los sectores (1-4) que se dividen en cuadrados (1-16) se demuestra en la figura 1A.
  2. Cortar los sectores esclerales (1-4) en cuadrados más pequeños (1-16) de aproximadamente 4 x 4 mm. Sector 1 se debe dividir en 9 cuadrados (hacer el sitio exacto de la inyección de una individual Plaza [2]). Dividir sectores 2 y 3 en 2 cuadrados (plazas 10-11 y 12-13) y 4 en 3 cuadrados (los cuadrados 14-16).
  3. Asignar a un número a cada cuadrado, como se muestra en la figura 1A, con el fin de localizar la distancia de los tejidos analizados de la ubicación de la zona inyectada.
  4. Para el ojo de control: después de dividir el tejido en cuatro sectores esclerales (similares al tejido tratado) corta pedazos cuadrados de tejido de los siguientes lugares: 3 plazas del sector superior (sector 1), 1 de cada lado (sectores 2 y 3) y 1 de la sector inferior (sector 4).
  5. Raspar las capas restantes de la retinales y coroides y lavar dos veces con PBS fresco cada vez, dejando las piezas sumergidas en la solución por aproximadamente 10 s a la vez.

5. para la proyección de imagen de SHG

  1. Cortar la parte superior de la esclerótica con unas tijeras para crear un área de 1 x 1 cm con el sitio de inyección alineada centralmente.
  2. Raspar las capas restantes de la retinales y coroides y lavar dos veces con PBS fresco cada vez dejando las piezas en la solución por aproximadamente 10 s.
  3. Coloque el tejido en tubos de 1 mL con solución de PBS para su transporte a un centro de proyección de imagen. Todos los procedimientos, siguiendo el tiempo de incubación y comenzar con la disección del globo ocular se deben realizar dentro de una hora.

6. microscopia protocolo

Nota: Este protocolo para la proyección de imagen señal SHG back-esparcidas del colágeno del tejido de la esclerótica se adapta para el microscopio de escaneo láser.

  1. Configurar la microscopia
    1. Para maximizar la señal y resolución cuando realizar microscopía SHG utiliza una lente de objetivo optimizan para transmitir infrarrojos luz y con una alta apertura numérica (NA). Nuestro objetivo es Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 agua de inmersión.
    2. Ajuste el collar de corrección del objetivo para que coincida con la profundidad de la muestra, en este caso que es el espesor del cubreobjetos, 0,17 milímetros.
    3. Montaje de la lente del objetivo de 25 x y añadir una cantidad generosa de lubricante a base de agua gel para cubrir la superficie de proyección de imagen antes de montar la muestra. El gel a base de agua no se evaporará durante el experimento y por lo tanto, mantendrá la calidad de imagen.
    4. Coloque el tejido escleral de un tubo de 1 mL con PBS sin secar entre dos cubreobjetos redondo de 25 mm (lado episcleral abajo) ofrece máximo contacto la episclera y la superficie del cubreobjetos.
      Nota: El tejido puede también colocarse al descubierto sobre el cubreobjetos. Una buena cantidad de PBS debe mantener el tejido hidratado durante proyección de imagen. En este caso, añadir la pieza de tejido y el PBS después de montar el cellchamber.
    5. Montar la cámara del celular colocando un cubreobjetos redondo de 25 mm, sola o en una técnica de sándwich, en la parte inferior de la cámara y atornille la parte superior para crear un sellado alrededor de la cámara. No Atornille firmemente cuando se utiliza un cubreobjetos superior, con el fin de evitar aplanar artificialmente y dañar el tejido.
    6. Monte la cámara de la celda con la muestra de tejido en la platina del microscopio.
    7. Encender el microscopio para vista con luz transmitida.
    8. Posición de la etapa y ajustar la altura del objetivo que la parte inferior de la muestra está en foco, según lo determinado por la inspección de campo brillante a través del ocular.
    9. Apague todas las luces excepto la pantalla del ordenador y bloquear la mayor cantidad de luz del monitor como sea posible con hojas de papel de aluminio envueltos en la platina del microscopio. Minimizando cualquier luz alcanzando los detectores garantizará la adquisición de bajo nivel de ruido, como los detectores de GaAsP NDD tienen alta sensibilidad.
    10. En el panel de la plataforma Ti del software, compruebe que la definición de la lente es correcto.
    11. En el panel de interfaz gráfica de usuario compacto A1, elegir el láser IR para la proyección de imagen, seleccionar los detectores NDD y elija el canal DAPI que está equipado con un filtro de paso de banda de 400-450 nm.
    12. En el panel A1 MP GUI, defina la longitud de onda del láser infrarrojo a 860 nm y abrir el obturador.
    13. Sistema láser de barrido condiciones en el panel de interfaz gráfica de usuario compacto A1 como sigue. Seleccione: escáner un Galvano, exploración (b) unidireccional, (c) Pixel detención tiempo 6.2 μs, (d) marco tamaño 1.024 x 1.024 píxeles, (e) línea con un promedio de 2 x
      Nota: El escáner Galvano y exploración unidireccional garantiza una alineación exacta punto por punto. Un tamaño de 1.024 x 1.024 para todo el campo de visión se traduce en un tamaño de píxel de 0.5 μm /pixel. Línea promedio reducirá el ruido de disparo en la imagen.
    14. Conjunto de condiciones en el panel de interfaz gráfica de usuario compacto A1 por ajuste de la ganancia de corriente y detector de láser. Abra el panel de tabla de mirar (LUTs) que muestra un histograma de valores de intensidad de pixel en la imagen actual. Encienda en proyección de imagen en modo de "Encontrar" y maximizar detectado entre los valores de píxeles de ajuste de la ganancia de corriente y detector de láser. Evitar la saturación. Los valores típicos son 2.5% energía del laser, de un total de 2.35 W a 860 nm y 100 HV (ganancia del detector).
    15. Nota: Para esta configuración, la potencia del láser miden con un medidor de potencia interna es 5.2 mW. Cada vez que se realiza un experimento, vuelva a ajustar el porcentaje de láser que la medición de la energía interna es constante en 5.2 mW entre sesiones de proyección de imagen. Debe tener cuidado al ajustar potencia de laser. El láser de camaleón II es un láser de W 3 a 800 nm y un 10% o mayor potencia potencialmente podría inducir daño tisular.
  2. Adquisición de imágenes
    1. En modo de vista previa, explore el área de tejido utilizando la herramienta de Resumen de XYZ.
    2. Establecer la proyección de imagen en baja resolución (256 x 256 píxeles y no con un promedio de línea) para acelerar la adquisición de imágenes en este modo.
    3. Captura de 5 x 5, 3 x 3 o solo campos de vista para cubrir toda la superficie del tejido. En cada lugar, antes de la captura del Resumen, activar el modo "Scan" vivo y traer el tejido en el foco. Tenga en cuenta que diferentes regiones del tejido tendrá posiciones ligeramente diferentes en la dirección axial.
    4. Encontrar un área plana donde las fibras de colágeno se observan en el campo de visión entero y haga doble clic en esa posición de la herramienta de resumen para mover el escenario a ese lugar en particular.
    5. Active el modo "Scan" vivo, ajustar la posición de Z del objetivo tal que el plano de la parte inferior está en foco y en la plataforma de Ti, utilizar la unidad Z para mover el plano óptico 10-15 μm sobre esta capa de fondo.
    6. Adquirir una imagen en alta resolución 1.024 x 1.024 píxeles y 2 x promedio, utilizando el botón "Capturar".
    7. Guardar la ubicación en la descripción de XYZ usando el botón «+». Esto asegura que la misma área de tejido no es recuperada.
    8. Para cada pieza de tejido captura 10 imágenes de superposición no campos de vista.

7. DSC protocolo

Nota: Proceder a este paso tan pronto como esté completa, para regional análisis de DSC, o después de la proyección de imagen de tejido cuando SHGM se realiza preparación de tejido.

  1. Preparar moldes para DSC, pesado y etiquetado.
    Nota: Este paso debe realizarse antes de la disección del tejido con el fin de minimizar la desecación del tejido.
  2. Seque cada cuadrado escleral con un tejido absorbente y colóquela plana en el fondo de una olla de DSC con unas pinzas dentadas.
  3. Pesar el recipiente con el tejido en el interior y la tapa doblada y cubierta obtener el tejido mojado peso (masa de las muestras debe estar en el rango de 5 a 11 mg).
    Nota: El sello de cada pan utilizando al prensado antes de proceder a la siguiente muestra de tejido. Las cacerolas están selladas herméticamente, evitando pérdidas de agua antes de análisis térmico.
  4. Una vez que la muestra quede aplastada, colóquelo en su lugar designado en la bandeja de DSC. Debe haber 6 muestras para el control y 16 para el ojo tratado.
  5. Crean un método utilizando el instrumento de gestión de software, especificar el peso del tejido, y el análisis térmico usando los siguientes parámetros: rango de temperatura de 40 a 80 ° C, velocidad de calentamiento: 1 ° C/min, flujo de calor: 17,37 mW, caudal de Gas (N2): 19,8 mL/min, Presión de gas: 2,2 bar.
  6. Una vez finalizado, analizar los datos para cada muestra extrayendo el pico de temperatura de transición a que desnaturalización térmica se produce mediante el instrumento de gestión de software.

8. Análisis de la imagen

  1. Señal SHG
    1. Seleccione al menos 5-10 de las imágenes más representativas de cada tratamiento y su control, tal que el área de la imagen está ocupado por fibras de colágeno principalmente.
    2. Cargar cada imagen en el software ImageJ y medir la intensidad del pixel media seleccionando Analyze > medida de la imagen activa.
    3. Los valores extraídos son reportados como la intensidad del pixel media y puede también ser demostrados por trazar el histograma de intensidades seleccionando en el menú Analyze > histograma.
    4. Utilizando una hoja de Excel, crear una tabla para documentar todos los datos medidos por consiguiente a la identificación de la muestra.
    5. Calcular la media y desviación estándar de intensidad de píxeles para cada condición de tratamiento y control.
    6. Uso del estudiante t-test, comparar diferencias para todas las comparaciones pares de concentraciones (es decir, 40 mM SMG vs 0 y 400 mM SMG vs 0). [P≤0. 05].
  2. Ondulación
    1. Seleccione una imagen que muestra las fibras de colágeno. Al menos 10 imágenes por muestra debe analizarse (incluyendo una muestra control para cada concentración - por lo menos 40 en total).
    2. Abierto ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ requiere la instalación previa.
    3. Subir todas imagesby arrastrando en una ventana NeuronJ abierta.
    4. Crear líneas de rastreo a lo largo de las fibras, siguiendo el contorno de la fibrilla con el ratón (podría utilizarse un pen tabletas de dibujo), haga clic en M para medir la distancia de longitud de la fibra total.
    5. Seleccione "Opción" para trazar una línea recta tangencial y conectar el principio y el fin del contorno fibra previamente trazadas. Ahora haga clic en M para medir la longitud de extremo a extremo.
    6. Repita el mismo procedimiento en al menos 10 fibrillas por imagen.
    7. Recoger esas dos mediciones de cada una de las fibrillas de 10 y entrada de los datos en una hoja de cálculo excel, expresando la longitud de la fibra total (contorno) y longitud de extremo a extremo (línea que conecta directamente) como longitud [curva] y longitud [lineal], respectivamente.
    8. Calcular el índice de ondulación (W) utilizando la fórmula: W = longitud [curva] / longitud [lineal].
    9. Calcular el % de ondulación comparación de los datos de las imágenes de samples(SMG) tratada con las imágenes de muestras de control utilizando la fórmula: (W [SMG] - 1) / (W [control] - 1)
    10. Realizar una prueba de t de pares para el índice de ondulación (W) para determinar diferencias estadísticas (valores de p) de la morfología de la fibra de colágeno entre las condiciones diferentes de tratamiento y control.

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Representative Results

Temperatura de desnaturalización térmica (Tm) como un método de ensayo para evaluar el efecto del cross-linking TXL: En estos experimentos se utilizaron un total de 16 pares de ojos de conejo para el procedimiento TXL. Como parte inicial de este estudio, se evaluó la localización del cross-linking efecto inducido por una sola inyección de agente reticulante SMG por sT espacio en la cabeza del conejo cadavérico. Este tipo de experimento tiene relevancia para el tratamiento clínico de los pacientes, puesto que las inyecciones en más de una ubicación podrían ser necesarias para estabilizar un área deseada de la esclera.

Como se puede predecir basado en los principios básicos de difusividad, el efecto fue mayor en el sitio de inyección con efectos inducidos en las regiones adyacentes, dependiendo de la concentración de las soluciones. Figura 1A representa la ubicación esquemática de sectores esclerales (1-4 en la fuente número hueco rojo) (dividida en cuadrados (1-16 de fuente número fino negro)) que experimentó el análisis separado de desnaturalización térmica después de una inyección única sT con Índice de asignación de color. La tabla 1 muestra el cambio en los valores de Tm para cada sector numerado en comparación con su control correspondiente. Valores se incluyen las inyecciones de 40 mM y 400 mM e incluyen error estándar de la media calculada durante un mínimo de tres determinaciones independientes.

Figuras 1B-C representar los resultados mediante dos diferentes concentraciones de SMG, 40 mM (figura 1B) y 400 mM (figura 1). En la figura 1B, la menor muestra de 40 mM de concentración mostró un leve cambio en Tm que observó en la Plaza 2 (el sitio de la inyección). Cambios similares fueron vistos en casillas adyacentes 1 y 3 (azul más claro). Cambios marginales se ven en cuadrados de 4 a 6 y 7 a 9 sin diferencias estadísticamente significativas de la Plaza de inyectado. No hay cambio de Tm fue visto en las plazas menores 14 a 16, que representa el sector más lejano lejos del sitio de la inyección.

Como se muestra en la figura 1, la concentración más alta (400 mM) tuvo un efecto Cross-linking estadísticamente muy significativo (indicado como tonos anaranjados). Se observaron un cambio grande en la Tm con desviación típica pequeña asociada y p < 0.05, lo que refleja una gran diferencia en el efecto de lo 400 mM en comparación con menor concentración de 40 mM. Los efectos más dramáticos se observaron en el sector 1 en el mundo superior. Con respecto a los restantes sectores, se observó un efecto menor en cuadrados de 10 y 14 (que pudo haber sido debido a algún seguimiento del cross-linking líquido posteriormente) y ningún efecto fue observado en los cuadros 11, 12, 13, 15 y 16. En general, los efectos Cross-linking fueron marginales en los sectores 2 y 3 sin efecto observado en el sector 4 (es decir, el lugar más distante desde el sitio de inyección), similar a la muestra de 40 mM. Estos resultados indicaron que había una '' zona de efecto '' y que este tipo de patrón podría esperarse después de una inyección de sT de agente del cross-linking. Esto podría indicar la necesidad de inyección en varios lugares para inducir efectos sobre un área amplia de tejido.

También se realizó el estudio de los efectos Cross-linking en ojos intactos evaluando TXL con dos concentraciones de SMG. Se realizó análisis de desnaturalización térmica del tejido que experimentó tal escleral del cross-linking. Cross-linking tiempo era 3,5 h de TXL con tres diferentes concentraciones, 40 (Tm = 1.11 +/-1.2), 100 (Tm = 5.12 +-2,9) y 400 (Tm = 14.34 +/-1.1) mM SMG. Los resultados mostraron que existe un efecto dependiente de la concentración en tejido reticulado SMG.

Segunda harmónica (SHG) imágenes como un método para evaluar el efecto del cross-linking TXL:

Microscopia SHG imágenes fueron analizados tanto por la intensidad del pixel de la ondulación de paquete de señal y fibra SHG. Un palmo ancho de la reticulación de las concentraciones (de 40 a 400 mM) se utilizó para explorar los cambios de señal SHG que pueden ocurrir en una amplia gama de efectos del cross-linking. Utilizando la capacidad de análisis de histograma incluida en el programa20de procesamiento de imágenes de Fiji, fue posible cuantificar la señal SHG producida en el tejido escleral por inyección sT, comparando los efectos de 40 mM a ésos inducidos usando 400 mM. La diferencia promedio en pixel media intesities en 40 mM fueron 66.3 ± 27,7 frente a 361.4 ± 28.3 para las muestras de 400 mM, un aumento de casi 6-fold. Esto corresponde con un aumento en tejido Cross-linking, puesto que los aumentos correspondientes en la Tm también fueron observados en estas condiciones. La figura 2 muestra imágenes representativas del SHG de esclera tomada de control (figura 2A), 40 mM (figura 2B) y 400 mM (figura 2). También se muestran el análisis del histograma que lo acompaña, incluyendo brillo promedio (o intensidad de píxeles). El número total de imágenes analizados fue: 120 de 40 mM y 98 para su control; 121 de 400 mM y 94 para su propio control. La profundidad de la proyección de imagen de tejidos fue de 10 a 15 μm de la superficie de episcleral. Los resultados de los análisis de histograma, que el promedio de numerosos campos de la imagen, indican que altas concentraciones de cross-linking efecto (figura 3) produjeron intensidades de píxeles mayor.

Como se muestra en la figura 4, un análisis de la imagen también se realizó con los métodos adoptados en la literatura cardiovascular vasos sanguíneos, usando el plugin de ImageJ ''Neurona J''21. Se estimó el factor de ondulación W = longitud [curva] / longitud [lineal] y observado que Cross-linking resultó en alisado de paquetes de la fibra como se indica en un % menor ondulación en esclera reticulado 40 mM y 400 mM versus esclerótica de control no tratados (W % = ([W SMG]-1)/(W[control]-1), tabla 2). La diferencia de ondulación entre 40 y 400 mM SMG tratada muestras no fue estadísticamente significativa.

Figure 1
Figura 1 : Localización del efecto TXL vía sT inyección usar 40 y 400 mM SMG.
(A)
representación esquemática de 4 sectores esclerales (números 1-4 en letra hueca roja grande), con esclera dividida en cuadrados [números 1-16 en fuente fina negro más pequeño] (no dibujadas a escala) que experimentaron el análisis térmico. El sitio de inyección correspondió a la céntrica plaza (2) en el sector 1. La desnaturalización térmica, efecto de TXL con (1B) 40 mM SMG y (1 C) 400 mM SMG del cross-linking. (D) cifrados Color de leyenda de escala de temperatura (B) y (C). Esta figura ha sido modificada de Zyablitskaya et al. , con permiso de22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Imágenes representativas de aumentos dependiente de la concentración de SHG niveles de brillo producidos tras TXL con SMG vía inyección de sT de esclera de señales ex vivo . Concentraciones de SMG se muestran como (B) 40 mM y (C) 400 mM. Cada imagen contiene un 50 μm escala bar (esquina derecha inferior) y valor de la intensidad del pixel media (esquina superior derecha) - valores absolutos. Esta figura ha sido modificada de Zyablitskaya et al. , con permiso de22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Gráfico de barras del cambio (Δ) en la intensidad de píxel de la señal SHG (en comparación con un control de pares de la misma cabeza de conejo) en globos intactas esclerales reticulado vía inyección de sT (TXL) con 40 400 mM SMG soluciones. Valores promedio con error estándar de la media fueron: 66 ± 27,7 de 40 mM y 361 ± 28.3 para 400 mM. Esta figura ha sido modificada de Zyablitskaya et al. , con permiso de22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Ejemplo de análisis de ondulación de fibras (según lo expresado por linearidades). Imagen de muestra de control para la concentración de SMG de 40 mM con una escala de 50 μm de la barra (esquina inferior derecha). Esta figura ha sido modificada de Zyablitskaya et al. con permiso de22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Representación esquemática de la inyección de sT. Las áreas numeradas 1-3 corresponden a áreas en la figura 1A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

±Δ Tm
zona 40mM 400mM
1 3.4 ±2.8 20.5 ±0.6
2 3.4 ±0.53 19.58 ±1. 5
3 ±2.47 2.5 ±3.06 17.99
4 ±0.9 0,72 ±0.19 20.36
5 ±0.55 0.85 ±1.33 19.11
6 ±1.35 0.52 ±4.1 18.66
7 0,78 1,6 ±2.8 18.44
8 ±0.9 0.56 ±2.69 17.77
9 ±0.6 0.22 ±2.6 18.92
10 ±0 0.46 ±10.56 8,75
11 ±0.18 0.47 ±1.84 0.63
12 0.11 ±0. 08 ±1.52 0.66
13 ±0.05 0.08 ±2.17 0.71
14 ±0.7 0.22 ±0.29 5.71
15 0,32 ±0. 2 ±0.7 0.29
16 ±0.73 0.24 ±0.79 0.26

Tabla 1: Resultados de DSC para la localización del estudio de efecto TXL. Cambio en la temperatura de fusión térmica (ΔTm) con errores estándar para cada sector muestreado es como se muestra en la figura 1A. Cada valor se expresa como la diferencia en Tm obras al control de pares y un promedio de un mínimo de 3 determinaciones independientes.

SMG, mM Ondulación Ondulación-% test de la t vs [0 mM SMG]
0 1.106 ± 0.044 100
40 1.067 ± 0.017 63 p < 0.02
400 1.059 ± 0.009 55 p < 0.003
Fibras lineales 1.000 0
(Teórico)

Tabla 2. Resultados del análisis de ondulación de fibra. Se analizaron imágenes SHG desde el área de inyección TXL grado de ondulación de fibra utilizando el software de la neurona J. Se seleccionaron diez fibras de cada imagen y grado de ondulación se analizaron un total de aproximadamente 100 fibras. Valores promedio con error estándar de la media están incluidos.

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Discussion

Experimentos realizados han mostrado evidencia apoya el uso de la microscopia de señal SHG como método para la evaluación de efectos en esclera, levantando la posibilidad futura de usar esta técnica como una herramienta de monitoreo para tratamientos del cross-linking del cross-linking de colágeno apuntan las proteínas de colágeno. De nota, un instrumento ya está en uso clínico que potencialmente puede captar esta señal SHG. Aunque este instrumento fue diseñado principalmente para la proyección de imagen dermis humana de la piel, se ha utilizado con éxito para imagen y esclera23.

Es necesario mantener idéntico análisis y condiciones de la proyección de imagen cuando se compara el control y tratamiento de muestras. Segunda generación armónica microscopia del colágeno en el tejido de la esclerótica requiere un microscopio de fluorescencia compatible con la proyección de imagen multi-photon, una infrarroja pulsada láser sintonizable en el rango de longitud de onda de 800-900 nm y un detector de alta sensibilidad como el GaAsP no descanned los detectores (DDN). Las directrices descritas en este manuscrito son un punto de partida. Las condiciones se deben determinar específicamente para los experimentos nuevos o para los distintos sistemas.

La córnea y la esclera también han sido evaluados simultáneamente en estudios utilizando esta técnica24,25,26,27. Sabiendo que la señal SHG se propaga en direcciones hacia adelantadas y hacia atrás, varios estudios han examinado el tejido corneal independientemente de su estado natal28,29,30,31, 32,33,34 queratocono35,36 y después de CXL (como se explica a continuación). Los resultados de estos estudios indican que la señal de la córnea está optimizada en la dirección dispersa hacia adelante, que tiene sentido dado la transparencia de la córnea y el hecho de que la luz pasa a través del tejido a un monitor de la huelga en adelantados sistemas dispersos. Típicamente, la señal de la SHG es en la gama visible azul y se reducirán considerablemente al pasar a través de un tejido altamente dispersión como la esclerótica del ojo. Como resultado, detección de la SHG disperso adelante requeriría una sección delgada de tejido de 50 μm o menos en grosor, así como un sistema óptico especial. Por el contrario, la señal back-esparcidas puede captarse a través de la trayectoria de la luz regular de un microscopio de fluorescencia sin seccionamiento de tejidos y por lo tanto, este modo es preferido al colágeno en el tejido de la esclerótica intacta a una profundidad de 30-40 μm de la proyección de imagen. En este estudio, observó un aumento dependiente de la concentración en densidad de señal. Sin embargo, es muy posible, que el TXL podría haber tenido efectos adicionales y similares en capas más profundas de la esclerótica, y que el efecto podría ser más pronunciado y se extiende a capas más profundas, particularmente con la concentración más alta. Sin embargo, debido a la limitada SHG señal penetración en la esclera y los fines de este estudio inicial, decidió trabajar con las mejores imágenes de calidad, obtenidos de la esclera más superficial (profundidad de 15 μm). En el futuro estudios, consideraremos profundidad dependiente los efectos métodos TXL como este puede proporcionar información adicional importante en cuanto a por qué incluso mayores diferencias no fueron observados entre 40 y 400 mM tratadas muestras.

Además, con respecto al uso de SHG para evaluar riboflavina CXL inducida tejido Cross-linking, riboflavina siguiente de la proyección de imagen del SHG microscopio CXL de la córnea han sido reportados por varios grupos37,38,39 , 40 , 41. en un estudio realizado por Steven et al. 37, estabilización corneal mediante la técnica CXL dio lugar a una '' homogeneización '' de la señal y pérdida de tejido '' pliegues '' o '' ondulaciones '' en muestras no-cruz-ligado. Estos tipos de cambios, sin embargo, también se observaron en un estudio de evaluación de los efectos de los cambios en la PIO en córneas señales SHG, levantando la posibilidad de artefactos técnicos. Organizativo de la fibrilla, así como el más alto orden fibra paquete/laminar organización punto de vista, la esclerótica y la córnea son bastante diferentes y se sabe mucho acerca de esas diferencias de los estudios de microscopia electrónica. Los dos tejidos difieren con respecto a la fibrilla de embalaje, que incluye distribución de diámetro fibrilar (fibras uniforme pequeño para las fibrillas de diámetro variable y córnea de la esclerótica) y la fibrilla espaciamiento (uniforme para variable de esclera y córnea). Así, la organización de orden superior en hojas laminares (córnea) versus paquetes de la fibra (esclerótica) es bastante diferente. Estas diferencias estructurales se reflejan en las señales SHG producidas por estos dos tejidos. Por lo tanto, cambios inducidos por Cross-linking pueden alterar la señal de la SHG en formas distintas pero paralelas. En otras palabras, el '' enderezar '' de fibras en la esclera observados en este estudio y la '' homogeneización '' de la señal en la córnea divulgada en la literatura, fueron tanto el resultado de la modificación del cross-linking del colágeno. Así, el efecto de '' homogeneización '' en la córnea podría de alguna manera ser análogo al efecto '' enderezar '' de la esclera que se ha divulgado aquí.

Los mecanismos que resultan en este efecto alisado TXL son claro basado en el estudio actual. Una posibilidad podría ser que el tejido era de alguna manera '' fijo '' en una posición mecánicamente '' cargada ''. Esto apoyaría la idea de que había ocurrido '' fibrilla y fibra de estabilización ''. Cambios en la presión intraocular probable no contribuyó a este efecto ya que IOP fue monitoreado antes y después de la inyección de sT y se mantuvo estable. En general, la importancia de estas observaciones no son claros y otros estudios serán necesarios. De nota, distintas técnicas como la microscopía de Brillouin42, la proyección de imagen que se ha demostrado para proporcionar medidas cuantitativas de la reticulación (según lo determinado por el módulo del esquileo) tras fotoquímica CXL pueden ser útil para confirmar los resultados con la SHG proyección de imagen en este estudio. Sin embargo, cabe señalar que su uso con gran dispersión tejidos como la esclera43, requiere de modificaciones técnicas y no ha sido validado con reticulado tejido escleral.

Polarización del laser y microscopia SHG es un tema importante. La luz láser es polarizada linealmente y orientado perpendicularmente a la dirección de propagación de las señales SHG y en un ángulo en el plano xy para cada fibra de colágeno. Así, las fibras en el plano xy exactamente perpendicular a la luz láser polarizada y bien alineada producirá una señal SHG más alta que los de otros ángulos, los incluidos paralelos a la luz del incidente (es decir, z-plane), que producirá la menor señal SHG (debido a interferencia destructiva). Con respecto al tejido de la esclerótica, colágeno fibras están orientadas en ángulos diferentes a nivel microscópico, aunque orientaciones de fibra anatómica preferida se saben para existir basado en ubicación de mundo. Así, ya que la señal SHG producida variará dependiendo del ángulo del plano xy de cada fibra, la señal global será menor que la que se produciría si todas las fibras de colágeno se alinearan exactamente con el mismo ángulo (en un tejido como un tendón por ejemplo). Así, en este estudio, debido a la naturaleza de la muestra se va a examinar, la dirección de polarización intencionalmente no fue determinada pero se mantuvo constante durante todo el estudio. Además, tomó cuidado para obtener tejidos de tratados y globos de idénticas regiones esclerales, minimizando las diferencias en la orientación de la fibra entre las muestras de control. Por último, se analizaron más de 100 imágenes por muestra para obtener valores de intensidad. Esta extensa evaluación debe han normalizado las señales SHG aberrantes que se han registrado. Dicho esto, es posible que como resultado de la "fibra endereza" que observamos en las muestras reticuladas (descritas anteriormente), una mayor proporción de «en plano focal"fibras podrían haber contribuido al aumento de la SHG señal así como la creciente SHG señales de una mayor alineación de xy-plano. Ambas de estas posibilidades sería manifestaciones de inducido efectos Cross-linking.

Se realizó un análisis regional de la reticulación cambios (por Tm) inducida por una inyección de sT de SMG. Como era de esperar, el nivel de efecto del cross-linking se concentró en el área de la inyección. Poco o ningún efecto Cross-linking se observó en la región justo enfrente (más lejos) de la inyección, consistente con lo que se conoce con respecto a la localización del efecto después de la inyección de sT como se muestra por ultrasonido localización44, 45 y computada tomografía46.

Finalmente, en cuanto tratamiento Cross-linking y miopía, colágeno Cross-linking de la córnea es encontrar amplio uso en el tratamiento de desestabilización corneal como el queratocono, post LASIK keratectasias, degeneración marginal pelúcida (PMD) y como un complemento de procedimientos quirúrgicos refractivos47. El éxito del tratamiento de la enfermedad de la córnea con cross-linking ha llevado a la exploración de la aplicación de este enfoque de tratamiento en la parte posterior del ojo y, en particular, la esclerótica, para limitar la elongación axial en alta miopía2, un concepto que se remonta a la etapas muy tempranas el concepto Cross-linking terapéuticas48,49.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Los autores agradecen Tongalp Tezel, MD, de consulta con respecto a la inyección del sT; Theresa Swayne, PhD, para consulta sobre microscopía de SHG; y Jimmy Duong de diseño y recursos de Bioestadística y el centro de Bioestadística base del Irving Institute en Columbia University Medical Center.

Apoyado en parte por la investigación para prevenir la ceguera y por institutos nacionales de salud subvenciones NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 y NEI R01EY020495 (DCP). La Universidad de Columbia es propietaria de propiedad intelectual relacionados con: U.S. emitido patentes Nº: 8.466.203 y no: 9.125.856. Pendiente de patente internacional: PCT/US2015/020276.

Imágenes recogidas en el Confocal y especializados microscopía compartido recursos del centro Herbert Irving integral cáncer en la Universidad de Columbia, apoyado por los NIH grant #P30 CA013696 (Instituto Nacional del cáncer). El microscopio confocal fue comprado con NIH grant #S10 RR025686.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120V EMD Millipore, Massachusetts, USA Double distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate  Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USA Crosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringe BD Eclipse, NJ, USA Syringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit head La Granja poultry Outbred Rabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen  Reichter Technologies Depew, NY IOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 Autosampler Perkin-Elmer Waltham, MA, USA Thermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software  Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA Ver 11.0  protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MP Nikon Instruments, Melville, NY, USA A water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal  Alcon, Fort Worth, TX  B000URVDQ8 Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II  Coherent, Santa Clara,CA, USA Ti:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamber Thermo Fisher Scientific Inc A7816 Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5 Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USA GG-25-1.5 protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-E Nikon Instruments, Melville, NY, USA protocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detector Nikon Instruments, Melville, NY, USA Equipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning system Nikon Instruments, Melville, NY, USA Compatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements software Nikon Instruments, Melville, NY, USA Ver 4.3 refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJ National Institute of Health  protocol step 9.1.2
NeuronJ Eric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlands https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel  Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA Ver 14 protocol step 9.2.8

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