Author Produced

امتصاص السوائل الآنف والشعب الهوائية: دقة أخذ العينات البشرية الغشاء المخاطي للجهاز التنفسي وتجهيز مختبر عينات

Medicine
 

Summary

ويصف هذه المخطوطة استخدام تقنيات الاستيعاب الآنف والشعب الهوائية، وعلى وجه التحديد باستخدام مصفوفات الاستيعابية الاصطناعية (SAM) لأخذ عينات السوائل البطانة المخاطية (بروميد الميثيل) من مجرى الهواء العلوي والسفلي. هذه الأساليب توفير أفضل المواصفات وقابلية التحمل من تقنيات أخذ العينات التنفسية الموجودة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Thwaites, R. S., Jarvis, H. C., Singh, N., Jha, A., Pritchard, A., Fan, H., Tunstall, T., Nanan, J., Nadel, S., Kon, O. M., Openshaw, P. J., Hansel, T. T. Absorption of Nasal and Bronchial Fluids: Precision Sampling of the Human Respiratory Mucosa and Laboratory Processing of Samples. J. Vis. Exp. (131), e56413, doi:10.3791/56413 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أساليب الاستيعاب الآنف (غ) وامتصاص الشعب الهوائية (BA) استخدام مصفوفات الاستيعابية الاصطناعية (SAM) لامتصاص السوائل البطانة المخاطية (الصندوق متعدد الأطراف) الجهاز التنفسي البشرية. نا هو أسلوب غير الغازية التي تمتص السوائل من أدنى توربيناتي، ويسبب عدم الراحة الحد الأدنى. نا قد أثمر نتائج استنساخه مع القدرة شكل متكرر تكرار أخذ العينات من مجرى الهواء العلوي.

وعلى سبيل المقارنة، أساليب بديلة لأخذ العينات في الجهاز التنفسي الغشاء المخاطي، مثل التطلع البلعوم (جيش الشعب الجديد) وينظف التقليدية، هي أكثر الغازية وقد تسفر عن زيادة البيانات تقلب. أساليب أخرى لها حدود، على سبيل المثال، الخزعات والشعب الهوائية الإجراءات الغازية والبصاق يحتوي على العديد من القتلى وتموت الخلايا ويتطلب تسييل، التنفس الزفير المكثفات (EBC) يحتوي على الماء واللعاب وعينات الغسل تمييع و متغير.

يمكن أن يؤديها با من خلال قناة العامل الفحص في العيادة. أخذ العينات هو جيد التحمل، ويمكن أن تجري في مواقع متعددة في مجرى الهواء. با النتائج في الصندوق متعدد الأطراف عينات يجري تمييع أقل من عينات للفيسيولوجيا الغسل (بال).

يوضح هذا المقال أساليب نا ومكتبة الإسكندرية، وكذلك تجهيز مختبر العينات الناتجة عن ذلك، التي يمكن أن تكون مصممة للعلامات البيولوجية المتلقين للمعلومات المرجوة التي يجري قياسها. تقنيات امتصاص هذه بدائل مفيدة لتقنيات أخذ العينات التقليدية المستخدمة في البحوث السريرية في الجهاز التنفسي.

Introduction

معظم أمراض الجهاز التنفسي يسبب استجابة التهابية، وهناك حاجة ملحة لأخذ عينات من سطح المخاطية التنفسية في حساسية الآنف، الالتهابات الفيروسية والفطرية، السل، والربو، ومرض الرئة المزمن، الرئوي تليف الرئة وسرطان 1. Aspirate البلعوم (جيش الشعب الجديد)، وغسل الآنف والغسل للفيسيولوجيا (BAL) هي الأساليب الشائعة لأخذ عينات من مجرى الهواء العلوي والسفلي. ومع ذلك، تقدم هذه التقنيات مشاكل كبيرة بما في ذلك قابلية التحمل الفقراء، وتمييع وسطاء التهابات، وعجز متكرر تكرار أخذ العينات2. بديل واحد لأخذ العينات من جيش الشعب الجديد هو استخدام مسحات، أما من النايلون تدفقوا، القطن، أو رايون3،4، ولكن هذه لها أيضا القيود، نظراً لأنها تسبب الانزعاج وتلف ظهارة الآنف، وفي بعض الحالات الملزمة لا رجعة فيه من 5من الوسطاء التحريضية. عموما لا يمكن أن تتكرر هذه التقنيات متسلسل أكثر من ساعة، وتقنيات بديلة قد تكون أكثر فعالية في الكشف عن وفرة منخفضة السيتوكينات والمستقطبات5،6. بالإضافة إلى ذلك، قد تنشئ تقلب المستخدم المرتبطة بهذه التقنيات التناقضات في البيانات، أسفر عن شرط أفواج المرضى أكبر.

بدلاً من ذلك، استخدمت تقنيات الاستيعاب باستخدام الأسفنج سواء الطبيعية أو الاصطناعية لجمع الصندوق متعدد الأطراف من الأسطح المخاطية. الأسفنج العيون تتكون من السليلوز الطبيعية (مثلاً، ويك-الجوف) وقد استخدمت عينة اللعاب، سرطان عنق الرحم، والإفرازات المهبلية7. وباﻹضافة إلى ذلك، الأسفنج التركيبية المصنوعة من البولي فينيل الكحول (PVA) وكانت خلات البولي فينيل الهيدروكسيلية (ةبفا) المستخدمة8. وقد تم مقارنة سبع مواد مختلفة الاستيعابية لأخذ عينات من السوائل عن طريق الفم قبل قياس9من الأجسام المضادة، في حين استخدمت ميني البولي يوريثان-الأسفنج لجمع الدموع البشرية10.

ورق الترشيح تتكون من السليلوز الطبيعي من نبات القطن قد استخدمت على نطاق واسع ﻻستيعاب إفرازات الآنف منذ الورقة رائد علام والزملاء في عام 199211،،من1213،14، 15،،من1617. أقراص ورق الترشيح قد صدرت من تصفية بطاقات (مثل Shandon)، وقد استخدمت لقياس الهيستامين والسيتوكينات بعد تسيطر تحديات حساسية الآنف والحساسية الطبيعية تعرض18،19 ،،من2021. ومع ذلك، مجموعات مختلفة من ورق الترشيح تختلف في درجة ملزمة البروتين وبعض الفشل للإفراج عن السيتوكينات. ولذلك كانت أساليب استخدام مصفوفة الاستيعابية اصطناعية (SAM) المتقدمة2،،من2223. سامز الآن تستخدم عادة للحصول على بروميد الميثيل الآنف قبل na. هذه المواد الماصة مريحة لاستخدام، ويمكن الحصول على الصندوق متعدد الأطراف حتى من انوف ملتهبة على فترات متكررة على مدى فترات طويلة من الزمن.

امتصاص الآنف نموذج "أخذ العينات المخاطية الدقة" استخدام سام لأخذ العينات من الصندوق متعدد الأطراف في مجرى الهواء العلوي. أجهزة نا تصنع كعلامة CE الأجهزة الطبية من المواد الطبية باستخدام غرف نظيفة وخالية من الغبار والمواد المسببة للحساسية. أخذ العينات نا يتكون من مقبض وسام في كريوتوبي عقيمة. سام يتكون من البوليمرات، عادة من الألياف، ولكن كما أنها متاحة كالرغوة، وهذه تم تحديدها لتكون لينة والاستيعاب، مع فتل السريع لجمع العينات. وقد سامز ملزمة البروتين الحد الأدنى للسماح شطف كفاءة من إفرازات استيعابها. نا هو أسلوب لطيف جداً، وغير الغازية التي يمكن إجراؤها على الجهات المانحة من جميع الإعمار. وباﻹضافة إلى ذلك، أخذ العينات المسلسل، بل كل بضع دقائق، من الممكن. وقد تم التحقق من صحة نا ضد مجرى الهواء العلوي الحالي أخذ العينات التقنيات5 وتكرار أخذ العينات قد سمح توليد البيانات الحركية عقب التحدي المتمثل في مجرى الهواء مع حساسية23،،من2425، 26 من الذيفان الجرثومي والفيروسي من نوع TLR يضع (جها، ألف- et al.، مخطوطة في إعداد). كما استخدمت نا في الرضع للتحقيق في التاريخ الطبيعي [أتوبي]27،،من2829 وفيروسي التهاب القصيبات30.

ميكروسامبلينج برونتشوسكوبيك (خدمات إدارة المباني) هو إجراء لجمع من الصندوق متعدد الأطراف في مجرى الهواء السفلي الذي تم تطويره بواسطة أوليمبوس31،،من3233. للأسف، هذا النظام خدمات إدارة المباني مرخص فقط في اليابان. أوليمبوس إمداد خدمات إدارة المباني نظامين: واحدة مع ألياف بوليستر الهيدروكسيلية (فب) التحقيق34،35،،من3637، وواحدة مع القطن التحقيق3833،، 39 , 40 , 41 , 42 , 43-وكان عقبة كأداء أن المسبار خدمات إدارة المباني المستخدمة في المرضى الذين يعانون من الربو بسبب الاتصال المخاطي النزيف، مع نصف جميع العينات الملوثة بالدم. استنتج المؤلفون أن ليس من المجدي لنموذج الصندوق متعدد الأطراف باستخدام هذا النظام خدمات إدارة المباني من الخطوط الطرفية في مرضى الربو43.

وكبديل لذلك، قمنا بتطوير استخدام سام ناعمة التي يمكن أن يؤديها خلال التحقيق برونتشوسكوبيك للخطوط الجوية السفلي، بما في ذلك أثر العدوى التجريبية من مواضيع الربو مع رهينوفيروس6بكالوريوس. الجهاز با يتكون من: قسطرة أجوف خارجية وقطعة يد التي يقذف SAM في التنشيط وسلك دليل بلاستيك وسط يحتوي سام في نهايته. أما بالنسبة للجمعية الوطنية، مجموعات مكتبة الإسكندرية مصنوعة من المواد الطبية باستخدام غرف نظيفة وخالية من الغبار والمواد المسببة للحساسية. بالإضافة إلى ذلك، هي أجهزة CE علامة وترد المشع أشعة غاما. قطاع سام لينة، والاستيعاب، وقد فتل السريع لجمع العينات. كما أنها ملزمة البروتين الحد الأدنى للسماح شطف كفاءة من إفرازات استيعابها. الجهاز يمكن أن يصلح من خلال قناة العامل الفحص ويمكن استخدامها بسرعة ودقة نموذج الصندوق متعدد الأطراف في مواقع محددة من الاهتمام داخل مجرى الهواء. على عكس BAL أو خدمات إدارة المباني، با لا ينتج نزيف الاتصال أو الانزعاج المريض إضافية بعد انتهاء الإجراء.

ينبغي النظر بعناية في تجهيز العينات نا ومكتبة الإسكندرية. يمكن أن تكون العينات مباشرة المجمدة والمجهزة على دفعات، أو يمكن معالجتها فورا. نوع المعالجة ويمكن تكييف تجاه بعض التطبيقات المتلقين للمعلومات، بما في ذلك تحديدكم المستقطبات والمناعية، السيتوكينات أو التيونس الفيروسية، والبكتيرية، والخلية المضيفة المرتبطة الحمض النووي الريبي. نحن نقدم مجموعة السريرية والمختبرية تقنيات المعالجة المرتبطة مع نا ومكتبة الإسكندرية كدليل للباحثين السريرية.

Protocol

التقنيات المستخدمة في البروتوكول التالي أقرتها "لجنة أخلاقيات البحوث لندن الغربية" (مرجع رقم 15/لو/0444).

1-الآنف الاستيعاب (غ)

  1. التحضير قبل أخذ العينات نا
    1. عند القيام نا، أولاً غسل اليدين ووضع قفازات، يفضل أن يكون ذلك أمام المريض.
    2. فحص تجويف الآنف باستخدام شعلة رأس، والطبيب استخدام الإبهام غير المهيمنة على التراجع عن آنف المريض لتصور تجويف الآنف.
      ملاحظة: منظار الآنف غير مطلوب عادة.
    3. تصور تجويف الآنف ودونية توربيناتي قبل أخذ العينات.
      ملاحظة: ناريس (الخياشيم) ليست جولة في المقطع العرضي، وأنها تذهب مباشرة إلى الوراء. عموما، يمكن اعتبار أدنى توربيناتي انتفاخ أو المسافات البادئة على الجدار الجانبي للأنف، مع الأنفي تشكيل الجدار الآنسي شقة، على نحو سلس. أننا نريد أن عينة من هذا أدنى توربيناتي، نظراً ظهارة الكامنة ظهارة عضو بسيط في الجهاز التنفسي44.
  2. نا أخذ العينات
    1. عند أخذ العينات، وتمرير "سام نا" بلطف حتى التجويف الآنف، توجيه أن تكون مسطحة ضد أدنى توربيناتي.
    2. أطلب من الجهات المانحة لاستخدام سبابة الضغط سام على الغشاء المخاطي للأنف. يمكن أن يسبب نا طفيفة دغدغة، مع سقي العين ممكنة، كما يمتص من الصندوق متعدد الأطراف.
      ملاحظة: في البالغين، ونحن عموما أداء نا ل 60 ثانية.
    3. بعد الامتصاص من الصندوق متعدد الأطراف، إزالة الجهاز نا من الآنف ووضع مرة أخرى في الأنبوب الأصلي.
    4. معالجة العينات مباشرة في المختبر أو تجميدها، كما هو مفصل في وقت لاحق في هذا البروتوكول.
      ملاحظة: وتجري دراسة نا في مجموعة متنوعة من نماذج التحدي مخاطية الآنف، وكذلك في أمراض مختلفة من الخطوط الجوية. ومع ذلك، ينبغي إجراء التحقق من صحة ضد أساليب أخذ العينات الجهاز التنفسي الأخرى لكل السكان دراسة والمريض.

2-الشعب الهوائية امتصاص (BA)

  1. التحضير قبل أخذ العينات با
    ملاحظة: ويقوم با بموظفين متخصصين في جناح القصبات.
    1. قبل وضع الجهاز با أسفل القسطرة، تحقق من أن سام هو البثق وسحب مرة أخرى إلى القسطرة.
    2. قبل القيام بمكتبة الإسكندرية على مريض، إجراء شهادة بكالوريوس وهمية على جهاز محاكاة القصبات.
  2. با أخذ العينات
    1. اجتياز الفحص أسفل القصبة الهوائية والقصبات الرئيسية الحق إلى مستوى intermedius القصبات الهوائية، مجرد الدانية إلى الشعبة في الفصوص السفلية اليمنى ويمين الوسط.
      ملاحظة: نحن عادة عينة من intermedius القصبات الهوائية، على الرغم من أن يمكن تذوق مواقع أخرى داخل مجرى الهواء. عند مراقبة القسطرة وسام، واحد لا يمكن رؤية تلميح الفحص. ونلاحظ الخطوات البسيطة التالية لمكتبة الإسكندرية، بمجرد الفحص قد وصلوا إلى موقع أخذ العينات المطلوب.
    2. قسطرة أسفل: أدخل القسطرة با من خلال قناة التشغيل الفحص حتى تلميح أبيض مرئياً فقط في مجرى الهواء، بحد أقصى 1 سم القاصي إلى نهاية الفحص. يبقى نصيحة الفحص والقسطرة في وسط التجويف مجرى الهواء. احرص على تقليل الاتصال بين طرف القسطرة وفي الغشاء المخاطي للشعب الهوائية الحد من خطر التآكل للغشاء المخاطي.
    3. خارج سام: كساد مقبض الجهاز با حيث أن سام هو مقذوف في التجويف مجرى الهواء الفص اليمين الوسط أو اليمين السفلي. تحت الرؤية المباشرة، منحنى غيض الفحص لضمان أن سام هو جعل الاتصال مع الصندوق متعدد الأطراف على الجدار مجرى الهواء. ترك سام داخل مجرى الهواء، شقة بالجدار المخاطي لمدة 30 ثانية.
    4. في سام: نظرة من خلال الفحص لضمان أن المسبار سام رطبة مستقيمة ولا بنت مرة أخرى على مدى نهاية القسطرة. إذا لزم الأمر، يمكن أن يقدم طرف القسطرة والفحص مرة أخرى إلى تصويب SAM. تحت الرؤية المباشرة، تتراجع سام مستقيم بلطف مرة أخرى إلى القسطرة.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك صعوبة تراجعه SAM إلى القسطرة، سحب الجهاز كله مع سام مقذوف مرة أخرى من أصل مجرى الهواء.
    5. قسطرة تصل: سحب القسطرة كامل من قناة التشغيل الفحص.
    6. قطع سام: SAM هو قطع مقص معقم وثم وضع في كريوتوبي على الجليد. ويمكن معالجة هذه العينات بطرق متفاوتة، كما هو مفصل في وقت لاحق في هذا البروتوكول.

3-تجهيز نا وعينات با

ملاحظة: وهناك العديد من الخيارات لتجهيز مختبر العينات الناتجة عن نا ومكتبة الإسكندرية. تسعى هذه البروتوكولات لتخزين العينات لاستخدامها في وقت لاحق، والوت العينة الصندوق متعدد الأطراف من سام.

  1. خيارات لمعالجة فورية لعينات نا ومكتبة الإسكندرية
    1. الخيار 1: تخزين سام رطبة على الجليد لبضع ساعات قبل إجراء مزيد من المعالجة.
    2. الخيار 2: فورا تجميد عميق "سامز نا" في جمع الأنبوبة. وبالمثل، تجميد سامز با في قنينات المبردة بعد الإزالة، مع مقص، من جهاز أخذ العينات.
    3. الخيار 3: مكان سام منفصلة في شطف المخزن المؤقت (300 ميليلتر) قبل معالجة التجميد العميق مباشرة أو غير مباشرة.
  2. خيارات شطف المخزن المؤقت لعينات نا ومكتبة الإسكندرية
    ملاحظة: ويتوقف اختيار شطف المخزن المؤقت على ما يجري ليتم تحليلها في العينة الصندوق متعدد الأطراف، ونقترح البدائل الرئيسية الأربعة:
    1. استخدام المخزن مؤقت مناسبة للمناعة إجراءات فحص معدّة مسبقاً. هذه المخازن المؤقتة يجب أن تحتوي على كمية صغيرة من المنظفات (0.05%) فضلا عن البروتين، مثل الأبقار ألبومين المصل (BSA) % 1.
    2. وبدلاً من ذلك، استخدام المخزن مؤقت الذي يحتوي على أكبر كمية من المنظفات، حيث يحدث تحلل الخلية.
      ملاحظة: يمكننا استخدام المخازن المؤقتة التي تحتوي على تريتون-X أو NP40 بتركيز 1%. المخازن المؤقتة لتحلل الخلية تمكين السيتوكينات سواء داخل الخلية وخارج الخلية تكون التيد من سام، ويؤدي عموما إلى مستويات أعلى من السيتوكينات والمستقطبات. هذه المخازن المؤقتة يجب أن تحتوي أيضا على البروتين، وهي تتكون مع جيش صرب البوسنة إلى 1%.
    3. لقياس الحمض النووي الريبي، مثل PCR الكمي للجيش الملكي النيبالي الفيروسية أو قياس المضيف الجيش الملكي النيبالي، إضافة المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي مباشرة إلى سام رطبة.
      ملاحظة: المخازن المؤقتة لاستخراج "الحمض النووي الريبي تشاوتروبيك" تحتوي على جوانيدينيوم التي ديناتوريس البروتينات. وبديل إضافة المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي إلى السائل التيد بروميد الميثيل الواردة في المناعة أو خلية تفسخ المخزن المؤقت.
    4. استخدام المذيبات العضوية، مثل حامض trifluoroacetic، لاستخراج الدهون ونواتج الأيض، للتقييم من قبل قياس الطيف الكتلي.
      ملاحظة: وترد تفاصيل عن جميع هذه الكواشف في قسم المواد.
  3. تقنية شطف
    1. لأي من التقنيات شطف أعلاه، إدراج SAM في أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد مركزي 2 مل، جنبا إلى جنب مع المخزن المؤقت المطلوب استخراج.
    2. دوامة تخلط العينة لمدة 30 ثانية لغسل سام المرفقة فضفاضة السوائل والجزيئات الحيوية.
    3. لضمان استعادة عينة كاملة، أداء شطف الطرد المركزي عن طريق إضافة SAM رطبة لتدور تصفية عمود المصغر الذي يدرج في نفس 2 مل أنبوب مايكرو--أجهزة الطرد المركزي المستخدمة للغسيل.
      ملاحظة: يمكن استخدام نوعين من تدور تصفية العمود صغير. الأول يحتوي على فقط شبكة بلاستيكية، الذي يحمل وسام في مكان، السماح شطف كامل من السوائل. وبدلاً من ذلك، إذا كان العمل مع المواد المعدية، استخدام مرشحات تدور مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر. عوامل التصفية هذه سيتم تعقيم العينات، وهي مناسبة للعينات مع الاشتباه في الإصابة المتفطرات. ومع ذلك، ينبغي أن تكون عوامل التصفية هذه المحتضنة مسبقاً مع المخزن المؤقت، لتقليل ملزمة للوسطاء لعامل التصفية بتفاعلات غير محددة.
    4. استخدام الملقط المعقم لنقل SAM رطبة لتصفية تدور. تغيير الملقط بين عينات لمنع التلوث.
    5. عينات للطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 16,000 س ز في أجهزة الطرد مركزي المصغر تبريده إلى 4 درجات مئوية.
  4. مثال موجز بروتوكول
    1. في المختبر، تسمية 2 مل أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي لجمع العينات وإضافة وحدة التخزين المطلوبة شطف المخزن المؤقت (عادة 300 ميليلتر نا؛ 100 ميليلتر لمكتبة الإسكندرية). إغلاق الغطاء ووضع على الجليد.
    2. بعد أخذ العينات (أما فورا أو في المختبر) سام هو إزالتها من التعامل مع استخدام الملقط ووضعها في المخزن المؤقت الذي يحتوي على أنبوب جمع (المنتجة في الخطوة السابقة). ضمان الحد أقصى أنبوب ميكروسينتريفوجي مغلق بشكل أمن ونقل العينات، على الجليد، إلى المختبر لإجراء مزيد من المعالجة.
    3. إزالة أنابيب تحتوي على المخزن سام وشطف من مزيجها نقل الحاويات ودوامه لمدة 30 ثانية.
    4. استخدام الملقط العقيمة، إزالة سام ومكان في عمود دوران (مع أو بدون تصفية خلات السليولوز ميكرومتر 0.22).
    5. تجمع المخزن المؤقت شطف من أنبوب جمع والاحتفاظ بهم.
    6. ضع عمود الدوران، مع سام، في أنبوب جمع الأصلي (أو عينات واحد جديد إذا العقيمة التصفية) وإضافة مجموعة المخزن المؤقت في عمود الدوران. بهذه الطريقة، سيمر سائل الغسيل عن طريق عمود الدوران مرة أخرى إلى أنبوب جمع، المساعدة على الوت العينة من SAM.
    7. الطرد المركزي العينات مع أغطية مختومة (16,000 س ز، 20 دقيقة، 4 درجة مئوية).
    8. إزالة العينات من أجهزة الطرد المركزي ووضع في رف.
    9. افتح غطاء مختومة من الأنابيب وإزالة عمود الدوران المتضمن SAM. التخلص من العمود سام وتدور في حاوية نفايات مناسبة.
    10. -الأنابيب بعناية قاسمة النذرة الواردة داخل الأنبوب إلى المسمى المبردة. سجل إجمالي حجم النذرة ووحدة التخزين في كل قاسمة.
    11. نقل الأنابيب المبردة مختومة لثلاجة-80 درجة مئوية وتخزين تستقيم حتى الاستخدام.

Representative Results

وقد استخدمت في عدد من الدراسات بسهولة نا وقياس غير إينفاسيفيلي التهاب الغشاء المخاطي. عقب إدارة حساسية للأنف، ويمكن ملاحظة مستويات البروستاغلاندين-D2 (PGD2) صعود وهبوط في غضون دقائق (الشكل 1)، تمشيا مع تحبب الخلية الصاري (ثوايتيس et al., مخطوطة في الإعداد). بالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس وسطاء التهاب النوع الثاني، مثل إيل-5 (الشكل 2، طبع بإذن من 24)، في الساعات التالية لحساسية الآنف التحدي23،24. في التجريبية الإصابة بالربو التحسسي وضوابط صحية، استخدمت نا لقياس فريق وسطاء، بما في ذلك انترفيرون-غاما (IFN-γ)، على مدى 7 أيام (الشكل 3، طبع بإذن من 6). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت نا في الإصابة بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV) الطبيعية للرضع، RSV مرتبطة بمستويات مرتفعة من السيتوكينات الالتهابية، مثل IFN-γ، بالنسبة إلى غير RSV الرضع المصابين بالتهاب القصيبات وضوابط صحية ( 4 الرقم، وطبع بإذن من 30). من المثير للاهتمام، لم يكن هذا التمييز بين RSV والتهاب القصيبات غير RSV كبير في جيش الشعب الجديد وقت مطابقة العينات (الشكل 4).

كما استخدمت با خلال العدوى التجريبية للربو التحسسي مع رهينوفيروس. في يوم 4 من العدوى رهينوفيروس، مستويات IFN-γ، CXCL11، إيل-10، وايل-5 كانت مرتفعة من الأساس (الشكل 5؛ ألف، باء، جيم ودال، على التوالي). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت هذه التقنية مستويات مرتفعة من إيل-5 في مجرى الهواء أقل من الربو حساسية أثناء الإصابة رهينوفيروس، بالنسبة لضوابط صحية (الشكل 5) (الشكل 5 طبع بإذن من 6).

تولدت هذه النتائج تمثيلية من عينات التيد استخدام مقايسة العازلة التي تحتوي على 0.05% توين-20 و 1% جيش صرب البوسنة (انظر الجدول للمواد).

Figure 1
الشكل 1 : توليد السريع والتخليص من البروستاغلاندين-D2 عقب التحدي حساسية الآنف. قياس مستويات البروستاغلاندين-D2 (PGD2) من امتصاص الآنف الواتس في عينات المسلسل عقب التحدي حساسية الآنف مع تيموثي العشب حبوب اللقاح (n = 5). ويمثل كل خط البيانات من فرد واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : قياس الحركية إيل-5 عقب التحدي حساسية الآنف. إنتاج إيل-5 في عينات الامتصاص الأنفي المسلسل عقب التحدي حساسية الآنف. كرر ثلاثة وأجريت دراسات الحساسية التحدي، مع المشاركين (n = 19) تلقي الغفل (أزرق)، منخفضة الجرعة (10 ملغ) بريدنيزون عن طريق الفم (برتقالي)، أو بريدنيزون عن طريق الفم جرعة عالية (25 ملغ) (أحمر) ساعة واحدة قبل الإدارة المسببة للحساسية. خطوط الدلالة هندسي وأشرطة الخطأ فواصل الثقة 95% من جميع المشاركين. (الرقم طبع بإذن من ليكر et al.، "علم المناعة المخاطية"، 2017). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تحريض الانترفيرون γ أثناء الإصابة رهينوفيروس. خلال التحدي العدوى من البالغين الأصحاء (n = 11، الأزرق) والربو التحسسي (n = 28، الأحمر) مع رهينوفيروس-16، استخدمت عينات الامتصاص الأنفي لقياس مستويات الانترفيرون-γ (IFN-γ). وتمثل البيانات كقطع معكرونة A) الخام من الأفراد ومستويات ب) متوسط مع أشرطة الخطأ تدل على النطاقات المجال. (الرقم طبع بإذن من هانسيل et al. 6)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : ناسوسوربشن يميز انترفيرون-γ المرتفعة المرتبطة بالعدوى RSV الرضع. امتصاص الآنف والبلعوم تطلع (جيش الشعب الجديد) المستخدمة لقياس مستويات الانترفيرون γ في الرضع بالتهاب القصيبات المرتبطة بالإصابة بالفيروس المخلوي التنفسي (RSV) (ن أحمر، = 12)، ممرض غير RSV تنفسي (n الخضراء، = 12)، وصحية عناصر التحكم (الأزرق، n = 9). تم تحليل البيانات باستخدام اختبار كروسكال-واليس مع تصحيح دونس لمقارنات متعددة (* * *ف< 0.001). خطوط ترمز إلى القيم الوسطية وأشرطة الخطأ النطاقات المجال. (الرقم معدلة بإذن من ثوايتيس et al. 30)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : الوسطاء التهابات في الشعب الهوائية امتصاص عينات خلال العدوى رهينوفيروس.
عقب الإصابة رهينوفيروس-16 من ضوابط صحية (n = 10، الأزرق) والمتطوعين الربو التحسسي (n = 23، الأحمر)، استيعاب الشعب الهوائية واستخدمت لقياس مستويات A) IFN-γ، ب) CXCL11، ج) إيل-10، وايل-5 د) عند خط الأساس، وفي يوم 4 من الإصابة. توقيع البيانات تحليلها بواسطة الرتبي اختبار رتبة (مطابقة العينات) واختبار مان-ويتني (عينات لا مثيل لها). الرقم طبع بإذن من هانسيل et al. 6 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وتعتبر النتائج من تقنيات أخذ العينات الهوائية الموجودة اختلافاً كبيرا؛ تقنيات أخذ العينات البديلة ضرورية لتوحيد معايير البحث داخل هذا الحقل5. نا با تسمح بأخذ عينات من الصندوق متعدد الأطراف بطريقة غير الغازية، وإمكانيات مثيرة لقياس الاستجابات المناعية في الخطوط الجوية صحية والمريضة. هذه التقنيات توفر العديد من المزايا المحتملة عبر التقنيات الموجودة، بما في ذلك زيادة قابلية التحمل، السرعة لأخذ العينات، والقدرة على تكرار أخذ العينات، وكثيراً ما خفض التباين بين المستخدم، وانخفض إضعاف المناعة الوسطاء5 . وينبغي الأمثل لكل دراسة مدة الاستيعاب والمعالجة التقنية المستخدمة والمحافظة على دقة بين الأحداث أخذ العينات. بالإضافة إلى ذلك، في حالة با، الموقع لأخذ العينات داخل مجرى الهواء ينبغي أن عناية تتكرر بين الأفراد.

نا، ولا سيما مكتبة الإسكندرية، تقنيات لا تزال جديدة نسبيا للبحوث السريرية. ومع ذلك، قد أدت إلى فوائد هذه التقنيات في استخدامها في العديد من الدراسات، بما في ذلك التحقق من صحة الحذر ضد التقنيات البديلة5. هذه الأجهزة متوفرة الآن كما تم وضع علامة CE الأجهزة جاهزة للاستخدام على نطاق واسع في أبحاث الجهاز التنفسي. بينما نا ومكتبة الإسكندرية ينتج كثير حجم عينة أصغر من تقنيات أخذ العينات بديلة، يمكن أن يؤدي ارتفاع التركيزات التي يتم الحصول عليها حساسية أكبر للوسطاء المناعية وفرة منخفضة.

اعتماداً على التطبيقات المتلقين للمعلومات المطلوبة، يمكن تجميد عينات نا ومكتبة الإسكندرية مباشرة للمعالجة فيما بعد، تعزيز جدوى الدراسة في بيئة بحوث سريرية. البروتوكول لمعالجة عينة يمكن تكييفها لتناسب التطبيقات المصب خاصة أيضا. تقنيات المعالجة المقترحة يمكن أن تستخدم لجمع من البروتين أو الدهون محصنة ضد الوسطاء أو الأحماض النووية، ولكن ينبغي أن يكون الأمثل لكل دراسة. على وجه الخصوص، يمكن أن تكون التيد الصندوق متعدد الأطراف مع مختلف المخازن المؤقتة. أولاً، يمكن استخدام المخزن المؤقت للمناعة لقياس السيتوكينات المخاطي والمستقطبات والأجسام المضادة6،45. يمكن أيضا استخدام المخازن المؤقتة مع أعلى مستويات المنظفات لضمان حدوث تحلل الخلية، مما يسمح بإدراج السيتوكينات داخل الخلوية. تحميل استخراج "الحمض النووي الريبي تشاوتروبيك" ينبغي استخدام المخازن المؤقتة لتحديد العدوى الفيروسية، الفيروسية، تستضيف مرناً، وميكروبيومي. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام المذيبات العضوية ليبيدوميكس والطيف الكتلي.

وفي الختام، الاستيعاب المباشر للصندوق متعدد الأطراف من الأسطح المخاطية تقنية مثيرة مع إمكانية استخدامها في الجهاز التنفسي، وأمراض المعدة والأمعاء، الجهاز البولي وغيرها من الأمراض المخاطية. ومع ذلك، هذه التقنيات الواعدة في امتصاص سيتطلب التحقق من دقة أخذ العينات والمعالجة التقنية لفحوصات الفردية (المؤشرات الحيوية) في كل إعداد المرض. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الأساليب دقة رواية المخاطية أخذ العينات سوف تتطلب التحقق من الصحة ضد العينات التقليدية، مثل من الدم والتنفس والبلغم. مع هذه التقنيات، يمكن استخدام الصندوق متعدد الأطراف لقياس الميكروبات، السيتوكينات، المستقطبات، بروستانويدس، والأجسام المضادة.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

التمويل: هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من المعهد الوطني الإمبراطوري لمركز البحوث الصحية (NIHR) البحوث الطبية الحيوية (BRC)، وفي NIHR الصحة حماية البحوث وحدة (هبرو) في "التهابات الجهاز التنفسي" في "امبريال كوليدج لندن" في الشراكة مع إنكلترا الصحة العامة (PHE) ومركز البحوث متعدية سلامة المرضى الإمبراطورية NIHR. الآراء التي أعرب عنها هي آراء المؤلفين وليس بالضرورة تلك المستشفيات العامة، وفي NIHR، ووزارة الصحة أو "إنكلترا الصحة العامة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nasosorption (adult, 7mm width) Hunt Developments NSFL-FXI-11 Different sizes are available for different patient groups/ages.
Bronchosorption Hunt Developments BSFL-FXI-11 Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) Sigma Aldrich CLS9301-1000EA
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) Sigma Aldrich CLS8160-24EA For sterilisation of samples with infection risk.
Assay (elution) buffer Millipore AB-33k Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA.
NP-40 Cell lysis buffer Life Technologies FNN0021 Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels.
Buffer RLT (RNA extraction) Qiagen 79216 Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples.
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 302031-100ML-M For elution of samples to be used in HPLC applications
2.0ml micro-centrifuge tubes Costar 3213 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hansel, T. T., Johnston, S. L., Openshaw, P. J. Microbes and mucosal immune responses in asthma. Lancet. 381, (9869), 861-873 (2013).
  2. Lu, F. X., Esch, R. E. Novel nasal secretion collection method for the analysis of allergen specific antibodies and inflammatory biomarkers. J Immunol Methods. 356, (1-2), 6-17 (2010).
  3. Esposito, S., et al. Collection by trained pediatricians or parents of mid-turbinate nasal flocked swabs for the detection of influenza viruses in childhood. Virol J. 7, (1), 85 (2010).
  4. Macfarlane, P., Denham, J., Assous, J., Hughes, C. RSV testing in bronchiolitis: which nasal sampling method is best? Arch Dis Child. 90, (6), 634-635 (2005).
  5. Jochems, S. P., et al. Novel Analysis of Immune Cells from Nasal Microbiopsy Demonstrates Reliable, Reproducible Data for Immune Populations, and Superior Cytokine Detection Compared to Nasal Wash. PLoS One. 12, (1), e0169805 (2017).
  6. Hansel, T. T., et al. A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma Increased Interferons (IFN-gamma and IFN-lambda) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13). EBioMedicine. (2017).
  7. Rohan, L. C., et al. Optimization of the weck-Cel collection method for quantitation of cytokines in mucosal secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 7, (1), 45-48 (2000).
  8. Castle, P. E., et al. Comparison of ophthalmic sponges for measurements of immune markers from cervical secretions. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (2), 399-405 (2004).
  9. Chang, C. K., Cohen, M. E., Bienek, D. R. Efficiency of oral fluid collection devices in extracting antibodies. Oral Microbiol Immunol. 24, (3), 231-235 (2009).
  10. Lopez-Cisternas, J., Castillo-Diaz, J., Traipe-Castro, L., Lopez-Solis, R. O. Use of polyurethane minisponges to collect human tear fluid. Cornea. 25, (3), 312-318 (2006).
  11. Alam, R., Sim, T. C., Hilsmeier, K., Grant, J. A. Development of a new technique for recovery of cytokines from inflammatory sites in situ. J Immunol Methods. 155, (1), 25-29 (1992).
  12. Sim, T. C., Grant, J. A., Hilsmeier, K. A., Fukuda, Y., Alam, R. Proinflammatory cytokines in nasal secretions of allergic subjects after antigen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 149, (2 Pt 1), 339-344 (1994).
  13. Sim, T. C., Reece, L. M., Hilsmeier, K. A., Grant, J. A., Alam, R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. Am J Respir Crit Care Med. 152, (3), 927-933 (1995).
  14. Weido, A. J., Reece, L. M., Alam, R., Cook, C. K., Sim, T. C. Intranasal fluticasone propionate inhibits recovery of chemokines and other cytokines in nasal secretions in allergen-induced rhinitis. Ann Allergy Asthma Immunol. 77, (5), 407-415 (1996).
  15. Linden, M., et al. Immediate effect of topical budesonide on allergen challenge-induced nasal mucosal fluid levels of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-5. Am J Respir Crit Care Med. 162, (5), 1705-1708 (2000).
  16. Bensch, G. W., Nelson, H. S., Borish, L. C. Evaluation of cytokines in nasal secretions after nasal antigen challenge: lack of influence of antihistamines. Ann Allergy Asthma Immunol. 88, (5), 457-462 (2002).
  17. Riechelmann, H., Deutschle, T., Friemel, E., Gross, H. J., Bachem, M. Biological markers in nasal secretions. Eur Respir J. 21, (4), 600-605 (2003).
  18. Wagenmann, M., et al. Bilateral increases in histamine after unilateral nasal allergen challenge. Am J Respir Crit Care Med. 155, (2), 426-431 (1997).
  19. Wagenmann, M., Schumacher, L., Bachert, C. The time course of the bilateral release of cytokines and mediators after unilateral nasal allergen challenge. Allergy. 60, (9), 1132-1138 (2005).
  20. Baumann, R., et al. The release of IL-31 and IL-13 after nasal allergen challenge and their relation to nasal symptoms. Clin Transl Allergy. 2, (1), 13 (2012).
  21. Baumann, R., et al. Nasal levels of soluble IL-33R ST2 and IL-16 in allergic rhinitis: inverse correlation trends with disease severity. Clin Exp Allergy. 43, (10), 1134-1143 (2013).
  22. Chawes, B. L., et al. A novel method for assessing unchallenged levels of mediators in nasal epithelial lining fluid. J Allergy Clin Immunol. 125, (6), 1387-1389 (2010).
  23. Scadding, G. W., et al. Optimisation of grass pollen nasal allergen challenge for assessment of clinical and immunological outcomes. J Immunol Methods. 384, (1-2), 25-32 (2012).
  24. Leaker, B. R., et al. The nasal mucosal late allergic reaction to grass pollen involves type 2 inflammation (IL-5 and IL-13), the inflammasome (IL-1beta), and complement. Mucosal Immunol. 10, (2), 408-420 (2017).
  25. Nicholson, G. C., et al. The effects of an anti-IL-13 mAb on cytokine levels and nasal symptoms following nasal allergen challenge. J Allergy Clin Immunol. 128, (4), 800-807 (2011).
  26. Dhariwal, J., et al. Nasal Lipopolysaccharide Challenge and Cytokine Measurement Reflects Innate Mucosal Immune Responsiveness. PLoS One. 10, (9), e0135363 (2015).
  27. Folsgaard, N. V., et al. Neonatal cytokine profile in the airway mucosal lining fluid is skewed by maternal atopy. Am J Respir Crit Care Med. 185, (3), 275-280 (2012).
  28. Folsgaard, N. V., et al. Pathogenic bacteria colonizing the airways in asymptomatic neonates stimulates topical inflammatory mediator release. Am J Respir Crit Care Med. 187, (6), 589-595 (2013).
  29. Wolsk, H. M., et al. Siblings Promote a Type 1/Type 17-oriented immune response in the airways of asymptomatic neonates. Allergy. 71, (6), 820-828 (2016).
  30. Thwaites, R. S., et al. Nasosorption as a Minimally Invasive Sampling Procedure: Mucosal Viral Load and Inflammation in Primary RSV Bronchiolitis. J Infect Dis. 215, (8), 1240-1244 (2017).
  31. Ishizaka, A., et al. New bronchoscopic microsample probe to measure the biochemical constituents in epithelial lining fluid of patients with acute respiratory distress syndrome. Crit Care Med. 29, (4), 896-898 (2001).
  32. Ishizaka, A., et al. Elevation of KL-6, a lung epithelial cell marker, in plasma and epithelial lining fluid in acute respiratory distress syndrome. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286, (6), L1088-L1094 (2004).
  33. Komaki, Y., et al. Cytokine-mediated xanthine oxidase upregulation in chronic obstructive pulmonary disease's airways. Pulm Pharmacol Ther. 18, (4), 297-302 (2005).
  34. Yamazaki, K., Ogura, S., Ishizaka, A., Oh-hara, T., Nishimura, M. Bronchoscopic microsampling method for measuring drug concentration in epithelial lining fluid. Am J Respir Crit Care Med. 168, (11), 1304-1307 (2003).
  35. Kikuchi, J., Yamazaki, K., Kikuchi, E., Ishizaka, A., Nishimura, M. Pharmacokinetics of telithromycin using bronchoscopic microsampling after single and multiple oral doses. Pulm Pharmacol Ther. 20, (5), 549-555 (2007).
  36. Kikuchi, E., et al. Comparison of the pharmacodynamics of biapenem in bronchial epithelial lining fluid in healthy volunteers given half-hour and three-hour intravenous infusions. Antimicrob Agents Chemother. 53, (7), 2799-2803 (2009).
  37. Kodama, T., et al. A technological advance comparing epithelial lining fluid from different regions of the lung in smokers. Respir Med. 103, (1), 35-40 (2009).
  38. Sasabayashi, M., Yamazaki, Y., Tsushima, K., Hatayama, O., Okabe, T. Usefulness of bronchoscopic microsampling to detect the pathogenic bacteria of respiratory infection. Chest. 131, (2), 474-479 (2007).
  39. Kipnis, E., et al. Proteomic analysis of undiluted lung epithelial lining fluid. Chest. 134, (2), 338-345 (2008).
  40. Kanazawa, H., Kodama, T., Asai, K., Matsumura, S., Hirata, K. Increased levels of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine in epithelial lining fluid from peripheral airways in patients with chronic obstructive pulmonary disease: a pilot study. Clin Sci (Lond). 119, (3), 143-149 (2010).
  41. Sugasawa, Y., et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 25, (2), 170-177 (2011).
  42. Sugasawa, Y., et al. Effects of sevoflurane and propofol on pulmonary inflammatory responses during lung resection. J Anesth. 26, (1), 62-69 (2012).
  43. Cohen, J., et al. Ciclesonide improves measures of small airway involvement in asthma. Eur Respir J. 31, (6), 1213-1220 (2008).
  44. Fahy, J. V., Dickey, B. F. Airway mucus function and dysfunction. N Engl J Med. 363, (23), 2233-2247 (2010).
  45. de Silva, T. I., et al. Comparison of mucosal lining fluid sampling methods and influenza-specific IgA detection assays for use in human studies of influenza immunity. J Immunol Methods. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics