גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לגלות Zika וירוס מסוים אבחון פפטידים באמצעות microarray פפטיד בצפיפות גבוהה. פרוטוקול זה יכול להתאים readly למחלות זיהומיות מתעוררים אחרים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sabalza, M., Barber, C. A., Abrams, W. R., Montagna, R., Malamud, D. Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery. J. Vis. Exp. (130), e56784, doi:10.3791/56784 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מיקרו-מערכים פפטיד בצפיפות גבוהה לאפשר הקרנה של יותר מ 6,000 פפטידים בשקופית מיקרוסקופ סטנדרט יחיד. בשיטה זו יכול להיות מיושם עבור גילוי תרופות, זיהוי מטרה טיפולית פיתוח של אבחון. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגלות ספציפי Zika וירוס (ZIKV) אבחון פפטידים באמצעות microarray פפטיד בצפיפות גבוהה של... מדגם בנסיוב אדם מאומת על זיהום ZIKV, נדגרה עם microarray פפטיד בצפיפות גבוהה המכילה חלבון ZIKV כולו מתורגם 3,423 ייחודי 15 חומצת אמינו ליניארי (aa) שאריות עם חפיפה 14-aa שאריות מודפס כפילויות. צביעת עם נוגדנים משניים שונים בתוך המערך אותו, גילינו פפטידים לכרוך אימונוגלובולינים ז (IgM), נוגדנים אימונוגלובולין G (IgG) נוכח סרום. פפטידים אלה נבחרו לניסויים אימות נוסף. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את האסטרטגיה המיושמת כדי לעצב, לעבד, לנתח microarray פפטיד בצפיפות גבוהה.

Introduction

Zika וירוס (ZIKV) האבחנה מבוססת על סימפטומים קליניים הוא מאתגר כי היא חולקת וקטורים תפוצה גאוגרפית, הסימפטומים עם קדחת דנגה, Chikungunya וירוס זיהום1. לאור הסיכון לתוצאות שליליות הריון בנשים נגוע ZIKV במהלך ההריון, חשוב להבחין בין 3 וירוסים. בדיקות האבחון המולקולרי הנוכחי אמנם ספציפיים, הם שימושיים רק דם או רוק בתקופה קצרה יחסית של דלקת חריפה2,3. מבחני סרולוגית חיוניים לצורך אבחון מחוץ תקופה ראשונית של זיהום4.

הפיתוח של ZIKV assay סרולוגית ספציפי הוא מאתגר משתי סיבות: ראשית, אנטיגנים Zika אשר מערכת החיסון האנושית מגיבה לא כיום ידועים; רצפים של חומצות אמיניות flaviviruses שנית, שנשמרת זירוז אשיג נוגדן. המטרה שלנו הייתה לגלות ייחודי ZIKV פפטידים מסוימים כדי לשמש אבחון. גישות שונות פותחו לספריות פפטיד המסך מכסה כל החלבונים כולל phage, חיידקי, ולהציג שמרים משטח5,6,7,8,9, 10. האסטרטגיה שלנו היה להשתמש microarray פפטיד בצפיפות גבוהה המתיר מהיר וזול תפוקה גבוהה סרולוגית הקרנות11,12 , לאחר מכן פפטידים מזוהה יכול לשמש כדי לשפר את זרם סרולוגית מבחני לגילוי של זיהום ZIKV.

פרוטוקול זה מאפשר גילוי Zika וירוס מסוים אבחון פפטידים באמצעות microarray של פפטיד בעל צפיפות גבוהה (איור 1). Microarray פפטיד בצפיפות גבוהה הופק באמצעות הטכנולוגיה להדפסת לייזר פפטיד. הרצף כולו ZIKV חלבון המורכב שאריות חומצה אמינית 3,423 בהתבסס על המתח פולינזיה הצרפתית (GenBank: KJ776791.2), הודפסה על משטח זכוכית רגילה בבלוקים של 15 שאריות ליניארי עם חפיפה בין שאריות חומצה אמינית 14 כפילויות עבור סך נקודות פפטיד 6,846. בנוסף כולו Zika חלבון רצף פפטידים, מנצל microarray שפעת hemagglutinin (HA) פפטידים עבור פקדים פנימיים.

Zika לאמת חיובי דגימת נסיוב שהושג ממרכז Wadsworth (אולבני, ניו יורק), היה משמש לזיהוי ספציפי אימונוגלובולינים ז (IgM), פפטידים תגובתי אימונוגלובולין G (IgG). לאחר המקננת עם הדגימה בן לילה, microarray מוכתם של נוגדן fluorochrome משני מצומדת (האנטי-האדם IgM או אנטי-אנושית IgG), והוא ניתח על סורק microarray. כימות של עוצמות ספוט, ביאור פפטיד בוצעה עם תוכנה ספציפיים המסופקים על ידי אותה חברה שייצרה את microarray.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

נתונים אלה הם חלק מחקריות המחקר שנערך בניו יורק אוניברסיטת מכללת לרפואת שיניים ואושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי של ניו יורק מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה, IRB # H10-01894. דוגמאות קליניות השתמשו במחקר זה היו מזוהה מבטל את דגימות המשמשות בעבר לצורך אבחון ועם רשות מן Wadsworth מרכז של ניו יורק מחלקת המדינה של בריאות, אולבני, ניו יורק.

1. התקנת ZIKV בצפיפות גבוהה פפטיד Microarray השקופית במגש הדגירה מסוים

  1. לטפל השקופית זכוכית בקצוות באמצעות אבקה ללא כפפות. הממדים שקופיות זכוכית הם 75.4 מ מ על ידי 25.0 מ"מ ו- 1 מ מ עבה. מקם את השקופית במגש הדגירה עם משטח microarray פונה כלפי מעלה.
  2. מניחים בצד מבריק של החותם פונה כלפי מטה אל השטח המודפסים microarray. כדי להבטיח עמדה טובה, חופפים את חורי הברגים של החותם, הבסיס.
  3. מניחים את החלק העליון של המגש על גבי החותם ליצירת תא microarray.
  4. אבטח את השקופית במגש על ידי הידוק באותה מידה את מכשיר העינויים אחד אחרי השני על ידי יד תבנית לסירוגין החל השמאלית העליונה ואחריו הימנית התחתונה. הנח את מכסה המגש הדגירה.

2. רקע אינטראקציה זיהוי: מכתים את Microarray עם נוגדנים משניים

הערה: השתמש פיפטה להפקיד את הפתרונות (מאגרי סטנדרטי, חסימה, נוגדנים משניים מדולל) בפינה של החדר microarray.

  1. דגירה של microarray עם מאגר רגיל (1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), 0.05% Tween 20, pH 7.4, מסונן עם מסנן 0.45 מיקרומטר) (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  2. להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray. למלא מחזיקי השקופית ריק עם מגלשות ריק כדי למנוע פריצה של השקופית microarray.
  3. לחסום את microarray עם המאגר חסימה (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) עבור 60 דקות ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  4. להסיר את המאגר חסימה על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  5. דגירה של microarray עם נוגדנים משניים, fluorochrome IgM נגד מצומדת, מדולל 1:5000 (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) ההכתמה מאגר (10% חסימת מאגר במאגר הרגיל) במשך 30 דקות ב- RT בחושך על תפקודי לב / 140 סל ד.
  6. להסיר את הנוגדן משני על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  7. לשטוף את microarray 3 x, 1 דקה לכל לשטוף עם מאגר סטנדרטי (נפח כולל של 2,000 µL microarray ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד. לשטוף אחרי זה, להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  8. לטבול את השקופית 2 x לתוך מאגר וטבלו המוכנים באופן טרי (1 מ"מ טריס, pH 7.4), (סה כ נפח של 200 מ ל).
  9. יבש את microarray בקפידה, עבור-1 דקות, על ידי כ רפה בעברית עודפי הנוזלים היטב בין החלק העליון לחלק התחתון של השקופית מבלי לגעת במשטח שקופיות. לנתח את השקופית קורא סורק microarray.

3. חשיפת Microarray לארח סרום

התראה: לבצע שלב זה בתנאי בטיחות מעבדה, אבטחה ברמה 2 (BSL-2) בגלל הטבע זיהומיות אפשריות של דגימות סרום. לעבוד במסגרת Class II בטיחות ביולוגית cabinet (BSC).

  1. הפוך ללא פעיל דגימת נסיוב ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, צנטריפוגה-16,000 rcf למשך 5 דקות ב 4 ° C13.
    הערה: השתמש פיפטה להפקיד את הפתרונות (מכתים, מאגר סטנדרטי, סרום מדולל) בפינה של החדר microarray.
  2. לדלל דגימת נסיוב במאגר מכתימים החל לדילול (נפח כולל של 2,000 μL/microarray) 1:1,000. לשמור את זה ב 4 ° C עד השימוש.
  3. תקופת דגירה של microarray עם המאגר מכתימים (נפח כולל של 2,000 μL/microarray) של 15 דקות ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  4. להסיר את המאגר מכתימים על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  5. דגירה של microarray עם הדגימה מדולל סרום לילה ב 4 ° C-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  6. הסר את דגימת נסיוב מדולל על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  7. לשטוף את microarray 3 x, 1 דקה לכל לשטוף עם מאגר סטנדרטי (נפח כולל של 2,000 μL microarray ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד. לשטוף אחרי זה, להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.

4. מכתים עם נוגדנים משניים, בקר תווית נוגדנים

הערה: השתמש פיפטה להפקיד את הפתרונות (מאגרי סטנדרטי, משני מדולל ו תווית נוגדנים) בפינה של החדר microarray.

  1. לדלל הנוגדן משני במאגר מוכתמים.
    הערה: השתמש האנטי-האדם IgM fluorochrome מצומדת נוגדן או האנטי-האדם IgG fluorochrome מצומדת נוגדן-לדילול 1:5,000 (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) במאגר מוכתמים.
  2. מיקס פקד תווית נוגדנים (monoclonal אנטי-חה fluorochrome מצומדת) לדילול 1:1,000 (הנפח הכולל של µL 2 000/microarray) בצביעת מאגר עם נוגדנים משניים בעבר מעורבבת עם צביעת מאגר.
  3. דגירה עם microarray למשך 30 דקות ב- RT בחושך על תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  4. הסר את התמהיל של משני מדולל, תווית נוגדנים על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  5. רחץ 3 x עם מאגר סטנדרטי (נפח כולל של 2,000 µL/microarray). כל כביסה היא 1 דקות ב- תפקודי לב / נשימה-140 סל ד. לשטוף אחרי זה, להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.

5. Microarray סריקה

  1. לטבול את השקופית 2 x לתוך מאגר וטבלו המוכנים באופן טרי (1 מ מ טריס, pH 7.4) (סה כ נפח של 200 מ ל).
  2. יבש את microarray בקפידה, בסביבות 1 דקות, על ידי כ רפה בעברית היטב מהחלק העליון לחלק התחתון של השקופית מבלי לגעת במשטח שקופיות.
  3. סרוק את microarray ועקוב אחר ההוראות של הסורק. מקם את השקופית לתוך הסורק עם השטח המודפס פונה כלפי מעלה.
  4. יצירת פרוייקט חדש, בחר את אזור הסריקה. הגדרת הסורק פרמטרים כמו: רזולוציה: 21 מיקרומטר, העוצמה עבור 700 ל-800 ננומטר ערוצי: 7.0, איכות סריקה: בינוני וההיסט: 0.8.
  5. לרכוש ולשמור תמונת raw סריקה כקובץ תבנית קובץ TIFF 16 סיביות בגווני אפור.

6. Microarray ניתוח באמצעות תוכנה מסוימת

  1. פתחו את התמונה raw (תמונה TIFF). פתח את הקובץ במערך רשת.
  2. ליישר את הרשת מערך לתמונה סריקה עם מקשי החצים העכבר או לוח המקשים של המחשב.
  3. בחר "הבחירה לכמת" התוכנה ספציפיים, אשר יוצר קובץ readout המכיל את עוצמת האות עבור כל נקודה, הערך רקע, ואודות הרצף פפטיד המתאימים.
    הערה: קובץ פלט זה ניתן גם לייבא לתוך תוכנית גיליון אלקטרוני עבור ניתוח נוסף, יצירת גרפים.

7. Microarray אחסון

  1. אחסן את microarray אטום בחושך ב 4 ° C תחת גז חנקן או ארגון ללא חמצן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול המתואר מוצגים באיור 2 , איור 3. אין אינטראקציות רקע נרשמו כאשר מראש מכתימה את microarray עם אנטי-האדם משני IgM (נתונים לא מוצג). צביעת עם אנטי-אדם IgM המספר המשלים הביא במספר תחומים מעל רקע בעוצמות קרינה פלואורסצנטית ירוק, המציינת את האיגוד של פפטידים אלה עם IgM במדגם סרום המארח (איור 2). אג זיהוי (אות פלואורסצנטי אדום) חשף רק כמה פפטידים (איור 2).

התוכנה ספציפיים המסופקים על ידי אותה חברה שייצרה את microarray מנתח את microarray לאחר סריקה. הקובץ readout שנוצר מכיל את עוצמת האות עבור כל נקודה, הערך רקע, ואודות הרצף פפטיד המתאימים. עוצמות קרינה פלואורסצנטית ספוט כל פפטיד עם תגובה חזקה IgM היו דמיינו ידי התוויית הקידמה ירוק החציוני הערכים שהתקבלו לאחר הפחתת את הרקע מהערך raw (איור 3).

Figure 1
איור 1: מציג את תהליך ניתוח עבור Microarray פפטיד בצפיפות גבוהה מפרטים טכניים- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: Microarray פפטיד סריקת תמונות- קרינה פלואורסצנטית raw תמונות של מכתימה את microarray פפטיד לאחר המקננת נסיוב ZIKV לטעום 1:250 מדולל. תגובתיות IgG מתואר באדום (שמאל), תגובתיות IgM מוצג בצבע ירוק (נכון). חה שליטה פפטידים מסגרת של microarray פפטיד. זום מראות קבוצה של פפטידים עם עוצמות קרינה פלואורסצנטית גבוהה, המציין תגובה חזקה IgM או IgG. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: נציג Zika וירוס רצף הסכמה Epitope מגיבים IgM במדגם סרום המארח. הקידמה ירוק ערכים חופפים פפטידים שורטטו על הגרף. פפטידים מהרצף קונצנזוס epitope מסומנים באדום. פפטיד עם עוצמת קרינה פלואורסצנטית הגבוהה מסומן באותיות מודגשות. וקטור מבוסס עיצוב גרפי תוכנה שימש ליצירת דמות זו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תיכננו פרוטוקול ניצול של microarray בצפיפות גבוהה פפטיד המכיל Zika וירוס חלבון הרצף כולו (זן צרפתי פולינזי). Microarray היה מתוצרת הדפסה 3,423 שונים חופפים ליניארי פפטידים. כל פפטיד 15 חומצות אמינו, מגוונים שאריות אחד בלבד של שכנתה הקרובה ברצף (קרי, שאריות 14 חפיפה). למרות שניתן להדפיס חופף קצר יותר, מיפוי epitope הוא יותר מדויק עם חפיפות יותר. כל פפטיד הודפס ב כפילויות כדי להגביר את אמינות.

זה חיוני כדי להתחיל את התהליך עם מראש מכתימה את microarray עם הנוגדן משני רקע אפשרי אינטראקציות ויוכל להבדיל אותם האות מדגם ספציפי. באמצעות מאגר חסימה ספציפית חשוב גם כמו מאגרי חסימה אחרים כמו אבקת אלבומין שור (BSA) או יבשים חלב עלולה לגרום בעוצמת האות מופחת. דגימת נסיוב המאומת על נוגדנים ZIKV IgM נדגרה קודם עם microarray ב 1:1,000 אבל אין אות זוהה. הדגירה עוקבות-נמוך לדילול שבערך הביא אות בעצימות נמוכה מגיע מכיוון פפטידים הגיב עם נוגדנים IgM במדגם. התוצאות הטובות ביותר התקבלו כאשר המדגם סרום המאומת Zika היה מדולל ב 1:250. אנחנו לא תבדקי את דגימת נסיוב-ריכוז גבוה יותר כדי למנוע גידול של האות רקע. טיפול זהיר microarray חיונית כדי להימנע מגרד את פני השטח microarray. לכן, פתרונות כגון שאותנו מדולל סרום ומאגר סטנדרטיים הם נוספו והוסרו בפינת החדר microarray. בנוסף, חשוב לקבלת תוצאה מוצלחת הוא המגש דגירה מסוימת שקופית המסופקים על ידי החברה שייצרה את microarray, אשר נועד לאפשר עבודה עם אמצעי אחסון מדגם מינימלי. הממדים מגש הדגירה הם 13.0 ס מ ס מ 9.0 ו- 3 ס מ עבה. ישנם 3 מגלשות המיועד חללים במגש הדגירה לאפשר assaying 3 מגלשות שונות בו זמנית. עם זאת, בניסוי זה השתמשנו שקופית 1 בלבד. שקופיות מיקרוסקופ ריק היו ממוקמים בתוך שני חללים אחרים כדי לאזן את המגש ולמנוע פריצה של השקופית מערך. המגש אינקובציה 4 חלקים: צלחת הבסיס היכן השקופיות ממוקמים בתוך חללים המיועדים לכך; סילר לאיטום עשוי סיליקון כדי להפריד כל שקופית האחרים; חלק עליון הכולל מכשיר העינויים להצטרף חותם עם הבסיס וליצור את לשכות microarray הוספת פתרונות וזמינותו כגון רחצה מדגם מאגר או סרום. סילר לאיטום של החלק העליון להימנע זיהום או ערבוב של פתרונות בין שקופיות. הרכיב בסעיף האחרון נמצא המכסה כדי למזער את הסיכון של אידוי או זיהום סביבתי של דגימות. תפקודי לב / נשימה הוא העדיף לקבל אופטימלית להרטיב, מכתימה את התנאים.

ריכוז נוגדן סרה יכולים להיות גבוהים או נמוכים בהתאם כשהוירוס המארח Zika IgM מסוים שנוצר. לכן, זה היה צפוי כי באמצעות דגימת נסיוב עם ריכוז גבוה יותר של IgM להגביר את עוצמת האות פלורסצנטיות היחסי. לאחר זיהוי IgM, סרום באותה דגימת זרע, נדגרה לדילול 1:250 עם microarray, אבל IgG נגד שימש הנוגדן משנית. לחלופין, נוגדנים שונים שיעורים ניתן להבחין בו זמנית בתוך microarray אותו באמצעות תערובת של נוגדנים משניים שאחד מצומדת עם צבעי זריחה שונים. Microarray אותו יכול להיות מוכתם שוב דגימת נסיוב מרוכז יותר אם עוצמת אות נמוכה. אם מאוחסנים כראוי microarray יציב למשך מספר חודשים, ואולי ניתן להשתמש שוב.

כימות של עוצמות ספוט וביאורים פפטיד בוצע שימוש בתוכנה קניינית של החברה שייצרה את microarray המספק גם קובץ ".psf" עם התבנית של תבנית המערך. הקובץ psf הוא למעשה רשת מיושר לתמונה raw סורק באמצעות תוכנה קניינית. אלגוריתם התוכנה מנתחת עוצמות קרינה פלואורסצנטית היחסי של כל מקום לתוך raw (ערך עוצמת אות של המקום), רקע (ערך משוער של האות נגרמת על-ידי איגוד שאינם ספציפיים) וקידמה (המופחת על רקע מתוך החומר גלם האות ערך). הוא גם מחשב את הקידמה ערכים ואת הקידמה צבירה החציון המקביל הממוצע של שני הערכים ספוט החציוני של כל פפטיד של כפילויות. בנוסף, התוכנה מזהה קונצנזוס במוטיבים/epitope בתוך חופפים פפטידים. לחלופין, ניתן לכמת עוצמות האות עם שתוכנת הסורק microarray ולאחר מכן באמצעות התבנית של הפורמט מערך, ניתן לזהות את רצף פפטיד.

בעקבות פרוטוקול זה, אותרו כמה מועמדים פפטיד מבטיח בהתבסס על עוצמת קרינה פלואורסצנטית. לאחר מכן הפיצוץ14 ניתוח שימש לזיהוי שאריות עם פוטנציאל אשיג כדי flavivirus אחרים. סכום כולל של 14 פפטידים מזוהה נמצאים רק ZIKV כפי שזוהו במסדי פרוטאום 3. סדרה שניה של מיקרו-מערכים מתוכננת שמכילות את פפטידים שנבחרו מן המערך הראשון. זה יאפשר בדיקות מרובות דגימות המאומת כמו גם דגימות של אנשים נגועים בלבד flavivirus חוץ ZIKV לאשר יחודיות. להקרנה, נסתגל תבנית assay אליסה, ציפוי הצלחות עם פפטידים שנבחר ובדיקות האיגוד כדי ZIKV נוגדנים ספציפיים אנושי הדוגמאות סרום ורוק.

טיפול ZIKV דורש עבודה מתקן אבטחה ברמה 2 (BSL-2)15. בזמן שעבדנו עם דגימת נסיוב מאומת על זיהום ZIKV עבדנו במתקן BSL-2 ביצוע כל מדגם מניפולציה בתוך של Class II (או גבוה יותר) בטיחות ביולוגית הקבינט (BSC). זו הסיבה מדוע אנו להשבית את הוירוס חימום הדגימה סרום ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני המקננת הדגימה עם microarray13. בעקבות חום איון, מומלץ גם להמשיך לעבוד במתקן BSL-2 עם אימון בטיחות מעבדה המתאים כדי למנוע את הסיכון לזיהום.

Microarray זה עיצבנו מכיל רק פפטידים לינארית, epitopes consequentially הסתגלותי שעשוי להיות בעל ערך כמו אבחון הוחמצו. מגבלה זו ניתן לטפל באמצעות בצפיפות גבוהה microarray המכיל מחזורית פפטידים מאולצות המחקים epitope שיכורה מבני16. פרוטוקול זה במהירות ניתן להתאים פתוגנים אחרים כי ברגע רצף חלבונים ידועה microarray החדש ניתן לעצב לגילוי של פפטידים אבחון פוטנציאל. זה גם יכול להיות מותאם עבור יישומים אחרים כגון גילוי סמן17, גילוי אנטיגן ו epitope עבור פיתוח החיסון או מטרות טיפולית18,19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

התמיכה הנוכחית מסופק על ידי גרנט תוספת ניהול SBIR (מחקר חדשנות עסקית קטנה) מ NIDCRR44 DE024456. גרנט NIDCR HIV זה התפתחה מתוך NIDCR הענק U01 DE017855 לפיתוח של אבחון בשלב של טיפול מאשרות ל- HIV. אנו להכיר בהכרת תודה שערותיו ארוכות ואפורות Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) עבור סוג תמיכה וסיוע טכני שלה. אנו מודים גם מרכז רפואי אוניברסיטת ניו-יורק Langone LI-קור אודיסיאה הדמיה למערכת.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray PEPperPRINT PPC.001.001 Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1 PEPperPRINT PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) PEPperPRINT PPC.037.002
PepSLide Analyzer PEPperPRINT PSA.004.001 14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer Rockland MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 Rockland 609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680 Thermo Scientific SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System LI-COR
Orbital shaker device IKA MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator Adobe
Deltagraph Redrocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18, (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38, (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11, (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8, (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12, (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421, (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11, (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16, (1), 6 (2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7, (12), e50748 (2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11, (1), e0005330 (2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. 2nd ed, (2013).
  15. Services, U. S. D. oH. aH. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). 5th ed, Vol. HHS Publication No. (CDC) 21-1112 (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20, (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11, (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics