Virus di Zika specifico diagnostico dell'epitopo Discovery

Immunology and Infection

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Summary

In questo protocollo, descriviamo una tecnica per scoprire Zika il peptidi diagnostico specifici di virus ha usando un microarray ad alta densità del peptide. Questo protocollo può essere idoneamente adattato per altre malattie infettive emergenti.

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Sabalza, M., Barber, C. A., Abrams, W. R., Montagna, R., Malamud, D. Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery. J. Vis. Exp. (130), e56784, doi:10.3791/56784 (2017).

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Abstract

Microarrays ad alta densità del peptide consentire lo screening dei peptidi più di seimila in una diapositiva di microscopia singola standard. Questo metodo può essere applicato per la scoperta di farmaci, identificazione del target terapeutico e lo sviluppo della diagnostica. Qui, presentiamo un protocollo per scoprire peptidi diagnostici specifici di virus (ZIKV) Zika usando un microarray ad alta densità del peptide. Un campione di siero umano convalidato per infezione ZIKV è stato incubato con un microarray ad alta densità del peptide contenente l'intera proteina ZIKV tradotta in 3.423 unico 15 lineare dell'aminoacido (aa) residui con una sovrapposizione di 14-aa residuo stampato in duplice copia. Colorazione con anticorpi secondari diversi all'interno della matrice stessa, abbiamo rilevato peptidi che legano alla immunoglobulina M (IgM) e gli anticorpi dell'immunoglobulina G (IgG) sono presenti nel siero. Questi peptidi sono stati selezionati per ulteriori esperimenti di convalida. In questo protocollo, descriviamo la strategia seguita per progettare, elaborare e analizzare un microarray ad alta densità del peptide.

Introduction

Zika diagnosi del virus (ZIKV) basata sui sintomi clinici è impegnativo, perché condivide con Dengue e Chikungunya virus infezione1vettori, distribuzione geografica e sintomi. Dato il rischio di esiti avversi della gravidanza in donne infettate con ZIKV durante la gravidanza, è importante distinguere tra i 3 virus. Anche se l'attuale test diagnostici molecolari sono specifici, sono solo utili nel sangue o saliva durante il periodo relativamente breve di infezione acuta2,3. I test sierologici sono essenziali per la diagnosi fuori di questo periodo iniziale di infezione4.

Lo sviluppo di un'analisi sierologica specifica ZIKV è difficile per due motivi: in primo luogo, gli antigeni di Zika che il sistema immunitario umano risponde a non sono attualmente noti; e flavivirus conservato, secondo sequenze aminoacidiche inducono cross-reattività dell'anticorpo. Il nostro obiettivo era di scoprire unici peptidi specifici ZIKV per essere utilizzato nella diagnostica. Diversi approcci sono stati sviluppati per librerie peptidiche schermo che copre intere proteine compreso Fago, batterica, e superficie di lievito visualizzare5,6,7,8,9, 10. La nostra strategia era di usare un microarray di peptide ad alta densità che consente il rapido e poco costoso high throughput screening sierologici11,12 e successivamente i peptidi identificati possono essere utilizzati per migliorare la corrente sierologici analisi per la rilevazione dell'infezione ZIKV.

Questo protocollo consente l'individuazione di Zika il peptidi diagnostico specifici di virus ha usando un microarray ad alta densità del peptide (Figura 1). Il microarray ad alta densità del peptide è stato prodotto utilizzando la tecnologia di stampa laser del peptide. L'intera sequenza di proteine ZIKV che consiste di 3.423 residui dell'amminoacido basato sul ceppo polinesiano francese (GenBank: KJ776791.2), è stato stampato su un vetrino standard in blocchi di 15 residui lineare con una sovrapposizione di 14 residui dell'amminoacido in duplicato per un totale di 6.846 macchie di peptide. Oltre i peptidi di sequenza di proteine Zika intero, il microarray utilizza emoagglutinina influenzale peptidi (HA) per i controlli interni.

Un Zika convalidato positivo campione di siero ottenuto da Wadsworth Center (Albany, NY), è stato utilizzato per identificare specifici dell'immunoglobulina M (IgM) e peptidi reattive dell'immunoglobulina G (IgG). Dopo incubazione con il campione durante la notte, il microarray è stato macchiato con un anticorpo coniugato secondario fluorocromo (IgM anti-umano o anti-IgG umane) e analizzato su uno scanner di microarray. Quantificazione di intensità di spot e annotazione del peptide è stata effettuata con un software specifico fornito dalla stessa società che ha prodotto il microarray.

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Protocol

Questi dati sono una parte di uno studio di ricerca condotto presso la New York University College of Dentistry e sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale della New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Campioni clinici utilizzati in questo studio sono stati de-identificati campioni precedentemente utilizzati per la diagnosi e con permesso da Wadsworth Center di New York State Department di salute, Albany, NY.

1. installazione di ZIKV ad alta densità Peptide Microarray fare scorrere in un determinato cassetto incubazione

  1. Gestire il vetrino per i bordi con guanti senza polvere. Le dimensioni di diapositiva di vetro sono 75,4 mm 25,0 mm e 1 mm di spessore. Porre il vetrino nel cassetto incubazione con la superficie di microarray rivolto verso l'alto.
  2. Posizionare il lato lucido del sigillo rivolta verso il basso sulla superficie stampata microarray. Per garantire una buona posizione, si sovrappongono i fori delle viti del sigillo e la piastra di base.
  3. Posizionare la parte superiore del vassoio sul sigillo per creare una camera di microarray.
  4. Serrando la diapositiva nel vassoio ugualmente le viti ad alette uno dopo l'altro a mano in uno schema alternato a partire dall'alto a sinistra seguito da in basso a destra. Posizionare il coperchio del cassetto incubazione.

2. sfondo Interaction Detection: Macchiando il Microarray con anticorpi secondari

Nota: Utilizzare una pipetta per depositare le soluzioni (standard e blocco buffer, anticorpi secondari diluiti) nell'angolo della camera di microarray.

  1. Incubare il microarray con un tampone standard (1 x tamponato fosfato salino (PBS), 0,05% di Tween 20, pH 7.4, filtrato con un filtro da 0,45 µm) (volume totale di 2.000 µ l/microarray) per 15 min a temperatura ambiente (TA) su agitatore orbitale a 140 giri/min.
  2. Rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray. Riempire portavetrini vuoto con diapositive vuote per evitare la rottura della diapositiva microarray.
  3. Bloccare il microarray con il tampone bloccante (volume totale di 2.000 µ l/microarray) per 60 min a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min.
  4. Rimuovere il tampone bloccante aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.
  5. Incubare il microarray con anticorpo secondario, fluorocromo di IgM anti-umano coniugato, diluito 1: 5.000 (volume totale di 2.000 µ l/microarray) nella macchiatura buffer (10% blocco buffer nel buffer standard) per 30 min a temperatura ambiente al buio in un agitatore orbitale a 140 giri/min.
  6. Rimuovere l'anticorpo secondario aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.
  7. Lavare il microarray 3 x, 1 min per lavaggio con tampone standard (volume totale di 2.000 µ l/microarray a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min. Dopo ogni lavaggio, è necessario rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.
  8. Immergere la diapositiva 2 x in un buffer tuffantesi preparato al momento (1 mM Tris, pH 7.4), (volume totale di 200 mL).
  9. Asciugare accuratamente, il microarray per circa 1 min, aspirando il liquido in eccesso con molta attenzione dalla parte superiore alla parte inferiore della diapositiva senza toccare la superficie di scorrimento. Analizzare il vetrino in un lettore di scanner di microarray.

3. esposizione del Microarray per ospitare siero

Attenzione: Eseguire questo passaggio in condizioni di sicurezza del laboratorio, livello 2 di biosicurezza (BSL-2) a causa della potenziale natura infettiva degli esemplari del siero. Lavorare all'interno di una classe II biologica sicurezza gabinetto (BSC).

  1. Inattivare il campione di siero a 56 ° C per 30 min e centrifugare a 16.000 rcf per 5 min a 4 ° C13.
    Nota: Utilizzare una pipetta per depositare le soluzioni (colorazione, tampone standard e siero diluito) nell'angolo della camera di microarray.
  2. Diluire il campione di siero nel buffer colorazione a partire con una diluizione di 1:1,000 (volume totale di 2.000 μL/microarray). Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  3. Incubare il microarray con il buffer di colorazione (volume totale di 2.000 μL/microarray) per 15 min a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min.
  4. Rimuovere il buffer di macchiatura aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.
  5. Incubare il microarray con il campione di siero diluito durante la notte a 4 ° C su agitatore orbitale a 140 giri/min.
  6. Rimuovere il campione di siero diluito aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.
  7. Lavare il microarray 3 x, 1 min per lavaggio con tampone standard (volume totale di 2.000 μL/microarray a temperatura ambiente su agitatore orbitale a 140 giri/min. Dopo ogni lavaggio, è necessario rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.

4. colorazione con gli anticorpi secondari e contrassegnata come controllo

Nota: Utilizzare una pipetta per depositare le soluzioni (buffer standard, secondario diluito e gli anticorpi etichetta) nell'angolo della camera di microarray.

  1. Diluire l'anticorpo secondario nel buffer di colorazione.
    Nota: Uso anti-umano IgM fluorocromo coniugate dell'anticorpo o anticorpo coniugato con fluorocromo di IgG anti-umano ad una diluizione di 1:5,000 (volume totale di 2.000 µ l/microarray) nel buffer di colorazione.
  2. Anticorpo di etichetta controllo Mix (monoclonale anti-HA fluorocromo coniugato) ad una diluizione di 1:1,000 (volume totale di 2 000 µ l/microarray) in tampone di macchiatura con anticorpo secondario precedentemente diluito in tampone di colorazione.
  3. Incubare con il microarray per 30 min a temperatura ambiente al buio in un agitatore orbitale a 140 giri/min.
  4. Rimuovere il mix di secondario diluito e gli anticorpi etichetta aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.
  5. Lavare 3 volte con tampone standard (volume totale di 2.000 µ l/microarray). Ogni lavaggio è per 1 min su agitatore orbitale a 140 giri/min. Dopo ogni lavaggio, è necessario rimuovere il tampone standard aspirando con una pipetta dall'angolo della camera del microarray.

5. scansione di Microarray

  1. Immergere la diapositiva 2 x nel buffer tuffantesi preparata al momento (1 mM Tris, pH 7.4) (volume totale di 200 mL).
  2. Asciugare accuratamente, il microarray circa 1 min, aspirando con molta attenzione dalla parte superiore alla parte inferiore della diapositiva senza toccare la superficie di scorrimento.
  3. Scansione del microarray seguendo le istruzioni dello scanner. Porre il vetrino sul vetro dello scanner con la superficie stampata rivolta verso l'alto.
  4. Creare un nuovo progetto e selezionare l'area di scansione. Impostare i parametri dello scanner come: risoluzione: 21 µm, intensità per canali nm sia 700 e 800: 7.0, qualità di scansione: medium e Offset: 0,8.
  5. Acquisire e salvare l'immagine raw di scansione come un formato di file TIFF 16 bit in scala di grigi.

6. Microarray Analysis utilizzando un Software specifico

  1. Aprire l'immagine raw (immagine TIFF). Aprire il file di griglia di matrice.
  2. Allineare la griglia di matrice per l'immagine di scansione con i tasti freccia del mouse o la tastiera del computer.
  3. Selezionare "Selezione quantificare" nel software specifico, che crea un file di lettura che contiene l'intensità del segnale per ogni spot, il valore di sfondo e la corrispondente sequenza del peptide.
    Nota: Il file di output possa anche essere importato in un foglio di calcolo per ulteriore analisi e grafici.

7. Microarray deposito

  1. Memorizzare il microarray sigillato al buio a 4 ° C sotto ossigeno libero e gas azoto o argon.

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Representative Results

I risultati ottenuti mediante il protocollo descritto sono mostrati nella Figura 2 e nella figura 3. Nessuna interazione di sfondo sono stata notata quando pre-macchiando il microarray con secondario anti-human IgM (dati non mostrati). Colorazione con un'anti-IgM umane coniugato ha provocato parecchie zone sopra intensità di fluorescenza verde di sfondo, che indica l'associazione di questi peptidi con IgM nel campione del siero di host (Figura 2). Rilevamento di igG (segnale di fluorescenza rossa) ha rivelato soltanto alcuni peptidi (Figura 2).

Il software specifico fornito dalla stessa società che ha prodotto il microarray analizza il microarray dopo la scansione. Il file di lettura creato contiene l'intensità del segnale per ogni spot, il valore di sfondo e la corrispondente sequenza del peptide. Le intensità di fluorescenza spot di ciascun peptide con una forte risposta IgM sono state visualizzate tracciando i valori mediani di primo piano verde ottenuti dopo la sottrazione del background del valore non elaborato (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Schema mostrando il processo di analisi per il Microarray ad alta densità Peptide. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Peptide Microarray immagini scansionate. Immagini di fluorescenza crudo di macchiatura del peptide microarray dopo incubazione con un siero ZIKV campione diluito 1: 250. La reattività di IgG è raffigurata in rosso (asinistra), e la reattività di IgM è mostrata in verde (adestra). HA controllo peptidi incorniciano il peptide microarray. Pannelli di zoom mostrano un gruppo di peptidi con intensità elevata fluorescenza, che indica una forte risposta IgM o IgG. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Sequenza di consenso di epitopo rappresentante Zika Virus reagendo con IgM nel campione del siero Host. I valori mediani di primo piano verde da peptidi di sovrapposizione sono stati tracciati su un grafico. Peptidi dalla sequenza di consenso di epitopo sono evidenziati in rosso. Il peptide con la massima intensità di fluorescenza è segnato in neretto. Vettoriale basato su grafica, il software è stato utilizzato per generare questa figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Abbiamo progettato un protocollo che utilizza un microarray ad alta densità del peptide contenente l'intera sequenza di proteina di Zika virus (ceppo polinesiano francese). Il microarray è stato fabbricato da peptidi lineari sovrapposti differenti 3.423 stampa. Ogni peptide era 15 aminoacidi e varia da un solo residuo dal suo vicino più prossimo nella sequenza (cioè, sovrapposizione di 14 residui). Anche se più breve sovrapposizioni possono essere stampati, mapping di epitopo è più preciso con più sovrapposizioni. Ogni peptide è stato stampato in duplice copia per aumentare l'affidabilità.

È essenziale per avviare il processo con pre-macchiando il microarray con l'anticorpo secondario per rilevare interazioni possibili sfondo e differenziarli dal segnale specifico del campione. Utilizzando un tampone bloccante specifico è anche importante come altri buffer blocco come l'albumina di siero bovino (BSA) o latte in polvere può causare nell'intensità del segnale ridotta. Un campione di siero convalidati per gli anticorpi IgM ZIKV in primo luogo è stato incubato con il microarray a 1:1,000 ma nessun segnale è stato rilevato. Incubazione successiva ad una bassa diluizione di 1: 500 è provocato da un segnale di bassa intensità proveniente da peptidi che hanno reagito con gli anticorpi di IgM nel campione. I migliori risultati sono stati ottenuti quando il campione di siero convalidato Zika è stato diluito a 1: 250. Non abbiamo ritestare il campione di siero ad una concentrazione più alta per evitare un aumento del segnale sfondo. Un'attenta gestione del microarray è essenziale per evitare di graffiare la superficie di microarray. Di conseguenza, le soluzioni tali che noi diluito siero e tampone standard vengono aggiunti a e rimosso dall'angolo della camera di microarray. Inoltre, importanti per un risultato positivo è il vassoio di incubazione specifico diapositiva fornito dalla società che ha prodotto il microarray, che è stato progettato per consentire di lavorare con i volumi di campione minimo. Le dimensioni del vassoio di incubazione sono 13,0 cm 9,0 cm e 3 cm di spessore. Ci sono 3 scivoli designati cavità nel cassetto incubazione che permettono di diluire 3 diverse diapositive contemporaneamente. Tuttavia, in questo esperimento abbiamo usato solo 1 scivolo. Vetrini per microscopio in bianco sono stati collocati nelle altre due cavità per bilanciare il vassoio e prevenire rotture della diapositiva matrice. Il vassoio di incubazione è costituito da 4 parti: una piastra di base dove le diapositive vengono inserite nelle cavità designato; un sigillante costituito da silicio per separare ogni diapositiva dagli altri; una parte superiore contenente le viti ad alette per unire il sigillante con la piastra di base e creare gli alloggiamenti di microarray per l'aggiunta di soluzioni per il dosaggio come buffer o siero campione di lavaggio. Il sigillante e parte superiore evitare contaminazione o miscelazione di soluzioni tra le diapositive. L'ultimo componente di sezione è un coperchio per ridurre al minimo il rischio di evaporazione o contaminazione ambientale di campioni. Agitatore orbitale è preferito per ottenere ottimale bagnabilità e la macchiatura condizioni.

A seconda di quando il virus infetta l'host specifico risultante Zika IgM concentrazione di anticorpi nel siero può essere alta o bassa. Di conseguenza, è stato anticipato che utilizzando un campione di siero con una maggiore concentrazione di IgM aumenterebbe l'intensità del segnale di fluorescenza relativa. Dopo il rilevamento di IgM, lo stesso campione di siero è stato incubato a una diluizione di 1: 250 con il microarray, ma un anti-IgG umane è stato usato come l'anticorpo secondario. In alternativa, classi differenti dell'anticorpo possono essere rilevate simultaneamente all'interno il microarray stesso usando una miscela di anticorpi secondari che ciascuno coniugato con fluorescenza diversi coloranti. Il microarray stesso può essere macchiato nuovamente con un campione di siero più concentrato se l'intensità del segnale è bassa. Se ben conservato il microarray è stabile per parecchi mesi e possa essere usato nuovamente.

Quantificazione di intensità di spot e le annotazioni del peptide è stata effettuata utilizzando software proprietario da parte della società che ha prodotto il microarray che fornisce anche un file di "PSF" con il modello del formato matrice. Il file psf è essenzialmente una griglia che è allineata all'immagine raw scanner utilizzando il software proprietario. Un algoritmo software analizza le intensità di fluorescenza relativa di ogni spot in raw (valore di intensità del segnale della macchia), primo piano e sfondo (valore stimato del segnale causato da legami aspecifici) (sottratto lo sfondo dalla materia segnale di valore). Calcola automaticamente anche i valori mediani di primo piano e mediana di aggregazione in primo piano corrispondente alla media dei due valori punto mediani di ciascun peptide in duplice copia. Inoltre, il software identifica consenso motivi/epitopo all'interno di peptidi di sovrapposizione. In alternativa, possono essere quantificate le intensità del segnale con il software dello scanner di microarray e quindi utilizzando il modello del formato matrice, la sequenza del peptide può essere identificata.

A seguito di questo protocollo, diversi candidati promettenti di peptide sono stati identificati basato sull'intensità di fluorescenza. Successive analisi di14 BLAST è stato utilizzato per identificare i residui con potenziale reattività crociata per altri flavivirus. Un totale di 14 peptidi identificati sono presenti solo in ZIKV come identificato in 3 proteoma database. È prevista una seconda serie di microarrays che conterrà i peptidi selezionati dalla prima matrice. Questo permetterà di test più campioni convalidati, nonché campioni da persone infettata solo flavivirus diverso da ZIKV per confermare la specificità. Per lo screening, ci adatteremo un formato di test ELISA, rivestimento le piastre con i peptidi selezionati e testare l'associazione agli anticorpi specifici ZIKV in campioni di siero e nella saliva umani.

ZIKV manipolazione richiede lavorando a livello 2 di biosicurezza (BSL-2) impianto15. Come abbiamo lavorato con un siero campione convalidato per l'infezione di ZIKV che abbiamo lavorato in BSL-2 struttura eseguendo tutte le manipolazioni del campione all'interno di una classe II (o superiore) cappa di sicurezza biologica (BSC). Ecco perché abbiamo inattivato del virus riscaldamento il campione di siero a 56 ° C per 30 min prima di incubazione del campione con i microarray13. A seguito di inattivazione termica, è inoltre consigliabile continuare a lavorare in una struttura di BSL-2 con bpl sicurezza appropriata per evitare il rischio di infezione.

Il microarray che abbiamo progettato contiene solo peptidi lineari ed epitopi conformazionali di conseguenza che potrebbero essere preziosi come diagnostica può avere perso. Questa limitazione può essere risolto utilizzando un ad alta densità microarray contenenti peptidi ciclici vincolate che imitano epitopo loop structures16. Questo protocollo può essere adattato ad altri agenti patogeni rapidamente perché una volta che la sequenza della proteina è noto un microarray nuovo può essere progettato per l'individuazione di potenziali peptidi diagnostiche. Può anche essere adattato per altre applicazioni come biomarcatore scoperta17, individuazione dell'antigene ed epitopo per lo sviluppo di vaccini o bersagli terapeutici18,19.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Il supporto corrente è fornito da una sovvenzione di supplemento amministrativo SBIR (Small Business Innovation Research) da NIDCRR44 DE024456. Concessione di NIDCR HIV che l'evoluzione di NIDCR concedere U01 DE017855 per lo sviluppo di una conferma diagnostica point-of-care per l'HIV. Noi riconosciamo con gratitudine Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) per la sua assistenza tecnica e supporto. Ringraziamo anche NYU Langone Medical Center per la LI-COR Odyssey Imaging System.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray PEPperPRINT PPC.001.001 Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1 PEPperPRINT PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) PEPperPRINT PPC.037.002
PepSLide Analyzer PEPperPRINT PSA.004.001 14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer Rockland MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 Rockland 609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680 Thermo Scientific SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System LI-COR
Orbital shaker device IKA MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator Adobe
Deltagraph Redrocks

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References

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