Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक Epitope डिस्कवरी

Immunology and Infection

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Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray का उपयोग Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक पेप्टाइड्स की खोज करने के लिए एक तकनीक का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को पढ़ने के अंय उभरते संक्रामक रोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Sabalza, M., Barber, C. A., Abrams, W. R., Montagna, R., Malamud, D. Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery. J. Vis. Exp. (130), e56784, doi:10.3791/56784 (2017).

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Abstract

उच्च घनत्व पेप्टाइड microarrays एक मानक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर ६००० से अधिक पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं । इस विधि दवा की खोज, चिकित्सकीय लक्ष्य पहचान, और निदान के विकास के लिए लागू किया जा सकता है । यहाँ, हम एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray का उपयोग कर विशिष्ट Zika वायरस (ZIKV) नैदानिक पेप्टाइड्स की खोज करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । एक मानव सीरम नमूना ZIKV संक्रमण के लिए मान्य एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray पूरे ZIKV प्रोटीन युक्त एक 14-aa अवशेषों के साथ डुप्लिकेट में मुद्रित ३,४२३ अद्वितीय 15 रैखिक एमिनो एसिड (ए. ए.) अवशेषों में अनुवादित किया गया था । एक ही सरणी के भीतर विभिंन माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला, हम पेप्टाइड्स कि Immunoglobulin एम (आईजीएम) और Immunoglobulin जी (आईजीजी) सीरम में मौजूद एंटीबॉडी को बांध का पता चला. इन पेप्टाइड्स का चयन आगे सत्यापन प्रयोगों के लिए किया गया. इस प्रोटोकॉल में, हम डिजाइन, प्रक्रिया के बाद की रणनीति का वर्णन है, और एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray का विश्लेषण ।

Introduction

Zika वायरस (ZIKV) नैदानिक लक्षणों के आधार पर निदान चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह वैक्टर, भौगोलिक वितरण, और डेंगू और Chikungunya वायरस के संक्रमण के साथ लक्षण के शेयरों1। गर्भावस्था के दौरान ZIKV से संक्रमित महिलाओं में प्रतिकूल गर्भावस्था परिणामों के लिए जोखिम को देखते हुए, यह 3 वायरस के बीच अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि वर्तमान आणविक नैदानिक परीक्षणों विशिष्ट हैं, वे केवल तीव्र संक्रमण2,3की अपेक्षाकृत कम अवधि के दौरान रक्त या लार में उपयोगी होते हैं । सीरम वैज्ञानिक परख संक्रमण के इस प्रारंभिक अवधि के बाहर निदान के लिए आवश्यक है 4 ।

एक ZIKV विशिष्ट सीरम वैज्ञानिक परख के विकास के दो कारणों के लिए चुनौतीपूर्ण है: पहले, Zika एंटीजन है कि मानव प्रतिरक्षा प्रणाली का जवाब वर्तमान में ज्ञात नहीं हैं; और दूसरा, संरक्षित flaviviruses एमिनो एसिड अनुक्रम एंटीबॉडी पार जेट प्रेरित । हमारा उद्देश्य निदान में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अद्वितीय ZIKV विशिष्ट पेप्टाइड्स की खोज करने के लिए किया गया था । विभिंन दृष्टिकोण फेज, जीवाणु, और खमीर सतह प्रदर्शन5,6,7,8,9सहित पूरे प्रोटीन को कवर पेप्टाइड पुस्तकालयों के लिए विकसित किया गया है, 10. हमारी रणनीति के लिए एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray है कि तेजी से और सस्ती उच्च प्रवाह परमिट सीरम वैज्ञानिक 11, 12 और बाद में पहचान पेप्टाइड्स वर्तमान सीरम वैज्ञानिक में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अनुमति का उपयोग करने के लिए किया गया ZIKV संक्रमण का पता लगाने के लिए परख ।

यह प्रोटोकॉल एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray (चित्रा 1) का उपयोग कर Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक पेप्टाइड्स की खोज को सक्षम करता है । उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray पेप्टाइड लेजर मुद्रण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर उत्पादित किया गया था । पूरे ZIKV प्रोटीन ३,४२३ अमीनो एसिड फ्रेंच Polynesian तनाव (GenBank: kj 776791.2) के आधार पर अवशेषों से मिलकर अनुक्रम, एक के लिए डुप्लिकेट में 14 एमिनो एसिड अवशेषों की एक ओवरलैप के साथ 15 रैखिक अवशेषों के ब्लॉक में एक मानक गिलास स्लाइड पर मुद्रित किया गया था कुल ६,८४६ पेप्टाइड स्पॉट । पूरे Zika प्रोटीन अनुक्रम पेप्टाइड्स के अलावा, microarray इंफ्लूएंजा hemagglutinin का उपयोग करता है (हा) आंतरिक नियंत्रण के लिए पेप्टाइड्स ।

एक Zika सत्यापित सकारात्मक सीरम Wadsworth केंद्र से प्राप्त नमूना (Albany, NY), विशिष्ट Immunoglobulin एम (आईजीएम) और Immunoglobulin जी (आईजीजी) प्रतिक्रियाशील पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. नमूना रात भर के साथ मशीन के बाद, microarray एक माध्यमिक fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी (विरोधी मानव आईजीएम या विरोधी मानव आईजीजी) के साथ दाग था, और एक microarray स्कैनर पर विश्लेषण किया । स्पॉट तीव्रता और पेप्टाइड एनोटेशन के ठहराव एक विशिष्ट एक ही कंपनी है कि microarray निर्मित द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया गया ।

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Protocol

इन आंकड़ों के एक चल रहे अनुसंधान ंयूयॉर्क दंत चिकित्सा विश्वविद्यालय के कॉलेज में किए गए अध्ययन का एक हिस्सा है और ंयू यॉर्क विश्वविद्यालय स्कूल ऑफ मेडिसिन, आईआरबी # H10-01894 के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया । नैदानिक नमूने इस अध्ययन में इस्तेमाल किया डी की पहचान के नमूनों के निदान के लिए पहले इस्तेमाल किया और ंयूयॉर्क राज्य स्वास्थ्य विभाग, Albany, NY के Wadsworth केंद्र से अनुमति के साथ थे ।

1. एक विशिष्ट मशीन ट्रे में ZIKV उच्च घनत्व पेप्टाइड Microarray स्लाइड अधिष्ठापन

  1. पाउडर मुक्त दस्ताने का उपयोग किनारों द्वारा ग्लास स्लाइड संभाल । ग्लास स्लाइड आयाम २५.० मिमी और मोटी के 1 मिमी द्वारा ७५.४ मिमी हैं । microarray सतह का सामना करना पड़ के साथ मशीन ट्रे में स्लाइड प्लेस ।
  2. microarray मुद्रित सतह पर नीचे की ओर का सामना करना पड़ सील के चमकदार पक्ष प्लेस । एक अच्छी स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, मुहर और आधार प्लेट के पेंच छेद ओवरलैप ।
  3. ट्रे के ऊपरी भाग को सील पर एक microarray चैंबर बनाने के लिए रखें ।
  4. ट्रे में एक के बाद एक बारी पैटर्न ऊपरी से शुरू निचले सही द्वारा पीछा छोड़ दिया में हाथ से एक के बाद एक ही thumbscrews कस द्वारा स्लाइड सुरक्षित । मशीन ट्रे के ढक्कन प्लेस ।

2. पृष्ठभूमि बातचीत का पता लगाने: माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ Microarray धुंधला

नोट: समाधान (मानक और अवरुद्ध बफ़र्स, पतला द्वितीयक एंटीबॉडी) microarray चैंबर के कोने में जमा करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ।

  1. एक मानक बफर के साथ microarray मशीन (1x फास्फेट बफर खारा (पंजाब), ०.०५% 20 के बीच, पीएच ७.४, एक ०.४५ µm फिल्टर के साथ फ़िल्टर) (२,००० µ एल की कुल मात्रा microarray) कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए (आरटी) १४० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर ।
  2. मानक बफ़र microarray कक्ष के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा निकालें । रिक्त स्लाइड धारकों को microarray स्लाइड के भंग होने से रोकने के लिए खाली स्लाइड्स के साथ भरें ।
  3. अवरुद्ध बफर के साथ microarray ब्लॉक (२,००० µ एल/microarray) के ६० मिनट के लिए RT पर १४० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर कुल मात्रा ।
  4. ब्लॉकिंग बफ़र microarray कक्ष के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा निकालें ।
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी, विरोधी मानव आईजीएम fluorochrome संयुग्मित के साथ microarray मशीन, पतला 1:५,००० (२,००० µ एल/microarray की कुल मात्रा) धुंधला बफर में (10% मानक बफर में बफर अवरुद्ध) में 30 मिनट के लिए आरटी पर अंधेरे में एक कक्षीय शेखर पर १४० rpm.
  6. द्वितीयक एंटीबॉडी को microarray चैंबर के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating करके निकालें.
  7. microarray 3x धो मानक बफर के साथ 1 मिनट धोने के प्रति (२,००० µ एल की कुल मात्रा/microarray के आर टी सी पर एक कक्षीय शेखर पर १४० rpm । प्रत्येक धोने के बाद, microarray चैंबर के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा मानक बफर निकालें ।
  8. एक हौसले से तैयार सूई बफर (1 मिमी Tris, पीएच ७.४), (२०० मिलीलीटर की कुल मात्रा) में 2x स्लाइड विसर्जित कर दिया ।
  9. सूखी microarray ध्यान से, लगभग 1 मिनट के लिए, aspirating अतिरिक्त द्रव बहुत ध्यान से स्लाइड की सतह को छूने के बिना स्लाइड के नीचे करने के लिए ऊपर से । एक microarray स्कैनर रीडर में स्लाइड का विश्लेषण ।

3. Microarray के जोखिम की मेजबानी के लिए सीरम

चेतावनी: सीरम नमूनों की संभावित संक्रामक प्रकृति के कारण प्रयोगशाला सुरक्षा स्थितियों, एक सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल-2) के तहत इस कदम का प्रदर्शन । एक वर्ग द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के भीतर काम करते हैं ।

  1. 30 मिनट के लिए ५६ ° c पर सीरम नमूना निष्क्रिय और 5 मिनट के लिए 4 ° c13में १६,००० आरसीएफ पर केंद्रापसारक ।
    नोट: समाधान (धुंधला, मानक बफर और पतला सीरम) microarray चैंबर के कोने में जमा करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ।
  2. एक 1:1000 (२,००० μL/microarray की कुल मात्रा) कमजोर पड़ने के साथ शुरू धुंधला बफर में सीरम नमूना पतला । इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक उपयोग करें ।
  3. धुंधला बफर के साथ microarray की मशीन (२,००० μL/microarray) के 15 मिनट के लिए आरटी में १४० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर कुल मात्रा ।
  4. microarray चैंबर के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा धुंधला बफर निकालें ।
  5. १४० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर पतला सीरम नमूना के साथ microarray गर्मी ।
  6. पतला सीरम नमूना microarray चैंबर के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा निकालें ।
  7. धो microarray 3x, मानक बफर (२,००० μL/microarray की कुल मात्रा में १४० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर आर टी के प्रति 1 मिनट । प्रत्येक धोने के बाद, microarray चैंबर के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा मानक बफर निकालें ।

4. माध्यमिक एंटीबॉडी और लेबल पर नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ धुंधला

नोट: समाधान (मानक बफ़र्स, पतला द्वितीयक और लेबल एंटीबॉडी) microarray कक्ष के कोने में जमा करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ।

  1. द्वितीयक एंटीबॉडी धुंधला बफ़र में पतला है ।
    नोट: का प्रयोग करें एंटी मानव आईजीएम fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी या विरोधी मानव आईजीजी fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी के एक कमजोर पड़ने पर 1:5000 (२,००० µ एल की कुल मात्रा/microarray) धुंधला बफर में ।
  2. मिश्रण नियंत्रण लेबल एंटीबॉडी (मोनोक्लोनल विरोधी हा fluorochrome संयुग्मित) 1 के कमजोर पड़ने पर: 1000 (२ ००० µ l/microarray की कुल मात्रा माध्यमिक एंटीबॉडी पहले धुंधला बफर में पतला के साथ धुंधला बफर में) ।
  3. १४० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर अंधेरे में आर टी में 30 मिनट के लिए microarray के साथ मशीन ।
  4. microarray चैंबर के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा पतला माध्यमिक और लेबल एंटीबॉडी का मिश्रण निकालें.
  5. मानक बफर के साथ 3x धो (२,००० µ एल की कुल मात्रा/microarray) । प्रत्येक धोने १४० rpm पर एक कक्षीय शेखर पर 1 मिनट के लिए है । प्रत्येक धोने के बाद, microarray चैंबर के कोने से एक पिपेट के साथ aspirating द्वारा मानक बफर निकालें ।

5. Microarray स्कैनिंग

  1. नए सिरे से तैयार की सूई बफर में 2x स्लाइड विसर्जित (1 मिमी Tris, पीएच ७.४) (२०० मिलीलीटर की कुल मात्रा) ।
  2. microarray को ध्यान से सुखाएं, 1 मिनट के आसपास, स्लाइड की सतह को छुए बिना स्लाइड के नीचे से ऊपर की ओर बहुत सावधानी से aspirating ।
  3. स्कैनर के निर्देशों का पालन microarray स्कैन करें । स्लाइड को ऊपर की दिशा में मुद्रित सतह के साथ स्कैनर पर रखें ।
  4. एक नया प्रोजेक्ट बनाएं और स्कैनिंग क्षेत्र का चयन करें । के रूप में सेट स्कैनर पैरामीटर: संकल्प: 21 µm, दोनों ७०० और ८०० एनएम चैनल के लिए तीव्रता: ७.०, गुणवत्ता स्कैनिंग: मध्यम और ऑफसेट: ०.८ ।
  5. प्राप्त करें और स्कैन raw छवि एक 16-बिट ग्रेस्केल TIFF फ़ाइल स्वरूप के रूप में सहेजें ।

6. Microarray एक विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण

  1. raw छवि (TIFF छवि) खोलें । सरणी ग्रिड फ़ाइल खोलें ।
  2. कंप्यूटर के माउस या कुंजीपटल तीर कुंजियों के साथ स्कैन छवि के लिए सरणी ग्रिड संरेखित करें ।
  3. चयन "यों तो चयन" विशिष्ट सॉफ्टवेयर में, जो एक readout फ़ाइल है कि प्रत्येक स्थान के लिए संकेत तीव्रता, पृष्ठभूमि मूल्य, और इसी पेप्टाइड अनुक्रम शामिल बनाता है ।
    नोट: यह आउटपुट फ़ाइल भी अतिरिक्त विश्लेषण और रेखांकन के लिए एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आयात किया जा सकता है ।

7. Microarray स्टोरेज

  1. ऑक्सीजन फ्री नाइट्रोजन या आर्गन गैस के तहत 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में सील microarray स्टोर ।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके प्राप्त किए गए परिणाम आरेख 2 और चित्र 3में दिखाए जाते हैं । कोई पृष्ठभूमि बातचीत जब पूर्व माध्यमिक विरोधी मानव आईजीएम के साथ microarray धुंधला (डेटा दिखाया नहीं) नोट किया गया । एक विरोधी मानव आईजीएम संयुग्मी के साथ धुंधला पृष्ठभूमि हरी प्रतिदीप्ति तीव्रता के ऊपर कई क्षेत्रों में हुई, मेजबान सीरम नमूने में आईजीएम के साथ इन पेप्टाइड्स के बंधन का संकेत (चित्रा 2) । आईजीजी डिटेक्शन (red प्रतिदीप्ति सिगनल) से केवल कुछ पेप्टाइड्स का पता चला (चित्रा 2) ।

विशिष्ट एक ही कंपनी है कि microarray निर्मित द्वारा प्रदान की स्कैनिंग के बाद microarray विश्लेषण करती है सॉफ्टवेयर । बनाया readout फ़ाइल प्रत्येक स्थान, पृष्ठभूमि मान, और संबंधित पेप्टाइड अनुक्रम के लिए संकेत तीव्रता शामिल हैं । स्पॉट प्रतिदीप्ति एक मजबूत प्रतिक्रिया के साथ एक पेप्टाइड की तीव्रता आईजीएम के लिए हरे अग्रभूमि माध्य कच्चे मूल्य से पृष्ठभूमि (चित्रा 3) के बाद प्राप्त मूल्यों की साजिश रचने के द्वारा visualized थे) ।

Figure 1
चित्र 1: योजनाबद्ध उच्च घनत्व पेप्टाइड Microarray के लिए विश्लेषण प्रक्रिया दिखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: पेप्टाइड Microarray स्कैन की गई छवियां. कच्चे प्रतिदीप्ति एक ZIKV सीरम नमूना 1:250 पतला के साथ मशीन के बाद पेप्टाइड microarray धुंधला के चित्र । आईजीजी जेट लाल (बाएं) में चित्रित है, और आईजीएम जेट हरी (दाएं) में दिखाया गया है । हा कंट्रोल पेप्टाइड्स फ्रेम पेप्टाइड microarray. ज़ूम पैनलों उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ पेप्टाइड्स के समूह दिखाएँ, आईजीएम या आईजीजी के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया का संकेत. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि Zika वायरस Epitope आम सहमति अनुक्रम होस्ट सीरम नमूने में आईजीएम के साथ प्रतिक्रिया । अतिव्यापी पेप्टाइड्स से हरी अग्रभूमि माध्य मान एक ग्राफ़ पर प्लॉट किए गए थे । epitope सहमति अनुक्रम से पेप्टाइड्स लाल रंग में हाइलाइट किए गए हैं । सबसे अधिक प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ पेप्टाइड बोल्ड में चिह्नित है । वेक्टर आधारित ग्राफिक डिजाइन सॉफ्टवेयर के लिए यह आंकड़ा उत्पंन किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

हम एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray पूरे Zika वायरस प्रोटीन अनुक्रम (फ्रेंच Polynesian तनाव) युक्त उपयोग प्रोटोकॉल बनाया । microarray मुद्रण ३,४२३ अलग अतिव्यापी रैखिक पेप्टाइड्स द्वारा निर्मित किया गया था । प्रत्येक पेप्टाइड 15 अमीनो एसिड था और अनुक्रम (यानी, 14 अवशेषों ओवरलैप) में अपने निकटतम पड़ोसी से केवल एक अवशेषों द्वारा विविध । हालांकि छोटे ओवरलैप मुद्रित किए जा सकते हैं, epitope मैपिंग अब अधिव्याप्त के साथ अधिक सटीक है । विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए प्रत्येक पेप्टाइड डुप्लिकेट में मुद्रित किया गया था ।

यह पूर्व के साथ प्रक्रिया शुरू करने के लिए आवश्यक है माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ microarray धुंधला संभव पृष्ठभूमि बातचीत का पता लगाने और उन्हें नमूना विशिष्ट संकेत से अंतर. एक विशिष्ट ब्लॉकिंग बफ़र का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है के रूप में अन्य अवरुद्ध बफ़र्स जैसे गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) या सूखे मिल्क पाउडर कम संकेत तीव्रता में परिणाम कर सकते हैं. ZIKV आईजीएम एंटीबॉडी के लिए एक सत्यापित सीरम नमूना पहले microarray के साथ 1:1000 पर था, लेकिन कोई संकेत नहीं पाया गया था । 1:500 के एक कम कमजोर पड़ने पर बाद की मशीन के नमूने में आईजीएम एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है कि पेप्टाइड्स से आने वाले एक निम्न तीव्रता संकेत के परिणामस्वरूप. सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त किया गया जब Zika सत्यापित सीरम नमूना 1:250 पर पतला था । हम पृष्ठभूमि संकेत की वृद्धि से बचने के लिए एक उच्च एकाग्रता पर सीरम नमूना retest नहीं किया. microarray के सावधान हैंडलिंग microarray सतह scratching से बचने के लिए आवश्यक है । इसलिए, समाधान ऐसे हमें पतला सीरम और मानक बफर करने के लिए जोड़ रहे है और microarray चैंबर के कोने से हटा दिया । इसके अलावा, एक सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण स्लाइड विशिष्ट मशीन कंपनी है कि microarray, जो ंयूनतम नमूना मात्रा के साथ काम करने की अनुमति के लिए डिज़ाइन किया गया है निर्मित द्वारा प्रदान की ट्रे है । मशीन ट्रे आयाम ९.० सेमी और मोटी के 3 सेमी द्वारा १३.० सेमी कर रहे हैं । 3 स्लाइडें एक साथ 3 अलग स्लाइड परख की अनुमति है कि मशीन ट्रे में गुहाओं नामित कर रहे हैं । हालांकि, इस प्रयोग में हम केवल 1 स्लाइड का इस्तेमाल किया । ट्रे को संतुलित करने और सरणी स्लाइड को तोड़ने से रोकने के लिए रिक्त माइक्रोस्कोप स्लाइड अन्य दो गुहाओं में रखे गए थे । मशीन ट्रे 4 भागों के होते हैं: एक आधार प्लेट जहां स्लाइड निर्दिष्ट गुहाओं में रखा जाता है; सिलिकॉन से बना एक मुहर दूसरों से प्रत्येक स्लाइड अलग करने के लिए; एक ऊपरी हिस्सा है कि आधार प्लेट के साथ मुहर में शामिल होने और ऐसे धोने बफर या सीरम नमूना के रूप में परख के लिए समाधान जोड़ने के लिए microarray कक्षों बनाने के लिए thumbscrews शामिल है । मुहर और ऊपरी हिस्सा संदूषण से बचने या स्लाइड के बीच समाधान के मिश्रण । पिछले अनुभाग घटक एक ढक्कन के वाष्पीकरण या नमूनों की पर्यावरणीय संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए है । एक कक्षीय शेखर इष्टतम गीला और धुंधला स्थिति प्राप्त करने के लिए पसंद है ।

पर निर्भर करता है जब वायरस मेजबान परिणामस्वरूप विशिष्ट Zika आईजीएम एंटीबॉडी एकाग्रता में सीरा उच्च या निंन हो सकता है । इसलिए, यह प्रत्याशित था कि एक उच्च आईजीएम एकाग्रता के साथ एक सीरम नमूना का उपयोग सापेक्ष प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता वृद्धि होगी । आईजीएम पता लगाने के बाद, एक ही सीरम नमूना microarray के साथ 1:250 के एक कमजोर पड़ने पर मशीन था, लेकिन एक विरोधी मानव आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में इस्तेमाल किया गया था. वैकल्पिक रूप से, अलग एंटीबॉडी वर्गों एक ही microarray के भीतर माध्यमिक एंटीबॉडी अलग प्रतिदीप्ति रंजक के साथ प्रत्येक संयुग्मित का एक मिश्रण का उपयोग कर एक साथ पता लगाया जा सकता है । एक ही microarray एक और अधिक केंद्रित सीरम नमूना के साथ फिर से दाग हो सकता है अगर संकेत तीव्रता कम है । यदि ठीक से संग्रहीत microarray कई महीनों के लिए स्थिर है और संभवतः फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

ठहराव की जगह तीव्रता और पेप्टाइड एनोटेशन स्वामित्व सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कंपनी है कि microarray भी प्रदान करता है एक ". पीएसएफ" सरणी प्रारूप के टेंपलेट के साथ फ़ाइल से निर्मित किया गया था । पीएसएफ फ़ाइल मूलतः एक ग्रिड कि कच्चे स्कैनर छवि मालिकाना सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए गठबंधन है । एक सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म रॉ में प्रत्येक स्थान के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण करती है (घटनास्थल के संकेत की गहनता मूल्य), पृष्ठभूमि (गैर-विशिष्ट बंधन की वजह से संकेत का अनुमानित मूल्य) और अग्रभूमि (कच्चे से पृष्ठभूमि घटाया मान) संकेत । यह भी अग्रभूमि औसत मूल्यों और समग्र अग्रभूमि औसत की गणना करता है डुप्लिकेट में प्रत्येक पेप्टाइड के दो औसत स्थान मूल्यों का मतलब करने के लिए इसी । इसके अलावा, सॉफ्टवेयर ओवरलैपिंग पेप्टाइड्स के भीतर आम सहमति रूपांकनों/epitope की पहचान करता है । वैकल्पिक रूप से, संकेत तीव्रता microarray स्कैनर सॉफ्टवेयर के साथ quantified जा सकता है और फिर सरणी प्रारूप के खाके का उपयोग कर, पेप्टाइड अनुक्रम पहचाना जा सकता है ।

इस प्रोटोकॉल के बाद, प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर कई होनहार पेप्टाइड उंमीदवारों की पहचान की गई । बाद में विस्फोट14 विश्लेषण के लिए अंय flavivirus के लिए संभावित पार-जेट के साथ अवशेषों की पहचान का इस्तेमाल किया गया । कुल 14 पहचान किए गए पेप्टाइड्स केवल ZIKV में 3 proteome डेटाबेस में पहचान के रूप में मौजूद हैं । microarrays की एक दूसरी श्रृंखला की योजना बनाई है कि पहली सरणी से चयनित पेप्टाइड्स शामिल होंगे । यह परीक्षण की अनुमति देगा एकाधिक सत्यापित नमूनों के रूप में अच्छी तरह से flavivirus के साथ ही संक्रमित लोगों से नमूने के लिए विशिष्टता की पुष्टि ZIKV । स्क्रीनिंग के लिए, हम एक एलिसा परख प्रारूप अनुकूलन, चयनित पेप्टाइड्स के साथ प्लेटों कोटिंग और मानव सीरम और लार के नमूनों में विशिष्ट एंटीबॉडी ZIKV बाध्यकारी परीक्षण होगा ।

ZIKV हैंडलिंग के लिए एक सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल-2) सुविधा15में काम करने की आवश्यकता है । जैसा कि हम एक सीरम नमूना के साथ काम किया ZIKV संक्रमण के लिए मान्य हम बीएसएल में काम किया-2 एक वर्ग द्वितीय (या उच्चतर) जैविक सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) के भीतर सभी नमूना हेरफेर प्रदर्शन सुविधा. यही कारण है कि हम microarray13के साथ नमूना मशीनिंग से पहले 30 मिनट के लिए ५६ ° c पर सीरम नमूना हीटिंग वायरस निष्क्रिय है. गर्मी निष्क्रियता के बाद, यह भी एक बीएसएल-2 उचित अच्छा प्रयोगशाला सुरक्षा अभ्यास के साथ सुविधा में काम जारी रखने के लिए संक्रमण की संभावना से बचने की सिफारिश की है ।

microarray है कि हम डिजाइन केवल रैखिक पेप्टाइड्स और क्रमिक रूप से गठन epitopes है कि निदान के रूप में मूल्यवान हो सकता है याद किया गया है । इस सीमा को एक उच्च घनत्व microarray चक्रीय विवश पेप्टाइड्स जिसमें looped epitope संरचनाओं16नकल युक्त का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल तेजी से अंय रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि एक बार प्रोटीन अनुक्रम एक नया microarray संभावित नैदानिक पेप्टाइड्स की खोज के लिए डिजाइन किया जा सकता है जाना जाता है । यह भी इस तरह के अंय अनुप्रयोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जैसे मार्की डिस्कवरी17, प्रतिजन और epitope खोज वैक्सीन विकास या चिकित्सकीय लक्ष्य के लिए18,19

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वर्तमान समर्थन NIDCRR44 DE024456 से एक SBIR (लघु व्यवसाय नवाचार अनुसंधान) प्रशासनिक अनुपूरक अनुदान द्वारा प्रदान की जाती है । NIDCR एचआईवी अनुदान है कि NIDCR अनुदान U01 DE017855 से बाहर एचआईवी के लिए एक पुष्टि बिंदु की देखभाल नैदानिक के विकास के लिए विकसित की है । हम कृतज्ञता उसे तकनीकी सहायता और तरह के समर्थन के लिए रेशमी Weisenburger (PEPperPRINT हीडलबर्ग, जर्मनी) स्वीकार करते हैं । हमने ली-ï ओडिसी इमेजिंग सिस्टम के लिए NYU Langone मेडिकल सेंटर का भी शुक्रिया अदा किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray PEPperPRINT PPC.001.001 Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1 PEPperPRINT PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) PEPperPRINT PPC.037.002
PepSLide Analyzer PEPperPRINT PSA.004.001 14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer Rockland MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 Rockland 609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680 Thermo Scientific SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System LI-COR
Orbital shaker device IKA MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator Adobe
Deltagraph Redrocks

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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